CN116829569A - 蛋白质纯化缓冲液和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括多个色谱步骤的蛋白质纯化方法的领域。本发明涉及从复杂溶液纯化蛋白质(优选抗体或其片段或含有所述片段的蛋白质)的方法，其中所述方法包括至少两个色谱步骤，所述色谱步骤使用包含相同化学化合物或由其组成的缓冲液。本发明对于重组蛋白的大规模生产和纯化特别有用。
Description
技术领域
本发明涉及包括多个色谱步骤的蛋白质纯化方法。本发明涉及从复杂溶液中纯化蛋白质(优选抗体或其片段或含有所述片段的蛋白质)的方法，其中所述方法包括至少两个色谱步骤，所述色谱步骤使用包含相同化学化合物或由其组成的缓冲液进行。本发明对于重组蛋白的大规模生产和纯化特别有用。
发明背景
通常使用多步树脂色谱法从细胞培养基中纯化重组蛋白，特别是抗体或融合蛋白，以将目的蛋白质与存在于细胞培养基中的核酸或其他分子分离。纯化方法通常包括液相色谱的两个或三个步骤，其中包含目的蛋白质的液体流动相传递到固体固定相，所述固体固定相可以是例如用特定化学物质官能化的树脂或膜，固体固定相基于其物理化学性质保留分子。蛋白质由两性离子氨基酸化合物组成；根据环境的pH值，蛋白质的净电荷可以是正电荷或负电荷。蛋白质的特定等电点(pI)可用于确定其净电荷在特定pH下是正电荷还是负电荷。该性质以及目的蛋白质的疏水性和大小用于模拟有关纯化过程，例如，在选择用于色谱步骤的固体支持物的特异性时。此外，可以使用各种pH的缓冲液来修饰待纯化蛋白质的净电荷，从而增加或抑制所述蛋白质与所用各种支持物的结合。在抗体纯化领域，纯化过程通常从使用亲和色谱的“捕获步骤”开始，经常使用基于蛋白A的亲和色谱进行，并且旨在基于蛋白A对Fc区的亲和力捕获抗体。如果更合适，可以使用基于蛋白L、重组亲和配体或合成亲和配体的其他亲和色谱。此外，该捕获步骤通常之后是精制步骤，旨在进一步将目的蛋白质与剩余的污染物如DNA、HCP和内毒素分离。离子交换(IEX)色谱法广泛用于生物制药工业中的精制步骤。IEX色谱柱依赖于分子表面电荷与固体固定相上带电官能团之间的静电相互作用。在IEX中，待纯化样品中存在的分子之间的结合特征由分子的净电荷，树脂表面上的电荷分布，树脂的配体类型(强离子交换剂和弱离子交换剂可以商购)和孔径决定。根据其化学性质，IEX色谱柱可分为阳离子交换(CEX)和阴离子交换(AEX)色谱柱。CEX通常使用对净正表面电荷分子具有亲和力的带负电荷的离子交换固体支持物，而AEX通常使用带正电荷的离子交换固体支持物。也可以使用其他类型的色谱，例如疏水相互作用色谱(HIC)，其中固体支持物包含疏水性配体并因此可用于基于其疏水性质分离化合物。混合模式色谱(MMC)依赖于结合2种物理化学性质的固体支持物，通常用作精制步骤的部分。
虽然已证明这种设置在提供高度纯化的蛋白质方面非常有效，但每种色谱都需要使用多种缓冲溶液，以便平衡色谱柱，在适当的化学条件下加载样品，洗涤杂质，洗脱目标蛋白质并再生柱。对于这些步骤中的任何步骤以及每个步骤都必须配制特定的缓冲液，并且必须调整缓冲液的pH和离子强度。因此，常规纯化方法通常需要配制和储存许多不同的缓冲液，这对公司的时间花费、使用的空间和总体财务成本具有重要影响。
因此需要在不损害色谱缓冲液的缓冲或化学质量或影响色谱性能的情况下简化色谱缓冲液的提供和储存。
发明概述
本发明提供了包含基本相同组分的水性缓冲液，其可用于重组蛋白的色谱纯化的所有常见步骤，因此能够简化大规模纯化过程。本发明的缓冲剂均含有乙酸盐，磷酸盐和Tris碱。它们可以通过用纯净水进行简单稀释从浓缩缓冲溶液(也称为母缓冲溶液)制备。为了适应电导率和/或pH，可以进一步加入氢氧化钠和/或氯化钠。本发明提供了一种简单的缓冲液配方，其具有介于pH 2和pH 9之间的广泛缓冲区。换句话说，在该pH区域，缓冲溶液的pH在加入NaOH后根据准线性曲线演变，没有突然的pH升高。本领域众所周知，具有高电导率(也称为高离子强度)的缓冲液会干扰目标蛋白质与离子交换柱的结合，而这可能是不需要的。本发明的水性缓冲剂已经配制成具有电导率，除非通过添加NaCl而自愿增加，否则其在添加NaOH后在整个缓冲区域内保持相对低的电导率，由此提供不易负面影响蛋白质纯化质量的缓冲溶液。
由于这个非常大的缓冲区域，本发明的缓冲液是非常通用的，并且可以容易地用于色谱的任何步骤，从平衡柱到洗脱目标蛋白质，包括洗涤步骤，无论使用的色谱类型或待纯化的蛋白质。本发明的缓冲液可在任何类型的色谱(亲和，离子交换，混合模式)中用作平衡或冲洗缓冲液，上样调节缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，甚至作为再生缓冲液，无论所述色谱步骤是否以结合/洗脱模式或流穿模式进行。
因此，本发明提供了使用色谱，优选液相色谱，纯化目的蛋白质的方法，其中色谱步骤基本上或甚至完全依赖于本发明缓冲液的使用。此外，可以实施所述方法，以便在整个纯化过程中使用全部通过简单稀释从相同浓缩母体衍生的色谱缓冲液，从而具有相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比，和/或相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比，从而简化流程步骤并减少对存储空间的需求和准备缓冲液所需的时间。
定义
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”应以本领域中的通常理解解释，即指包含一个或多个氨基酸残基长链的大分子。在本发明的上下文中，蛋白质通常含有至少20个氨基酸残基和/或分子量为至少15kD。在本发明的上下文中，术语“蛋白质”应以蛋白质生产和纯化领域中的通常理解解释，也就是说广泛地指基本上由氨基酸构成的化合物，并且可以包括翻译后修饰如糖基化。在本发明的上下文中，蛋白质可以是例如抗体或其片段、嵌合蛋白质、酶或受体蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“重组蛋白”应以本领域中的通常理解解释，即指通过基因工程改造获得的蛋白质。通常，重组蛋白由其遗传物质已通过基因工程改造修饰的宿主产生。该定义还包括在无细胞系统中产生的蛋白质，并且该生产涉及基因工程改造步骤。因此，该定义包括已经通过重组手段修饰了序列的蛋白质，以及具有天然序列并在重组宿主中产生的蛋白质。
术语“抗体”尤其包括多克隆抗体，亲和纯化的多克隆抗体，单克隆抗体和抗原结合片段，例如F(ab′)2，Fab蛋白水解片段和单链可变区片段(scFv)。还包括基因工程改造的完整抗体或片段，例如嵌合抗体，scFv和Fab片段，以及合成的抗原结合肽和多肽。
术语“重组抗体”是指通过重组技术产生的抗体。由于重组DNA技术在抗体产生中的相关性，不需要局限于天然抗体中发现的氨基酸序列；可以重新设计抗体以获得所需的特征。可能的变化很多，从仅改变一个或几个氨基酸到完全重新设计，例如对于可变结构域或恒定区。通常，进行恒定区改变是为了改善，减少或改变特征，例如补体结合(例如补体依赖性细胞毒性，CDC)，与Fc受体的相互作用和其他效应子功能(例如抗体依赖性细胞毒性，ADCC)，药代动力学性质(例如与新生Fc受体结合；FcRn)。将进行可变结构域的改变，以改善抗原结合特性。除抗体外，免疫球蛋白可以多种其他形式存在，包括例如单链或Fv，Fab和(Fab′)2，以及双抗体，线性抗体，多价或多特异性杂合抗体。
