CN116829567A - 基于环状二硫化物修饰的磷酸酯的寡核苷酸前药 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含式(I)结构的化合物：环状二硫化物部分‑磷偶联基团(I)。环状二硫化物部分具有(C‑I)、(C‑II)或(C‑III)的结构。本发明还涉及包含一种或多种含式(I)结构的化合物的寡核苷酸，其中至少一个磷偶联基团含有核苷或寡核苷酸。本发明还涉及包含本文所述的寡核苷酸的药物组合物和通过向受试者施用施用治疗有效量的本文所述的寡核苷酸来减少或抑制靶基因表达的方法。

Description

基于环状二硫化物修饰的磷酸酯的寡核苷酸前药

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月31日递交的美国临时申请号63/132,535；和于2021年12月9日递交的美国临时申请号63/287,833的优先权的权益，该两者以其整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明一般涉及基于修饰的磷酸酯的寡核苷酸前药的领域。

背景技术

磷酸酯是形成核苷酸及其组装成RNA和DNA的重要中间体。在细胞内，磷酸酯基团通常用作可调的离去基团。磷酸酯在生理pH下带电，其用于将磷酸酯结合至酶的活性位点。然而，为了使磷酸酯结合酶，其必须首先穿透膜以接近酶，因为除了通过内吞作用，带电分子可能难以跨越细胞膜。在化合物具有较大、更亲脂性的取代基的情况下，该限制可以得到改善。

可替代地，已经研究了前药途径，以暂时掩蔽在生理pH下寡核苷酸上磷酸酯的任何负电荷。前药是以无活性或活性显著低的形式施用的药剂，并且在不同刺激下，其在体内经历化学或酶促转化以产生活性母体药物。用可细胞裂解的保护/掩蔽基团来掩蔽寡核苷酸的磷酸酯基团的负电荷的前药途径可提供优于其未保护的对应物的许多优点，其包括，例如，通过细胞隔离增强细胞穿透和避免或最小化血清中的降解。

然而，前药途径仍然具有实质性挑战，部分地是因为难以选择最佳掩蔽基团。例如，保护基团的细胞裂解通常可产生被视为不利或甚至有毒的产物。此外，保护基团必须在允许在肠中吸收和允许在血液或靶细胞中裂解之间达到平衡。

因此，持续需要开发新的和改善的修饰的磷酸酯前药用于掩蔽寡核苷酸的核苷酸间磷酸酯键，以制备有效和高效的基于寡核苷酸的药物，用于寡核苷酸的有效体内递送和改善的体内功效。

发明内容

本发明的一个方面涉及包含式(I)结构的化合物： 该具有以下结构： 在这些式中：

R₁是O或S，并且键合至的P原子；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环；

G是O、N(R’)、S或C(R¹⁴)(R¹⁵)；

n是0-6的整数；

R¹³在每次出现时独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地是H、卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、杂芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、N(R’)(R”)；

R’和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基、羟基、烷氧基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基或ω-羟基炔基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；并且

R^sub每次出现时独立地是卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧代、硝基、氨基、酰基氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基氨基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷基、链烷磺酰基、芳烃磺酰基、链烷磺酰胺基、芳烃磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、酰氧基、氰基或脲基。

在一些实施方案中，在中：

R₁是O；

G是CH₂；

n是0或1；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或C₁-C₆亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或C₁-C₆亚烷基-N(R’)(R”)、C₁-C₆烷基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或C₁-C₆亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或C₁-C₆亚烷基-N(R’)(R”)、C₁-C₆烷基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成6-8个原子的第二环；

R¹³在每次出现时独立地是H、C₁-C₆烷基、芳基、烷基羰基或芳基羰基；并且

R’和R”各自独立地是H或C₁-C₆烷基。

在一些实施方案中，具有的结构。R₂可以是任选地取代的芳基，例如，任选地取代的苯基。在一些实施方案中，R₂是单-、二-或三-取代的苯基。在一个实施方案中，R₂是对位取代的苯基。在一些实施方案中，R₂是任选地取代的C_1-6烷基。在一个实施方案中，R₂是卤代C_1-6烷基。在一个实施方案中，R₂是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，具有的结构。R₂可以是任选地取代的芳基，例如，任选地取代的苯基。在一些实施方案中，R₂是单-、二-或三-取代的苯基。在一个实施方案中，R₂是对位取代的苯基。在一些实施方案中，R₂是任选地取代的C_1-6烷基。在一个实施方案中，R₂是卤代C_1-6烷基。在一个实施方案中，R₂是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，具有选自以下Ia)、Ib)和II)基团之一的结构。Ia)基团含有以下结构：

Ib)基团含有以下结构：

II)基团含有以下结构：

在一些实施方案中，具有以下结构： 在这些式中：

X₁和Z₁各自独立地是H、OH、OM、OR¹³、SH、SM、SR¹³、C(O)H、S(O)H或烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，N(R’)(R”)、B(R¹³)₃、BH₃ ^-、Se；或D-Q，其中D在每次出现时独立地是不存在、O、S、N(R’)、亚烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，并且Q在每次出现时独立地是核苷或寡核苷酸；

X₂和Z₂各自独立地是N(R’)(R”)、OR¹⁸或D-Q，其中D在每次出现时独立地是不存在、O、S、N、N(R’)、亚烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，并且Q在每次出现时独立地是核苷或寡核苷酸，

Y₁是S、O或N(R’)；

M是有机或无机阳离子；并且

R¹⁸是H或烷基，任选地被一个或多个R^sub基团取代。

在一些实施方案中，具有的结构。在该式中：X₁和Z₁各自独立地是OH、OM、SH、SM、C(O)H、S(O)H、任选地被一个或多个羟基或卤素基团取代的C₁-C₆烷基，或D-Q；D在每次出现时独立地是不存在、O、S、NH、任选被一个或多个卤素基团取代的C₁-C₆亚烷基；并且Y₁是S或O。在一个实施方案中，X₁是OH或SH；并且Z₁是D-Q。

在一些实施方案中，具有的结构。在该式中：X₂是N(R’)(R”)；Z₂是X₂、OR¹⁸或D-Q；R¹⁸是H或被氰基取代的C₁-C₆烷基；并且R’和R”各自独立地是C₁-C₆烷基。

在一个实施方案中，具有选自以下的结构：变量R’、R”和Q是如以上在式P-I和P-II中所定义。

在一个实施方案中，化合物具有选自以下之一的结构：

在一个实施方案中，具有(P-I)的结构，并且 -P(Y₁)(X₁)-具有选自以下的结构：

X是O或S。

在一些实施方案中，化合物含有一个或多个配体，其任选地通过一个或多个接头连接至的R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉中的任一个。

在一些实施方案中，配体选自抗体、受体的配体结合部分、受体的配体、适体、基于碳水化合物的配体、脂肪酸、脂蛋白、叶酸、促甲状腺激素、促黑素、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白、二膦酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、亲脂性部分(例如，增强血浆蛋白结合的亲脂性部分)、胆固醇、类固醇、胆汁酸、维生素B12、生物素、荧光团和肽。

在某些实施方案中，至少一种配体是靶向肝组织的基于碳水化合物的配体。在一个实施方案中，基于碳水化合物的配体选自半乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、多价GalNAc、甘露糖、多价甘露糖、乳糖、多价乳糖、N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)、多价GlcNAc、葡萄糖、多价葡萄糖、岩藻糖和多价岩藻糖。

在某些实施方案中，至少一个配体是亲脂性部分。在一个实施方案中，通过logK_ow测量的亲脂性部分的亲脂性超过0，或通过化合物的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的化合物的疏水性超过0.2。

在一个实施方案中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C₄-C₃₀烃链，和任选的选自羟基、胺、羧酸、磺酸、磷酸、硫醇、叠氮化物和炔烃的官能团。例如，亲脂性部分含有饱和或不饱和的C₆-C₁₈烃链。

在某些实施方案中，至少一种配体靶向介导至CNS组织的递送的受体。在一个实施方案中，配体选自Angiopep-2、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体、转铁蛋白受体(TfR)配体、甘露糖受体配体、葡萄糖转运蛋白和LDL受体配体。

在某些实施方案中，至少一种配体靶向介导至眼组织的递送的受体。在一个实施方案中，配体选自反式视黄醇、RGD肽、LDL受体配体和基于碳水化合物的配体。

本发明的另一方面涉及包含一个或多个式(I)结构的寡核苷酸(例如，单链iRNA剂或双链iRNA剂)：

本发明的另一方面涉及包含一个或多个式(II)结构的寡核苷酸(例如，单链iRNA剂或双链iRNA剂)：

在式(I)和(II)中，具有以下结构： 或其盐。

在这些式中：

R₁是O或S，并且键合至式(I)的的P原子，或式(II)的P原子；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环；

G是O、N(R’)、S或C(R¹⁴)(R¹⁵)；

n是0-6的整数；

R¹³在每次出现时独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地是H、卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、杂芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、N(R’)(R”)；

R’和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基、羟基、烷氧基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基或ω-羟基炔基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；并且

R^sub每次出现时独立地是卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧代、硝基、氨基、酰基氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基氨基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷基、链烷磺酰基、芳烃磺酰基、链烷磺酰胺基、芳烃磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、酰氧基、氰基或脲基；

其中，当具有式(C-III)结构时，至少一个 连接在核苷或寡核苷酸的5’端。

在式(I)中，至少一个含有核苷或寡核苷酸。

在式(II)中，*代表至寡核苷酸的键，Y不存在、＝O或＝S；X是OH、SH或X’，其中X’是OR¹³或SR¹³。

所有上述涉及与化合物相关的本发明第一方面中的 的式(C-I)和式(C-II)、的所有式、这些式中定义的所有变量、所有配体以及所有与化合物相关的亚属和种类结构、 和的实施方案适用于与寡核苷酸相关的本发明的这些方面。

在一些实施方案中，具有选自以下Ia)、Ib)和II)基团之一的结构。Ia)基团含有以下结构：

Ib)基团含有以下结构：

II)基团含有以下结构：

在一些实施方案中，具有选自III)基团的结构之一的结构。III)基团含有以下结构：

在一些实施方案中，寡核苷酸含有选自以下之一的结构：

或其盐，其中X是O或S。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有具有下式的结构： -P(O)(SH)-*或其盐。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有具有下式的结构： -P(O)(OH)-*或其盐.

