CN116836270B - 一种抗蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体、制备方法及应用。本发明筛选获得一株高效分泌抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，并通过RT‑PCR技术成功获得了该株抗体的重链及轻链可变区核苷酸序列。所述单克隆抗体不仅与重组表达的VP7蛋白具有良好的亲和反应能力，而且能够与蓝舌病毒感染细胞中天然的VP7蛋白发生特异性反应；以该单克隆抗体为竞争抗体建立了蓝舌病毒竞争ELISA抗体检测方法，为蓝舌病的检测诊断以及流行病学调查提供了工具。

Description

一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途。

背景技术

蓝舌病是由蓝舌病毒(Bluetongue virus)引起的羊、牛、鹿等反刍动物感染的疾病，主要通过库蠓属的吸血库蠓进行传播。绵羊对该病最易感，其临床症状主要表现为精神沉郁、体温升高、面部水肿充血、口鼻粘膜溃疡或充血。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为必须上报的疾病。蓝舌病毒是一种双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科环状病毒属。其基因组是由十个大小不同的RNA片段组成，共编码7种结构蛋白和4种非结构蛋白。BTV的血清型众多，不同血清型之间虽然存在交叉反应，但并没有疫苗可以用来治疗本病，所以早期的诊断和预防是防止本病流行的重要手段。结构蛋白VP7在不同的血清型之间高度保守，氨基酸的同源性在94％以上，是建立血清群特异性诊断方法的抗原。单克隆抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，此外它还具有纯度高、灵敏度高的特点，可以用来建立病原的血清学诊断方法。

随着蓝舌病毒的不断变异目前已发现至少29种血清型，不同血清型之间无交叉保护或交叉保护较差。蓝舌病有多种检测方法，但每种方法各有其优缺点。本发明提供了一种高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，并获得了一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体。所述单克隆抗体与VP7蛋白具有良好的亲和能力，能够与蓝舌病毒VP7蛋白发生特异性反应，为蓝舌病毒的鉴定以及诊断方法建立提供了重要基础。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体、制备方法及应用，具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链；

所述抗体重链的可变区CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR3；

所述抗体轻链的可变区CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CDR3。

优选地，所述体重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸编码上述第一方面所述单克隆抗体的抗体重链和抗体轻链。

优选地，编码所述抗体重链的可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述抗体轻链的可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

第三方面，本发明提供了上述第一方面如所述的单克隆抗体在制备检测蓝舌病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

(i)上述第一方面所述的单克隆抗体；

(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

第五方面，本发明提供了一种蓝舌病毒ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面所述的单克隆抗体。

优选地，所述试剂盒包括酶标板、蓝舌病毒抗原、封闭液、稀释液、上述第一方面所述的单克隆抗体、酶标二抗、洗涤液、显色剂、终止液。

优选地，所述蓝舌病毒抗原选自蓝舌病毒VP7重组蛋白；

优选地，所述封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液；

优选地，所述稀释液为0.01M PBS pH7.2；

优选地，所述洗涤液为PBST缓冲液。

优选地，所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗鼠二抗。

第六方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的单克隆抗体在以非疾病诊断为目的的蓝舌病毒体外检测中的应用。

第七方面，本发明提供了一种以非疾病诊断为目的蓝舌病毒ELISA检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)包被：用CBS缓冲液将表达的BTV VP7重组蛋白稀释为0.5μg/mL，100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜；用PBST缓冲液洗板5次；所述CBS缓冲液为0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH9.6；

(2)封闭：用含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育1h；用PBST缓冲液洗板5次；

(3)检测：将稀释液加入酶标板内，50μL/孔，把待检测的血清样本1：4稀释后加入酶标板A孔内，50μL/孔，然后进行倍比稀释(A-H；1:8-1:1024)；37℃孵育30min，用PBST缓冲液洗板5次；所述稀释液为0.01M PBS pH7.2；

(4)加竞争抗体：将上述第一方面所述的单克隆抗体0.5μg/mL稀释后加入酶标板内，100μL/孔，37℃孵育30min，用PBST缓冲液洗板5次；所述稀释液为0.01M PBS pH7.2；

(4)加酶标二抗：将1：40000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育30min；用PBST缓冲液洗板5次；所述稀释液为0.01M PBS pH7.2；

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育10min；加入终止液100μL/孔，读取OD₄₅₀的值；

判定方法：PI％＝(1-样品OD值/阴性OD值)×100％，当PI≥60％时判定为阳性，当PI<60％时判定为阴性，阴性OD值大于0.3，小于2.0时检测方法成立。

