CN116850286A - 烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用与不依赖氧气的巩膜胶原交联方法 - Google Patents

Abstract

一种烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用与不依赖氧气的巩膜胶原交联方法，利用烷基自由基的引发剂对I型胶原溶液和巩膜组织进行交联，相比于紫外光/核黄素交联法，其反应的进行不依赖氧气的参与，可能更适用于近视缺氧状态下的巩膜，相比于化学交联法，更易于控制交联反应。烷基自由基诱导的胶原交联在抗酶降解性能、热稳定性和生物力学性能方面，都有所提高。

Description

烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用与不 依赖氧气的巩膜胶原交联方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用与不依赖氧气的巩膜胶原交联方法。

背景技术

近视是全球最常见的眼科疾病之一，通常从儿童时期就开始。近视的患病率不断增加，预计到2050年，近视人数将高达47.58亿，约占全球人口的49.8%，而高度近视人数将有9.38亿。而这些高度近视的患者，有一部分将发展成病理性近视。病理性近视对视力的危害极大，是近视患者失明的主要原因。它常见的并发症有后巩膜葡萄肿、黄斑萎缩、黄斑劈裂、黄斑裂孔、脉络膜新生血管和视网膜脱离等，这些往往就是病理性近视患者失明的原因。病理性近视表现为眼轴不断增长，伴随着眼轴增长，巩膜容易出现后巩膜葡萄肿，随之发生其他并发症。关于近视的病因，目前还机制不明，认为是遗传和环境因素相互作用的结果。有研究发现在近视进展中，巩膜的力学性能会减弱，硬度下降，厚度变薄，还伴随着巩膜弹性的增加和胶原含量的减少。Wu等发现缺氧可促进人巩膜成纤维细胞转分化，同时使I型胶原的表达减少，表明其在巩膜细胞外基质的重塑和近视进展中有着重要的作用。巩膜交联术通过对巩膜胶原进行交联，使胶原分子内部和胶原分子之间形成新的连接，从而增强巩膜的力学性能，是防治近视进展的新方法。目前的巩膜交联术主要有物理交联和化学交联。其中，物理交联主要是紫外光/核黄素交联和蓝光/核黄素交联。化学交联主要是使用化学交联剂对胶原进行交联，如戊二醛、京尼平和甘油醛等。

紫外光/核黄素交联法是用370 nm波长的紫外光照射光敏剂核黄素，使核黄素被激发到三线态，从而产生活性氧。活性氧能和胶原分子发生反应，诱导相邻的胶原的氨基酸分子间或分子内发生交联。Wollensak等利用波长为370 nm、能量为3 mW/cm²的紫外光，对预先使用0.1%核黄素溶液处理过的兔眼赤道部的巩膜进行照射，并在术后3天、术后4月、术后8月对兔巩膜进行力学性能评估，发现术后3天，兔巩膜的杨氏模量就增加了320%，而术后4月为277%，术后8月能增加502%，表明紫外光/核黄素交联是一种非常有效而稳定的交联方法，并且，对视网膜或视网膜色素上皮没有损伤。然而，由于紫外线可以穿过巩膜，存在对视网膜和眼内其他组织造成损伤的可能。Wang等用365 nm波长、相同能量的激光和相同浓度的核黄素对兔眼巩膜进行交联处理，并在术后对实验兔行视觉电生理检查（ERG），结果发现暗适应ERG的振幅在术后1周、1个月和3个月均有统计学意义的降低，且在巩膜交联眼的视网膜层中可以发现凋亡细胞和超微结构的变化。蓝光/核黄素交联的原理和紫外光/核黄素的相似，但是蓝光的波长比紫外光长，光子能量较低，可能对生物造成的损伤也较小一些。但这种交联方式还存在如何将后巩膜暴露在光照下而同时避免损伤眼球其他部位的问题。Kwok等通过一种有金属涂层、柔韧的聚合物波导将蓝光导至赤道部巩膜，光传导过程中能尽可能减少光的泄露，这可能可以应用于后部巩膜。然而，这种光交联方式需要有氧气的参与，而近视的巩膜可能本身就处于缺氧状态，交联时若消耗了组织间的氧，可能会出现雪上加霜的情况。