在一些实施方案中，寡核苷酸含有具有下式的结构： -P(O)(OR¹³)-*或其盐。变量R¹³如上所定义。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有具有下式的结构： -P(S)(OR¹³)-*或其盐。变量R¹³如上所定义。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有具有下式的结构： -P(OR¹³)-*或其盐。变量R¹³如上所定义。

在一些实施方案中，具有选自以下的结构：

其中*指示与-P(X)(Y)-*基团的磷原子的键。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有选自以下之一的结构：

在一个实施方案中，寡核苷酸含有选自以下的结构： X是O或S。

在一些实施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸的5’-端含有至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸具有以下结构：或其盐。在这些结构中：

*代表与随后任选地修饰的核苷酸间连接的键；

碱基是任选地修饰的核碱基；

Rs是并且

R是H、OH、O-甲氧基烷基、O-甲基、O-烯丙基、CH₂-烯丙基、氟、O-N-甲基乙酰胺基(O-NMA)、O-二甲基氨基乙氧基乙基(O-DMAEOE)、O-氨基丙基(O-AP)或ara-F。变量X、X’和Y如以上式(II)中所定义。

在一些实施方案中，寡核苷酸5’-端的第一核苷酸具有以下结构：

或其盐。变量碱基、R^S、R¹³、R¹⁴和Y如上所定义。

在一些实施方案中，寡核苷酸5’-端的第一核苷酸具有以下结构：或其盐。变量碱基、R^S和R如上所定义。

在一些实施方案中，这些结构中的碱基是尿苷。在一些实施方案中，这些结构中的R是甲氧基。在一些实施方案中，这些结构中的R是氢。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有在寡核苷酸的3’-端的至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸含有在寡核苷酸的5’-端的至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸含有在寡核苷酸的5’-端的至少一个和在寡核苷酸的3’-端的至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸含有在寡核苷酸的内部位置的至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸是单链寡核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸是包含有义链和反义链的双链寡核苷酸。

在一些实施方案中，有义链和反义链各自的长度为15至30个核苷酸。在一个实施方案中，有义链和反义链各自的长度为19-25个核苷酸。在一个实施方案中，有义链和反义链各自的长度为21至23个核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸在至少一个末端上包含单链突出端，例如，长度为1-10个核苷酸的3’和/或5’突出端，例如，长度为1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，两条链在双链体区域中具有至少一个1-5(例如，1、2、3、4或5)个单链核苷酸的链段。在一个实施方案中，单链突出端长度是1、2或3个核苷酸，任选地在至少一个末端上。

在一些实施方案中，寡核苷酸还可以具有平端，位于反义链的5’-端(或有义链的3’-端)，或反之亦然。在一个实施方案中，寡核苷酸在反义链的3’-端包含3’突出端，并且任选地在反义链的5’-端包含平端。在一个实施方案中，寡核苷酸在有义链的5’-端具有5’突出端，并且任选地在反义链的5’-端具有平端。在一个实施方案中，寡核苷酸在双链iRNA双链体的两端具有两个平端。

在一个实施方案中，寡核苷酸的有义链长度为21个核苷酸，并且反义链长度为23个核苷酸，其中该链形成21个连续碱基对的双链体区域，该双链体区域在3’-端具有2个核苷酸长的单链突出端。

在一个实施方案中，有义链含有至少一个在一个实施方案中，反义链含有至少一个在一个实施方案中，有义链和反义链各自含有至少一个

在一个实施方案中，寡核苷酸含有在反义链的5’-端的至少一个 并且在有义链的3’-端的至少一个靶向配体。

在一些实施方案中，有义链在3’-端进一步包含至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，有义链在3’-端包含至少两个硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，有义链在5’-端进一步包含至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，有义链在5’-端包含至少两个硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，反义链在3’-端进一步包含至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链在3’-端包含至少两个硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，寡核苷酸在反义链的5’-端进一步包含磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一个实施方案中，磷酸酯模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。

在一些实施方案中，反义链的5’-端不含有5’-乙烯基膦酸酯(VP)。

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含至少一个末端手性磷原子。

对核苷酸间连接的位点特异性、手性修饰可出现在链的5’端、3’端或5’端和3’端两者处。这在本文中称为“末端”手性修饰。末端修饰可以出现在末端区域中的3’或5’-末端位置处，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内。手性修饰可以出现在有义链、反义链或有义链和反义链两者上。每个手性纯磷原子可以是Rp构型或Sp构型及其组合。关于手性修饰和手性修饰的dsRNA剂的更多细节可以在2018年12月21日递交的名称为“手性修饰的双链RNA剂”的PCT/US18/67103中找到，以其整体通过引用并入本文。

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含出现在反义链的3’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；出现在反义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型的连接磷原子；以及出现在有义链的5’-端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型或Sp构型的连接磷原子。

在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包含出现在反义链的3’端的第一和第二核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；出现在反义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型的连接磷原子；以及出现在有义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp或Sp构型的连接磷原子。

在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包含出现在反义链的3’端的第一、第二和第三核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；出现在反义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型的连接磷原子；以及出现在有义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp或Sp构型的连接磷原子。

在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包含出现在反义链的3’端的第一和第二核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；出现在反义链的3’端的第三核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型的连接磷原子；出现在反义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型的连接磷原子；以及出现在有义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp或Sp构型的连接磷原子。

在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包含出现在反义链的3’端的第一和第二核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；出现在反义链的5’端的第一和第二核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp构型的连接磷原子；以及出现在有义链的5’端的第一核苷酸间连接处的末端手性修饰，其具有Rp或Sp构型的连接磷原子。

在一些实施方案中，寡核苷酸在反义链上的前五个核苷酸处(从5’端计数)具有至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接。

在一些实施方案中，反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个磷酸酯核苷酸间连接分隔的一个、两个或三个硫代磷酸酯核苷酸间连接的两个嵌段。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有一个或多个靶向配体，其任选地通过一个或多个接头连接至化合物的的R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉中的任一个。

在一些实施方案中，靶向配体选自抗体、受体的配体结合部分、受体的配体、适体、基于碳水化合物的配体、脂肪酸、脂蛋白、叶酸、促甲状腺激素、促黑素、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化的聚氨基酸、转铁蛋白、二膦酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、增强血浆蛋白结合的亲脂性部分、胆固醇、类固醇、胆汁酸、维生素B12、生物素、荧光团和肽。

在一些实施方案中，至少一种靶向配体是亲脂性部分。在一个实施方案中，通过logK_ow测量的亲脂性部分的亲脂性超过0，或通过化合物的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的化合物的疏水性超过0.2。在一个实施方案中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C₄-C₃₀烃链和任选的选自羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔的官能团。例如，亲脂性部分含有饱和或不饱和的C₆-C₁₈烃链。

在一些实施方案中，至少一个靶向配体靶向介导至特定CNS组织的递送的受体。在一个实施方案中，靶向配体选自Angiopep-2、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体、转铁蛋白受体(TfR)配体、甘露糖受体配体、葡萄糖转运蛋白和LDL受体配体。

在一些实施方案中，至少一wh靶向配体靶向介导至眼组织的递送的受体。在一个实施方案中，靶向配体选自反式视黄醇、RGD肽、LDL受体配体和基于碳水化合物的配体。在一个实施方案中，靶向配体是RGD肽，例如H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)。

在一些实施方案中，至少一个靶向配体靶向肝组织。在一些实施方案中，靶向配体是基于碳水化合物的配体。在一个实施方案中，基于碳水化合物的配体选自半乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、多价GalNAc、甘露糖、多价甘露糖、乳糖、多价乳糖、N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)、多价GlcNAc、葡萄糖、多价葡萄糖、岩藻糖和多价岩藻糖。在一个实施方案中，靶向配体是GalNAc缀合物。例如，GalNAc缀合物是通过二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物，例如：

在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链和有义链的100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％被修饰。例如，当寡核苷酸的50％被修饰时，寡核苷酸中存在的所有核苷酸的50％含有本文所述的修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链和有义链包含至少30％、

35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或几乎100％的2’O-甲基修饰的核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸是双链dsRNA剂，并且双链dsRNA剂的至少50％的核苷酸独立地用2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-脱氧或2’-氟修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸是反义的，并且反义寡核苷酸的至少50％的核苷酸独立地用LNA、CeNA、2’-甲氧基乙基或2’-脱氧修饰。

在一些实施方案中，有义链和反义链包含12个或更少、10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、2个或更少或没有2’-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链上具有12个或更少、10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、2个或更少或没有2’-F修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸在反义链上具有12个或更少、10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少、2个或更少或没有2’-F修饰。在一个实施方案中，有义链和反义链包含不超过十个2’-氟修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有一个或多个2’-O修饰，其选自2’-脱氧、2’-O-甲氧基烷基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)和2’-ara-F。

在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链或反义链的任何位置上含有一个或多个2’-F修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％的非天然核苷酸或基本上没有非天然核苷酸。非天然核苷酸的实例包括无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-O-甲氧基烷基(例如，2’-O-甲氧基甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-O-2-甲氧基丙烷基)、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-ara-F、L-核苷修饰(例如，2’-修饰的L-核苷，如，2’-脱氧-L-核苷)、BNA无碱基糖、无碱基环状和开链烷基。

在一些实施方案中，寡核苷酸具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或几乎100％的天然核苷酸。为了这些实施方案的目的，天然核苷酸可以包括具有2’-OH、2’-脱氧和2’-OMe的那些。

在一些实施方案中，反义链含有至少一个未锁定核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)修饰，例如，在反义链的种子区域。在一个实施方案中，种子区域位于反义链的5’-端的2-8位(或5-7位)。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含各自具有15-30个核苷酸长度的有义链和反义链；在反义链上的前五个核苷酸处(从5’端计数)至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；其中双链体区域在19至25个碱基对之间(优选地，19、20、21或22个)；其中寡核苷酸具有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％的非天然核苷酸，或基本上没有非天然核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含各自长度为15-30个核苷酸的有义链和反义链；在反义链上的前五个核苷酸处(从5’端计数)的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；其中双链体区域在19至25个碱基对之间(优选地，19、20、21或22个)；其中寡核苷酸具有大于80％、大于85％、大于95％或几乎100％的天然核苷酸，例如具有2’-OH、2’-脱氧或2’-OMe的那些。

本发明的一个方面提供了包含有义链和反义链的寡核苷酸，每条链独立地具有15至35个核苷酸的长度；从反义链的5’端计数的前五个核苷酸之间的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；有义链和/或反义链上的至少三个、四个、五个或六个2’-脱氧修饰；其中寡核苷酸具有19至25个碱基对的双链(双链体)区域；其中寡核苷酸包含配体。

在一个实施方案中，有义链不包含二醇核酸(GNA)。

可以理解，反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰。换句话说，寡核苷酸能够抑制靶基因的表达。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少三个2’-脱氧修饰。从反义链的5’-端开始计数，2’-脱氧修饰位于反义链的第2和14位，和从反义链的5’-端开始计数，位于有义链的第11位。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少五个2’-脱氧修饰。从反义链的5’-端开始计数，2’-脱氧修饰位于反义链的第2、12和14位，和从反义链的5’-端开始计数，位于有义链的第9和11位。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少七个2’-脱氧修饰。从反义链的5’-端开始计数，2’-脱氧修饰位于反义链的第2、5、7、12和14位，和从反义链的5’-端开始计数，位于有义链的第9和11位。

在一个实施方案中，反义链包含至少五个2’-脱氧修饰，其从反义链的5’-端开始计数，位于第2、5、7、12和14位。反义链的长度为18-25个核苷酸或18-23个核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含少于20％，例如，少于15％、少于10％或少于5％的非天然核苷酸或不包含非天然核苷酸。

