CN116858812A - 双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用，属于生物分析领域。该装置包括：双色光交替激发器用于激发两束不同波长的激光作为激发光源；声光可调谐滤波器适用于控制两束不同波长的激光交替激发形成交替激光并将所述交替激光耦合至一根光纤内；载物平台用于放置包含被两种不同的荧光染料标记的目标分子的样品，通过所述交替激光激发所述目标分子的两种不同的所述荧光染料，使所述荧光染料响应发出荧光基团，所述荧光基团共振转移形成荧光共振能量转移信号；荧光检测组件用于接收所述目标分子被激发后产生的荧光共振能量转移信号，并通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析领域，具体涉及一种双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用。
背景技术
同源重组由一系列保守的同源重组酶催化完成，包括噬菌体的T4UvsX，古细菌的RadA，细菌的RecA，以及真核生物的Rad51和DMC1等。在真核生物中，Rad51主要负责DNA双链断裂的同源重组修复过程，而DMC1特异性地催化减数分裂过程中的同源重组。同源重组步骤繁多，需要多种蛋白质机器的参与，并受到精细的调控，其生物化学过程大致可以分为以下四个阶段：起始阶段、同源配对阶段、新链合成阶段和分离阶段。同源重组是生命起源、生物多样性以及疾病发生发展的分子基础，其各个精细过程的研究是当今的生命科学前沿领域。发展新的光学分析与研究手段是回答同源重组中重要科学问题的关键。
由于传统的分析技术获得的信息是基于所有分子测量的平均结果，大量特异的个体信息被掩盖，其难以揭示同源重组等许多复杂的生物学过程。而在基本的生命过程中，许多生物大分子都是通过单个或数个分子执行其特定功能。因此，在单分子水平上观测目标分子的结构与行为对于我们理解基本的生命过程至关重要。
目前，已发展出多种单分子测量技术，大致可以分为两类：一是基于荧光及其光谱学的成像技术，主要包括单分子荧光成像技术(single-molecule fluorescence imaging)和单分子荧光共振能量转移技术(single-molecule fluorescence resonance energytransfer，smFRET)；二是基于力学的操纵和检测技术，主要包括光镊、磁镊和原子力显微镜等。
光学显微镜是生物医学领域不可或缺的研究工具，在基础研究与临床诊断中都发挥了重要作用。通过显微成像，我们不仅可以获得目标分子的存在及位置信息，还可以利用其偏振响应等特性推导目标分子的旋转和取向。由于荧光的发射波长比吸收波长更长，通过合理的光路设计，可以大幅降低背景的干扰，从而成为单分子成像的最佳选择。目前，现有的光学显微镜，对于观察短暂存在的中间状态或不稳定状态无法进行精确测量，也难以同时获得两种或多种荧光信号并对其进行分析。
发明内容
基于此，本发明提出了一种双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用，可在单分子水平实现对两个相互作用分子的动态或者一个双链DNA分子两条互补链的配对与分离的实时检测与定量表征。
根据本发明的第一个方面，提供了一种双色激光交替激发单分子成像检测装置，包括：
双色光交替激发器，用于激发两束不同波长的激光作为激发光源；
声光可调谐滤波器，适用于控制两束不同波长的激光交替激发形成交替激光并将上述交替激光耦合至一根光纤内；
载物平台，用于放置包含被两种不同的荧光染料标记的目标分子的样品，通过上述交替激光激发上述目标分子的两种不同的上述荧光染料，使上述荧光染料响应发出荧光基团，上述荧光基团共振转移形成荧光共振能量转移信号；
荧光检测组件，用于接收上述目标分子被激发后产生的荧光共振能量转移信号，并通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像；
其中，上述交替激光在上述载物平台上形成隠逝场以降低背景光噪音干扰。
根据本发明的实施例，上述微流室包括：
由载玻片和PEG修饰的盖玻片组合成的用于样品留存的腔室，上述微流室的高度为连接结构的高度；
其中，上述载玻片包括进样孔和输出孔，上述输出孔通过导管连接有注射器。
