CN116874632A - 一种戊糖乳杆菌多糖及应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种戊糖乳杆菌多糖及应用，该戊糖乳杆菌多糖由一个支链甘露聚糖部分和线性葡聚糖部分组成，甘露聚糖部分包含一个α‑(1→3)‑Manp、一个α‑(1→2)‑Manp和两个α‑(1→2,6)‑Manp，终端的β‑Manp连接在O‑6位置，葡聚糖部分由8个α‑(1→4)‑Glcp残基组成，在葡萄糖的O‑6位有一个分支点。戊糖乳杆菌多糖在制备维持肠道健康的保健食品或药品中的应用。本发明通过明确胞外多糖的具体结构，用于研究其对应的功能性质，发现该特定结构的胞外多糖对维持肠道健康及调节免疫功能具有较好的防治作用，可通过调节小鼠结肠和紧密连接蛋白的表达来维持肠道完整性并保护肠道化学和机械屏障。

Description

一种戊糖乳杆菌多糖及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种戊糖乳杆菌多糖及应用。

背景技术

乳酸菌是世界公认安全的微生物，其特定菌株具有抑制有害菌生产、维持肠道菌群平衡、增强免疫力、降低胆固醇、降低血压、抗肿瘤、抗氧化、抗突变等重要生理功能。乳酸菌还可以在发酵过程中转化乳糖生成乳酸、乙酸等有机酸，同时合成多糖、脂类、蛋白质等物质，形成各种风味化合物及其它功能成分，从而提高产品的营养价值、改善风味、延长保质期。

许多乳酸菌可以发酵产生胞外多糖，主要包括保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、开菲尔乳杆菌(L.kefir)、植物乳杆菌(L.plantarum)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等。这些菌株大多来源于乳或乳制品，如酸奶、奶酪等，也有一些来源于植物制品，如泡菜、发酵果蔬汁、酸面团等，但相对前者而言，植物来源乳酸菌胞外多糖开发较少。

胞外多糖因其特定的理化与结构特性，具有独特的生理活性，如降胆固醇、抗氧化、调节炎症、抗肿瘤、抗凝血和抗病毒活性等，能够抑制病原菌繁殖，促进益生菌在肠内的定植，维持肠道菌群平衡，可用于保健品及治疗药物的添加成分。不同结构的多糖对应的功能不同，目前乳酸菌多糖既有单一单糖组成的纯多糖，又有不同单糖组成的杂多糖，其糖链结构、长度、支链组成、空间结构各不相同，形成了复杂的多级结构，各自具有独特的生理功能。目前对胞外多糖结构与对应功能性质之间的详细机制仍不清楚。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种戊糖乳杆菌多糖及应用。

本发明一方面提供了一种戊糖乳杆菌多糖E112，该戊糖乳杆菌多糖由一个支链甘露聚糖部分和线性葡聚糖部分组成，甘露聚糖部分包含一个α-(1→3)-Manp、一个α-(1→2)-Manp和两个α-(1→

2,6)-Manp，终端的β-Manp连接在O-6位置，葡聚糖部分由8个α-(1→4)-Glcp残基组成，在葡萄糖的O-6位有一个分支点。

本发明第二个方面提供了戊糖乳杆菌多糖在制备维持肠道健康的保健食品或药品中的应用。

进一步地，戊糖乳杆菌多糖在制备减少肠道有害气体产生的保健食品或药品中的应用。

进一步地，戊糖乳杆菌多糖在制备增加肠道有益短链脂肪酸产生的保健食品或药品中的应用。

进一步地，戊糖乳杆菌多糖在制备调节肠道菌群组成的保健食品或药品中的应用。

本发明第三个方面提供了戊糖乳杆菌多糖在制备调节免疫功能的保健食品或药品中的应用。

进一步地，戊糖乳杆菌多糖在制备增强免疫功能的保健食品或药品中的应用。

进一步地，戊糖乳杆菌多糖在制备维持体内免疫环境的保健食品或药品中的应用。

本发明通过明确胞外多糖的具体结构，用于研究其对应的功能性质，发现该特定结构的胞外多糖对维持肠道健康及调节免疫功能具有较好的防治作用，可通过调节小鼠结肠和紧密连接蛋白的表达来维持肠道完整性并保护肠道化学和机械屏障。