术语“抗体片段”是指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合区或可变区。所述部分或片段应保持完整链/抗体的至少一种活性，即它们是“功能部分”或“功能片段”。如果它们保持至少一种活性，它们优选保持目标结合属性。抗体部分(或抗体片段)的实例包括但不限于“单链Fv”，“单链抗体，“Fv”或“scFv”。这些术语是指包含来自重链和轻链的可变结构域但缺少恒定区的抗体片段，其全部在单个多肽链内。通常，单链抗体还包含VH和VH结构域之间的多肽接头，使其能够形成能够进行抗原结合的所需结构。在具体实施方式中，单链抗体也可以是双特异性和/或人源化的。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的可变区和CH1区构成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。这样的“Fab”片段称为F(ab′)2分子，其包含一条轻链和一条重链并且在CH1和CH2结构域之间包含更多恒定区，从而可以在两条重链之间形成链间二硫键。“F(ab′)2”包含两条轻链和两条重链，它们包含CH1和CH2域之间恒定区的部分，从而在两条重链之间形成链间二硫键。定义了一些重要术语后，现在可以将注意力集中在本发明的特定实施方式上。
在本发明的上下文中，术语“等电点”也称为pI、H(I)或IEP，是特定分子不携带净电荷或在统计平均中是电中性的pH。分子上的净电荷受其周围环境的pH影响，并且分别由于质子(H+)的获得或损失，分子上的净电荷可能带更多正电荷或更多负电荷。蛋白质的等电点可以通过基于蛋白质氨基酸序列的计算来评估，或者可以通过实验确定，例如使用Goyon等中公开的icIEF(成像毛细管等电聚焦)方法。如Goyon等所示，使用该方法测定的实验pI与计算的pI非常好地相关，使得本领域技术人员可以使用任何所述方法。优选地，为了清楚起见，本文定义的pI对应于由icIEF(成像的毛细管等电聚焦)方法确定的pI。通常，重组抗体的等电点介于约6和9.5之间。
在本发明的上下文中，术语“复杂溶液”是指这样的水基溶液，其包含目的蛋白质，并且可以还包含其它化合物(也称为杂质)，例如通常存在于细胞培养基中的化合物或细胞培养的残基。
在本发明的上下文中，术语“色谱”是指基于相平衡分配并旨在分离存在于复杂混合物中的化合物的方法。
在本发明的上下文中，术语“液相色谱”是指旨在通过使用固体固定相分离存在于液体流动相中的分子的色谱方法，并且由于复杂溶液的各个溶质在液体流动相的影响下迁移通过所述固体固定相的速率的差异，复杂溶液中的目标溶质与所述复杂溶液中的其他溶质分离。通常，固体固定相包含显示处这样的物理和/或化学性质的材料或由其组成，所述物理和/或化学性质使得能够基于所述分子的物理或化学特征(例如它们的尺寸，极性，亲和力，亲水性)将分子保留在所述材料的表面内或表面上。因此，术语“液相色谱”包括本领域已知的所有液相色谱技术，例如亲和色谱法，尺寸排阻色谱法，离子交换色谱法，疏水相互作用色谱法，多模式(multimodal)或混合模式色谱法。如本领域众所周知的，色谱方法可以通过使液体流动相与平面固体固定相接触来实施，在这种情况下，通常将其称为平面色谱法，或者可以通过在垂直固定相上倾倒液体流动相来实施，在这种情况下，通常将其称为柱色谱法。
在本发明的上下文中，“液相色谱步骤”应理解为指用色谱柱进行的色谱方法的任何步骤，例如平衡固体固定相，使待纯化到固体固定相上或通过固体固定相的含蛋白质的复杂溶液流动，洗涤固体固定相，从固体固定相中洗脱目标蛋白质(当处于结合/洗脱模式时)，以及再生固体固定相。另外，应该有一个可选的稀释步骤。
在本发明的上下文中，与色谱步骤或技术结合使用的术语“结合-洗脱模式”是指实施色谱技术的模式，其中建立色谱技术以在第一步中通过使待纯化的蛋白质在固体固定相上的保留最大化并同时使液体流动相的其他组分在固体固定相上的保留最小化将待纯化的蛋白质与液体流动相的其他组分分离，并且在另一个单独的步骤中最大化目标蛋白质与固体固定相的解离(从而洗脱它)。
在本发明的上下文中，与色谱步骤或技术结合使用的术语“迎头(frontal)”是指实施色谱技术的模式，其中建立色谱技术以通过最小化待纯化蛋白质在固体固定相上的保留并同时在固体固定相上保留液体流动相的其他组分而将待纯化的蛋白质与液体流动相的其他组分分离。在这种条件下，杂质和固体固定相配体之间的相互作用必须强于目标蛋白质和固体固定相配体之间的相互作用。最终，在加载步骤期间，杂质将取代配体上潜在结合的目的蛋白质，从而允许分离。
在本发明的上下文中，与色谱步骤或技术结合使用的术语“流穿模式”是指实施色谱技术的模式，其中建立色谱技术以通过最小化待纯化蛋白质在固体固定相上的保留并同时在固体固定相上保留液体流动相的其他组分而将待纯化的蛋白质与液体流动相的其他组分分离。
在本发明的上下文中，术语“平衡缓冲液”是指不含目的蛋白质的缓冲液，并传递到色谱柱的固相，在将含有目的蛋白质的样品传递到固体固定相之前，改变色谱的固体固定相的pH或电导率，以便能够或改善目标蛋白质与样品其他组分的进一步分离。例如，当以结合/洗脱模式使用时，其中寻求目的蛋白质与固相的结合，设定平衡缓冲液，以使目的蛋白质在所述固相上的进一步保留最大化并同时使存在于液相中的其他组分的保留最小化。或者，当以流通模式使用时，其中寻求液相中存在的杂质的结合，设定平衡缓冲液，以使目标蛋白质在所述固相上的进一步保留最小化并同时使在液相中存在的其他组分的保留最大化。
在本发明的上下文中，术语“上样调节缓冲液”是指旨在稀释待传递到色谱柱固相的液相(含有目的蛋白质)的缓冲液。通常，上样调节缓冲液用于改变液相的pH或电导率，以便能够或改善通过固相将目标蛋白质与液相的其他组分分离。例如，当以结合/洗脱模式使用时，其中寻求目的蛋白质与固相的结合，设定上样调节缓冲液，以使目的蛋白质在所述固相上的保留最大化并同时使存在于液相中其他组分的保留最小化。或者，当以流穿模式使用时，其中寻求液相中存在的杂质的结合，设定上样调节缓冲液，以使所述固相上目标蛋白质的保留最小化并同时使在液相中存在的其他组分的保留最大化。
在本发明的上下文中，术语“洗涤缓冲液”是指以结合/洗脱模式使用的缓冲液，其旨在并且适合于从固相洗脱杂质而不从固相洗脱目标蛋白质。
在本发明的上下文中，术语“洗脱缓冲液”是指以结合/洗脱模式使用的缓冲液，其旨在并且适合于从固相洗脱目的蛋白质。在本发明的上下文中，术语“再生缓冲液”是指在所述固相已用于将目的蛋白质与液相的其他组分分离之后用于固相以从固体支持物基本上去除所有来自液相的化合物的缓冲液。
在本发明的上下文中，术语“漂洗缓冲液”或“再平衡缓冲液”是指这样的缓冲液，其不含目的蛋白质，并在所述色谱已用于纯化目标液相之后传递到色谱柱的固相，以在将新样品传递到固体固定相之前改变色谱的固体固定相的pH或电导率。通常，“漂洗缓冲液”或“再平衡缓冲液”具有与平衡缓冲液相似的化学性质。
在本发明的上下文中，术语“亲和色谱(法)”是指液相色谱方法，其中目的溶质(例如目的蛋白质)可逆地和特异性地结合固定在固体固定相上的特异性配体。优选地，特异性配体共价连接固体固定相，并且当溶液接触固体固定相时，可接近溶液中的目的蛋白质。目的蛋白质与固定的配体的结合允许与复杂溶液的其他组分分离，例如通过固体固定相的杂质，而目的蛋白质保持与固体固定相上的固定配体的特异性结合。然后通过改变化学或物理条件从固定的配体中除去特异性结合的目的蛋白质，从而影响亲和常数。可以如此来影响目的蛋白质与固定的配体的结合，例如通过使用具有低或高pH的缓冲液改变pH，通过使用具有低或高电导率的缓冲液改变目的蛋白质的电荷，或通过使用竞争性配体。亲和色谱通常使用结合/洗脱模式进行，包括其中设定条件以使目的蛋白质与固定在固体固定相上的特异性配体的结合最大化的第一步，以及其中设定条件以使目的蛋白质与固定在固体固定相上的特异性配体的解离最大化的另一步骤。
在本发明的上下文中，术语“蛋白A”包括从其天然来源回收的蛋白A，合成产生的蛋白A(例如通过肽合成或通过重组技术)及其变体，它们保留结合具有CH2/CH3结构域(例如Fc区)的蛋白的能力。
在本发明的上下文中，术语“蛋白L”包括从其天然来源回收的蛋白L，合成产生的蛋白L(例如通过肽合成或通过重组技术)及其变体，它们保留结合具有CH2/CH3结构域(例如Fc区)的蛋白的能力。