在一个实施方案中，有义链不包含二醇核酸(GNA)；并且其中寡核苷酸包含少于20％，例如，少于15％、少于10％或少于5％的非天然核苷酸或全部包含天然核苷酸。

在一个实施方案中，有义链和反义链中的至少一个在有义链或反义链的中心区域中包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，有义链和/或反义链在有义链和/或反义链的中心区域中包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一些实施方案中，有义链具有18至30个核苷酸的长度，并且在有义链的中心区域包含至少两个2’-脱氧修饰。例如，有义链具有18至30个核苷酸的长度，并且包含从有义链的5’端开始计数，第7、8、9、10、11、12和13位内的至少两个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，反义链具有18至30个核苷酸的长度，并且在反义链的中心区域包含至少两个2’-脱氧修饰。例如，反义链具有18至30个核苷酸的长度，并且从反义链的5’端计数，包含10、11、12、13、14、15和16位内的至少两个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链；其中有义链具有17-30个核苷酸的长度，并且在有义链的中心区域包含至少一个2’-脱氧修饰；并且其中反义链独立地具有17-30个核苷酸的长度，并且在反义链的中心区域包含至少两个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链；其中有义链具有17-30个核苷酸的长度，并且在有义链的中心区域包含至少两个2’-脱氧修饰；并且其中反义链独立地具有17-30个核苷酸的长度，并且在反义链的中心区域包含至少一个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，有义链在有义链的中心区域包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，反义链在反义链的中心区域包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含少于20％，例如，少于15％、少于10％或少于5％的非天然核苷酸或寡核苷酸全部包含天然核苷酸；并且其中有义链和/或反义链在有义链和/或反义链的中心区域包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含少于20％，例如，少于15％、少于10％或少于5％的非天然核苷酸或寡核苷酸全部包含天然核苷酸；并且其中有义链在有义链的中心区域包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含少于20％，例如，少于15％、少于10％或少于5％的非天然核苷酸或寡核苷酸全部包含天然核苷酸；并且其中反义链在反义链的中心区域包含至少一个，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或更多个2’-脱氧修饰。

在一个实施方案中，当寡核苷酸包含少于8个非2’OMe核苷酸时，反义链包含至少一个DNA。例如，在本发明的任一个实施方案中，当寡核苷酸包含少于8个非2’OMe核苷酸时，反义链包含至少一个DNA。

在一个实施方案中，当反义链包含两个脱氧核苷酸，并且所述核苷酸位于从反义链的5’-端计数的第2和14位，寡核苷酸包含8个或更少(例如，8、7、6、5、4、3、2、1或0个)非-2’OMe核苷酸。例如，在本发明的任一个实施方案中，当反义包含两个脱氧核苷酸，并且所述核苷酸在从反义链的5’-端计数的第2和14位时，寡核苷酸包含0、1、2、3、4、5、6、7或8个非-2’-OMe核苷酸。

本发明的另一个方面涉及包含本文所述的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在涉及寡核苷酸的本发明的上述方面中与寡核苷酸相关的所有上述实施方案在与药物组合物相关的本发明的该方面中是合适的。

在另一个方面，本发明进一步提供了通过皮下或静脉内施用将本发明的寡核苷酸递送至受试者中的特定靶标的方法。本发明进一步提供了本发明的寡核苷酸，其用于通过皮下或静脉内施用将所述试剂递送至受试者中的特定靶标的方法中。

本发明的另一个方面涉及减少或抑制受试者中靶基因表达的方法，其包括以足以抑制靶基因表达的量向受试者施用本文所述的寡核苷酸。

在与寡核苷酸相关的本发明的上述方面中涉及寡核苷酸的所有上述实施方案在与降低受试者中靶基因表达的方法相关的本发明的这一方面中是合适的。

本发明的另一个方面涉及用于修饰寡核苷酸的方法，其包括在适合于使化合物与寡核苷酸反应的条件下使寡核苷酸与本文所述的化合物接触，其中寡核苷酸包含游离羟基。

在一些实施方案中，游离羟基是5’-末端核苷酸的部分。在一些实施方案中，游离羟基是3’-末端核苷酸的部分。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含5’-OH基团。在一些实施方案中，寡核苷酸包含3’-OH基团。

在一些实施方案中，适用于使化合物与寡核苷酸反应的条件包括酸性催化剂。例如，酸催化剂可以是取代的四唑。合适的酸性催化剂包括但不限于1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苄硫基四唑、4,5-二氰基咪唑、5-硝基苯基-1H-四唑、5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四唑、5-苄硫基-1H-四唑、5-甲硫基-1H-四唑、1-羟基苯并三唑、1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑、4-硝基-1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑、氯化吡啶鎓、溴化吡啶鎓、4-甲基苯磺酸吡啶鎓、氯化2,6-二(叔丁基)吡啶鎓、三氟乙酸吡啶鎓、N-(苯基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-PhIMT)、N-(苯基)-咪唑鎓高氯酸盐(N-PhIMP)、N-(甲基)苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(NMeBIT)、N-(对-乙酰基苯基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-AcPhIMT)、N-(苯基)咪唑鎓四氟硼酸盐(N-PhIMTFB)、咪唑鎓高氯酸盐(IMP)、4-(苯基)-咪唑鎓三氟甲磺酸盐(4-PhIMT)、苯并咪唑鎓四氟硼酸盐(BITFB)、咪唑鎓四氟硼酸盐(IMTFB)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(IMT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、2-(苯基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(2-PhIMT)、N-(甲基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-MeIMT)、4-(甲基)咪唑鎓三氟甲磺酸盐(4-MeIMT)、糖精-1-甲基咪唑、N-(氰甲基)吡咯烷三氟甲磺酸盐、三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸(TFA)、二氯乙酸(DCA)和2,4-二硝基苯甲酸(2,4-DNBA)、氯化铁(FeCl3)、氯化铝(AlCl3)、三氟硼醚合物(BF3-OEt2)、氯化锆(IV)(ZrCl4)和氯化铋(III)(BiCl3)、三甲基氯硅烷、2,4-二硝基苯酚、1-甲基-5-巯基四唑和1-苯基-5-巯基四唑。

涉及本发明上述方面的化合物和寡核苷酸的所有上述实施方案均适用于涉及修饰寡核苷酸的方法的本发明的这一方面。

本发明的另一个方面涉及用于制备修饰的寡核苷酸的方法，其包括：在适用于形成包含式(B)的基团的修饰的寡核苷酸或其盐的条件下：

其中Y是O或S；并且X是-OH、-SH或X’，

氧化包含式(A)的基团的第一寡核苷酸：

或其盐，其中：

RS是

X’是-OR¹³或-SR¹³，其中R¹³是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代。

变量碱基、R^S、X、X’和Y如上所定义。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸包含式(A)的基团，并且修饰的寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸包含式(B)的基团。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的3’-端的最后一个核苷酸包含式(A)的基团，并且修饰的寡核苷酸的3’-端的最后一个核苷酸包含式(B)的基团。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸是根据式(C)：

或其盐，其中：

*代表与随后任选地修饰的核苷酸间连接的键；

碱基是任选地修饰的核碱基；并且

R是H、OH、O-甲氧基烷基、O-甲基、O-烯丙基、CH₂-烯丙基、氟、O-N-甲基乙酰胺基(O-NMA)、O-二甲基氨基乙氧基乙基(O-DMAEOE)、O-氨基丙基(O-AP)或ara-F。变量R^S和X’如上文所定义。

在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸具有式(D)结构：

变量碱基、R、R^S、X和Y如上所定义。

在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸具有式(E)或(F)的结构：

或其盐，其中**代表与随后核苷酸的键。变量碱基、R、R^S、X和Y如上所定义。

在一些实施方案中，适用于形成修饰的寡核苷酸的条件包含使用选自以下的氧化剂：碘；硫；过氧化物；过酸；苯基乙酰基二硫化物；3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物；二黄原酸(dixanthogen)；5-乙氧基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮；3-[(二甲氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)；二甲基亚砜；和N-溴代琥珀酰亚胺。例如，氧化剂可以是过酸(例如，间-氯过苯甲酸)或过氧化物(例如，叔丁基过氧化氢或三甲基甲硅烷基过氧化物)。

涉及本发明上述方面的化合物和寡核苷酸的所有上述实施方案均适用于涉及制备修饰的寡核苷酸的方法的本发明的这一方面。

附图说明

图1是描绘在0.1、1、10和100nm浓度下用RNAiMAX转染后并在转染后24小时进行分析，在原代小鼠肝细胞中在5’端含有修饰的磷酸酯前药的F12 siRNA的体外活性的图。通过qPCR测定残留的F12信使的百分比，并相对于对照作图。

图2是描绘以0.1、1、10和100nm浓度温育并在温育后48小时进行分析，在原代小鼠肝细胞中在5’端含有修饰的磷酸酯前药的F12siRNA双链体的体外活性的图。通过qPCR测定残留的F12信使的百分比，并相对于对照作图。

图3是描绘在0.1、1和10nm浓度下用RNAiMAX转染后并在转染后24小时进行分析，在原代小鼠肝细胞中在5’端含有修饰的磷酸酯前药的F12 siRNA双链体的体外活性的图。通过qPCR测定残留的F12信使的百分比，并相对于对照作图。

图4A-J显示了在DTT还原测定中测试的寡核苷酸的代表性LCMS谱。

图5是描绘与PBS对照相比，以0.3mg/kg的单剂量皮下施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的F12 siRNA双链体后，在小鼠中通过ELISA测定的循环中相对mF12蛋白的图。

图6是描绘与PBS对照相比，以0.1mg/kg或0.3mg/kg的单剂量皮下施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的F12 siRNA双链体后，在小鼠中通过ELISA测定的循环中相对mF12蛋白的图。

图7显示了5’环状二硫化物修饰的磷酸酯前药展示5’-磷酸酯的可能的体内胞质去掩蔽机制。

图8是描绘以0.1mg的单剂量鞘内(IT)施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体14天后，通过qPCR测定的在大鼠的胸部脊髓、海马、额叶皮质、纹状体和心脏中残留的相对SOD1 mRNA的图。

图9是描绘以0.3mg的单剂量鞘内(IT)施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体84天后，通过qPCR测定的在大鼠的胸部脊髓、小脑、额叶皮质、纹状体和心脏中残留的相对SOD1 mRNA的图。

图10是描绘以0.9mg的单剂量鞘内(IT)施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体14天后，通过qPCR测定的在大鼠的胸部脊髓、海马、额叶皮质、纹状体和心脏中残留的相对SOD1 mRNA的图。

图11是描绘以0.9mg的单剂量鞘内(IT)施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体84天后，通过qPCR测定的在大鼠的胸部脊髓、小脑、额叶皮质、纹状体和心脏中残留的相对SOD1 mRNA的图。

图12是描绘以0.9mg的单剂量鞘内施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体14天后，通过qPCR测定的在大鼠的胸部脊髓、海马、额叶皮质、纹状体和心脏中残留的相对SOD1 mRNA的图。

图13是描绘以0.3mg或0.9mg的单剂量鞘内施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1 siRNA双链体14天后，通过qPCR测定的在大鼠的胸部脊髓、海马、额叶皮质、纹状体和心脏中残留的相对SOD1mRNA的图。

图14是描绘以100μg的单剂量颅内脑室施用在5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体7天后，通过qPCR测定的在小鼠右脑半球中残留的相对SOD1 mRNA的图。

