CN116836955B - 末端脱氧核苷酸转移酶及其制备方法 - Google Patents
末端脱氧核苷酸转移酶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种末端脱氧核苷酸转移酶及其制备方法，制备方法包括步骤：提供野生型末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其具有N端和C端；选取野生型TdT Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割，生成两段氨基酸序列；利用柔性氨基酸连接子将所述两段氨基酸序列连接起来，并使得柔性氨基酸连接子的一端与野生型TdT原有的N端相连，另一端与野生型TdT原有的C端相连，得到具有新的N端和C端的末端脱氧核苷酸转移酶突变体。本发明中通过不同切割位点的选择，可以获得一系列不同的具有新的N端和C端的TdT突变体，为TdT的蛋白质工程提供了更加丰富的C端和N端选择，进而丰富了TdT上实现的蛋白质修饰操作和效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶及其制备方法。
背景技术
人工DNA合成技术是现代基因技术的重要基础。DNA人工合成的关键方法包括：柱式化学寡核苷酸合成、芯片化学寡核苷酸合成、寡核苷酸纯化、寡核苷酸拼装、基因合成纠错与克隆筛选、大片段基因合成组装以及DNA的新一代酶法合成。DNA人工合成的传统方法大多依赖亚磷酰胺化学完成反应，近年来以酶促合成为原理的第三代DNA人工合成逐渐崛起，成为前景广阔的DNA人工合成方法，其中以末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)为核心的酶促合成技术是极具前景的DNA合成策略。
新型核苷酸酶促合成法是利用非模版依赖性的TdT进行体外的寡核苷酸片段合成，即TdT是生物酶促法合成寡聚核苷酸的重要工具。TdT最先由Bollum发现并提出该酶可用于单链寡核苷酸的合成，随后Schott和Schrade研究发现，TdT对四种核苷酸的偏好性差异小、偶联效率高，持续合成和延伸单链DNA可产生长达8000nt的均聚物。为了实现TdT催化的可控DNA合成，TdT的活性需要被可逆控制。Keasling团队在2018年构建的TdT催化活性控制机制，利用TdT与单个核苷酸的可逆共价键链接，来阻止TdT催化合成的DNA链的进一步延伸。当该可逆共价键链接断裂后，DNA链便可进入新的核苷酸添加循环。该方法平均偶联效率可达97.7％，单个循环需2～3min。基于创新TdT的DNA合成得到了学术界和工业界的普遍关注。
由于TdT越发显著的DNA合成应用，针对TdT开展酶工程设计以实现TdT酶活性的灵活调控意义逐渐凸显。TdT的新型嵌合体有望实现DNA的可控酶促合成，而针对TdT设计额外的酶活性调控功能(如二聚功能，酶活性的条件控制功能，活性位点的构象调控功能等)多依赖在TdT的C端或者N端添加额外的功能基团或蛋白结构域，该类功能基团或蛋白结构域可实现的调控效果又极大程度地依赖TdT的C端或者N端(即额外功能基团的添加点)同TdT活性位点或关键结构域的相对位置。但现有TdT多为天然来源(如小鼠、牛、鸟类来源等)的野生型TdT，而野生型TdT的C端和N端构象、C端或者N端与活性位点的距离、C端或者N端的修饰对TdT活性位点的调控能力等相对固定，极大地限制了TdT后续潜在的蛋白质工程操作的选择性，限制了可在TdT上实现的蛋白质修饰操作和效果。因此开发具有多样化构象的C端和N端的TdT十分必要。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种TdT及其制备方法，旨在解决现有野生型TdT的C端和N端构象相对固定，极大地限制了可在TdT上实现的蛋白质修饰操作和效果的问题。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种TdT的制备方法，其中，包括步骤：
提供野生型TdT，其具有N端和C端；
选取所述野生型TdT Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割，生成两段氨基酸序列；
利用柔性氨基酸连接子将所述两段氨基酸序列连接起来，并使得所述柔性氨基酸连接子的一端与所述野生型TdT原有的N端相连，另一端与所述野生型TdT原有的C端相连，得到具有新的N端和C端的TdT突变体。
可选地，所述柔性氨基酸连接子的氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列重复构建而成的8-10个氨基酸残基构成。
可选地，所述柔性氨基酸连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