本发明的有益效果是：①本发明提供了一种抗蓝舌病毒结构蛋白VP7的单克隆抗体；②免疫印迹试验表明其特异性的和结构蛋白VP7反应；③而且所述单克隆抗体能特异性的与感染细胞中的蓝舌病毒结合，能够用于蓝舌病毒的检测与诊断；④本发明利用所述单克隆抗体建立了蓝舌病毒ELISA检测试剂盒及检测方法，相较于现有抗体检测方法，本发明所述方法具有更好的灵敏度和特异性，适用于蓝舌病毒的检测与诊断。

附图说明

图1纯化后的单克隆抗体2D7的SDS-PAGE鉴定结果；

图2单克隆抗体2D7的细胞免疫荧光鉴定；

图3单克隆抗体2D7的Western Blot。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1单克隆抗体的制备

1.杂交瘤细胞的制备

1.1小鼠免疫

取6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠；用表达的BTV VP7重组蛋白对其进行免疫注射；首次免疫用VP7蛋白与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，对小鼠进行皮下免疫注射，50μg/只；14d后进行第二次免疫注射，弗氏不完全佐剂与VP7蛋白充分乳化后，皮下免疫注射小鼠，50μg/只；14d后进行第三次免疫注射，弗氏不完全佐剂与VP7蛋白充分乳化，皮下免疫注射小鼠，50μg/只；10d后对小鼠断尾采血，用间接ELISA方法检测血清抗体效价。当抗体水平达到要求后，在第三次免疫后的第14d，选择效价最高的免疫小鼠进行加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量为50μg/只；3d后无菌采取小鼠脾细胞，然后与SP2/0细胞融合。

1.2细胞融合

细胞融合时，在无菌的环境下进行，将准备好的SP2/0细胞和小鼠脾细胞按照1：5的比例混合，加入20mL不完全培养基，1000rpm离心10min，弃去上清。用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀的细胞分散，在37℃的水浴中，用1mL 37℃预温的50％PEG进行细胞的融合，边加边轻轻的搅拌，然后静止1min，使PEG充分的发挥作用，用20mL的DMEM培养基终止融合，1000rpm离心5min，用HAT培养基重悬融合细胞，接种于96孔细胞培养板中，将96孔板放在37℃5％CO₂培养箱进行培养。

1.3筛选杂交瘤细胞

融合后前7天用HAT培养基，第7-14天用HT培养基，第14天以后用普通的完全培养基，当克隆的面积达到1/3-1/2培养孔的面积，此时即对所有克隆生长孔的培养基进行检测。对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，及时进行克隆化。亚克隆采用倍比稀释法，亚克隆7天后，再利用间接ELISA的方法检测培养上清，选取细胞团单一的阳性孔继续进行亚克隆，重复3次，筛选出稳定的杂交瘤细胞株。

具体检测方法：

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH9.6)将表达的BTV VP7重组蛋白稀释为0.5μg/mL，100μL/孔加到酶标板中，4℃包被过夜；用PBST缓冲液洗板5次。

(2)封闭：用含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育1h；用PBST缓冲液洗板5次。

(3)检测：将上述杂交瘤细胞的细胞培养上清加入到酶标板中，100μL/孔，同时用未免疫小鼠血清做阴性对照，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板5次。

(4)加酶标二抗：将1：40000稀释(稀释液为0.01M PBS pH7.2)的HRP标记的山羊抗鼠二抗加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h；用PBST缓冲液洗板5次。

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育10min；加入终止液100μL/孔，读取OD₄₅₀的值，如下表1所示，其中2D7为上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

表1 OD₄₅₀的值

2D7	阴性对照
		3.6555	0.0952
2.9486	0.0660

2.单克隆抗体的制备

2.1单克隆抗体腹水的制备

准备2只BALB/c小鼠，接种杂交瘤细胞前提前使用石蜡油腹腔注射小鼠，0.5mL/鼠。7天后，接种准备好的杂交瘤细胞，细胞的数量在10⁶左右，在第七天左右，观察小鼠的腹部明显膨大，用手触摸时，皮肤有紧张感，即可抽取腹水。