具体实施方式

本发明人已发现新类别的环状二硫化物部分，其可被引入到寡核苷酸(例如，单链iRNA剂、双链iRNA剂)的磷酸酯基团以暂时掩蔽磷酸酯基团，并且其可通过细胞活化在体内切割。细胞活化是通过谷胱甘肽或二硫苏糖醇介导的还原/生物转化机制以从掩蔽基团释放磷酸酯基团的活性阴离子形式。本发明人已发现，可以在有义链或反义链或有义链和反义链两者，在链的5’端、3’端和/或内部位置引入环状二硫化物部分。在反义链的5’端引入环状二硫化物部分修饰的磷酸酯前药提供了特别好的结果。

修饰的磷酸酯前药化合物

本发明的一个方面涉及修饰的磷酸酯前药化合物。该化合物包含式(I)结构：

具有以下结构：

在式(C-I)、(C-II)和(C-III)中：

R₁是O或S，并且键合至的P原子；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环；

G是O、N(R’)、S或C(R¹⁴)(R¹⁵)；

n是0-6的整数；

R¹³在每次出现时独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地是H、卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、杂芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、N(R’)(R”)；

R’和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基、羟基、烷氧基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基或ω-羟基炔基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；并且

R^sub每次出现时独立地是卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧代、硝基、氨基、酰基氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基氨基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷基、链烷磺酰基、芳烃磺酰基、链烷磺酰胺基、芳烃磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、酰氧基、氰基或脲基。

在一些实施方案中，在中：

R₁是O；

G是CH₂；

n是0或1；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或C₁-C₆亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或C₁-C₆亚烷基-N(R’)(R”)、C₁-C₆烷基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或C₁-C₆亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或C₁-C₆亚烷基-N(R’)(R”)、C₁-C₆烷基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成6-8个原子的第二环；

R¹³在每次出现时独立地是H、C₁-C₆烷基、芳基、烷基羰基或芳基羰基；并且

R’和R”各自独立地是H或C₁-C₆烷基。

可以具有以下结构：

在式(P-I)和(P-II)中：

X₁和Z₁各自独立地是H、OH、OM、OR¹³、SH、SM、SR¹³，C(O)H、S(O)H或烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代、N(R’)(R”)、B(R¹³)₃、BH₃ ^-、Se；或D-Q，其中D在每次出现时独立地是不存在、O、S、N(R’)、亚烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，并且Q在每次出现时独立地是核苷或寡核苷酸；

X₂和Z₂各自独立地是N(R’)(R”)、OR¹⁸或D-Q，其中D在每次出现时独立地是不存在、O、S、N、N(R’)、亚烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，并且Q在每次出现时独立地是核苷或寡核苷酸，

Y₁是S、O或N(R’)；

M是有机或无机阳离子；并且

R¹⁸是H或烷基，任选地被一个或多个R^sub基团取代。

在一些实施方案中，具有结构。在该式中：X₁和Z₁各自独立地是OH、OM、SH、SM、C(O)H、S(O)H、任选地被一个或多个羟基或卤素基团取代的C₁-C₆烷基，或D-Q；D在每次出现时独立地是不存在、O、S、NH、任选被一个或多个卤素基团取代的C₁-C₆亚烷基；并且Y₁是S或O。在一个实施方案中，X₁是OH或SH；并且Z₁是D-Q。

在一个实施方案中，具有的结构，其中X₁是OH或SH。

在一些实施方案中，具有结构。在该式中：X₂是N(R’)(R”)；Z₂是X₂、OR¹⁸或D-Q；R¹⁸是H或被氰基取代的C₁-C₆烷基；并且R’和R”各自独立地是C₁-C₆烷基(例如，异丙基)。

在一个实施方案中，具有选自以下的结构：变量R’、R”和Q如上式P-I和P-II中所定义。在一个实施方案中，R’和R”各自是异丙基。

在一些实施方案中，具有结构-P(Z)(X)，其中：

X选自-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂CH₃、-OCH₂CH(CH₃)₂、-OCH₂CH₂CN、-OCH₂CH₂Si(CH₃)₃、-OCH₂CH₂Si(CH₂CH₃)₃、-OC(H)＝CH₂、-OCH₂C(H)＝CH₂、

并且

Z选自： 或

X和Z与其所附接的磷原子一起形成选自以下的环状结构：

在一个实施方案中，具有的结构。

可以具有结构式(C-I)的5元环状化合物的示例性包括：

在一些实施方案中，化合物具有式 其中：R₂、R₃、R₄和R₅各自独立地是H、烷基(例如，CH₃)、杂环、CH₂R¹⁵、芳基(例如，苯基)、杂芳基、CHFR¹⁵、CF₂R¹⁵、CF₃；并且可以是任何立体异构构型；并且R¹⁵是烷基、杂环基、芳基、OH、O-烷基、NH₂、NH(烷基)、N(烷基)₂、CF₂R¹⁵或CF₃；并且可以是任何立体异构构型。

具有5-元环状二硫化物部分的式(I)的示例性化合物示于表1中。

表1.具有5-元环状二硫化物部分的化合物

在一些实施方案中，具有结构 其中R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环。在一个实施方案中，第二环具有6-8个原子。

式(C-I)的双环化合物的示例性包括：

在一些实施方案中，化合物具有式 其中R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环(例如，具有6-8个原子)。

具有双环二硫化物部分的式(I)的示例性化合物示于表2中。

表2.具有双环二硫化物部分的化合物

也可具有结构

式(C-II)的环状化合物的示例性包括：

在一些实施方案中，化合物具有下式：

在这些式中，n是1、2、3、4、5或6；G是O、NR¹⁵、S或任何其它杂原子；R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地是H、烷基(例如，CH₃)、杂环、CH₂R¹⁵、芳基(例如，苯基)、杂芳基、CHFR¹⁵、CF₂R¹⁵、CF₃；并且可以是任何立体异构构型；并且R¹⁵为烷基、杂环基、芳基、OH、O-烷基、NH₂、NH(烷基)、N(烷基)₂、CF₂R¹⁵或CF₃；并且可以是任何立体异构构型。

具有较大(7元或更大)环状二硫化物部分的示例性式(I)化合物示于表3中。

表3.具有7-元或8-元环状二硫化物部分的化合物

还可以具有结构：式(C-III)的6元环状化合物的示例性包括：

在一些实施方案中，化合物具有式 在该式中，R₂、R₃、R₄、R₅和R₆各自独立地是H、烷基(例如，CH₃)、杂环、CH₂R¹⁵、芳基(例如，苯基)、杂芳基、CHFR¹⁵、CF₂R¹⁵、CF₃；并且可以是任何立体异构构型；并且R¹⁵是烷基、杂环基、芳基、OH、O-烷基、NH₂、NH(烷基)、N(烷基)₂、CF₂R¹⁵或CF₃；并且可以是任何立体异构构型。

具有6元环状二硫化物部分的式(I)的示例性化合物示于表4中。

表4.具有7元-或8-元环状二硫化物部分的化合物

如本领域技术人员所熟悉的，在整个申请中，化学结构内的某些术语被缩写，包括，例如，甲基(Me)、苯甲酰基(Bz)、苯基(Ph)和新戊酰基(Piv)。

术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘的任何基团。

本文所用的术语“脂族”或“脂族基团”意指饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链或支链、取代或未取代的烃链，或者饱和或含有一个或多个不饱和单元但不是芳族的单环烃或双环烃或多环烃，其具有与分子其余部分的单一连接点。在一些实施方案中，脂族基团含有1-50个脂族碳原子，例如，1-10个脂族碳原子、1-6个脂族碳原子、1-5个脂族碳原子、1-4个脂族碳原子、1-3个脂族碳原子或1-2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“环脂族”是指饱和或含有一个或多个不饱和单元但不是芳族的单环或双环C₃-C₁₀烃(例如，单环C₃-C₆烃)，其具有与分子其余部分的单一连接点。合适的脂族基团包括但不限于直链或支链、取代或未取代的烷基、烯基、炔基及其杂合体，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。

术语“烷基”是指可以是直链或支链的烃链，其含有指定数量的碳原子。例如，C₁-C₁₂烷基指示该基团中可具有1至12个(包括)碳原子。除非另外指明，“烷基”通常是指C₁-C₂₄烷基(例如，C₁-C₁₂烷基、C₁-C₈烷基或C₁-C₄烷基)。术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤素取代的烷基，并且包括其中所有氢均被卤素取代的烷基部分(例如，全氟烷基)。烷基和卤代烷基可任选地插入O、N或S。术语“芳烷基”是指其中烷基氢原子被芳基取代的烷基部分。芳烷基包括其中多于一个氢原子被芳基取代的基团。“芳烷基”的实例包括苄基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基。

术语“烯基”是指含有2-8个碳原子，并且特征在于具有一个或多个双键的直链或支链烃链。除非另外指明，否则“烯基”通常是指C₂-C₈烯基(例如，C₂-C₆烯基、C₂-C₄烯基或C₂-C₃烯基)。典型烯基的实例包括但不限于烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-己烯基和3-辛烯基。术语“炔基”是指含有2-8个碳原子，并且特征在于具有一个或多个三键的直链或支链烃链。除非另外指明，否则“炔基”通常是指C₂-C₈炔基(例如，

C₂-C₆炔基、C₂-C₄炔基或C₂-C₃炔基)。典型炔基的一些实例是乙炔基、2-丙炔基和3-甲基丁炔基和炔丙基。sp²和sp³碳可任选地分别用作烯基和炔基的连接点。

术语“烷氧基”是指-O-烷基。术语“亚烷基”是指二价烷基(即，-R-)。术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。术语“巯基”是指-SH基团。术语“硫代烷氧基”是指-S-烷基。

术语“亚烷基”是指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基，即，-(CH₂)_n-，其中n是正整数，优选地1至6、1至4、1至3、1至2或2至3。取代的亚烷基链是其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基替代的聚亚甲基。合适的取代基包括下文所述的那些。

术语“亚烯基”是指二价烯基。取代的亚烯基链是含有至少一个双键的聚亚甲基，其中一个或多个氢原子被取代基替代。合适的取代基包括下文所述的那些。

术语“芳基”是指6-碳单环或10-碳双环芳族环系统，其中每个环的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。芳基的实例包括苯基、联苯基、萘基、蒽基等，其可带有一个或多个取代基。本文所用的术语“芳基”的范围内还包括其中芳环与一个或多个非芳环稠合的基团，例如，茚满基、邻苯二甲酰亚胺基、萘酰亚胺基、菲啶基或四氢萘基等。术语“芳基烷基”或术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。术语“芳基烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基。

本文所用的术语“环烷基”或“环基”包括具有3至12个碳，例如，3至8个碳和例如3至6个碳的饱和和部分不饱和的，但不是芳族的环状烃基，其中环烷基另外可任选地被取代。环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。