可选地，所述选取所述野生型TdT Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割的步骤具体包括：
删除所述野生型TdT中没有催化功能的氨基酸后，确定所述野生型TdT三维结构中的若干个Loop区域，从原有的N端开始，依次在若干个Loop区域中选取氨基酸位点作为切割位点进行切割。
可选地，所述野生型TdT选自小鼠来源的野生型TdT、牛来源的野生型TdT、鸟类来源的野生型TdT中的一种。
可选地，所述野生型TdT选自鸟类来源的野生型TdT，所述鸟类来源的野生型TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
可选地，所述没有催化功能的氨基酸为1-146号氨基酸。
可选地，所述鸟类来源的野生型TdT中作为切割位点的氨基酸位点选自以下氨基酸位点中的一个：
212G、213L、214P、215C、216V、217G、218D、219Q、220V、221R、350P、351G、352P、353R、354E、355D、356D、357E、358L、359L。
本发明的第二方面，提供一种TdT突变体，其中，采用本发明如上所述的制备方法制备得到。
本发明的第三方面，提供一种TdT突变体，其中，所述TdT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示。
有益效果：本发明选取野生型TdT的Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割，生成分别含有新的N端和新的C端的两段氨基酸序列，然后利用柔性氨基酸连接子将所述两段氨基酸序列连接起来，并使得所述柔性氨基酸连接子的一端与所述野生型TdT原有的N端相连，另一端与所述野生型TdT原有的C端相连，得到具有新的N端和C端的TdT突变体。本发明中通过不同切割位点的选择，可以获得一系列不同的具有新的N端和C端的TdT突变体，为TdT的蛋白质工程提供了更加丰富的C端和N端选择，进而丰富了在TdT上的蛋白质修饰操作和效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中TdT突变体的构建示意图。
图2为本发明实施例1中TdT突变体新的N端和C端所在位点示意图。
图3为本发明实施例2中不同TdT突变体的SDS-PAGE蛋白质胶图。
图4为本发明实施例2中不同TdT突变体反应活性的变性尿素PAGE蛋白质胶图。
图5为本发明实施例2中wt ZaTdT、cpTdT 0.1和cpTdT 0.7的酶催化速率结果图。
具体实施方式
本发明提供一种TdT及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
TdT是生物酶促法合成寡聚核苷酸的重要工具，但是现有TdT多为天然来源(如小鼠、牛、鸟类来源等)的野生型TdT，具有天然的C和N端构象。但是天然的C和N端构象相对固定，极大地限制了野生型TdT后续潜在的蛋白质工程操作的选择性，限制了可在TdT上实现的蛋白质修饰操作和效果。基于此，本发明实施例提供一种TdT突变体的制备方法，其中，包括步骤：
S1、提供野生型TdT，其具有N端和C端；
S2、选取所述野生型TdT Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割，生成两段氨基酸序列；
S3、利用柔性氨基酸连接子将所述两段氨基酸序列连接起来，并使得所述柔性氨基酸连接子的一端与所述野生型TdT原有的N端相连，另一端与所述野生型TdT原有的C端相连，得到具有新的N端和C端的TdT突变体。
本发明选取野生型TdT的Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割，生成分别含有新的N端和新的C端的两段氨基酸序列(其中一段氨基酸序列具有野生型TdT原有的C端和切割后生成的新的N端，另一段氨基酸序列具有野生型TdT原有的N端和切割后生成的新的C端)后，利用柔性氨基酸连接子将所述两段氨基酸序列连接起来，并使得所述柔性氨基酸连接子的一端与所述野生型TdT原有的N端相连，另一端与所述野生型TdT原有的C端相连，得到具有新的N端和C端的TdT突变体。本发明可通过不同切割位点的选择，利用循环排列(circular permutation)方法对TdT的蛋白质一级结构进行循环排列，可以获得一系列不同的具有新的N端和C端的TdT突变体，用于进一步的研究，为TdT的蛋白质工程提供了更加丰富的C端和N端选择，进而丰富了在TdT上的蛋白质修饰操作和效果。
此外，仅就催化活性来说，还可以将获得的一系列具有新的N端和C端的TdT突变体的催化活性进行研究，以筛选出具有催化活性的TdT突变体(cpTdT突变体)。
本实施例中选取TdT的Loop区域的氨基酸位点作为切割位点，而不选取a-helix及B-sheet二级结构区域的氨基酸位点作为切割位点，以避免破坏蛋白稳定性。