根据本发明的实施例，上述微流室内包括：
目标分子，包括被两种不同的荧光染料标记的探针分子与靶分子；
成像缓冲液，用于引入目标分子，包括除氧系统和还原剂组成，上述成像缓冲液的成分包括D-葡糖糖、葡糖糖氧化酶、过氧化氢酶和水溶性维生素E。
根据本发明的实施例，其中，还包括倒置荧光显微镜，上述倒置荧光显微镜设置于上述载物平台下侧，用于将上述交替激光聚焦于上述载物平台的盖玻片，或将上述荧光共振能量转移信号从上述载物平台引出；
照明器，通过光纤与所述声光可调谐滤波器连接，用于接收来自所述声光可调谐滤波器的交替激光，并发射所述交替激光激发目标分子。
根据本发明的实施例，上述双色光交替激发器包括：
激光源，用于发出两束不同波长的上述激光；
反射镜和二向色镜，用于将上述激光源发出的激光反射进上述光路中；
透镜，用于将两束上述激光聚焦至上述声光可调谐滤波器。
根据本发明的实施例，上述荧光检测组件包括：
二向色镜，用于分离上述荧光共振能量转移信号，得到两种不同波长的荧光激光；
两个单波段滤光片，平行设置于电子倍增电感耦合器件和上述二向色镜之间，用于过滤上述荧光激光的噪音。
根据本发明的第二个方面，提供了一种上述的双色激光交替激发单分子成像检测装置在鉴定生物链交换过程中目标分子的捕获与反应的启动中的应用。
根据本发明的实施例，包括以下方面的应用：
双链DNA分子或RNA分子的链分离检测；
一个单链DNA分子与一个双链DNA中互补链的重组反应检测；
一个单链RNA分子与一个双链DNA中互补链的重组反应检测；
重组反应检测或链分离检测中的DNA链的捕获、反应的启动与结束等过程的准确鉴定；
两个单链DNA分子或单链RNA分子间的杂交反应检测；
一个单链RNA分子与一个单链DNA分子间的杂交反应检测；
单链RNA分子或DNA分子的构象与折叠实时动态分析与检测；
单个核酸适配体分子的构象与动态分析；
单个核酸适配体分子与靶蛋白结合的动态分析；
以核酸适配体分子作为亲和配体和单分子信号传导，高灵敏检测蛋白质和其它靶分子；或
以抗体和其它亲和蛋白作为配基，高灵敏检测其它分子，如蛋白质、DNA、RNA、各种小分子化合物。
根据本发明的第三个方面，提供了一种使用上述的双色激光交替激发单分子成像检测装置的方法，包括：
通过双色光交替激发器激发两束不同波长的激光，作为激发光源；
通过声光可调谐滤波器使两束上述激光形成用于激发目标分子的交替激光；
通过光纤接收来自上述声光可调谐滤波器的交替激光；
通过照明器发射上述交替激光激发载物平台中的目标分子；
上述交替激光在上述载物平台进行全反射后，在上述载物平台上形成隠逝场，激发上述目标分子上标记的两种荧光染料产生荧光基团；
两种上述荧光染料发出的荧光基团共振转移形成的荧光共振能量转移信号；
通过荧光检测组件接收上述荧光共振能量转移信号；
通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像。
根据本发明的实施例，上述通过荧光检测组件接收上述荧光共振能量转移信号包括：
通过二向色镜分离两种上述荧光共振能量转移信号；
通过平行设置的单波段滤光片过滤上述荧光共振能量转移信号中的噪音。
从上述技术方案可以看出，本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用具有以下有益效果：
本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置，可在单分子水平上实现对两个相互作用分子的动态或者一个双链DNA分子两条互补链的配对与分离的实时检测与定量表征。已成功应用于同源重组过程的链交换实时分析，并可以排除DNA链交换事件中的假阳性结果。另外，该装置提高了对单分子荧光共振能量转移(smFRET)的准确测量，可识别极低的smFRET状态。可以用于同源重组等重要生物过程中的生物分析、检测与成像技术以及单分子动态研究。
附图说明
图1为本发明实施例双色激光交替激发单分子成像检测装置的结构示意图；
图2为本发明实施例微流室的结构示意图；
图3为本发明实施例使用的双色激光交替激发单分子成像检测装置的流程图；
图4为本发明实施例1单链DNA分子与同源的双链DNA分子间的链交换反应示意图；