术语“杂芳基”或“杂芳-”是指具有1-3个杂原子(如果是单环)、1-6个杂原子(如果是双环)或1-9个杂原子(如果是三环)的芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，所述杂原子选自O、N或S(例如，碳原子和1-3、1-6或1-9个N、O或S的杂原子(如果分别是单环、双环或三环)，其中每个环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代。该术语还包括其中杂芳族环与一个或多个芳基、环烷基或杂环基环稠合的基团，其中连接基团或连接点在杂芳族环上。杂芳基的实例包括吡咯基、吡啶基、哒嗪基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、呋喃基、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、苯硫基或噻吩基、喹啉基、吲哚基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、嘌呤基、萘啶基、蝶啶基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮等。术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”是指被杂芳基取代的烷氧基。

术语“杂环基”、“杂环”、“杂环基团”或“杂环状环”是指具有1-3个杂原子(如果是单环)、1-6个杂原子(如果是双环)或1-9个杂原子(如果是三环)的非芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，所述杂原子选自O、N或S(例如，碳原子和1-3、1-6或1-9个N、O或S的杂原子(如果分别是单环、双环或三环)，其中每个环的0、1、2或3个原子可以被取代基取代。当用于提及杂环的环原子时，术语“氮”包括取代的氮。作为实例，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和环中，氮可为N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或+NR(如在N-取代的吡咯烷基中)。杂环基的实例包括三唑基、四唑基、哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂基、氧氮杂基、硫氮杂基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基吡咯烷基、哌啶基、吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、奎宁环基等。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选被取代。

术语“氧代”是指当与碳连接时形成羰基的氧原子、当与氮连接时形成N-氧化物和当与硫连接时形成亚砜或砜。

术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基取代基，其中任何一个可以进一步被取代基取代。

术语“取代的”是指在给定结构中的一个或多个氢基团被指定取代基的基团替，包括但不限于：卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、硫醇、烷硫基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环基和脂肪族基。应理解，取代基可被进一步取代。

“任选地取代的”基团的饱和碳原子上的合适的二价取代基包括以下：═O、═S、═NNR*₂、═NNHC(O)R*、═NNHC(O)OR*、═NNHS(O)₂R*、═NR*、═NOR*、-O(C(R*₂))_2-3O-或-S(C(R*₂))_2-3S-，其中R*的每次独立出现选自氢、可如下文所定义取代的C_1-6脂族基或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。与“任选地取代的”基团的邻位可取代碳键合的合适的二价取代基包括：-O(CR*₂)_2-3O-，其中R*的每次独立出现选自氢，可如下文所定义取代的C_1-6脂族基或具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的未取代的5-6元饱和、部分不饱和或芳基环。

寡核苷酸前药

本发明的另一方面涉及寡核苷酸(例如，单链iRNA剂或双链iRNA剂)，其包含一种或多种包含式(I)结构的化合物： 在式(I)中，至少一个含有核苷或寡核苷酸。

涉及的所有式、的所有式、这些式中定义的所有变量和与化合物(或修饰的磷酸酯前药化合物)相关的的本发明第一方面中的化合物、环状二硫化物部分和磷偶联基团的所有亚属和种类结构的所有上述实施方案在涉及寡核苷酸的本发明的该方面中是合适的。

在一些实施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸的5’-端含有至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸的3’-端含有至少一个

在一些实施方案中，寡核苷酸在寡核苷酸的内部位置含有至少一个

在一些实施方案中，当具有式(C-III)结构时，至少一个连接在核苷或寡核苷酸的5’端。

修饰的磷酸酯前药化合物的另外的结构包括在2014年06月12日公开的WO 2014/088920中公开的那些，其内容以其整体通过引用并入本文。特别地，这些修饰的磷酸酯前药化合物在5’端引入寡核苷酸中。

在一些实施方案中，寡核苷酸是单链寡核苷酸，例如单链iRNA剂(例如，单链siRNA)。

在一些实施方案中，寡核苷酸是双链寡核苷酸，例如双链iRNA剂(例如，双链siRNA)，其包含有义链和反义链。

在一个实施方案中，有义链含有至少一个在一个实施方案中，反义链含有至少一个在一个实施方案中，有义链和反义链均含有至少一个

在有义链或反义链或有义链和反义链两者上，将 作为临时保护基引入到磷酸酯基团在以下实施例9的方案10-15中说明。

寡核苷酸定义和设计

除非提供了具体定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学相关使用的命名法及其程序和技术是本领域众所周知和常用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。某些此类技术和程序可以在例如由Sangvi和Cook编辑的“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,American Chemical Society,Washington D.C.,1994；“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,第18版,1990；和由Stanley T.Crooke编辑的“Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies,and Applications”,CRC Press,Boca Raton,Fla.；以及Sambrook等人,“Molecular Cloning,A laboratory Manual,”第2版,Cold SpringHarbor Laboratory出版社，1989中找到，其出于任何目的通过引用并入本文。在允许的情况下，本文公开内容中通篇提及的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物以及其它数据以其整体通过引入并入本文。

如本文所用，术语“靶核酸”是指其表达或活性能够被siRNA化合物调节的任何核酸分子。靶核酸包括但不限于从编码靶蛋白的DNA转录的RNA(包括但不限于前mRNA和mRNA或其部分)，以及衍生自此类RNA的cDNA，和miRNA。例如，靶核酸可以是其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或从该基因转录的mRNA)。在一些实施方案中，靶核酸可以是来自感染剂的核酸分子。

如本文所用，术语“iRNA”是指介导RNA转录物的靶向切割的试剂。这些试剂与称为RNAi-诱导的沉默复合物(RISC)的细胞质多蛋白复合物相关联。有效诱导RNA干扰的试剂在本文中也称为siRNA、RNAi剂或iRNA剂。因此，这些术语在本文中可以互换使用。如本文所用，术语iRNA包括微RNA和前微RNA。此外，本文所用的本发明的“化合物”或“多种化合物”也指iRNA剂，并且可与iRNA剂互换使用。

iRNA剂应包括与靶基因具有足够同源性的区域，并且在核苷酸方面具有足够的长度，使得iRNA剂或其片段可介导靶基因的下调。(为了便于阐述，术语核苷酸或核糖核苷酸有时在本文中用于指代iRNA剂的一个或多个单体亚基。在本文中应理解，在修饰的RNA或核苷酸代理的情况下，本文中术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”的使用也可指代在一个或多个位置处的修饰的核苷酸或代理替代部分。)因此，iRNA剂是或包括与靶RNA至少部分互补，并且在一些实施方案中完全互补的区域。不需要在iRNA剂和靶之间存在完全的互补性，但是对应性必须足以使iRNA剂或其裂解产物能够指导序列特异性沉默，例如，通过靶RNA(例如，mRNA)的RNAi裂解。与靶链的互补性或同源性程度在反义链中是最关键的。虽然通常需要完美的互补性，特别是在反义链中，但是一些实施方案可以包括，特别是在反义链中，一个或多个，或例如6、5、4、3、2个或更少的错配(相对于靶RNA)。有义链仅需要与反义链充分互补以维持分子的总体双链特征。

iRNA剂包括：足够长以引发干扰素反应的分子(其可被Dicer裂解(Bernstein等人2001.Nature,409:363-366)和进入RISC(RNAi-诱导的沉默复合物))；以及足够短以致不引发干扰素反应的分子(该分子也可被Dicer裂解和/或进入RISC)，例如，具有允许进入RISC的大小的分子，例如，类似Dicer-裂解产物的分子。足够短而不引发干扰素反应的分子在本文中称为siRNA剂或短iRNA剂。如本文所用，“siRNA剂或短iRNA剂”是指iRNA剂，例如，双链RNA剂或单链剂，其足够短使得其不在人细胞中诱导有害的干扰素反应，例如，其具有小于60、50、40或30个核苷酸对的双链体区域。siRNA剂或其裂解产物可以例如通过诱导针对靶RNA的RNAi来下调靶基因，其中靶标可包含内源性或病原体靶RNA。

本文所用的“单链iRNA剂”是由单个分子组成的iRNA剂。它可以包括通过链内配对形成的双链体区域，例如其可以是或包括发夹或盘柄结构。单链iRNA剂对于靶分子可以是反义的。单链iRNA剂可以足够长，使得其可以进入RISC并参与RISC介导的靶mRNA的裂解。单链iRNA剂的长度为至少14个核苷酸，并且在其它实施方案中为至少15、20、25、29、35、40或50个核苷酸。在某些实施方案中，其长度小于200、100或60个核苷酸。

环是指当iRNA链的一段与另一条链或同一条链的另一段形成碱基对时，与双链体中相对的核苷酸不配对的iRNA链的区域。

发夹iRNA剂将具有等于或至少17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链体区域。双链体区域的长度可以等于或小于200、100或50。在某些实施方案中，双链体区域的长度范围为15-30、17-23、19-23和19-21个核苷酸对。发夹可具有单链突出端或末端不配对区域，在一些实施方案中在3’侧，并且在某些实施方案中在发夹的反义侧上。在一些实施方案中，突出端的长度为2-3个核苷酸。

如本文所用，“双链(ds)iRNA剂”是包括多于一条链，并且在一些情况下是两条链的iRNA剂，其中链间杂交可形成双链体结构的区域。

如本文所用，术语“siRNA活性”和“RNAi活性”是指通过siRNA的基因沉默。

如本文所用，通过RNA干扰分子的“基因沉默”是指在细胞中靶基因的mRNA水平降低不存在miRNA或RNA干扰分子的情况下在细胞中发现的mRNA水平的至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％直至并包括100％，以及之间的任何整数。在一个优选的实施方案中，mRNA水平降低至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％，至多并包括100％以及在5％和100％之间的任何整数。

如本文所用，术语“调节基因表达”意指基因的表达或者编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在不存在调节剂的情况下观察到的表达、水平或活性。例如，术语“调节”可以意指“抑制”，但词语“调节”的使用不限于该定义。

如本文所用，当基因的表达或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平与不存在siRNA，例如RNAi剂时所观察到的水平相差至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多时，发生基因表达调节。可以相对于对照或非对照计算％和/或倍数差异，例如，

或

如本文所用，与基因表达相关的术语“抑制”、“下调”或“降低”意指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性降低至低于不存在调节剂的情况下观察到的表达、水平或活性。当基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性降低相对于相应的未调节的对照低至少10％、并且优选地至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或最优选地100％(即，没有基因表达)时，基因表达被下调。

如本文所用，与基因表达相关的术语“增加”或“上调”意指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性增加至高于在不存在调节剂时观察到的表达、水平或活性。当基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性相对于相应的未调节对照增加至少10％，优选地至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、100％、1.1倍、1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多时，基因表达被上调。

如本文所用，术语“增加的”或“增加”通常意指静态显著量的增加；为了避免任何疑问，“增加的”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并且包括100％增加或在10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍和10倍或更大之间的任何增加。

如本文所用，术语“减少的”或“减少”通常意指统计学显著量的减少。然而，为了避免疑问，“减少”意指与参考水平相比降低至少10％，例如与参考水平相比降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并且包括100％减少(即与参考样品相比不存在水平)、或在10-100％之间的任何减少。

双链iRNA包含两条充分互补以杂交而形成双链体结构的寡核苷酸链。通常，双链体结构的长度为在15和30个碱基对之间，更通常为在18和25个碱基对之间，还更通常为在19和24个碱基对之间，最通常为在19和21个碱基对之间。在一些实施方案中，优选长度为在25和30个碱基对之间的较长双链iRNA。在一些实施方案中，优选长度为在10和15个碱基对之间的较短双链iRNA。在另一个实施方案中，双链iRNA的长度为至少21个核苷酸。