在一些实施方式中，所述柔性氨基酸连接子的氨基酸序列由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列重复构建而成的8-10个氨基酸残基构成。
在一些实施方式中，所述柔性氨基酸连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本实施方式中用柔性氨基酸连接子(如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，具体为GTGGSGGTGG)将野生型TdT的C端和N端连接融合起来，形成具有新的C端和N端的完整的TdT突变体。
在一些实施方式中，所述选取所述野生型TdT Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割的步骤具体包括：
删除所述野生型TdT中没有催化功能的氨基酸后，确定所述野生型TdT三维结构中的若干个Loop区域，从原有的N端开始，依次在若干个Loop区域中选取氨基酸位点作为切割位点进行切割。
本实施方式中，删除野生型TdT中没有催化功能的氨基酸以避免设计的冗余，本实施例中，从原有的N端开始，依次在若干个不同的Loop区域中选取氨基酸位点作为切割位点，可获得一系列切割位点，进而可获得一些列不同的循环排列的具有新的N端和C端的TdT突变体。
对于在若干个Loop区域中的某一个Loop区域进行切割位点选择时，可以逐个尝试，例如每隔1-3个氨基酸位点，进行分割。
在一些实施方式中，所述野生型TdT选自小鼠来源的野生型TdT、牛来源的野生型TdT、鸟类来源的野生型TdT中的一种，但不限于此。
在一些实施方式中，所述野生型TdT选自鸟类来源的野生型TdT，所述鸟类来源的野生型TdT的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的鸟类来源的野生型TdT，其没有催化功能的氨基酸为1-146号氨基酸。
在一些实施方式中，所述鸟类来源的野生型TdT中作为切割位点的氨基酸位点选自以下氨基酸位点中的一个：
212G、213L、214P、215C、216V、217G、218D、219Q、220V、221R、350P、351G、352P、353R、354E、355D、356D、357E、358L、359L。根据对Loop区域的结构分析，确认这些氨基酸残基所对应的位置较为柔性并且是可以重排的位点。
本发明实施例还提供了一种TdT突变体，其中，采用本发明实施例如上所述的制备方法制备得到。
本发明实施还提供了一种TdT突变体，其中，所述TdT突变体的氨基酸序列如SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示。其中测试发现，氨基酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11所示的TdT突变体具有比鸟类来源的野生型TdT(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)更优异的催化活性，氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13所示的TdT突变体也具有一定的催化活性。
下面通过具体的实施例进行详细说明。
实施例1TdT突变体的制备
TdT突变体的制备方法，包括步骤：
(1)如图1所示，根据鸟类来源的野生型TdT(wt ZaTdT，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示)的3D结构和功能解析，删除wt ZaTdT氨基酸序列中没有实质催化功能的1-146号氨基酸；然后，确定wt ZaTdT三维结构中的柔性Loop区域；
(2)在选取的Loop区域中挑取一个氨基酸位点作为切割位点，进而生成分别具有新的N端和C端的两段氨基酸序列；
(3)用柔性氨基酸连接子(简写为Linker，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，具体为GTGGSGGTGG)，将wt ZaTdT原有的C端和N端连接融合起来，进而将两段氨基酸序列连接起来，形成具有新的C端和N端的TdT突变体。
重复步骤(2)-(3)，从原有N端开始，依次在选取的若干个Loop区域中挑取一个氨基酸位点作为切割位点，最终得到若干个TdT突变体，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:13所示。