图5为采用本发明实施例的检测装置识别实施例1中DNA链交换反应的信号曲线图；
图6为采用本发明实施例的检测装置识别实施例1中ATP水解促进链交换反应产物释放的信号曲线图；
图7为采用本发明实施例的检测装置实时观测实施例2不同长度ssDNA介导的链交换反应的曲线图；
图8为采用本发明实施例的检测装置表征实施例2中不同长度ssDNA介导的链交换反应效率图。
图中：
声光可调谐滤波器-1；
载物平台-2；
载玻片-21；
盖玻片-22；
连接结构-23；
双色光交替激发器-3；
反射镜-31；
二向色镜-32；
透镜-33；
荧光检测组件-4；
二向色镜-41；
单波段滤光片-42；
电子倍增电感耦合器件-43；
照明器-5；
倒置荧光显微镜-6。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
同源重组由一系列保守的同源重组酶催化完成，包括噬菌体的T4UvsX，古细菌的RadA，细菌的RecA，以及真核生物的Rad51和DMC1等。在真核生物中，Rad51主要负责DNA双链断裂的同源重组修复过程，而DMC1特异性地催化减数分裂过程中的同源重组。同源重组步骤繁多，需要多种蛋白质机器的参与，并受到精细的调控，其生物化学过程大致可以分为以下四个阶段：起始阶段、同源配对阶段、新链合成阶段和分离阶段。在起始阶段，双链断裂产生后，多种解旋酶和核酸酶作用于双链断裂末端，特异性切割双链DNA(dsDNA)，产生3’端突出的单链DNA(ssDNA)，并被单链DNA结合蛋白保护。在同源配对阶段，同源重组酶首先在一些辅助蛋白质的支持下替代结合于ssDNA上的蛋白质分子，在ssDNA区域协同组装形成核蛋白纤维丝。所形成的核蛋白纤维丝能够寻找并侵入同源的dsDNA区域，与之发生链交换反应，形成三链连接分子。在新链合成阶段，DNA聚合酶以完整的同源DNA链为模板，在断裂链的3’末端合成并延伸DNA链，并形成一种新的结构，即霍利迪交叉结构。在最后的分离阶段，解离酶(resolvase)或核酸酶将霍利迪交叉结构解开，形成两条独立的dsDNA分子。至此，同源重组得以完成。同源重组是生命起源、生物多样性以及疾病发生发展的分子基础，其各个精细过程的研究是当今的生命科学前沿领域。发展新的光学分析与研究手段是回答同源重组中重要科学问题的关键。
由于传统的分析技术获得的信息是基于所有分子测量的平均结果，大量特异的个体信息被掩盖，其难以揭示同源重组等许多复杂的生物学过程。而在基本的生命过程中，许多生物大分子都是通过单个或数个分子执行其特定功能。因此，在单分子水平上观测目标分子的结构与行为对于我们理解基本的生命过程至关重要。目前，已发展出多种单分子测量技术，大致可以分为两类：一是基于荧光及其光谱学的成像技术，主要包括单分子荧光成像技术(single-molecule fluorescence imaging)和单分子荧光共振能量转移技术(single-molecule fluorescence resonance energy transfer，smFRET)；二是基于力学的操纵和检测技术，主要包括光镊、磁镊和原子力显微镜等。
光学显微镜是生物医学领域不可或缺的研究工具，在基础研究与临床诊断中都发挥了重要作用。通过显微成像，我们不仅可以获得目标分子的存在及位置信息，还可以利用其偏振响应等特性推导目标分子的旋转和取向。由于荧光的发射波长比吸收波长更长，通过合理的光路设计，可以大幅降低背景的干扰，从而成为单分子成像的最佳选择。
目前发展了一种“DNA帘幕(DNA curtains)”技术，其可以将数千个长片段的DNA分子同时固定在经磷脂修饰的玻片表面，并利用流动的液体将这些DNA分子展开，形成DNA阵列，然后通过荧光显微镜实时观察目标蛋白在单个DNA分子上的作用情况。为了降低背景噪音的干扰，只观察DNA分子上的荧光共振能量转移信号，“DNA帘幕”实验通常是在全内反射荧光显微镜上完成。当激发光在玻片表面发生全反射后，会在另一面产生消逝场，并且其能量随空间距离呈指数衰减，因此其只能激发玻片表面极薄的一层(<200nm)内DNA分子的荧光共振能量转移信号。