在一些实施方案中，双链iRNA包含有义链和反义链，其中反义RNA链具有与靶序列的至少一部分互补的互补区域，并且双链体区域的长度为14-30个核苷酸。类似地，与靶序列的互补区域的长度为在14和30之间，更通常为在18和25之间，还更通常为在19和24之间，并且最通常为在19和21个核苷酸之间。

如本文所用，短语“反义链”是指与目标靶序列基本上或100％互补的寡核苷酸链。短语“反义链”包括由两条单独的链形成的两条寡核苷酸链的反义区域，以及能够形成发夹或哑铃型结构的单分子寡核苷酸链。术语“反义链”和“指导链”在本文中可互换使用。

短语“有义链”是指具有与靶序列例如信使RNA或DNA序列全部或部分相同的核苷序列的寡核苷酸链。术语“有义链”和“乘客链”在本文中可互换使用。

“可特异性杂交”和“互补”意指核酸可通过传统的沃森-克里克或其它非传统类型与另一核酸序列形成氢键。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许执行核酸的相关功能，例如RNAi活性。测定核酸分子的结合自由能是本领域众所周知的(参见，例如，Turner等人,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123-133；Frier等人,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:9373-9377；Turner等人,1987,/.Am.Chem.Soc.109:3783-3785)。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”或100％互补性意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。不完全互补是指其中两条链的一些但不是全部核苷单元可以彼此形成氢键的情况。“基本上互补”是指表现出90％或更大互补性的多核苷酸链，排除被选择为非互补的多核苷酸链的区域，例如突出端。特异性结合需要足够程度的互补性，以避免在需要特异性结合的条件下，即，在体内测定或治疗性处理的情况中于生理条件下，或在进行测定的条件下体外测定的情况中寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合。非靶序列通常相差至少5个核苷酸。

在一些实施方案中，双链区域的长度等于或至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸对。

在一些实施方案中，反义链的长度等于或至少为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

在一些实施方案中，有义链的长度等于或至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、

27、28、29或30个核苷酸。

在一个实施方案中，有义链和反义链的长度各自为15至30个核苷酸。在一个实施方案中，有义链和反义链的长度各自为19-25个核苷酸。在一个实施方案中，有义链和反义链的长度各自为21至23个核苷酸。

在一些实施方案中，一条链在双链区域中具有至少一个1-5个单链核苷酸的链段。“双链区域中的单链核苷酸链段”意指在单链链段的两端存在至少一个核苷酸碱基对。在一些实施方案中，两条链在双链区域中具有至少一个1-5(例如，1、2、3、4或5)个单链核苷酸的链段。当两条链在双链区域中具有1-5(例如，1、2、3、4或5)个单链核苷酸的链段时，此类单链核苷酸可以彼此相对(例如，错配链段)，或其可以被定位使得第二链不具有与第一链的单链iRNA相对的单链核苷酸，反之亦然(例如，单链环)。在一些实施方案中，单链核苷酸存在于来自任一端的8个核苷酸内，例如两条链之间的互补区域的5’或3’端的8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸在至少一个末端包含单链突出端。在一个实施方案中，单链突出端的长度为1、2或3个核苷酸。

在一个实施方案中，iRNA剂的有义链的长度为21个核苷酸，反义链的长度为23个核苷酸，其中该链形成21个连续碱基对的双链区域，其在3’-端具有2个核苷酸长的单链突出端。

在一些实施方案中，双链iRNA的每条链具有ZXY结构，例如PCT公开号2004080406中所述，其以整体通过引用并入本文。

在某些实施方案中，双链寡核苷酸的两条链可以连接在一起。两条链可在两端或仅在一端彼此连接。在一端连接意指第一链的5’-端连接至第二链的3’-端或第一链的3’-端连接至第二链的5’-端。当两条链在两端彼此连接时，第一链的5’-端连接至第二链的3’-端，并且第一链的3’-端连接至第二链的5’-端。两条链可以通过寡核苷酸接头连接在一起，包括但不限于(N)_n；其中N独立地是修饰的或未修饰的核苷酸并且n是3-23。在一些实施方案中，n是3-10，例如，3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，寡核苷酸接头选自GNRA、(G)₄、(U)₄和(dT)₄，其中N是修饰的或未修饰的核苷酸，并且R是修饰的或未修饰的嘌呤核苷酸。接头中的一些核苷酸可参与与接头中的其它核苷酸的碱基对相互作用。两条链也可通过非核苷接头，例如本文所述的接头连接在一起。本领域技术人员将理解，本文所述的任何寡核苷酸化学修饰或变化可用于寡核苷酸接头。

发夹和哑铃型寡核苷酸将具有等于或至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链体区域。双链体区域的长度可以等于或小于200、100或50。在一些实施方案中，双链体区域的长度范围为15-30、17至23、19至23和19至21个核苷酸对。

发夹寡核苷酸可具有单链突出端或末端未配对区域，在一些实施方案中在3’侧，并且在一些实施方案中在发夹的反义侧上。在一些实施方案中，突出端的长度为1-4个，更通常为2-3个核苷酸。可诱导RNA干扰的发夹寡核苷酸在本文中也称为“shRNA”。

在某些实施方案中，当存在足够程度的互补性时，两条寡核苷酸链特异性杂交，以避免在需要特异性结合的条件下，即，在体内测定或治疗性处理的情况下于生理条件下，和在体外测定的情况中进行测定的条件下反义链与非靶核酸序列的非特异性结合。

如本文所用，“严格杂交条件”或“严格条件”是指反义链与其靶序列杂交，但与最小数量的其它序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下是不同的，且反义链与靶序列杂交的“严格条件”是通过反义链的性质和组成以及对其进行研究的测定法来确定。

本领域理解，与未修饰的寡核苷酸相比，核苷酸亲和修饰的引入可允许更多数量的错配。类似地，某些寡核苷酸序列可能比其它寡核苷酸序列更耐受错配。本领域普通技术人员能够例如通过测定解链温度(Tm)来确定寡核苷酸之间或寡核苷酸与靶核酸之间的错配的适当数量。Tm或ΔTm可以通过本领域普通技术人员熟悉的技术来计算。例如，Freier等人(Nucleic Acids Research,1997,25,22:4429-4443)描述的技术允许本领域普通技术人员评估核苷酸修饰增加RNA:DNA双链体的解链温度的能力。

另外的dsRNA设计

在一个实施方案中，iRNA剂是长度为19nt的双末端平端体，其中有义链在5’-端的7、8、9位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序。反义链在5’-端的11、12、13位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

在一个实施方案中，iRNA剂是长度为20nt的双末端平端体，其中有义链在5’-端的8、9、10位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序。反义链在5’-端的11、12、13位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

在一个实施方案中，iRNA剂是长度为21nt的双末端平端体，其中有义链在5’端的9、10、11位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序。反义链在5’-端的11、12、13位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

在一个实施方案中，iRNA剂包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中有义链在5’端的9、10、11位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序；反义链在5’端的11、12、13位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序，其中iRNA的一端是平端，而另一端包含2nt突出端。优选地，2nt突出端在反义的3’-端。任选地，iRNA剂进一步包含配体(例如，GalNAc₃)。

在一个实施方案中，iRNA剂包含有义和反义链，其中：有义链的长度为25-30个核苷酸残基，其中从5’-末端核苷酸(位置1)开始，所述第一链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义链长度为36-66个核苷酸残基，并且从3’-末端核苷酸开始，在与有义链的位置1-23配对的位置中包含至少8个核糖核苷酸以形成双链体；其中至少反义链的3’-末端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续的3’-末端核苷酸与有义链不配对，从而形成1-6个核苷酸的3’单链突出；其中反义链的5’-末端包含10-30个与有义链不配对的连续核苷酸，从而形成10-30个核苷酸的单链5’突出端；其中当有义链和反义链对齐以获得最大互补性时，至少有义链的5’-末端和3’-末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链和反义链之间形成基本上双链体的区域；并且当将所述双链核酸引入哺乳动物细胞中时，反义链沿反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以减少靶基因表达；并且其中有义链在三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或附近的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

在一个实施方案中，iRNA剂包含有义链和反义链，其中所述iRNA剂包含长度为至少25个和至多29个核苷酸的第一链和长度为至多30个核苷酸的第二链，其在从5’端的11、12、13位的三个连续核苷酸上具有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序；其中所述第一链的所述3’端和所述第二链的所述5’端形成平端，并且所述第二链在其3’端比第一链长1-4个核苷酸，其中双链体区域长度为至少25个核苷酸，并且所述第二链沿着所述第二链长度的至少19nt与靶mRNA充分互补，以在所述iRNA剂引入哺乳动物细胞中时减少靶基因表达，并且其中所述iRNA的Dicer切割优先地产生包含所述第二链的所述3’端的siRNA，从而减少靶基因在哺乳动物中的表达。任选地，iRNA剂还包含配体(例如，GalNAc₃)。

在一个实施方案中，有义链在三个连续核苷酸上含有至少一个三个相同修饰的基序，其中一个基序出现在有义链的切割位点处。例如，有义链可在5’-端的7-15位内的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序。

在一个实施方案中，反义链还可以在三个连续核苷酸上含有至少一个三个相同修饰的基序，其中一个基序出现在反义链中的切割位点处或附近。例如，反义链可在从5’-端的9-15位内的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

对于具有长度为17-23nt的双链体区域的iRNA剂，反义链的切割位点通常在5’-端的10、11和12位周围。因此，三个相同修饰的基序可以出现在9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或反义链的13、14、15位，从反义链5’-端的第1核苷酸开始的计数，或从反义链5’-端的双链体区域内第1配对核苷酸开始的计数。反义链中的切割位点也可以根据iRNA的双链体区域从5’-端开始的长度而变化。

在一些实施方案中，iRNA剂包含各自具有14至30个核苷酸的有义链和反义链，其中有义链含有至少两个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在链内的切割位点处或附近，并且至少一个基序出现在与切割位点处的基序分隔至少一个核苷酸的链的另一部分处。在一个实施方案中，反义链还含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在链内的切割位点处或附近。在有义链的切割位点处或附近存在的基序中的修饰不同于在反义链中的切割位点处或附近存在的基序中的修饰。

在一些实施方案中，iRNA剂包含各自具有14至30个核苷酸的有义链和反义链，其中有义链在三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在链中的切割位点处或附近。在一个实施方案中，反义链在切割位点处或附近的三个连续核苷酸上还含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

在一些实施方案中，iRNA剂包含各自具有14至30个核苷酸的有义链和反义链，其中有义链在从5’端的9、10、11位的三个连续核苷酸上包含至少一个三个2’-F修饰的基序，并且其中反义链在从5’端的11、12、13位的三个连续核苷酸上含有至少一个三个2’-O-甲基修饰的基序。