其中TdT突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示的序列时，步骤(2)中选取的切割位点为216V，进行切割后得到147-216、217-513两段氨基酸序列(147-216这段氨基酸序列中147一侧为TdT原有的N端，216一侧为切割后新生成的C端；217-513这段氨基酸序列中217一侧为切割后新生成的N端，513一侧为TdT原有的C端)，用Linker将两段氨基酸序列连接后，得到具有新的N端和C端的TdT突变体为217-513-Linker-147-216(如图1所示)，其新的N端和C端所在位点示意图如图2所示；
其中TdT突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示的序列时，步骤(2)中选取的切割位点为354E，进行切割后得到147-354、355-513两段氨基酸序列(147-354这段氨基酸序列中147一侧为TdT原有的N端，354一侧为切割后新生成的C端；355-513这段氨基酸序列中355一侧为切割后新生成的N端，513一侧为TdT原有的C端)，用Linker将两段氨基酸序列连接后，得到具有新的N端和C端的TdT突变体为344-513-Linker-147-354(如图1所示)，其新的N端和C端所在位点示意图如图2所示；
其他TdT突变体的氨基酸序列的设计和排列方式同理。
实施例2cpTdT突变体的筛选
通过同源重组手段构建循环排列TdT突变体基因，测序正确后采用热激法转化进大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行TdT突变体的表达纯化；通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)判断TdT突变体的表达量及纯度；纯化获得TdT突变体后，利用变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳对不同TdT突变体的催化活性进行测试；结合TdT突变体表达量、纯度和催化活性来选取最适于作为改造的模板cpTdT突变体。具体操作步骤如下：
采用热激法转化进大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行TdT突变体的表达纯化：
取1μL测序正确的质粒加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上孵育30min后，置于42℃水浴锅中热激45s后立刻取出置于冰上5min；加入500μL BL培养基，于37℃培养箱中，190rpm转速培养50min；以10000rpm转速离心1min，将沉淀细胞均匀涂于培养皿后置于培养箱过夜，次日挑取单克隆；
选取单克隆突变，在含100μg/mL卡那霉素的200mL的LB培养基中孵育3小时至OD600值为0.6；加入IPTG(异丙基-β-d-硫半乳糖)至终浓度为0.5mM，230rpm转速，16℃下诱导过夜；6000g离心10min收集细胞，然后在50mL裂解缓冲液(30mM Tris-HCL缓冲液，500mMNaCl，20mM咪唑)中重悬；用高压均质器裂解细胞，在4℃下以6000g离心10min去除细胞碎片，使澄清的裂解液在重力作用下流过镍亲和色谱柱；用50mL洗涤缓冲液(30mM Tris-HCL缓冲液，200mM NaCl，40mM咪唑)去除非目标蛋白，然后用5mL洗脱缓冲液(30mM Tris-HCL缓冲液，200mM NaCl，200mM咪唑)收集目标蛋白，用30kDa分子量的超滤离心柱对洗脱蛋白进行浓缩和透析，得到纯化的循环排列的TdT突变体。
TdT突变体浓度及表达量测试(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称SDS-PAGE)：
将5μL TdT突变体样品与20μL的5X上样缓冲液混合，70℃加热5min，得到待测样品；配置10％的分离胶8mL和10％的浓缩胶5mL，将分离胶灌注于制胶架玻璃板间，等待凝固后灌注浓缩胶并插入样品梳，装好电泳系统，加入SDS电泳缓冲液拔去样品梳并在样品孔加入Marker和待测样品，恒压200V下进行电泳，时间为60min；将胶取出置于考马斯亮蓝溶液染色30min后过夜脱色并进行成像，并以wt ZaTdT作为对照。
活性测试(变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称变性尿素PAGE)：
将寡核苷酸引物、脱氧核糖核苷酸、CoCl2加入到HEPES缓冲液中，配制得到含有浓度为1μM寡核苷酸引物、0.1mM脱氧核糖核苷酸、0.25mM CoCl2的反应预备液，置于30℃金属浴中保存备用；
取1μL浓度为0.5mg/mL的TdT突变体样品加入到20μL反应预备液中，用移液枪混合均匀后，37℃反应30min，然后95℃加热15s停止反应；取5μL反应液和5μL 2X上样缓冲液混合，得到待测样品；配置15％的尿素变性胶10mL，然后灌注于制胶架玻璃板间并插入样品梳，装好电泳系统，加入TBE电泳缓冲液拔去样品梳并在样品孔加入Marker和待测样品，恒压200V下进行电泳，时间为60min，在凝胶成像仪下观察结果，此活性测试以寡核苷酸引物和wt ZaTdT作为对照。