当一个荧光分子(供体分子)的发射光谱与另一个荧光分子(受体分子)的激发光谱重叠，且它们的空间距离较近(<10nm)时，供体分子的发射能量可以激发受体分子发出荧光(波长更长)，同时其自身发射的荧光强度减弱，这种现象称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。FRET的效率与供体—受体分子的空间距离紧密相关，因此可以通过FRET表征同一分子的结构变化或不同分子之间的相互作用情况。Ha等将传统的整体FRET技术拓展到了单分子水平，发展了单分子FRET(smFRET)技术，使得实时观察单个分子的构象变化以及运动情况成为可能。与整体FRET测量相比，smFRET技术不仅可以观察到分子之间的异质性，确定多种构象的分布，还可以观察到一些短暂存在的中间状态以及不稳定状态，实时测量生化反应的动力学参数。
目前，现在采用的光学显微镜并非专用于实时观察单个分子的构象变化以及运动情况，在观察过程中一般采用其他专业显微镜进行观察。对于观察短暂存在的中间状态或不稳定状态无法进行精确测量，也难以同时获得两种或多种荧光信号并对其进行分析。因此需要一种专用于单分子FRET(smFRET)技术的成像检测装置。
根据本发明的第一个方面总体上的发明构思，提供了一种双色激光交替激发单分子成像检测装置，包括双色光交替激发器、声光可调谐滤波器1、载物平台2和荧光检测组件。
双色光交替激发器用于激发两束不同波长的激光作为激发光源。声光可调谐滤波器1适用于控制两束不同波长的激光交替激发形成交替激光并将交替激光耦合至一根光纤内。载物平台2用于放置包含被两种不同的荧光染料标记的目标分子的样品，通过交替激光激发目标分子的两种不同的荧光染料，使荧光染料响应发出荧光基团，荧光基团共振转移形成荧光共振能量转移信号。荧光检测组件用于接收目标分子被激发后产生的荧光共振能量转移信号，并通过电子倍增电感耦合器件43感应形成目标图像。其中，交替激光在载物平台2上形成隠逝场以降低背景光噪音干扰。荧光检测组件用于接收目标分子被激发后产生的荧光共振能量转移信号，并通过电子倍增电感耦合器件43感应形成目标图像。
根据本发明的实施例，激光可以选择532nm和647nm两种波长的激光，可同时激发目标分子中的两种荧光基团，如532nm激光激发荧光染料Cy3，647nm激光激发荧光染料Cy5。
本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置，可在单分子水平上实现对两个相互作用分子的动态或者一个双链DNA分子两条互补链的配对与分离的实时检测与定量表征。已成功应用于同源重组过程的链交换实时分析，并可以排除DNA链交换事件中的假阳性结果。另外，该装置提高了对单分子荧光共振能量转移(smFRET)的准确测量，可识别极低的smFRET状态。可以用于同源重组等重要生物过程中的生物分析、检测与成像技术以及单分子动态研究。
根据本发明的实施例，可以采用安装在计算机中的Micro-Manager-1.4软件控制双色光交替激发器、声光可调谐滤波器1、照明器5和荧光检测组件的工作。
图1为本发明实施例双色激光交替激发单分子成像检测装置的结构示意图。
根据本发明的实施例，如图1所示，检测装置还包括倒置荧光显微镜6，倒置荧光显微镜6设置于载物平台2下侧，用于将交替激光聚焦于载物平台2的盖玻片22，或将荧光共振能量转移信号从载物平台2引出。
根据本发明的实施例，检测装置还包括照明器5，照明器5通过光纤与声光可调谐滤波器1连接，用于接收来自声光可调谐滤波器1的交替激光，并发射所述交替激光激发目标分子。
根据本发明的实施例，双色光交替激发器包括：激光源、反射镜31、二向色镜32和透镜33。激光源，用于发出两束不同波长的激光。反射镜31和二向色镜32，用于将激光源发出的激光反射进光路中。透镜33，用于将两束激光聚焦至声光可调谐滤波器1。
根据本发明的实施例，还可以在光路中设置声光偏转器，可使两束激光交替通过该器件，从而实现不同波长的两束激光交替激发目标分子。
根据本发明的实施例，荧光检测组件包括：二向色镜41和两个单波段滤光片42。二向色镜41，用于分离荧光共振能量转移信号，得到两种不同波长的荧光激光。两个单波段滤光片42，平行设置于电子倍增电感耦合器件4343和二向色镜32之间，用于过滤荧光激光的噪音。