附图说明

图1为实施例2中E112的组成及结构；

图2为实施例3中E112对肠道菌群产气的影响；

图3为实施例3中E112对肠道菌群产有机酸的影响；

图4为实施例3中E112对肠道菌群组成的影响；

图5为实施例4中E112对小鼠免疫状态的影响；

图6为实施例4中E112对小鼠脾脏损伤的修复；

图7为实施例4中E112对小鼠结肠损伤的修复；

图8为实施例4中E112对小鼠血液免疫指标的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本技术方案。

实施例1：戊糖乳杆菌多糖的准备

粗多糖的制备：L.pentosae YY112活化后以4％接种量接种于MRS-Broth改良培养基中，30℃培养24h；发酵液离心(20min，10000g，4℃)去除菌体，取上清液加80％(W/V)三氯乙酸至终浓度4％(W/V)，静置10h；离心(20min，10000g，4℃)去除沉淀蛋白，取上清液50℃旋转蒸发至原体积的1/4，取浓缩后的样液加入3倍体积95％(V/V)乙醇，4℃静置过夜；离心(20min，10000g，4℃)取沉淀，用水重新溶解，装入透析袋去离子水透析3d，每8h换水一次；浓缩样液，冷冻干燥得到粗多糖。

纯多糖制备：以DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱进行纯化。以脱气超纯水清洗填料，然后0.1mol/L NaCl溶液冲洗平衡填料。粗多糖溶解于超纯水(50mg/mL)后上样100mg，依次以超纯水、0.1mol/L和0.2mol/L NaCl溶液洗脱，分步收集，苯酚-硫酸法测定多糖含量并绘制洗脱曲线，获得两个单一峰，其中第二个峰组分含量为80％，纯度达到90％以上，将其收集后以去离子水透析3d，每8h换水一次，浓缩透析样液，经冷冻干燥得到纯化多糖，命名为EPS112，以下简称E112。

实施例2：戊糖乳杆菌多糖结构

以HPSEC测定其均一性及平均分子量，以HPAEC离子色谱分析其单糖组成，E112的平均相对分子量为5.9×10⁴Da(图1A)，主要由葡萄糖(53.8％)和甘露糖(41.3％)组成，还有少量的半乳糖(2.7％)、葡糖胺(1.6％)和阿拉伯糖(0.6％)(图1B)。

通过甲基化、GC-MS以及NMR分析，推测其结构单元由一个支链甘露聚糖部分和线性葡聚糖部分组成。甘露聚糖部分包含一个α-(1→3)-Manp、一个α-(1→2)-Manp和两个α-(1→2,6)-Manp，终端的β-Manp连接在O-6位置。葡糖部分由8个α-(1→4)-Glcp残基组成，在葡萄糖的O-6位有一个分支点(图1C)。该多糖的结构与以往报道的戊糖乳杆菌及其接近的植物乳杆菌所产的多糖结构均不相同。

实施例3:对人体肠道菌群的影响

1.实验设计

招募32名健康志愿者(16名男性和16名女性，25-45岁，体重指数18.5-23.9，3个月内未服用过抗生素或含活菌产品)，取其空腹晨便，0.8g新鲜粪便加入8mL磷酸盐缓冲盐水(0.1M，pH7.0)匀浆制备粪便溶液。将YCFA培养基(4mL)、粪便溶液(0.5mL)和E112溶液(0.5mL，50g/L)加入10mL的无菌青霉素瓶中作为实验组；以无菌水代替E112溶液作为对照组。小瓶充氮气5min以去除氧气，37℃培养24h后，测定发酵产生的甲烷(CH₄)、氨气(NH₃)、硫化氢(H₂S)、氢气(H₂)和二氧化碳(CO₂)浓度，将发酵液离心(9000r/min，5min)，取上清液测定乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等有机酸含量，沉淀物进行16S rRNA基因分析。