2.2单克隆抗体的纯化

将收集的腹水离心，去除沉淀，收集上清。然后利用Protein G柱对抗体进行纯化。

具体纯化步骤：

(1)层析柱预处理：用10倍柱体积的PBS洗涤平衡层析柱。

(2)样品上样：将收集的腹水用2倍体积的PBS稀释，调整pH后，缓慢加入到层析柱中。

(3)洗杂：用10倍柱体积的PBS洗涤，直至流出液无蛋白检出。

(4)抗体洗脱：用0.1M甘氨酸进行抗体洗脱，收集洗脱液直至无蛋白检出。

(5)PH调节：用饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性。

(6)样品浓缩：用10kDa超滤管，超滤浓缩至1-5mL左右。

将纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE鉴定。

结果如图1所示，纯化后的单克隆抗体2D7纯度大于95％，可满足临床应用的需求。

3.单克隆抗体的鉴定

抗BTV VP7单克隆抗体2D7的免疫荧光检测：用制备的抗BTV VP7单克隆抗体2D7对感染BTV-1的BSR细胞做免疫荧光分析。将BSR细胞提前一天铺到爬片上，然后用BTV-1感染细胞，37℃，培养24h，弃去细胞培养上清，用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，再用0.5％Triton X-100作用10min，PBS洗3次后，用3％BSA封闭1h，吸弃旧液后，加入单克隆抗体2D7，4℃过夜孵育，然后用Hoechst 33342染核10min，PBS洗3次，加入山羊抗鼠IgG(Alexa488室温避光孵育1h，封片后观察并收集图像。

检测结果如图2所示，感染了BTV-1的BSR细胞有荧光，而对照没有荧光。结果显示：本发明所述的抗BTV-1VP7单克隆抗体能够与感染BTV-1的细胞结合，而不与未感染的细胞结合。

抗BTV-1VP7单克隆抗体2D7的免疫印记检测：将纯化的BTV VP7蛋白制样做Western Blot，一抗用制备的抗BTV VP7单克隆抗体2D7，4℃过夜孵育，PBST洗3次，每次10分钟，二抗用HRP标记的山羊抗鼠二抗(1：10000)，室温孵育1h，PBST洗3次，最后显色观察。

结果如图3所示，本发明制备的单克隆抗体2D7能够和重组的VP7蛋白发生特异性反应。

4.单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆及分析

4.1单克隆抗体重链和轻链可变区的扩增

将分泌单克隆抗体2D7的杂交瘤细胞用TRIzol裂解法提取其总RNA，然后采用逆转录试剂盒进行反转录合成cDNA。以获得的cDNA为模板进行PCR的扩增，将扩增产物连接到载体上进行测序，获得抗体的重链及轻链可变区核苷酸序列。

经测序，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为：GCGGTGCAGCTTCAGGA GTCAGGACCTAGCCTCGTGAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCGACTCCATCACCAGTGGTTACTGGAACTGGATCCGGAAATTCCCAGGGAATAAACTTGAGTACATGGGGTACGTAAGCTACAGTGGTAGCACTTACTACAATCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATCACTCGAGACACATCCAAGAACCGGTACTACCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAAATGGGAGGATTACGACCCCTTTGGGTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO.2所示)；

所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列如下：GACATCCAGATGACACAGTCT CCATCCTCACTGTCTGCATCTCTGGGAGGCAAAGTCACCATCACTTGCAAGGCAAGCCAAGACATTAACAAGTATATAGCTTGGTACCAACACAAGCCTGGAAAAGGTCCTAGGCTACTCATACATTACACATCTACATTACAGCCAGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGGTCTGGGAGAGATTATTCCTTCAGCATCAGCAACCTGGAGCCTGAAGATATTGCAACTTATTATTGTCTACAGTATGATAATCTGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ IDNO.4所示)；

根据密码子编码规则，可知：所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如下所示：AV QLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYVSYSGSTYYNPSL KSRISITRDTSKNRYYLQLNSVTTEDTATYYCAKWEDYDPFGYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.1所示)；

所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如下所示：DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITC KASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYY CLQYDNLWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.3所示)。

4.2CDR区的确定

将测序所得单克隆抗体2D7轻链和重链可变区序列，在abysis.org网站上进行分析，得出其CDR区。

重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列如下所示：

CDR1：SGYWN(SEQ ID NO.5所示)；

CDR2：YVSYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO.6所示)；

CDR3：WEDYDPFGY(SEQ ID NO.7所示)；

轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列如下所示：

CDR1：KASQDINKYIA(SEQ ID NO.8所示)；

CDR2：YTSTLQP(SEQ ID NO.9所示)；

CDR3：LQYDNLWT(SEQ ID NO.10所示)。

实施例2利用蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体建立竞争ELISA检测方法

1、检测方法的建立

(1)包被：用CBS缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH9.6)将表达的BTV VP7重组蛋白稀释为0.5μg/mL，100μL/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜；用PBST缓冲液洗板5次。

(2)封闭：用含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，37℃孵育1h；用PBST缓冲液洗板5次。