在双色激光交替激发单分子成像检测装置中，将两束不同波长的激光(532nm和647nm)与声光可调谐滤波器1(acousto-optical tunable filter，AOTF)进行耦合，通过AOTF可以控制不同波长的激光进行交替激发，与AOTF耦合后的激光只需要通过一根光纤和照明器5与物镜型全内反射荧光(total internal reflection fluorescent,TIRF)显微镜的光路连接。交替激发的激光通过TIRF照明器5和倒置荧光显微镜的物镜聚焦至微流腔室中的盖玻片22，通过TIRF照明器5调节激光照射的角度，利用激光全反射后在介质的另一面产生隠逝场，由于激发光呈指数衰减，只有极靠近全内反射面的样本区域内的荧光分子被激发产生200nm以下的荧光，并且大大降低了背景光噪音干扰，提高了单分子检测的分辨率。固定在盖玻片22表面的样品被激发产生的荧光信号，首先通过一个二向色镜32分离，再分别经过两个平行的带通滤光片过滤后的荧光信号被电子倍增电感耦合器件43(electronmultiplying charge coupled device，EMCCD)采集并记录在计算机上。
图2为本发明实施例微流室的结构示意图。
根据本发明的实施例，如图2所示，微流室包括：由载玻片21和PEG修饰的盖玻片22组合成的用于样品留存的腔室，微流室的高度为连接结构23的高度。
根据本发明的实施例，载玻片21包括进样孔和输出孔，输出孔通过导管连接有注射器。
根据本发明的实施例，链接结构可以为双面胶、胶黏剂等等。
微流室的作用是可以通过溶液引入目标分子，以便实时观察探针分子与靶分子相互作用信息。双面胶的作用是将处理后的盖玻片22和载玻片21粘贴在一起提供一个反应的腔室。PEG是中性的并且具有良好的生物兼容性，修饰的目的使玻片表面钝化，减少生物分子等杂质在表面吸附，降低对单分子检测的干扰，提高检测信号。
根据本发明的实施例，微流室内包括目标分子和成像缓冲液。
目标分子包括被两种不同的荧光染料标记的探针分子与靶分子。
成像缓冲液用于引入目标分子，其主要由除氧系统和还原剂组成，成分包括D-葡糖糖、葡糖糖氧化酶、过氧化氢酶和水溶性维生素E。
根据本发明的实施例，优选的，成像缓冲液可以包括D-葡糖糖(8mg/mL)、葡糖糖氧化酶(1mg/mL)、过氧化氢酶(0.04mg/mL)和水溶性维生素E(>3mM)。
根据本发明的第二个方面总体上的发明构思，提供了一种的双色激光交替激发单分子成像检测装置在鉴定生物链交换过程中目标分子的捕获与反应的启动中的应用。
根据本发明的实施例，其中，包括以下方面的应用：双链DNA分子或RNA分子的链分离检测；一个单链DNA分子与一个双链DNA中互补链的重组反应检测；一个单链RNA分子与一个双链DNA中互补链的重组反应检测；重组反应检测或链分离检测中的DNA链的捕获、反应的启动与结束等过程的准确鉴定；两个单链DNA分子或单链RNA分子间的杂交反应检测；一个单链RNA分子与一个单链DNA分子间的杂交反应检测；单链RNA分子或DNA分子的构象与折叠实时动态分析与检测；单个核酸适配体分子的构象与动态分析；单个核酸适配体分子与靶蛋白结合的动态分析；以核酸适配体分子作为亲和配体和单分子信号传导，高灵敏检测蛋白质和其它靶分子；或以抗体和其它亲和蛋白作为配基，高灵敏检测其它分子，如蛋白质、DNA、RNA、各种小分子化合物。
本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置，可在单分子水平上实现对两个相互作用分子的动态或者一个双链DNA分子两条互补链的配对与分离的实时检测与定量表征。已成功应用于同源重组过程的链交换实时分析，并可以排除DNA链交换事件中的假阳性结果。另外，该装置提高了对单分子荧光共振能量转移(smFRET)的准确测量，可识别极低的smFRET状态。可以用于同源重组等重要生物过程中的生物分析、检测与成像技术以及单分子动态研究。
本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置可同时激发目标分子中的两种荧光基团，如532nm激光激发荧光染料Cy3，647nm激光激发荧光染料Cy5；可同时检测两种受激发荧光基团发射不同波长的荧光；可同时检测两种荧光基团发生的荧光共振能量转移(FRET)信号；消除了荧光共振能量转移(FRET)产生的荧光共振能量转移信号与其它荧光共振能量转移信号的相互干扰；可鉴定生物过程如链交换的发生、发展与结束，例如目标分子的捕获与反应的启动。