2.减少肠道有害气体产生

肠道菌群分解难以直接吸收的营养物质，产生各类代谢产物从而参与消化吸收，气体即为一类重要代谢产物。过量的CH₄降低胃肠道中血清素的水平，减缓肠道运输，可导致便秘、肠易激综合征等症状。NH₃和H₂S能够对结肠粘膜、肾脏和血管内皮细胞造成潜在危害。与对照相比(CG)，添加多糖后，男性组(EG-M)CH₄、NH₃、H₂含量显著下降(P＜0.05)，H₂S也有下降趋势，女性组(EG-F)中CH₄、NH₃浓度显著下降，H₂S、H₂、CO₂无显著变化(图2)，说明E112有效减少肠道有害肠道气体的产生，并具有性别差异性。

3.增加短链脂肪酸含量

短链脂肪酸(SCFAs)与宿主健康密切相关。乙酸能够维持肠道酸性环境，也是合成胆固醇唯一碳源。丙酸可降低血液胆固醇浓度，预防脂肪过量储存，并具有抗癌和抗炎活性。丁酸能够为结肠上皮细胞提供能量，戊酸可用于肿瘤免疫治疗。加入E112后，男性组中丙酸、总酸含量显著增加(P<0.05)，乙酸、丁酸有增加趋势但不显著，女性组中丙酸与戊酸显著增加(P<0.05)，乙酸显著下降(P<0.05)，丁酸与总酸无显著变化(图3)。说明E112对于短链有机酸的调控具有性别差异。

4.维持肠道菌群健康

如图4所示，添加E112后，男性组与女性组的菌群组成均发生变化，从门水平看，Firmicutes和Actinobacteria相对丰度增加，Proteobacteria的相对丰度下降(含多种条件致病菌)，女性组的变化较男性更明显。从属水平上看，加入E112后，男性和女性的肠道微生物群聚集在一起，说明其对不同性别组的菌群具有类似调节作用。加入E112后，两组中Escherichia-Shigella相对丰度均显著减少(P<0.05)，Bifidobacterium的相对丰度增加(P<0.05)，Lactobacillus的相对丰度也明显增加。男性组的变化菌属主要为Escherichia-Shigella、Bifidobacterium等，女性组中，Escherichia-Shigella、Bifidobacterium、Bacteroides、Lactobacillus等重要菌属的相对丰度均发生明显变化(图4)。Bifidobacterium、Lactobacillus及Bacteroides等重要有益菌相对丰度增加，Escherichia-Shigella等主要条件致病菌丰度降低，对于肠道免疫系统的维护、肠道屏障功能的保护具有重要意义。添加E112能够促进肠道健康，性别对其作用方式及程度有一定影响。

实施例4:调节免疫功能

1.动物实验设计

利用环磷酰胺(CP)建立免疫低下小鼠模型：正常对照组(NC)，CP模型组(MC)，阳性对照组(PC)，CP+低剂量EPS组(LE)，CP+中剂量EPS组(ME)，CP+高剂量EPS组(HE)。适应性饲喂一周后，在0-2、21和30天，NC组注射3天生理盐水，其余组注射80mg/kg BW CP，其他时间NC组和MC组的小鼠灌胃生理盐水，PC组灌胃40mg/kg BW左旋咪唑(LMS)。LE组、ME组和HE组的小鼠分别灌胃50、100和200mg/kg的E112。第39天眼球取血后，小鼠断颈处死。收集脾脏、远端结肠和结肠内容物，保存于-80℃冰箱中。