在本发明的上下文中，术语“离子交换色谱”或“IEX”是指旨在基于其总电荷分离可电离分子的液相色谱。该定义通常包括阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。根据预期结果，两者均可用于结合/洗脱、迎头或流穿模式。
“阳离子交换色谱”或CEX是指用带负电荷的固体固定相进行的色谱，因此具有与通过固相或穿过固相的溶液中存在的带正电荷的分子结合的游离阳离子。阳离子交换色谱可以例如依赖于固定在固体固定相表面的磺酸盐(强阳离子交换剂)或羧酸盐(弱阳离子交换剂)基团的使用。
“阴离子交换色谱”或AEX是指用带正电荷的固体固定相进行的色谱，因此具有与通过固相或穿过固相的溶液中存在的带负电荷的分子结合的游离阴离子。阴离子交换色谱可以例如依赖于固定在固体固定相表面的二乙基氨基乙基基团(DEAE)的使用。
在本发明的上下文中，术语“疏水相互作用色谱”或HIC是指旨在基于其疏水性特征分离分子的液相色谱。通常，HIC用特征在于疏水配体的固体固定相进行，，其优先与通过固相或穿过固相的溶液中存在的蛋白质的疏水区域相互作用。HIC可以例如依赖于固定在固体固定相表面的脂族链(例如己基，丁基，苯基基团)的使用。
在本发明的上下文中，术语“多模式色谱”或“混合模式色谱”或MMC是指旨在基于多种感兴趣的物理化学性质(例如它们的总电荷和疏水性特征)分离分子的液相色谱。通常，MMC可以用固体固定相进行，所述固体固定相结合了多种感兴趣的物理化学性质，例如疏水配体和游离离子。在MM中，固体固定相可以例如包含结合多个前述特征的配体，或者可以包含各自具有感兴趣特征的不同类型的单个配体。最常见的MMC依赖于含有离子交换化学基团和脂族基团的配体，导致带电荷的配体和疏水配体的组合，提供所谓的“双模”相互作用模式(在本例中，基于IEX和HIC)。
在本发明的上下文中，术语“水性缓冲液”是指展现缓冲性质的水基溶液，其具有通过吸收或解吸H+和OH-离子抵抗由于添加酸或碱而引起的剧烈pH变化的能力，也就是说针对添加酸或碱，其pH根据大致线性的曲线演变，没有突然的pH上升。
在本发明的上下文中，术语“Tris碱”是指对应于CAS号77-86-1的化合物2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇。
具体实施方式
本发明涉及包含乙酸盐，磷酸盐，Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠或由其组成的水性缓冲液用于从复杂溶液中纯化目的蛋白质的用途，所述用途包括至少第一液相色谱和第二色谱，其中对于各所述液相色谱，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少一种缓冲液。
本发明还涉及一种从复杂溶液中纯化目的蛋白质的方法，所述方法包括至少第一液相色谱和第二种色谱，其中对于每种所述液相色谱，将包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选地氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液用作平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少一种缓冲液。
有利地，在所述用途或方法中，在第一或第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少两种缓冲液，优选在平衡缓冲液、洗涤缓冲液和再生缓冲液中选择的至少两种缓冲液。
有利地，在所述用途或方法中，在第一和第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少两种缓冲液，优选在平衡缓冲液、洗涤缓冲液和再生缓冲液中。
有利地，在所述用途或方法中，在第一或第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少三种缓冲液，优选作为平衡缓冲液、洗涤缓冲液和再生缓冲液。
有利地，在所述用途或方法中，在第一和第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少三种缓冲液，优选作为平衡缓冲液，洗涤缓冲液和再生缓冲液。
优选地，所述用途或方法包括第三色谱。在其中根据本发明的用途或方法包括第三色谱的实施方式中，对于所述第三液相色谱，优选至少包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液作为在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少一种缓冲液。有利地，在所述用途或方法中，对于第一，第二和第三液相色谱，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少三种缓冲液，优选作为平衡缓冲液，洗涤缓冲液和再生缓冲液。
本发明涉及一种从复杂溶液中纯化目的蛋白质的方法，其中所述方法包括通过至少第一液相色谱和第二色谱纯化所述含有目的蛋白质的复杂溶液，其中对于各所述第一和第二液相色谱，使用包含化合物乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目标蛋白质和再生所述固体固定相中的至少一个步骤。
优选地，本发明涉及一种从复杂溶液中纯化目的蛋白质的方法，其中所述方法包括：
a)使用包含第一固体固定相的至少第一液相色谱纯化包含所述目的蛋白质的所述复杂溶液，由此获得第一目的蛋白质洗脱液，其中使用包含化合物乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质，和再生所述固体固定相中的至少一个y步骤；和
b)使用包含第二固体固定相的第二液相色谱纯化步骤a)的第一目的蛋白质洗脱液，由此获得第二目的蛋白质洗脱液，其中使用包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质，和再生所述固体固定相中的至少一个步骤。
任选地，在本发明的方法中，在流过所述第二固体固定相之前，将第一目的蛋白质洗脱液与根据本发明的上样调节缓冲液混合，所述上样调节缓冲液即包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液。
优选地，在上面详述的本发明方法中，对于第一或第二液相色谱，使用包含乙酸盐、磷酸盐，Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目标蛋白质和再生所述固体固定相中的至少两个步骤。优选地，在上面详述的本发明方法中，在第一和第二液相色谱中，使用所述水性缓冲液进行至少两个步骤。优选地，在上面详述的本发明方法中，在第一或第二液相色谱的每一个中，使用所述水性缓冲液进行平衡所述固体固定相、洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质和漂洗所述固体固定相中的所有所述步骤。优选地，在上面详述的本发明方法中，在第一和第二液相色谱中，使用所述水性缓冲液进行平衡所述固体固定相、洗涤所述固体固定相、洗脱目的蛋白质和漂洗所述固体固定相中的所有所述步骤。
优选地，所述方法包括第三色谱。在其中所述方法包括第三色谱的那些实施方式中，对于各所述的第一，第二和第三液相色谱，使用所述水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相、洗涤所述固体固定相、洗脱感兴趣的蛋白质，和漂洗所述固体固定相的至少一个步骤。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液由乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠组成。在本发明的上下文中，水性缓冲液含有水作为主要溶剂。换句话说，更优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液由水、乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠组成。