在一个实施方案中，iRNA剂在双链体内包含与靶标的错配或其组合。错配可以出现在突出端区域或双链体区域中。碱基对可以基于其促进解离或解链的倾向进行排序(例如，基于特定配对的缔合或解离的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用次近邻或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；和I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如，非规范配对或规范以外的配对(如本文别处所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包括通用碱基的配对优于规范配对。

在一个实施方案中，iRNA剂包含双链体区域内从反义链5’-端的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，其可以独立地选自：A:U、G:U、I:C和错配对，例如非规范的或规范以外的配对或包括通用碱基的配对，以促进反义链在双链体的5’-端的解离。

在一个实施方案中，双链体区域内从反义链5’-端的1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。可选地，双链体区域内从反义链5’-端的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，双链体区域内从反义链5’-端的第一碱基对是AU碱基对。

在一个实施方案中，dsRNA剂的100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％被修饰。例如，当dsRNA剂的50％被修饰时，dsRNA剂中存在的所有核苷酸的50％含有如本文所述的修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有一个或多个2’-O修饰，其选自2’-脱氧、2’O-甲氧基烷基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)和2’-ara-F。

在一个实施方案中，有义链和反义链各自独立地用非天然核苷酸修饰，例如无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟代、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)或2’-ara-F。

在一个实施方案中，dsRNA剂的有义链和反义链各自含有至少两个不同的修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个2’-F修饰。在一个实例中，寡核苷酸含有九个或十个2’-F修饰。

在一个实施方案中，寡核苷酸不含有任何2’-F修饰。

iRNA剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接修饰可以出现在有义链或反义链或两者的在该链的任何位置中的任何核苷酸上。例如，核苷酸间连接修饰可以出现在有义链或反义链上的每一个核苷酸上；每个核苷酸间连接修饰可以在有义链或反义链上以交替模式出现；或有义链或反义链可以含有交替模式的两种核苷酸间连接修饰。有义链上的核苷酸间连接修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上的核苷酸间连接修饰的交替模式可以相对于反义链上的核苷酸间连接修饰的交替模式具有偏移。

在一个实施方案中，iRNA在突出端区域中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接修饰。例如，突出端区域可以含有两个核苷酸，其具有两个核苷酸之间的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接。还可以进行核苷酸间连接修饰以将突出核苷酸与双链体区域内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2、3、4个或所有突出核苷酸可通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接进行连接，并且任选地，可存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接，其将突出端核苷酸与邻近突出端核苷酸的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，第三个是邻近突出端核苷酸的配对核苷酸。优选地，这些末端三个核苷酸可以在反义链的3’-端。

在一个实施方案中，有义链和/或反义链包含一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接的区块。在一个实例中，有义链包含两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接的一个区块。在一个实例中，反义链包含两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接的两个区块。例如，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接的两个区块被16-18个磷酸酯核苷酸间连接隔开。

在一个实施方案中，有义链和反义链各自具有15-30个核苷酸。在一个实例中，有义链具有19-22个核苷酸，并且反义链具有19-25个核苷酸。在另一个实例中，有义链具有21个核苷酸，反义链具有23个核苷酸。

在一个实施方案中，双链体中反义链5’-端1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。在一个实施方案中，从反义链5’-端的第一、第二和第三碱基对中的至少一个是AU碱基对。

在一个实施方案中，dsRNA剂的反义链与靶RNA 100％互补以与其杂交并通过RNA干扰抑制其表达。在另一个实施方案中，dsRNA剂的反义链与靶RNA至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％互补。

在一个方面，本发明涉及能够抑制靶基因表达的如本文定义的dsRNA剂。dsRNA剂包含有义链和反义链，各链具有14至40个核苷酸。有义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中至少一种所述热去稳定核苷酸出现在与反义链的种子区域相对的位点处或附近(即，在反义链的5’-端的位置2-8处)。

例如，当有义链长度为21个核苷酸时，热去稳定核苷酸可出现在有义链的5’-端的14-17位之间。反义链含有至少两个比空间上要求的2’-OMe修饰小的修饰核酸。优选地，小于空间上要求的2’-OMe的两个修饰的核酸在长度上相隔11个核苷酸。例如，两个修饰的核酸位于反义链5’-端的2和14位。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含：

(a)有义链，其具有：

(i)18-23个核苷酸的长度；

(ii)在7-15位的三个连续的2’-F修饰；及

(b)反义链，其具有：

(i)18-23个核苷酸的长度；

(ii)在链上的任何位置的至少2’-F修饰；和

(iii)在前五个核苷酸(从5’端计数)处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；

其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且或者具有在反义链的3’-端的两个核苷酸的突出端和在反义链的5’-端的平端；或者具有双链体两端的平端。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含：

(a)有义链，其具有：

(i)18-23个核苷酸的长度；

(ii)少于四个2’-F修饰；

(b)反义链，其具有：

(i)18-23个核苷酸的长度；

(ii)少于十二个2’-F修饰；和

(iii)在前五个核苷酸(从5’端计数)处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；

其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且或者具有在反义链的3’-端的两个核苷酸的突出端和在反义链的5’-端的平端；或者具有双链体两端的平端。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含：

(a)有义链，其具有：

(i)19-35个核苷酸的长度；

(ii)少于四个2’-F修饰；

(b)反义链，其具有：

(i)19-35个核苷酸的长度；

(ii)少于十二个2’-F修饰；和

(iii)在前五个核苷酸(从5’端计数)处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；

其中双链体区域在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；并且其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且或者具有在反义链的3’-端的两个核苷酸的突出端和在反义链的5’-端的平端；或者具有双链体两端的平端。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含长度15-30个核苷酸的有义链和反义链；在反义链上的前五个核苷酸(从5’端计数)处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；其中双链体区域在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且其中dsRNA剂具有少于20％、少于15％和少于10％的非天然核苷酸。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含长度15-30个核苷酸的有义链和反义链；在反义链上的前五个核苷酸(从5’端计数)处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；其中双链体区域在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且其中dsRNA剂具有大于80％、大于85％和大于90％的天然核苷酸，例如2’-OH、2’-脱氧和2’-OMe是天然核苷酸。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含长度15-30个核苷酸的有义链和反义链；在反义链上的前五个核苷酸(从5’端计数)处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间连接；其中双链体区域在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且其中dsRNA剂具有100％天然核苷酸，例如2’-OH、2’-脱氧基和2’-OMe是天然核苷酸。

在一个实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，各链具有14至30个核苷酸，其中有义链序列由式(I)表示：

5’n_p-N_a-(XXX)_i-N_b-YYY-N_b-(ZZZ)_j-N_a-n_q3’

(I)

其中：

i和j各自独立地为0或1；

p和q各自独立地为0-6；

N_a各自独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；

N_b各自独立地表示包含1、2、3、4、5或6个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；

n_p和n_q各自独立地表示突出端核苷酸；

其中N_b和Y不具有相同的修饰；

其中XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序；

其中dsRNA剂具有一个或多个亲脂性单体，其含有与至少一条链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且

其中dsRNA的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间连接隔开的一个、两个或三个硫代磷酸酯核苷酸间连接的两个区块。

各种出版物描述了多聚siRNA，并且均可与本发明的iRNA一起使用。此类出版物包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，其以其整体通过引用并入本文。

在一些实施方案中，反义链与靶RNA 100％互补以与其杂交并通过RNA干扰抑制其表达。在另一个实施方案中，反义链与靶RNA至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％互补。

核酸修饰

在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一种本文所述的核酸修饰。例如，至少一种修饰选自修饰的核苷间连接、修饰的核碱基、修饰的糖及其任何组合。非限制地，这种修饰可以存在于寡核苷酸中的任何地方。例如，修饰可以存在于RNA分子之一中。

核酸修饰(核碱基)

核苷的天然存在的碱基部分通常是杂环碱基。此类杂环碱基的最常见的两个种类是嘌呤和嘧啶。对于包括呋喃核糖基的那些核苷，磷酸酯基团可以连接至糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时，那些磷酸酯基团将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。在寡核苷酸中，磷酸酯基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的天然存在的连接或主链是3’至5’磷酸二酯键。

除了“未修饰的”或“天然的”核碱基例如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(U)之外，本领域技术人员已知的许多修饰的核碱基或核碱基模拟物也适用于本文所述的寡核苷酸。未修饰或天然的核碱基可以被修饰或取代以提供具有改进特性的iRNA。例如，核酸酶抗性寡核苷酸可以用这些碱基或用合成的和天然的核碱基(例如，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷或tubercidine)和本文所述的任何一种寡聚物修饰来制备。可替代地，可以使用任何上述碱基和“通用碱基”的取代或修饰的类似物。当天然碱基被非天然和/或通用碱基替代时，核苷酸在本文中被称为包含修饰的核碱基和/或核碱基修饰。修饰的核碱基和/或核碱基修饰还包括天然的、非天然的和通用的碱基，其包含缀合部分，例如本文所述的配体。用于与核碱基缀合的优选的缀合部分包括阳离子氨基，其可通过适当的烷基、烯基或具有酰胺键的接头缀合至核碱基。

本文所述的寡核苷酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(U)。示例性的修饰的核碱基包括但不限于其它合成和天然核碱基例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟嘌呤、tubercidine、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N⁶-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(脱氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N⁶-(异戊基)腺嘌呤、N⁶-(甲基)腺嘌呤、N⁶,N⁶-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(脱氮)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3-(脱氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤代)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N⁴-(乙酰基)胞嘧啶、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍基烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N³-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2-(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)假尿嘧啶、2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-取代的假尿嘧啶、1-取代的2-(硫代)-假尿嘧啶、1-取代的4-(硫代)假尿嘧啶、1-取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-4-(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2-(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4-(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、tubercidine、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-脱氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹啉基(isocarbostyrilyl)、5-(甲基)异喹啉基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹啉基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹啉基、7-(丙炔基)异喹啉基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2-(氨基)嘌呤、2,6-(二氨基)嘌呤、5-取代的嘧啶、N²-取代嘌呤、N⁶-取代嘌呤、O⁶-取代嘌呤、取代的1,2,4-三唑、吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、对位取代-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、双邻位取代-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。可替代地，可以采用任何上述碱基和“通用碱基”的取代或修饰的类似物。

如本文所用，通用核碱基是可以与所有四种天然存在的核碱基进行碱基配对而基本上不影响解链行为，细胞内酶的识别或iRNA双链体活性的任何核碱基。一些示例性的通用核碱基包括但不限于2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异喹啉基、5-甲基异喹啉基、3-甲基-7-丙炔基异喹啉基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹啉基、7-丙炔基异喹啉基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基，并四苯基，并五苯基及其结构衍生物(参见，例如，Loakes,2001,Nucleic Acids Research,29,2437-2447)。

另外的核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些；2009年3月26日递交的国际申请号PCT/US09/038425中公开的那些；在Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering，第858-859页，Kroschwitz,J.I.编辑John Wiley&Sons,1990中公开的那些；由English等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些；在Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijin,P.Ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些；以及由Sanghvi,Y.S.，第15章，dsRNAResearch and Applications，第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑，CRC出版社，1993中公开的那些。所有上述内容通过引用并入本文。

在某些实施方案中，修饰的核碱基是在结构上与母体核碱基相当相似的核碱基，例如7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G-钳。在某些实施方案中，核碱基模拟物包括更复杂的结构，例如三环吩噁嗪核碱基模拟物。制备上述修饰的核碱基的方法是本领域技术人员众所周知的。