2.增强小鼠免疫状态

如图5所示，CP引起小鼠体重显著下降，阳性药物对体重无恢复作用，但E112组在整个实验期间表现出良好的体重恢复趋势，LE组的作用最明显，在第38天达到110.2±0.69％，与正常对照组无明显差异。器官指数可以用来反映免疫反应的水平，注射CP对于胸腺、肾脏和肝脏指数的影响不显著，但脾脏明显肿大，LMS和E112干预均能缓解肿大趋势，其中HE组改善显著，表明E112可以促进重要免疫器官的健康。

肠道和脾脏是至关重要的免疫器官。利用HE染色评估小鼠脾脏和结肠中的组织损伤。如图6所示，NC组的脾细胞排列整齐、紧密，红髓和白髓之间有明显的边界。MC组的脾细胞排列稀疏，淋巴细胞减少，红白髓之间的边界模糊。PC、E112干预后，白髓区域变大，间质间隙变小，脾细胞更紧密地堆积。其中PC、LE和ME组与NC组表现类似，说明E112可以有效地增加脾淋巴细胞，修复CP对脾细胞的损伤。如图7所示，与NC组小鼠相比，MC组小鼠的上皮细胞受损，隐窝较短，杯状细胞减少，粘液分泌较少。LMS治疗后结肠杯状细胞增加，但出现隐窝萎缩。E112干预后，结肠隐窝结构更加完整，粘液分泌增加，但HE组中部分结肠隐窝发生萎缩，说明对于免疫力抑制小鼠，喂食E112有助于重建肠粘膜的免疫反应，但干预剂量可能不宜过高。

3.维持小鼠体内免疫环境

注射CP引起小鼠体重显著下降，并引起血清TG与CHO浓度下降，阳性药物对其没有改善作用，中剂量E112将其恢复至正常水平。如图8所示，免疫球蛋白(IgA、IgM和IgG)和炎症因子(IFN-γ和TNF-α)浓度在各组之间没有显著差异；注射CP引起NEU(中性粒细胞)、MCV(红细胞平均体积)和PLT(血小板)水平显著升高，E112干预下调这些指标，说明此多糖可调整血液指标至正常水平。LYM(淋巴细胞)是淋巴系统重要免疫功能的主要执行者，参与细胞免疫、分泌免疫球蛋白和细胞因子的能力。与NC组相比，MC组的淋巴细胞浓度显著降低，说明免疫缺陷的发生，而中剂量EPS可以显著增加淋巴细胞含量至正常水平(P<0.05)，这与HE染色中观察到的现象一致。E112可以通过增加淋巴细胞来增强机体免疫力。

Claims (8)

1.一种戊糖乳杆菌多糖，其特征在于，该戊糖乳杆菌多糖由一个支链甘露聚糖部分和线性葡聚糖部分组成，甘露聚糖部分包含一个α-(1→3)-Manp、一个α-(1→2)-Manp和两个α-(1→2,6)-Manp，终端的β-Manp连接在O-6位置，葡聚糖部分由8个α-(1→4)-Glcp残基组成，在葡萄糖的O-6位有一个分支点。

2.权利要求1所述的戊糖乳杆菌多糖在制备维持肠道健康的保健食品或药品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于戊糖乳杆菌多糖在制备减少肠道有害气体产生的保健食品或药品中的应用。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于戊糖乳杆菌多糖在制备增加肠道有益短链脂肪酸产生的保健食品或药品中的应用。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于戊糖乳杆菌多糖在制备调节肠道菌群组成的保健食品或药品中的应用。

6.权利要求1所述的戊糖乳杆菌多糖在制备调节免疫功能的保健食品或药品中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于戊糖乳杆菌多糖在制备增强免疫功能保健食品或药品中的应用。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于戊糖乳杆菌多糖在制备维持体内免疫环境的保健食品或药品中的应用。