如所示，通过从浓缩缓冲溶液中衍生根据本发明使用的所有缓冲液，可以进一步实施本发明以简化工艺步骤并减少对存储空间的需要，所述浓缩缓冲溶液可以容易地用水稀释并用氢氧化钠和/或氯化钠调节pH和电导率。因此，然后使用本文定义的缓冲液进行根据本发明的用途和方法，所述缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
发明人进一步确定了磷酸盐与Tris碱的摩尔比以及乙酸盐与磷酸盐的摩尔比的值区间，其可有利地用于制备易于通过如上所述的简单方法适应任何色谱步骤的通用缓冲液，即用水稀释并使用氢氧化钠和/或氯化钠调节可能的pH和电导率。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比在1和3之间，还优选在1.5和2之间。还优选地，磷酸盐与Tris的摩尔比为约2。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比在0.5和4之间，还优选在1和2.5之间。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比在1.5和2之间。并且所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比在1和2.5之间。还优选地，在本文详述的任何用途和方法中，磷酸盐与Tris的摩尔比为约2，并且所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比在1和2.5之间。
在本文详述的用途和方法的优选实施方式中，磷酸盐与Tris的摩尔比为约2，并且所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比为约1。在本文详述的用途和方法的另一优选实施方式中，磷酸盐与Tris的摩尔比为约2，并且所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比为约2.5。
由于本文详述的方法和用途中待使用的水性缓冲液可以由单一母缓冲溶液制备，优选在本文详述的任何用途和方法中，所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比在1.5和2之间。并且所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比在1和2.5之间，并且所述水性缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
优选地，目的蛋白质是重组蛋白质。还优选地，目的蛋白质是抗体、其片段或包含所述片段的融合蛋白。
优选地，目的蛋白质的等电点在6和9.5之间，有利地在6和8.5之间。
在本发明的上下文中，本发明的用途和方法的第一和第二，任选地第三色谱中的每一个选自亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质。在本发明的上下文中，所述色谱可以在纯化级联中以任何顺序使用。根据预期的结果，任何所述色谱可以结合/洗脱，迎头或流穿模式使用。优选地，亲和色谱以结合/洗脱模式进行。优选地，离子交换色谱以流穿或迎头模式进行。
取决于其预期用途(平衡，上样，洗涤，洗脱等)，以及根据使用的模式(结合/洗脱或流穿)，色谱缓冲液的制备，特别是pH和电导率的适应是本领域众所周知的，并且已经在许多参考书和手册中进行了详尽的描述。例如，本领域的一般知识已经在本领域技术人员可以参考的《蛋白质色谱法》(Giorgo Carta和Alois Jungbauer，Wiley-VCH Verlag GMBH，2010)中进行了详尽的讨论。
通常，当以结合/洗脱模式使用阳离子交换色谱时，将配制平衡缓冲液，以使其具有高于固定在固体固定相的基团的pI的pH，从而确保固体固定相在含有目的蛋白质的样品流动之前带负电荷。然后，如果需要，可以通过使用可用的不同溶液来调节含有目的蛋白质的液体部分的pH和/或电导率，从而改善适当的相互作用。通过这样做，蛋白质的物理化学性质将被溶液环境改变，确保与固定相的适当相互作用。通常，可以通过使用低于目的蛋白质的pI和高于配体基团的pI的调节溶液来降低pH，以确保目的蛋白质带正电荷并且配体带正电荷。上样调节缓冲液。然后，通常，将配制一种或多种洗涤缓冲液，以洗脱不需要的分子而不影响目的蛋白质与固体固定相的结合。最后，通常，配制洗脱缓冲液，以确保目的蛋白质从固体固定相中释放，例如通过调节pH使其高于目的蛋白质的pI和/或通过调节洗脱缓冲液的电导率(特别是通过增加正离子例如Na+的浓度)。
通常，当以流穿模式使用阳离子交换色谱时，将配制平衡缓冲液，以使其具有高于固定在固体固定相的基团的pI的pH，从而确保固体固定相在含有目的蛋白质的样品流动之前带负电荷。然后，如果需要，可以通过pH高于目的蛋白质的pI的上样调节缓冲液来调节目的蛋白质，以确保目的蛋白质具有负电荷并且不与固体固定相结合。
通常，当以结合/洗脱模式使用阴离子交换色谱时，将配制平衡缓冲液，以使其pH低于固定在固体固定相的基团的pI的pH，从而确保固体固定相在含有目的蛋白质的样品流动之前带正电荷。然后，如果需要，可以在pH高于目的蛋白质的pI的上样调节缓冲液中稀释目的蛋白质，，以确保目的蛋白质具有负电荷并与固体固定相结合。然后，通常，配制一种或多种洗涤缓冲液，以洗脱不需要的分子而不影响目的蛋白质与固体固定相的结合。最后，通常，配制洗脱缓冲液，以确保目标蛋白质从固体固定相中释放，例如通过调节pH使其低于目标蛋白质的pI和/或通过调节洗脱缓冲液的电导率(特别是通过增加负离子如Cl-的浓度)。
通常，当以流穿模式使用阴离子交换色谱时，将配制平衡缓冲液，以使其pH低于固定在固体固定相的基团的pI的pH，从而确保固体固定相在含有目的蛋白质的样品流动之前带正电荷。然后，如果需要，可以在pH低于目的蛋白质的pI的上样调节缓冲液中稀释目的蛋白质，以确保目的蛋白质具有中性或正电荷并且不结合到固体固定相。
如已经指出的，本文详述的方法中使用的缓冲液的具体组成提供了大范围的可能的缓冲液，使得本领域技术人员将通过选择和制备最适合待纯化的目的蛋白质，缓冲液的预期用途，以及使用色谱的模式(例如结合/洗脱或流穿)的水性缓冲液而容易地实施本发明的用途和方法。因此，本领域技术人员可以容易地调整缓冲液组分的浓度以及所述缓冲液的pH和电导率，而不使用比所示化合物更多的化合物。
蛋白质纯化，特别是抗体纯化，通常使用亲和色谱进行，亲和色谱通常作为第一色谱步骤或至少在下游纯化级联的第一阶段进行。如实验部分所证明的，本文定义的构成本发明用途和方法的基本部分的水性缓冲液已被证明在涉及亲和色谱的下游纯化级联中非常高效。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，至少第一或第二液相色谱是亲和色谱，还优选第一液相色谱是亲和色谱。优选地，亲和色谱选自蛋白A、蛋白L和重组亲和配体亲和色谱。换句话说，优选使用包含固化蛋白A、蛋白L或重组亲和配体的固体固定相进行亲和色谱。优选地，亲和色谱是蛋白A亲和色谱。换句话说，优选使用包含固化蛋白A的固体固定相进行亲和色谱。优选地，亲和色谱以结合/洗脱模式进行。
包含固化蛋白A的固体固定相在本领域中是众所周知的并且可商购获得。包含可用于实施本发明的固化蛋白A的商业化固定相是例如由GEHealthcare Life Sciences商业化的MabSelectTM树脂(例如PrismA，SuReTM，SuRe LX，SuRe XtraTM)，由Millipore商业化的A和Ultra Plus，由JSR Life Sciences商业化的AmsphereTMA3，由Purolite商业化的Jetted A50。