结果如下：
氨基酸序列为SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:13的TdT突变体的SDS-PAGE蛋白质胶图如图3所示(氨基酸序列为SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:13的TdT突变体分别对应图中的cpTdT-0.0、cpTdT-0.1、cpTdT-0.2、cpTdT-0.3、cpTdT-0.4、cpTdT-0.5、cpTdT-0.6、cpTdT-0.7、cpTdT-0.8、cpTdT-0.9)，由图3可知，氨基酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11的TdT突变体(即cpTdT-0.1和cpTdT-0.7)在大肠杆菌表达体系中有显著的蛋白质表达。
氨基酸序列为SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:13的TdT突变体反应后的变性尿素PAGE蛋白质胶图如图4所示，由图4可知，氨基酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11的TdT突变体(即cpTdT-0.1和cpTdT-0.7)具有最好的催化活性。
氨基酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11的TdT突变体的催化速率结果如图5所示，由图5可知，氨基酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的TdT突变体(即cpTdT-0.1和cpTdT-0.7)没有导致明显的酶催化活性变化，且相比wtZaTdT具有更优异的催化活性。
综上，本发明实施例通过蛋白质设计，质粒构建，TdT突变体的大肠杆菌重组表达，TdT突变体纯化等步骤获得了循环排列TdT的蛋白质文库。随后通过TdT突变体酶活性测试，确定了有催化活性且具有新颖C端和N端的TdT。总的来说，本发明将野生型TdT进行了蛋白质一级结构的循环排列，选择合适的蛋白结构域以开辟新的C端和N端，利用特定柔性氨基酸连接子(Linker)连接了野生型TdT原有的C端、N端，得到一系列具有新颖C端和N端的TdT突变体，为TdT的蛋白质工程提供了更加丰富的C端和N端选择。此外，本发明进一步对柔性氨基酸连接子和原有的C端或者N端进行了优化，并从一系列具有新颖C端和N端的TdT突变体中筛选获得了具有新颖C端和N端且具有较高催化活性的TdT突变体。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体的制备方法，其特征在于，包括步骤：
提供鸟类来源的野生型末端脱氧核苷酸转移酶，其具有N端和C端；所述鸟类来源的野生型末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
选取所述野生型末端脱氧核苷酸转移酶Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割，生成两段氨基酸序列；
利用柔性氨基酸连接子将所述两段氨基酸序列连接起来，并使得所述柔性氨基酸连接子的一端与所述野生型末端脱氧核苷酸转移酶原有的N端相连，另一端与所述野生型末端脱氧核苷酸转移酶原有的C端相连，得到具有新的N端和C端的末端脱氧核苷酸转移酶突变体；
所述柔性氨基酸连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述末端脱氧核苷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述选取所述野生型末端脱氧核苷酸转移酶Loop区域的氨基酸位点作为切割位点进行切割的步骤具体包括：
删除所述野生型末端脱氧核苷酸转移酶中没有催化功能的氨基酸后，确定所述野生型末端脱氧核苷酸转移酶三维结构中的若干个Loop区域，从原有的N端开始，依次在若干个Loop区域中选取氨基酸位点作为切割位点进行切割。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述没有催化功能的氨基酸为1-146号氨基酸。
4.末端脱氧核苷酸转移酶突变体，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到，所述末端脱氧核苷酸转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:11所示。
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