图3为本发明实施例使用的双色激光交替激发单分子成像检测装置的流程图。
根据本发明的第三个方面总体上的发明构思，如图3所示，提供了一种使用的双色激光交替激发单分子成像检测装置的方法，包括操作S1～操作S8。
S1：通过双色光交替激发器激发两束不同波长的激光，作为激发光源。
S2：通过声光可调谐滤波器1使两束激光形成用于激发目标分子的交替激光。
S3：通过光纤接收来自声光可调谐滤波器1的交替激光。
S4：通过照明器5发射交替激光激发载物平台2中的目标分子。
S5：交替激光在载物平台2进行全反射后，在载物平台2上形成隠逝场，激发目标分子上标记的两种荧光染料产生荧光基团。
S6：两种荧光染料发出的荧光基团共振转移形成的荧光共振能量转移信号。
S7：通过荧光检测组件接收荧光共振能量转移信号。
S8：通过电子倍增电感耦合器件43感应形成目标图像。
双色交替激发(two-color alternating excitation，TCAE)单分子荧光成像技术，并将其成功应用于DNA链交换反应的实时动态监测。将Cy3和Cy5分别标记在供体dsDNA的两条链上，通过在532nm和647nm交替激发可以实时观察链交换的全部过程，从最初的供体捕获直到最后被替换链的释放。通过这种交替激发的模式，可以实现在单分子水平上从假阳性的信号中识别成功的链交换事件。
根据本发明的实施例，其中，通过荧光检测组件接收荧光共振能量转移信号包括操作S701～操作S702。
S701：通过二向色镜32分离两种荧光共振能量转移信号。
S702：通过平行设置的单波段滤光片过滤荧光共振能量转移信号中的噪音。
以下通过较佳实施例来对本发明的技术方案作详细说明，需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。
实施例1：
图4为本发明实施例单链DNA分子与同源的双链DNA分子间的链交换反应示意图。
采用本发明实施例提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置对单链DNA分子与同源的双链DNA分子间进行链交换反应进行识别。
1、制备微流室内的目标样品
将载玻片和PEG修饰的盖玻片通过双面胶黏结组合成的用于样品留存的腔室。
向该腔室内加入包含目标分子的成像缓冲液。
成像缓冲液为D-葡糖糖(8mg/mL)、葡糖糖氧化酶(1mg/mL)、过氧化氢酶(0.04mg/mL)和水溶性维生素E(>3mM)。
目标分子包括相同长度的单链DNA分子(ssDNA)与同源的双链DNA(dsDNA)。
其中双链DNA(dsDNA)的两个链段分别用荧光染料Cy3和Cy5进行标记。
成像缓冲液中还包括用于单链DNA分子(ssDNA)与同源的双链DNA(dsDNA)进行组装的同源重组酶(RecA)。
该反应过程包括：同源重组酶RecA在ssDNA上组装形成核蛋白丝；
核蛋白丝会与同源的dsDNA结合暂时形成三链复合物；
核蛋白丝的ssDNA与同源dsDNA上的互补链配对形成新的异源的双链DNA；
而同源dsDNA中另一条与单链DNA分子(ssDNA)相同的被替换链与核蛋白丝在发生链交换反应后被释放。
2、采用本双色激光交替激发单分子成像检测装置对链交换反应的反应过程进行表征
采用激光可以选择532nm和647nm两种波长的激光，可同时激发目标分子中的两种荧光基团，532nm激光激发荧光染料Cy3，647nm激光激发荧光染料Cy5。
(1)DNA链交换反应过程中的信号识别
图5为采用本发明实施例的检测装置识别实施例1中DNA链交换反应的信号曲线图。
采用本发明实施例的检测装置识别DNA链交换反应过程中核蛋白丝捕获同源的dsDNA结合暂时形成三链复合物时的信号曲线，以及成功的DNA链交换反应后的信号曲线，其结果如图5所示。
图5(A)中示出了同源dsDNA的短暂捕获获得的信号曲线。箭头所指表示Cy5信号的消失，即互补链被同源dsDNA中另一条与单链DNA分子(ssDNA)相同的被替换链与核蛋白丝在发生链交换反应后被释放形成的信号变化。图5(B)中示出了成功的DNA链交换反应获得的信号。
由此可知，通过本发明提供的检测装置能够实时识别出DNA链交换反应过程中的信号变化。
(2)ATP水解促进链交换反应过程中的信号识别