蛋白质纯化，特别是抗体纯化，通常涉及一个或两个离子交换色谱，通常进一步进行亲和色谱。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，第二和第三液相色谱中的至少一种是离子交换色谱，还优选地，第二液相色谱是离子交换色谱。还优选地，在本文详述的任何用途和方法中，第二和第三液相色谱是离子交换色谱。还优选地，在本文详述的任何用途和方法中，第二和第三液相色谱是离子交换色谱，第二液相色谱和第三液相色谱优选以流穿模式进行。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，第二和第三液相色谱中的至少一种是阳离子交换色谱，还优选地，第二液相色谱是阳离子交换色谱。优选地，阳离子交换色谱以迎头或流穿模式进行，还优选以流穿模式进行。
适用于阳离子交换色谱的固体固定相在本领域中是众所周知的并且可商购获得。适用于可用于实施本发明的阳离子交换色谱的商业化固体固定相是例如由Millipore商业化的树脂(例如COO-，SO3 -)，由Millipore商业化的树脂(例如S，HCX，CPS，CPX，CP-FT)，由Sartorius商业化的Sartobind S膜，由Pall商业化的Mustang S膜。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，第二和第三液相色谱中的至少一种是阴离子交换色谱，还优选地，第三液相色谱是阴离子交换色谱。优选地，阴离子交换色谱以迎头或流穿模式进行，还优选以流穿模式进行。
适用于阴离子交换色谱的固体固定相在本领域中是众所周知的并且可商购获得。适用于可用于实施本发明的阴离子交换色谱的商业化固体固定相是例如由Millipore商业化的Q树脂，由Tosoh商业化的NH2-750F，由Sartorius商业化的Sartobind Q膜，由Pall商业化的Mustang Q膜，由Millipore商业化的NatriFlo HD-Q膜。
适用于多模式色谱的固体固定相在本领域中是众所周知的并且可商购获得。适用于可用于实施本发明的多模式色谱的商业化固体固定相是例如由GE Healthcare LifeSciences商业化的Capto-Adhere，其是具有阴离子交换和疏水相互作用性质的多模式树脂，由Sartorius商业化的Sartobind STIC。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述第一液相色谱是亲和色谱，优选蛋白A亲和色谱，并且所述第二色谱是阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，疏水相互作用色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质。还优选地，所述第一液相色谱是亲和色谱，优选蛋白A亲和色谱，并且所述第二色谱是阳离子交换色谱。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述第一液相色谱是亲和色谱，优选蛋白A亲和色谱，并且所述第二色谱是阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，疏水相互作用色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质，优选阳离子交换色谱；并且所述第三色谱是阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，疏水相互作用色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质，优选地，阴离子交换色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质。
优选地，在本文详述的任何用途和方法中，所述第一液相色谱是亲和色谱，优选蛋白A亲和色谱，并且所述亲和色谱以结合/洗脱模式进行；所述第二色谱是阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，疏水相互作用色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质，优选阳离子交换色谱，还优选以迎头或流穿模式进行的阳离子交换色谱；并且所述第三色谱是阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，疏水相互作用色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质，优选地，阴离子交换色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质的，还优选以迎头或流穿模式进行的阴离子交换色谱或多模式色谱，优选具有阴离子交换和疏水相互作用性质。
更优选地，在本文详述的任何用途和方法中：
-目的蛋白质是抗体，其片段或包含所述片段的融合蛋白；
-目的蛋白质具有6至9.5的等电点；
-第一液相色谱是亲和色谱，优选蛋白A亲和色谱；
-第二色谱是阳离子交换色谱或阴离子交换色谱，优选阳离子交换色谱；
-所述用途或方法任选地包括第三色谱，其为阳离子交换色谱或阴离子交换色谱，优选阴离子交换色谱；
-对于各所述第一和第二以及任选的第三液相色谱，使用包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液作为选自平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和漂洗缓冲液中的至少一种缓冲液，优选作为选自平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和漂洗缓冲液中的至少三种缓冲液，还优选作为平衡缓冲液，洗涤缓冲液；洗脱缓冲液和替代地再生缓冲液；
-所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比在1.5和2之间。并且所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比在1和2.5之间，并且所述水性缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
还优选地，在本文详述的任何用途和方法中：
-目的蛋白质是抗体，其片段或包含所述片段的融合蛋白；
-目的蛋白质具有6至9.5的等电点；
-第一液相色谱是蛋白A亲和色谱；
-第二色谱是阳离子交换色谱；
-所述用途或方法包括第三色谱，其为阴离子交换色谱；
-对于各所述第一、第二和第三液相色谱，使用包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液作为上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和替代地再生缓冲液；
-所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比为约2，所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比为1-2.5，并且所述水性缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
还优选地，在本文详述的任何用途和方法中：
-目的蛋白质是抗体，其片段或包含所述片段的融合蛋白；
-目的蛋白质具有6至9.5的等电点；
-第一液相色谱是蛋白A亲和色谱，并以结合/洗脱模式进行；
-第二色谱是阳离子交换色谱，并且优选以迎头或流穿模式进行；
-所述用途或方法包括第三色谱，其为阴离子交换色谱法，并且优选以迎头或流穿模式进行；