化学交联的交联度要高于物理交联，相较于物理交联的不稳定，可以获得比较均匀的交联效果，但化学交联会引入外源性交联，因此，可能存在毒性作用。比如戊二醛，就是由于其存在细胞毒性，而基本不应用于巩膜交联术。目前应用比较成熟的是京尼平和甘油醛。京尼平是一种天然的交联剂，多项研究证实其能使巩膜力学强度增强且毒性低，但是，它存在巩膜甚至角膜染色、需多次注射的问题。此外，所有的化学交联剂，只能通过浓度剂量来控制交联度，而无法控制反应时间，因为交联剂注射于Tenon’s囊下后就无法再取出。那么，是不是存在一种巩膜交联方法，它既不需要耗氧，也能够控制交联反应，同时还能获得比较满意的力学性能。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷与不足，本发明提供了一种烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用与不依赖氧气的巩膜胶原交联方法。

本发明采用的技术解决方案是：烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用。

所述的烷基自由基的引发剂为能在热刺激下能分解产生烷基自由基的水溶性偶氮化合物。

所述的烷基自由基的引发剂为2,2’-氮杂双（2-咪唑啉）二盐酸盐（AIBI）。

所述的AIBI在热刺激下能分解产生烷基自由基的适宜的加热温度为44-50℃。

所述的AIBI的浓度为0.5-5mg/mL。

一种不依赖氧气的巩膜胶原交联方法，包括以下步骤：将I型胶原溶液或巩膜组织加入能产生烷基自由基的引发剂溶液中，在避光条件下加热10分钟，然后在室温下反应24小时。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用与不依赖氧气的巩膜胶原交联方法，利用烷基自由基的引发剂对I型胶原和巩膜进行交联，相比于光交联法，其反应的进行不依赖氧气的参与，可能更适用于近视缺氧状态下的巩膜，相比于化学交联法，也更易于控制交联反应，在抗酶降解性能、热稳定性和生物力学性能方面，都有所提高。

附图说明

图1 为不同浓度的AIBI改性后I型胶原溶液中苯丙氨酸的荧光发射光谱；其中右边虚线框为左边虚线框的放大部分。

图2 为不同浓度的AIBI改性后I型胶原溶液中酪氨酸的荧光发射光谱。

图3为AIBI改性前后I型胶原的SDS-PAGE；其中1：对照组；2-6，AIBI浓度：0、0.5、1、3、5 mg/mL；7：Marker。

图4 为AIBI处理力学性能正常的猪巩膜的生物力学参数；a：不同组别的应力-应变曲线（应变范围0-8%）；b、c、d：分别为不同组别的巩膜厚度、8%应变的弹性模量、极限应力的比较。（**p<0.01）

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 改性I型胶原溶液的制备

用PBS配置不同浓度的AIBI溶液保存于4℃备用。实验组：取150 µL的I型胶原溶液（3mg/mL）加入1050 µL的AIBI溶液，使AIBI溶液的工作浓度为1mg/mL，在避光44℃条件下加热10分钟。对照组：取相同量的I型胶原溶液（3mg/mL）加入等体积的PBS溶液，最终使溶液的总体积和实验组保持一致。

为研究不同浓度的AIBI溶液对I型胶原溶液的改性作用，设置不同浓度实验组：取150 µL的I型胶原溶液（3mg/mL）加入1050 µL的AIBI溶液，使AIBI溶液的工作浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、3mg/mL和5mg/mL，分别在避光条件下加热10分钟。对照组同上所述，实验组和对照组均放置在室温下反应24小时后用于荧光分光光度计、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测。

实施例2离体猪巩膜条带的制备和处理

从当地屠宰场获取死亡时间在6小时以内的新鲜猪眼。将50只猪眼随机分为5组，每组10只，组别分别为对照组、PBS组、AIBI组。分离猪眼上方的结膜及结膜下组织，暴露巩膜，去除肌肉组织，于12点位距角巩膜缘6-7 mm（肌肉附着点）后，用手术刀沿矢状面往视神经方向制备5mm×15 mm巩膜条带，条带置于PBS溶液中在4℃保存备用。

用PBS溶液配制1mg/mL的AIBI溶液，保存于4℃备用。实验开始时，将AIBI溶液置于44-50℃的油浴锅中预热5min，之后加入巩膜条带反应10 min，每10 mL的AIBI溶液加入3条巩膜条带。PBS组的巩膜条带，除外反应溶液为PBS，余处理同AIBI组，对照组巩膜条带一直保存于4℃冰箱中。