图6为采用本发明实施例的检测装置识别实施例1中ATP水解促进链交换反应产物释放的信号曲线图。
采用本发明实施例的检测装置识别ATP水解促进链交换反应以及未发生链交换反应过程中的信号，其结果如图6所示。
图6中(A)示出了ATP水解条件下获得的典型信号曲线。箭头所指表示被替换链的释放。(B)示出了在缺乏ATP水解时获得的典型信号曲线。(C)示出了截取自10min链交换以后Cy5通道的代表性照片(24μm×24μm)。
在波长532nm的图片中，箭头表示被捕获但是没有发生完全链分离的供体ds93分子，此处Cy5信号在532nm激发；
在波长647nm的图片中，Cy5信号只能在647nm激发箭头表示被捕获并且成功发生链分离的供体ds93分子，此处Cy5信号只能在647nm激发。
图6中(D)示出了三个不同成像区域(82μm×41μm)捕获的Cy5信号数目的统计结果，由此可知，通过本发明提供的检测装置能够实时识别出ATP水解促进链交换反应过程中的信号变化。
实施例2：
1、制备微流室内的目标样品
其制备过程与实施例1相同，不同的是，采用不同长度的单链DNA分子(ssDNA)与同源的双链DNA(dsDNA)。
2、采用本双色激光交替激发单分子成像检测装置对链交换反应的反应过程进行表征
采用激光可以选择532nm和647nm两种波长的激光，可同时激发目标分子中的两种荧光基团，532nm激光激发荧光染料Cy3，647nm激光激发荧光染料Cy5。
(1)不同长度ssDNA介导的链交换反应过程中的信号识别
图7为采用本发明实施例的检测装置实时观测实施例2不同长度ssDNA介导的链交换反应的曲线图。
采用本发明实施例的检测装置识别不同长度ssDNA介导的链交换反应以及未发生链交换反应过程中的信号，其结果如图7所示。
图7中(A)示出了不同长度ssDNA介导的链交换反应中短链的单分子DNA链交换实验方案示意图。(B–D)供体ds93分别与同源的ss93(B)、ss83(C)或ss73(D)发生链交换时的代表性荧光共振能量转移信号和FRET效率时间曲线。左侧实箭头表示供体ds93的捕获，右侧虚箭头表示同源链链的释放。Δt表示三链联会体的寿命(即发生链交换需要的时间)。(E)链交换反应所需时间分布情况。由此可知，通过本发明提供的检测装置能够实时识别出不同长度ssDNA介导的链交换反应过程中的信号变化。
(2)DNA链交换反应过程中的信号识别
图8为采用本发明实施例的检测装置表征实施例2中不同长度ssDNA介导的链交换反应效率图。
图8中(A)示出了经过10min的链交换反应(左侧两栏)或另外的30min SacI切割(最右侧一栏)后获得的Cy5通道荧光图像。在波长532nm的图片中，箭头表示被捕获但是没有发生完全链分离的供体ds93分子，此处Cy5信号在532nm激发。
在波长647nm的图片中，Cy5信号只能在647nm激发箭头表示被捕获并且成功发生链分离的供体ds93分子，此处Cy5信号只能在647nm激发。图8(B)示出了利用不同长度ssDNA捕获供体ds93分子数量的统计结果。数据代表从六个不同成像区域(82μm×41μm)统计的平均值及标准差。
由此可知，通过本发明提供的检测装置能够实时识别出DNA链交换反应过程中的信号变化。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双色激光交替激发单分子成像检测装置，包括：
双色光交替激发器，用于激发两束不同波长的激光作为激发光源；
声光可调谐滤波器，适用于控制两束不同波长的激光交替激发形成交替激光并将所述交替激光耦合至一根光纤内；
载物平台，用于放置包含被两种不同的荧光染料标记的目标分子的样品，通过所述交替激光激发所述目标分子的两种不同的所述荧光染料，使所述荧光染料响应发出荧光基团，所述荧光基团共振转移形成荧光共振能量转移信号；
荧光检测组件，用于接收所述目标分子被激发后产生的荧光共振能量转移信号，并通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像；
其中，所述交替激光在所述载物平台上形成隠逝场以降低背景光噪音干扰。
2.根据权利要求1所述的检测装置，其中，所述微流室包括：
由载玻片和PEG修饰的盖玻片组合成的用于样品留存的腔室，所述微流室的高度为连接结构的高度；