-对于各所述第一，第二和第三液相色谱，使用包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液作为平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；
-所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比为约2，所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比为1-2.5，并且所述水性缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
优选地，本文详述的方法还包括低pH灭活步骤，其可以在任何液相色谱之前，两个液相色谱之间或在已经实施所有液相色谱之后实施。优选地，在第一液相色谱和第二液相色谱之间进行所述低pH灭活步骤。优选地，在第二液相色谱和第三液相色谱之间进行所述低pH灭活步骤。
优选地，本发明的方法还包括纳滤步骤和/或超滤和透滤步骤，其可以在任何液相色谱之前，两个液相色谱之间或在已经实施所有液相色谱之后实施。还优选地，在所有液相色谱之后进行所述纳滤步骤和/或超滤和透滤步骤。
附图说明
图1：根据本发明的缓冲液配方和用途的原理。
图2：使用NaOH 1mol/L的两种不同配方的理论滴定曲线。
图3：实验滴定曲线。逐渐加入NaOH后，包含55mM乙酸盐、20mM磷酸盐和10mM Tris碱的水性缓冲溶液的pH和电导率的变化。
实施例
以下实施例旨在说明本发明的各种实施方式，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或定义。
实施例1。根据本发明的两种缓冲液的理论和实验滴定支持这种缓冲液组合物用于DSP工艺的多功能性
在以下实验中，首先在理论上，即在计算机上使用本领域定义的数学模型，或在实验上，即在实验室环境中，在加入NaOH后，滴定包含55mM乙酸盐，20mM磷酸盐和10mM Tris碱或20mM乙酸盐，20mM磷酸盐和10mM Tris碱的两种水性缓冲液。
1.材料和方法
溶液
为了制备缓冲液，制备了以下溶液：
55mM乙酸盐，20mM磷酸盐和10mM Tris碱
NaOH 1M作为滴定溶液
这些溶液由Merck KGaA的相应商业品种制成：
冰醋酸(64-19-7)
正磷酸85％(7664-38-2)
Tris碱(77-86-1)
NaOH 32％(1310-73-2)
缓冲液在室温下制备。
理论滴定
基于以下Henderson-Hasselbalch方程(热力学模型)，在加入NaOH后进行包含55mM乙酸盐，20mM磷酸盐和10mM Tris碱或20mM乙酸盐，20mM磷酸盐和10mM Tris碱的两种水性缓冲液的理论滴定：
pH：给定物质浓度值的溶液的pH
Ka：酸解离常数
[A-]：偶联物碱的浓度
[HA]：酸的浓度
内部软件用于执行多平衡情况的计算。该方法由Baeza-Baeza等(计算多平衡问题中化学物质浓度的系统方法(Systematic Approach To Calculate the Concentrationof Chemical Species in Multi-Equilibrium Problems)，Journal of ChemicalEducation 201188(2)，169-173)详细介绍了。
实验滴定
使用Metrohm的713pH Meter装置进行pH滴定。
使用Metrohm的712Conductometer进行电导率测量。
根据供应商建议进行测量。滴定的每个点对应于一定体积的1M NaOH添加量，因此对应于缓冲液中NaOH的总浓度。
结果
如图1和2所示，加入NaOH后，水性缓冲溶液的pH值大致根据线性曲线变化。没有观察到pH显著升高，这证实了溶液在pH 2和10之间的整个范围内的缓冲性质。
实施例2。使用本发明方法实施纯化级联的实施例。
使用常规细胞培养方法在CHO细胞中重组产生具有约8.5的等电点的单克隆IgG1抗体(下文称A1)，并且根据本发明方法的两个不同实施方式纯化各自收获的细胞培养液。
A.纯化方法1
对于纯化方法1，按以下顺序进行以下下游纯化级联：
1.使用Amsphere A3色谱柱的蛋白A亲和色谱(来自JSR Life Science)
a)该柱用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8的缓冲液平衡，
b)将细胞培养收获物在来自Merck Millipore的Stericup 0.22μm上过滤，然后上样到柱；
c)第一洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8
d)第二洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1.5M NaCl组成并用1M NaOH调整pH值为5.5
e)第三洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8
f)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为3.2的缓冲液从柱洗脱目标蛋白质。保存洗脱液用于下一步色谱；
g)使用0.1M NaOH进行再生
h)使用0.5M NaOH进行净化(sanitation)
i)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8的缓冲液进行漂洗
2.使用EMD COO-(M)柱(来自Merck Millipore)进行CEX色谱；
a)该柱使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5.5的缓冲液平衡
b)步骤1.f)的洗脱液在上样柱之前用1M NaOH将其调整至pH 5.5。
c)使洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整至pH 5.5。将得到的流穿物(2.b和2.c)保存用于下一步色谱；
d)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行漂洗
3.使用Capto Adhere柱(来自GE Healthcare)的AEX色谱；
a)使用由水、0.025M乙酸盐、0.01M磷酸盐、0.005M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为7.5的缓冲液平衡柱
b)在上样柱之前，用1M NaOH将CEX流穿物调整至pH 7.5。
c)使洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.025M乙酸盐、0.01M磷酸盐、0.005MTris碱组成并用1M NaOH调节pH 7.5。将得到的流穿物(3.b和3.c)保存用于分析；
d)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1.5M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
进行步骤3b)c)的流穿物的质量和杂质分析。结果列于表1。
B.纯化方法2
对于纯化方法2，按以下顺序进行以下下游纯化级联：
1.使用Amsphere A3色谱柱(来自JSR Life Science)的蛋白A亲和色谱
a)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液平衡柱
b)将细胞培养收获物在来自Merck Millipore的Stericup 0.22μm上过滤，然后上样到柱；
c)第一洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8
