CN116836973A - 一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，先采用β‑乙腈亚磷酰胺合成带有T7启动子的oligo DNA双链片段；再以带有T7启动子的oligo DNA双链片段为模板，体外转录合成oligo RNA。本申请首创了获得5’端带3磷酸的oligo RNA的方法，操作快捷简便，纯度高，对RNA序列、长度等无特殊要求。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法。
背景技术
oligo RNA是指人工设计的短片段RNA，通常由十几到几十个核糖核苷酸组成，经常作为引物或探针，应用于测序、DNA微阵列、FISH等技术，在生物学研究和生物医药领域发挥着重要角色。
oligo RNA的体外合成通常采用磷酸三酯法或亚磷酸三酯法，其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3’末端核苷先固定在一个不溶性的高分子上面，然后再从此末端核苷开始，逐步接长，每接长一个经历一次循环，最后将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需的产物。由于核苷酸是一个多官能团的化合物，在化学合成RNA中，必须将不希望发生反应的基团保护起来，因此核糖核苷酸5’位连接的始终是保护基团而非3磷酸基团，因此导致最终产物脱去保护基团后5’端不含有3磷酸基团，也就是说，现有技术中采用化学合成的方式还无法合成5’端带3磷酸的oligo RNA。同时，传统IVT体外转录实验室以超螺旋质粒为酶切线性化之后为模板，转录得到大片段的RNA，该模板需要质粒发酵制备，线性化等步骤，过程繁琐成本高。
发明内容
为了高效合成oligo RNA，本申请提供一种5’端带3磷酸的oligo制备方法。
本申请提供一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，采用如下技术方案:
S1、采用β-乙腈亚磷酰胺合成带有T7启动子的oligo DNA双链片段；
S2、以带有T7启动子的oligo DNA双链片段为模板，体外转录合成oligo RNA。
上述技术方案通过设计合成短序列的模板用于IVT转录实验，直接转录得到带5’端带3磷酸的oligo RNA，可节省大量的原料成本，缩减过程，简便、高效。
优选的，所述oligo DNA双链片段序列为如SEQ ID NO:2所示的序列，或为与SEQID NO:2所示的序列具有80％、90％、95％或98％同源性的序列。
SEQ ID NO:2
ATCGAAATTAATACGACTCACTATAAGGTCTTCTGGTCCCCACAGACTCA
优选的，所述oligo RNA序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，或为与SEQ ID NO:1所示的序列具有80％、90％、95％或98％同源性的序列。
SEQ ID NO:1
ppp-UCCAGAAGACCAGGGGUGUCUGAGU
优选的，所述步骤S2中加入T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂和NTP，进行体外转录，合成oligo RNA。
优选的，加入DNaseⅠ消化去除模板DNA，用RNA磁珠进行回收。
优选的，所述步骤S2合成oligo RNA后对产物进行纯化，分离出单一长度的oligoRNA产物。
优选的，通过HPLC对产物进行纯化。
进一步优选的，所述进行纯化的色谱柱采用DANPacTMRP，4.6*50mm，4m。
进一步优选的，所述进行纯化流动相A：100mM TEAA in Water；流动相B：100mMTEAA-75％Water/15％甲醇/10％乙醇(v/v/v)。
进一步优选的，所述进行纯化柱温：80℃；流速：0.4mL/min。
优选的，纯化后验证产物的均一性和纯度。
优选的，通过HPLC-MS验证产物的均一性和纯度。
进一步优选的，所述HPLC采用ACQUITY Oligonucleaotide BEHC18Colume 2.1*100mm,1.7μm。
进一步优选的，所述HPLC流动相A：8mM TEA-200mM HFIP-Water；流动相B：甲醇。
进一步优选的，所述HPLC柱温：50℃；流速：0.3mL/min。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请首创了获得5’端带3磷酸的oligo RNA的方法，是一种新型oligo RNA的合成方法，操作快捷简便，成本低，产量大，纯度高，对RNA序列、长度等无特殊要求，适用范围广。
附图说明
图1为oligo RNA液相分离图谱；
图2为制备纯化产物质谱鉴定结果；
图3为组分1质谱鉴定去卷积图谱；
图4为组分2质谱鉴定去卷积图谱；
图5为组分3质谱鉴定去卷积图谱；
图6为组分4质谱鉴定去卷积图谱。
具体实施方式
以下实施例、对比例涉及的所有原料成分均为市售购买。
T7 RNA polymease，Yeasen(上海翌圣生物科技有限公司)，货号：10626-A；10*Transcription buffer，Yeasen，货号：10626-B；
RNase抑制剂，Yeasen，货号：10603ES05；
无机焦磷酸酶，Yeasen，货号：10658ES60；
4种NTP(ATP，Synthgene(江苏申基生物科技有限公司)，货号：ATP001；GTP，Synthgene，货号GTP001；CTP，Synthgene，货号CTP001；N-me-pUTP，Synthgene，货号：NMPUTP001)；
DNaseⅠ(脱氧核糖核酸酶Ⅰ)，Yeasen，货号：10611ES84；
DEPC水，源叶生物，货号：S30710-500ml；
RNA磁珠，Yeasen，货号：12602ES56。
(一)合成带有T7启动子的oligo DNA双链片段
采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA，合成时从3'→5'方向进行，通常3'端的第一个碱基结合在Glass担体(Controlled Pore Glass，CPG)上。合成的详细过程如下：
1.Step1：脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5'-OH基团上的保护基(DMTr)，准备附加下一个新的碱基；
2.Step2：活化新的碱基单体(Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应；
3.Step3：第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应；