(3)检测：将稀释液(0.01M PBS pH7.2)加入酶标板内，50μL/孔，把待检测的血清样本1：4稀释后加入酶标板A孔内，50μL/孔，然后进行倍比稀释(A-H；1:8-1:1024)；37℃孵育30min，用PBST缓冲液洗板5次。

(4)加竞争抗体：将0.5μg/mL本申请实施例制备的单克隆抗体2D7稀释(稀释液为0.01M PBS pH7.2)后加入酶标板内，100μL/孔，37℃孵育30min，用PBST缓冲液洗板5次。

(4)加酶标二抗：将1：40000稀释(0.01M PBS pH7.2)的HRP标记的山羊抗鼠二抗加入到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育30min，用PBST缓冲液洗板5次。

(5)显色：用TMB显色液避光显色，100μL/孔，37℃孵育10min；加入终止液100μL/孔，读取OD₄₅₀的值。

判定方法：PI％＝(1-样品OD值/阴性OD值)×100％，当PI≥60％时判定为阳性，当PI<60％时判定为阴性，阴性OD值大于0.3，小于2.0时实验成立。

2、竞争ELISA特异性实验

利用本实施例建立的ELISA实验方法对羊口疮、羊痘、羊小反刍兽疫等阳性血清进行检测，评估蓝舌病毒竞争ELISA检测方法的特异性。

结果如表2所示，只有蓝舌病血清检测结果为阳性，而其他病原阳性血清检测结果均为阴性。表明利用本申请所述的单克隆抗体2D7建立的蓝舌病毒竞争ELISA检测方法具有良好的特异性。

表2蓝舌病毒竞争ELISA检测方法的特异性结果

	OD450值	PI％
			羊口疮	1.7468	13.5％
羊痘病	1.9678	2.5％
			小反刍兽疫	1.7556	13％
蓝舌病	0.5775	66.8％

3、敏感性实验

把蓝舌病毒阳性血清按照1：8、1：16、1：32、1：64、进行连续稀释，以评估蓝舌病毒竞争ELISA检测方法的灵敏度。

结果如表3所示，当血清样品进行1：64稀释时，检测结果仍为阳性，表明，利用本申请所述的单克隆抗体2D7建立的蓝舌病毒竞争ELISA检测方法具有良好的敏感性。

表3蓝舌病毒竞争ELISA检测方法的敏感性结果

	OD450值	PI％
			1：8	0.3642	81.9％
1：16	0.4697	76.7％
			1：32	0.6035	70.1％
1：64	0.7749	61.6％

4、符合率实验

用本实施例建立的竞争ELISA实验方法检测已知微量中和实验BTV阳性血清(1-11)11份和BTV阴性血清(12-22)11份。

结果如表4所示，表明，利用本申请所述的单克隆抗体2D7建立的蓝舌病毒竞争ELISA检测方法具有良好的准确率，检测结果的符合率达到100％。

表4蓝舌病毒竞争ELISA检测方法的符合率结果

编号	OD450	PI％	编号	OD450	PI％
						1	0.3999	78.7％	12	1.8778	-7.8％
2	0.5236	72.1％	13	1.8669	-7.1％
						3	0.489	74％	14	1.8796	1.5％
4	0.6523	65.3％	15	1.8077	-3.7％
						5	0.7425	74.2％	16	1.8495	-6.1％
6	0.7253	72.5％	17	1.8901	0.9％
						7	0.6821	63％	18	1.8961	0.6％
8	0.6831	66.1％	19	1.6868	8.5％
						9	0.3642	81.9％	20	1.9004	0.4％
10	0.5989	70.3％	21	1.9087	0
						11	0.6413	63.1％	22	1.9331	-1.2％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗蓝舌病毒VP7蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链；

所述抗体重链的可变区CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的CDR3；

所述抗体轻链的可变区CDR包括氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1或2所述单克隆抗体的抗体重链和抗体轻链。

4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，编码所述抗体重链的可变区的基因序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述抗体轻链的可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

5.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备检测蓝舌病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。

6.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

(i)如权利要求1或2所述的单克隆抗体；

(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

7.一种蓝舌病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的单克隆抗体。

8.如权利要求7所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶标板、蓝舌病毒抗原、封闭液、稀释液、权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗、洗涤液、显色剂、终止液。

9.如权利要求7所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述蓝舌病毒抗原选自蓝舌病毒VP7重组蛋白。

10.如权利要求1或2所述的单克隆抗体在以非疾病诊断为目的的蓝舌病毒体外检测中的应用。