d)第二洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1.5M NaCl组成并用1M NaOH调整pH值为5.5
e)第三洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8
f)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为3.2的缓冲液从柱洗脱目标蛋白质。将洗脱液保存用于下一步色谱；
g)使用0.1M NaOH进行再生
h)使用0.5M NaOH进行净化
i)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液进行漂洗
2.使用EMD COO-(M)柱(来自Merck Millipore)进行CEX色谱；
a)该柱使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5.5的缓冲液平衡
b)步骤1.f)的洗脱液在上样柱之前用1M NaOH将其调节至pH 5.5。
c)洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5.5。将得到的流穿物(2.b和2.c)保存用于下一步色谱；
d)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行漂洗
3.使用Capto Adhere柱(来自GE Healthcare)的AEX色谱；
a)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为7.5的缓冲液平衡柱
b)在上样柱之前，用1M NaOH将CEX流穿物调节至pH 7.5。
c)洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调节pH 7.5。将得到的流穿物(3.b和3.c)保存用于分析；
d)使用由水、0.1M乙酸盐、0.1M磷酸盐、0.05M Tris碱组成的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为7.5的缓冲液进行漂洗
进行步骤3b)c)的流穿物的质量和杂质分析。结果列于表2。
表1：根据方法1进一步纯化的A1纯化说明
表2：根据方法2进一步纯化的A1纯化说明
结论：两种纯化级联的产率相当(约70％)。尽管使用了不同的收获批次，但两个级联的累计百分比和HCP浓度都非常低并且相当(在纯化结束时小于20ppm的HCP和0.3％的HMW)。第二个例子中剪切形式的高值是由于相应收获物的初始值和纯化对LMW的有限影响。总之，所使用的不同缓冲液比例在性能和纯化方面显示出很好且相当的结果。
实施例3。使用本发明方法实施纯化级联的实施例。
使用常规细胞培养方法在CHO细胞中重组产生包含等电点为6.09的抗体片段(下文称为A2)的融合蛋白，并根据本发明方法的两个实施方式纯化各自收获的细胞培养液。
A.纯化方法1
对于纯化方法1，按以下顺序进行以下下游纯化级联：
1.使用Amsphere A3色谱柱(来自JSR Life Science)的蛋白A亲和色谱
a)该柱用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8的缓冲液平衡
b)将细胞培养收获物在来自Merck Millipore的Stericup 0.22μm过滤，然后上样到柱；
c)第一洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8
d)第二洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1.5M NaCl组成并用1M NaOH调整pH值为5.5
e)第三洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8
f)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为3.2的缓冲液从柱洗脱目的蛋白质。将洗脱液保存用于下一步色谱；
g)使用0.1M NaOH进行再生
h)使用0.5M NaOH进行净化
i)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为8的缓冲液进行漂洗
2.使用EMD COO-(M)柱(来自Merck Millipore)进行CEX色谱；
a)该柱使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5.5的缓冲液平衡
b)步骤1.f)的洗脱液在上样柱之前用1M NaOH将其调节至pH 5.5。
c)洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5.5。将得到的流穿物(2.b和2.c)保存用于下一步色谱；
d)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行漂洗
3.使用Eshmuno Q柱(来自Merck Millipore)的AEX色谱；
a)该柱用由水、0.025M醋酸盐、0.01M磷酸盐、0.005M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5的缓冲液平衡
b)在上样柱之前，用1M乙酸将CEX流穿物调节至pH 5。
c)洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.025M乙酸盐、0.01M磷酸盐、0.005MTris碱组成并用1M NaOH调整至pH为5。将得到的流穿物(3.b和3.c)保存用于分析；
d)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1.5M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.05M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5的缓冲液进行漂洗
进行步骤3b)c)的流穿物的质量和杂质分析。结果列于表1。
C.纯化方法2
对于纯化方法2，按以下顺序进行以下下游纯化级联：
1.使用Amsphere A3色谱柱(来自JSR Life Science)的蛋白A亲和色谱
a)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液平衡柱
b)将细胞培养收获物在来自Merck Millipore的Stericup 0.22μm过滤，然后上样到柱；
c)第一洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整至pH 8
d)第二洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01MTris碱、1.5M NaCl组成并用1M NaOH调整至pH 5.5
e)第三洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整至pH 8
f)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为3.2的缓冲液从柱洗脱目的蛋白质。将洗脱液保存用于下一步色谱；
g)使用0.1M NaOH进行再生
h)使用0.5M NaOH进行净化
i)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液进行漂洗
2.使用EMD COO-(M)柱(来自Merck Millipore)进行CEX色谱；
a)该柱使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整pH值为5.5的缓冲液平衡