其中，所述载玻片包括进样孔和输出孔，所述输出孔通过导管连接有注射器。
3.根据权利要求2所述的检测装置，其中，所述微流室内包括：
目标分子，包括被两种不同的荧光染料标记的探针分子与靶分子；
成像缓冲液，用于引入目标分子，包括除氧系统和还原剂组成，所述成像缓冲液成分包括D-葡糖糖、葡糖糖氧化酶、过氧化氢酶和水溶性维生素E。
4.根据权利要求2所述的检测装置，其中，还包括：
倒置荧光显微镜，所述倒置荧光显微镜设置于所述载物平台下侧，用于将所述交替激光聚焦于所述载物平台的盖玻片，或将所述荧光共振能量转移信号从所述载物平台引出；
照明器，通过光纤与所述声光可调谐滤波器连接，用于接收来自所述声光可调谐滤波器的交替激光，并发射所述交替激光激发目标分子。
5.根据权利要求1所述的检测装置，其中，
所述双色光交替激发器包括：
激光源，用于发出两束不同波长的所述激光；
反射镜和二向色镜，用于将所述激光源发出的激光反射进所述光路中；
透镜，用于将两束所述激光聚焦至所述声光可调谐滤波器。
6.根据权利要求1所述的检测装置，其中，所述荧光检测组件包括：
二向色镜，用于分离所述荧光共振能量转移信号，得到两种不同波长的荧光激光；
两个单波段滤光片，平行设置于电子倍增电感耦合器件和所述二向色镜之间，用于过滤所述荧光激光的噪音。
7.一种权利要求1-6任一所述的双色激光交替激发单分子成像检测装置在鉴定生物链交换过程中目标分子的捕获与反应的启动中的应用。
8.根据权利要求7所述的检测装置的应用，其中，包括以下方面的应用：
双链DNA分子或RNA分子的链分离检测；
一个单链DNA分子与一个双链DNA中互补链的重组反应检测；
一个单链RNA分子与一个双链DNA中互补链的重组反应检测；
重组反应检测或链分离检测中的DNA链的捕获、反应的启动与结束等过程的准确鉴定；
两个单链DNA分子或单链RNA分子间的杂交反应检测；
一个单链RNA分子与一个单链DNA分子间的杂交反应检测；
单链RNA分子或DNA分子的构象与折叠实时动态分析与检测；
单个核酸适配体分子的构象与动态分析；
单个核酸适配体分子与靶蛋白结合的动态分析；
以核酸适配体分子作为亲和配体和单分子信号传导，高灵敏检测蛋白质和其它靶分子；或
以抗体和其它亲和蛋白作为配基，高灵敏检测其它分子，如蛋白质、DNA、RNA、各种小分子化合物。
9.一种使用权利要求1-6任一所述的双色激光交替激发单分子成像检测装置的方法，包括：
通过双色光交替激发器激发两束不同波长的激光，作为激发光源；
通过声光可调谐滤波器使两束所述激光形成用于激发目标分子的交替激光；
通过光纤接收来自所述声光可调谐滤波器的交替激光；
通过照明器发射所述交替激光激发载物平台中的目标分子；
所述交替激光在所述载物平台进行全反射后，在所述载物平台上形成隠逝场，激发所述目标分子上标记的两种荧光染料产生荧光基团；
两种所述荧光染料发出的荧光基团共振转移形成的荧光共振能量转移信号；
通过荧光检测组件接收所述荧光共振能量转移信号；
通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述通过荧光检测组件接收所述荧光共振能量转移信号包括：
通过二向色镜分离两种所述荧光共振能量转移信号；
通过平行设置的单波段滤光片过滤所述荧光共振能量转移信号中的噪音。
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|---|---|---|---|
| CN202310604676.0A CN116858812A (zh) | 2023-05-26 | 2023-05-26 | 双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117969457A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种双色消逝场散射成像装置、水样中铅离子浓度的检测方法 |
-
2023
- 2023-05-26 CN CN202310604676.0A patent/CN116858812A/zh active Pending
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