4.Step4：将没有反应的第一个碱基的5'-OH加帽封死(Capping)，使其不再进一步参与反应；5.Step5：将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即将三价磷氧化成五价磷)。
6.重复进行Step1～Step5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列。
7.合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。
表1模板序列
(二)以合成的DNA双链作为模板进行体外转录反应。
按下表配置IVT反应体系，在200μl EP管中，先加入DEPC水、10*Transcriptionbuffer和4种NTP，涡旋混匀后再加入两种酶和RNase抑制剂，最后加入DNA模板，混匀。
表2体外转录条件
PCR仪中37℃反应4h，结束后向体系中加入10μl DNaseⅠ，涡旋混匀，再在PCR仪中37℃反应15min，用RNA磁珠进行回收。
(三)将得到的oligo RNA进行HPLC纯化。
使用设置好的方法参数对空白样品进行上样平衡，待系统稳定后开始上样分离uncap oligo粗品，对色谱图中10-20min范围内的每一个色谱峰信号进行单个收集。将收集到的各个组分溶液送于LC-MS进行定性分析，确认目标uncap oligo的结构及其对应的组分。待目标uncap oligo的结构及其对应的组分确认后即可开始对其相应出峰顺序的目标馏分进行持续地上样收集。将收集过程中的馏分暂存于2-8℃条件，将每天收集的馏分至于-20℃条件保存，尽量避免反复冻融Oligo样品。
表3纯化条件
(四)检测手段：通过HPLC-MS检测产物的均一性和分子量大小将HPLC纯化收集到的产物使用10mM EDTA水溶液稀释后按照以下设定好的方法参数进行进样分析
1.HPLC方法：
表4HPLC条件
2.MS条件：
表5 MS条件
3.通过BioPharma Finder 5.0软件进行分子量计算。
将体外转录得到的oligo RNA产物进行液相色谱分离，在保留时间10-20 min得到四个感兴趣组分(图1 oligo RNA液相分离图谱中)，结果如图1所示，分别对四个组分进行收集，鉴定结果如下表，
表6组分1质谱鉴定结果
表7组分2质谱鉴定结果
表8组分3质谱鉴定结果
表9组分4质谱鉴定结果
对组分2的质谱上样结果进行进一步的结构分析，通过对目标产物及其对应加合信好的分子量进行计算，与质谱实际检测到的分子量进行匹配，匹配误差在10ppm以内认为可信度高，确认质量数为8214.060的组分为ppp-UCCAGAAGACCAGGGGUGUCUGAGU对应分子量，同时有检测到目标产物的加Na+、K+、Fe+等加和离子信号。8214.060分子量为目标序列未加合的分量大小，同时有多个以该分子量为基础且匹配误差小于10ppm的Na+、K+、Fe+信号被检测到，充分证明该匹配结果准确可靠，进一步确认了鉴定结果的可靠性。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用β-乙腈亚磷酰胺合成带有T7启动子的oligo DNA双链片段；
S2、以带有T7启动子的oligo DNA双链片段为模板，体外转录合成oligo RNA。
2.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，所述oligo DNA双链片段序列为如SEQ ID NO:2所示的序列，或为与SEQ ID NO:2所示的序列具有80%、90%、95%或98%同源性的序列。
3.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，所述oligo RNA序列为如SEQ ID NO:1所示的序列，或为与SEQ ID NO:1所示的序列具有80%、90%、95%或98%同源性的序列。
4.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中加入T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂和NTP，进行体外转录，合成oligoRNA。
5.根据权利要求4所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，加入DNaseⅠ消化去除模板DNA，用RNA磁珠进行回收。
6.根据权利要求1所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，所述步骤S2合成oligo RNA后对产物进行纯化，分离出单一长度的oligo RNA产物。
7.根据权利要求6所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，通过HPLC对产物进行纯化。
8.根据权利要求7所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，纯化后验证产物的均一性和纯度。
9.根据权利要求8所述的5’端带3磷酸的oligo RNA的制备方法，其特征在于，通过HPLC-MS验证产物的均一性和纯度。
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| CN107805636A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-03-16 | 山东大学 | 一种双功能5′‑tri‑phosphate siGPC‑3及制备方法与应用 |
| KR20220100392A (ko) * | 2021-01-08 | 2022-07-15 | 한국생명공학연구원 | 5'-삼인산올리고아데닐레이트 제조방법 |
-
2023
- 2023-06-20 CN CN202310734755.3A patent/CN116836973A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BARONTI, L.,: "A guide to large-scale RNA sample preparation", 《 ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 410, no. 14, pages 3239 - 3252, XP036509412, DOI: 10.1007/s00216-018-0943-8 * |
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