b)步骤1.f)的洗脱液在上样柱之前用1M NaOH将其调整至pH 5.5。
c)洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整至pH 5.5。将得到的流穿物(2.b和2.c)保存用于下一步色谱；
d)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为8的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行漂洗
3.使用Eshmuno Q柱(来自Merck Millipore)的AEX色谱；
a)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5的缓冲液平衡柱
b)在上样柱之前，用1M乙酸将CEX流穿物调整至pH 5。
c)洗涤缓冲液流过柱，其由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1M NaOH调整至pH 5。将得到的流穿物(3.b和3.c)保存用于分析；
d)使用由水、0.1M乙酸盐、0.1M磷酸盐、0.0SM Tris碱组成的缓冲液进行再生
e)使用0.5M NaOH进行净化
f)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱、1M NaCl组成并用1MNaOH调整pH值为5.5的缓冲液进行再生
g)使用由水、0.02M乙酸盐、0.02M磷酸盐、0.01M Tris碱组成并用1MNaOH调整pH值为5的缓冲液进行漂洗
进行步骤3b)c)的流穿物的质量和杂质分析。结果列于表2。
表3：根据方法1进一步纯化的A2纯化说明
表4：根据方法2进一步纯化的A2纯化说明
结论：两种纯化级联的产率相当(约65％)。尽管使用了不同的收获批次，但两个级联的累计百分比和HCP浓度都非常低并且相当(在纯化结束时约30ppm的HCP和0.3％的HMW)。第二个例子中剪切形式的高值是由于相应收获物的初始值和纯化对LMW的有限影响。总之，所使用的不同缓冲液比例在性能和纯化方面显示出很好且相当的结果。
参考文献
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Carta G.和Jungbauer A.(2010)蛋白质色谱(Protein Chromatography)，Wiley-VCH Verlag GMBH.
Claims (15)
1.包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠或由其组成的水性缓冲液用于从复杂溶液中纯化目的蛋白质的用途，所述用途包括至少第一液相色谱和第二色谱，其中对于各所述液相色谱，所述水性缓冲液用作选自平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液的至少一种缓冲液。
2.一种从复杂溶液中纯化目的蛋白质的方法，所述方法包括至少第一液相色谱和第二色谱，其中对于各所述液相色谱，包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液用作选自平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液的至少一种缓冲液。
3.一种从复杂溶液中纯化目的蛋白质的方法，其中所述方法包括通过至少第一液相色谱和第二色谱纯化所述含有目的蛋白质的复杂溶液，其中对于各所述第一和第二液相色谱，使用包含化合物乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质和再生所述固体固定相的至少一个步骤。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述方法包括：
a.使用包含第一固体固定相的至少第一液相色谱纯化包含所述目的蛋白质的所述复杂溶液，由此获得第一目的蛋白质洗脱液，其中使用包含化合物乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质和再生所述固体固定相的至少一个y步骤；和
b.使用包含第二固体固定相的第二液相色谱纯化步骤a)的第一目的蛋白质洗脱液，由此获得第二目的蛋白质洗脱液，其中使用包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质和再生所述固体固定相的至少一个步骤。
5.如权利要求2所述的方法，其中在所述第一或第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作选自平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液的至少两种缓冲液，优选在平衡缓冲液、洗涤缓冲液和再生缓冲液中选择。
6.如权利要求2所述的方法，其中在所述第一和第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作选自平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液的至少两种缓冲液，优选在平衡缓冲液，洗涤缓冲液和再生缓冲液中选择。
7.如权利要求2所述的方法，其中在所述第一或第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少三种缓冲液，优选用作平衡缓冲液、洗涤缓冲液和再生缓冲液。
8.如权利要求2所述的方法，其中在所述第一和第二液相色谱中，所述水性缓冲液用作在平衡缓冲液、上样调节缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、再生缓冲液和漂洗缓冲液中选择的至少三种缓冲液，优选用作平衡缓冲液、洗涤缓冲液和再生缓冲液。
9.如权利要求3或4中任一项所述的方法，其中在所述第一或第二液相色谱中，使用包含乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠的水性缓冲液进行选自平衡所述固体固定相，洗涤所述固体固定相，洗脱目的蛋白质和再生所述固体固定相的至少两个步骤。
10.如权利要求1所述的用途或如权利要求2-9中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲液由水、乙酸盐、磷酸盐、Tris碱和任选的氢氧化钠和/或氯化钠组成。
11.如权利要求1或10所述的用途或如权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲液具有相同的磷酸盐与Tris碱的摩尔比和相同的乙酸盐与磷酸盐的摩尔比。
12.如权利要求1、9或10中任一项所述的用途或如权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲液中磷酸盐与Tris碱的摩尔比在1.5和2之间。
13.如权利要求1、9、10或11中任一项所述的用途或如权利要求2-11中任一项所述的方法，其中所述水性缓冲液中乙酸盐与磷酸盐的摩尔比在1和2.5之间。
14.如权利要求1、9、10、11或12中任一项所述的用途或如权利要求2-12中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白质是抗体、其片段或包含所述片段的融合蛋白。
15.如权利要求1或9-13中任一项所述的用途或如权利要求2-13中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白质具有6至9.5的等电点。
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