实施例3 离体猪巩膜条带用于扫描电子显微镜观察和生物力学性能测试。

结果如下：

本实验中通过检测内源性荧光，即主要测量苯丙氨酸和酪氨酸的荧光发射光谱，来反映AIBI对I型胶原溶液三级结构的影响。如图1 不同浓度的AIBI改性后I型胶原溶液中苯丙氨酸的荧光发射光谱所示：I型胶原溶液在278nm处有吸收峰，且荧光强度随着AIBI浓度的增加而显著降低或消失，但无蓝移或红移，表明AIBI使苯丙氨酸发生了改变，该过程可能是消耗了苯丙氨酸或将胶原结构改变后包埋了苯丙氨酸，从而导致其荧光强度下降，但未改变I型胶原疏水腔的疏水环境。

图2为不同浓度的AIBI对I型胶原溶液改性后，其对应的酪氨酸的荧光发射光谱。由图可知，I型胶原溶液在308nm处有吸收峰，随着AIBI浓度的增加，酪氨酸的荧光强度也是逐渐下降。然而，与苯丙氨酸相比，酪氨酸荧光强度的降低量无其显著，同样地，酪氨酸的吸收峰也未发生蓝移或红移。综上所述， AIBI改性过程中，对苯丙氨酸和酪氨酸都产生了作用，使它们发生了一定的改变，如消耗或包埋，但未改变它们疏水腔的疏水环境，因此，I型胶原溶液的三级结构可能未改变。

本发明采用SDS-PAGE来验证烷基自由基对I型胶原具有交联的作用。SDS-PAGE可以根据凝胶中胶原分子的移动速度而获得胶原的分子量。I型胶原具有三螺旋的特征结构，它包含了2条α1链和1条α2链，其中，每条胶原链都是左手螺旋结构，3条胶原链互相缠绕又形成右手螺旋结构。图3是AIBI改性前后I型胶原的SDS-PAGE图，由对照组的泳道可以看出I型胶原α链的分子量大约是130kDa，α1链分子量大于α2链，其比例约为2：1，β链是其二聚体，γ链为其三聚体。泳道2是0mg/mL的AIBI，相当于是将I型胶原加热10分钟，与对照组相比，其没有明显差异，说明该加热过程不影响I型胶原的分子量。由图可知，AIBI改性后的I型胶原表现为α、β链减少，γ链增多，表明I型胶原经AIBI作用后产生了交联，形成了分子量更高的胶原分子，且这个过程与AIBI的作用浓度相关，浓度越高，反应越显著。泳道5和6，与泳道4相比，表现出γ链无明显增多，这可能是由于胶原分子之间发生交联而形成分子量更大的聚合物，聚合物太大而无法进入泳道所致。

图4中表 1-5为AIBI对力学性能正常的猪巩膜处理后，测量的生物力学参数表，图4为其对应的参数统计图。由表可知，AIBI组、PBS组和对照组的巩膜厚度分别为（0.78±0.07）mm、（0.79±0.06）mm和（0.80±0.03） mm，三组间无统计学差异，表明AIBI的改性作用对巩膜厚度无明显影响。AIBI组、PBS组和对照组的极限应力分别为（2.11±0.40） MPa、（2.19±0.28） MPa和（1.95±0.46） MPa，组间也无统计学差异。在8%应变的应力方面，三组间有统计学差异（p<0.01），组间两两比较见图4中的应力-应变曲线，与PBS组相比，AIBI组和对照组之间差异更显著，其p值分别为0.001（AIBI组 vs对照组）和0.006（AIBI组 vs PBS组）。在8%应变的弹性模量方面，三组间差异也有统计学意义（p<0.01），组间的两两比较可见图4中的图c：AIBI组与对照组、PBS组都有统计学差异，p<0.01。综上所述，AIBI对力学性能正常的猪巩膜改性后，能使其弹性模量增加，8%应变的应力提高，但对极限应力无显著改变作用。

实验结果表明，本发明利用烷基自由基的引发剂能对I型胶原溶液和离体猪巩膜产生交联作用，在抗酶降解性能、热稳定性和生物力学性能方面，都有所提高。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.烷基自由基的引发剂在制备巩膜胶原交联药物上的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的烷基自由基的引发剂为在热刺激下能分解产生烷基自由基的水溶性偶氮化合物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的烷基自由基的引发剂为2,2’-氮杂双（2-咪唑啉）二盐酸盐（AIBI）。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的AIBI在热刺激下能分解产生烷基自由基的适宜的加热温度为44-50℃。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的2,2’-氮杂双（2-咪唑啉）二盐酸盐（AIBI）的浓度为0.5-5mg/mL。

6.一种不依赖氧气的巩膜胶原交联方法，其特征在于，包括以下步骤：将I型胶原溶液或巩膜组织加入能产生烷基自由基的引发剂溶液中，在避光条件下加热10分钟，然后在室温下反应24小时。