核酸修饰(糖)

本文提供的寡核苷酸可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个)单体，其包括具有修饰的糖部分的核苷或核苷酸。例如，核苷的呋喃糖基糖环可以多种方式修饰，包括但不限于添加取代基、桥接两个非偕环原子以形成锁核酸或双环核酸。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个)作为LNA的单体。

在锁核酸的一些实施方案中，呋喃糖基的2’位通过接头连接至4’位，该接头独立地选自-[C(R1)(R2)]_n-、-[C(R1)(R2)]_n-O-、-[C(R1)(R2)]_n-N(R1)-、-[C(R1)(R2)]_n-N(R1)-O-、-[C(R1R2)]_n-O-N(R1)-、-C(R1)＝C(R2)-O-、-C(R1)＝N-、-C(R1)＝N-O-、-C(═NR1)-、-C(═NR1)-O-、-C(═O)-、-C(═O)O-、-C(═S)-、-C(═S)O-、-C(═S)S-、-O-、-Si(R1)2-、-S(═O)_X-和-N(R1)-；

其中：

X是0、1或2；

n是1、2、3或4；

R1和R2各自独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或硫氧基(S(＝O)-J1)；并且

J1和J2各自独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。

在一些实施方案中，LNA化合物的接头各自独立地是-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-。在另一个实施方案中，所述接头各自独立地是4’-CH₂-2’、4’-(CH₂)₂-2’、4’-(CH₂)₃-2’、4’-CH₂-O-2’、4’-(CH₂)₂-O-2’、4’-CH₂-O-N(R1)-2’和4’-CH₂-N(R1)-O-2’-，其中R1各自独立地是H、保护基团或C1-C12烷基。

在专利文献以及科学文献中已经制备并公开了某些LNA(Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；WO 94/14226；WO 2005/021570；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；公开了LNA的授权美国专利和公开申请的实例包括，例如，美国专利号7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；和6,525,191；和美国授权前公开号2004-0171570；2004-0219565；2004-0014959；2003-0207841；2004-0143114；和20030082807。

本文还提供了LNA，其中核糖基糖环的2’-羟基基团连接至糖环的4’碳原子，从而形成亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)连接以形成双环糖部分(综述于Elayadi等人,Curr.OpinionInvens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol.,2001,8 1-7；和Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；还参见美国专利号6,268,490和6,670,461)。连接可以是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH₂-)基团，对于此将术语亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA用于双环部分；在该位置是亚乙基的情况下，使用术语亚乙基氧基(4’-CH₂CH₂-O-2’)LNA(Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456:Morita等人,BioorganicMedicinal Chemistry,2003,11,2211-2226)。亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA和其他双环糖类似物显示出与互补DNA和RNA的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对于3’-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性能。已经描述了包含BNA的高效且无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638)。

已经讨论的亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA的异构体是α-L-亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA，其已显示针对3’-核酸外切酶具有优异的稳定性。将α-L-亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA掺入至反义缺口聚体和嵌合体中，这显示出高效的反义活性(Frieden等人,Nucleic AcidsResearch,2003,21,6365-6372)。

已经描述了亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备，及其寡聚化和核酸识别特性(Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。BNA及其制备也描述于WO98/39352和WO99/14226中。

还制备了亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA、硫代磷酸酯-亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA和2’-硫代-LNA的类似物(Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。还描述了作为核酸聚合酶底物的包含寡脱氧核糖核苷酸双链体锁核苷酸类似物的制备(Wengel等人，WO 99/14226)。此外，2’-氨基-LNA(一种新型构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成已在本领域中描述(Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。此外，已经制备了2’-氨基-LNA和2’-甲基氨基-LNA，并且先前已经报道了其与互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。

修饰的糖部分是众所周知的，并且可用于改变，通常增加反义化合物对其靶标的亲和力和/或增加核酸酶抗性。优选的修饰糖的代表性列表包括但不限于双环修饰糖，包括亚甲氧基(4’-CH₂-O-2’)LNA和亚乙基氧基(4’-(CH₂)2-O-2’桥)ENA；取代的糖，尤其是具有2’-F、2’-OCH₃或2’-O(CH₂)₂-OCH₃取代基的2’-取代糖；和4’-硫代修饰糖。糖也可以用糖模拟基团替代。用于制备修饰糖的方法是本领域技术人员众所周知的。教导制备此类修饰糖的一些代表性专利和公开包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；6,531,584；和6,600,032；和WO 2005/121371。

“氧基”-2’羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR，n＝1-50；“锁”核酸(LNA)，其中核苷的呋喃糖部分包括连接呋喃糖环上的两个碳原子的桥，从而形成双环环系统；O-AMINE或O-(CH₂)_nAMINE(n＝1-10，AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)；和O-CH₂CH₂(NCH₂CH₂NMe₂)₂。

“脱氧”修饰包括氢(即，脱氧核糖，其与单链突出特别相关)；卤素(例如，氟)；氨基(例如NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-AMINE(AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)；-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；氰基；硫基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；硫代烷基；烷基；环烷基；芳基；烯基和炔基，其可任选地被例如氨基官能团取代。

其它合适的2’-修饰，例如，修饰的MOE，描述于美国专利申请公开号20130130378中，其内容通过引用并入本文。

2’位的修饰可存在于阿拉伯糖构型中。术语“阿拉伯糖构型”是指以与阿拉伯糖中的2’-OH相同的构型将取代基置于核糖的C2’上。

糖可以在糖的相同碳上包含两个不同的修饰，例如，gem修饰。糖基还可以含有一个或多个具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，寡核苷酸可以包括一个或多个含有例如阿拉伯糖作为糖的单体。该单体可以在糖的1’位具有α连接，例如α-核苷。单体还可以在4’-位具有相反的构型，例如C5’和H4’或替代其的取代基彼此互换。当C5’和H4’或替代其的取代基彼此交换时，糖被称为在4’位被修饰。

本文公开的寡核苷酸还可以包括脱碱基糖，即，在C-1’处缺少核碱基或在C1’处具有替代核碱基的其它化学基团的糖。参见例如美国专利号5,998,203，其内容以其整体通过引用并入本文。这些脱碱基糖还可以进一步含有在一个或多个组成糖原子处的修饰。寡核苷酸还可以含有一个或多个为L异构体，例如L-核苷的糖。对糖基的修饰还可以包括用硫替代4’-O，任选地取代的氮或CH₂基团。在一些实施方案中，C1’与核碱基之间的连接呈α构型。

糖修饰还可以包括“无环核苷酸”，其是指具有无环核糖的任何核苷酸，例如，其中核糖碳之间的C-C键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’、C1’-O4’)不存在和/或核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施方案中，无环核苷酸是 其中B是修饰或未修饰的核碱基，R₁和R₂独立地是H、卤素、OR₃或烷基；并且R₃是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。

在一些实施方案中，糖修饰选自2’-H、2’-O-Me(2’-O-甲基)、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-F、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)、2’-S-甲基、2’-O-CH₂-(4’-C)(LNA)、2’-O-CH₂CH₂-(4’-C)(ENA)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和gem 2’-OMe/2’F与阿拉伯糖构型的2’-O-Me。

应理解，当特定核苷酸通过其位于2’-位与下一个核苷酸连接时，本文所述的糖修饰可置于该特定核苷酸的糖的3’-位，例如，通过其2’-位连接的核苷酸。在3’位的修饰可以木糖构型存在。术语“木糖构型”是指以与木糖中的3’-OH相同的构型将取代基置于核糖的C3’上。

与C4’和/或C1’连接的氢可被直链或支链的任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基替代，其中烷基、烯基和炔基的主链可以含有O、S、S(O)、SO₂、N(R’)、C(O)、N(R’)C(O)O、OC(O)N(R’)、CH(Z’)、含磷连接、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的杂环或任选地取代的环烷基，其中R’是氢、酰基或任选地取代的脂族基，Z’选自OR₁₁、COR₁₁、CO₂R₁₁、 NR₂₁R₃₁、CONR₂₁R₃₁、CON(H)NR₂₁R₃₁、ONR₂₁R₃₁、CON(H)N＝CR₄₁R₅₁、N(R₂₁)C(＝NR₃₁)NR₂₁R₃₁、N(R₂₁)C(O)NR₂₁R₃₁、N(R₂₁)C(S)NR₂₁R₃₁、OC(O)NR₂₁R₃₁、SC(O)NR₂₁R₃₁、N(R₂₁)C(S)OR₁₁、N(R₂₁)C(O)OR₁₁、N(R₂₁)C(O)SR₁₁、N(R₂₁)N＝CR₄₁R₅₁、ON＝CR₄₁R₅₁、SO₂R₁₁、SOR₁₁、SR₁₁以及取代或未取代的杂环；R₂₁和R₃₁每次出现时独立地是氢、酰基、未取代或取代的脂族、芳基、杂芳基、杂环、OR₁₁、COR₁₁、CO₂R₁₁或NR₁₁R₁₁’；或R₂₁和R₃₁与其所连接的原子一起形成杂环；R₄₁和R₅₁在每次出现时独立地是氢、酰基、未取代或取代的脂族基、芳基、杂芳基、杂环基、OR₁₁、COR₁₁或CO₂R₁₁或NR₁₁R₁₁’；并且R₁₁和R₁₁’独立地是氢、脂族基、取代的脂族基、芳基、杂芳基或杂环基。在一些实施方案中，连接至5’-末端核苷酸的C4’的氢被替代。

在一些实施方案中，C4’和C5’一起形成任选地取代的杂环，优选地包含至少一个-PX(Y)-，其中X为H、OH、OM、SH、任选地取代的烷基、任选地取代的烷氧基、任选地取代的烷硫基、任选地取代的烷基氨基或任选地取代的二烷基氨基，其中M在每次出现时独立地为总电荷为+1的碱金属或过渡金属；并且Y是O、S或NR’，其中R’是氢、任选地取代的脂族基。优选地，该修饰位于iRNA的5’-末端。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含上式的至少两个连续单体的至少两个区域。在某些实施方案中，寡核苷酸包含带缺口的基序。在某些实施方案中，寡核苷酸包含约8至约14个连续的β-D-2’-脱氧呋喃核糖核苷的至少一个区域。在某些实施方案中，寡核苷酸包含约9至约12个连续的β-D-2’-脱氧呋喃核糖核苷的至少一个区域。

在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多种)包含至少一个下式的(S)-cEt单体：

其中Bx是杂环碱基部分。

在某些实施方案中，单体包括糖模拟物。在某些此类实施方案中，使用模拟物替代糖或糖-核苷间连接的组合，并且维持核碱基用于与选择的靶标杂交。糖模拟物的代表性实例包括但不限于环己烯基或吗啉基。糖-核苷间连接组合的模拟物的代表性实例包括但不限于通过不带电荷的非手性键连接的肽核酸(PNA)和吗啉基团。在一些情况下，使用模拟物替代核碱基。代表性的核碱基模拟物是本领域众所周知的，并且包括但不限于三环吩噁嗪类似物和通用碱基(Berger等人,Nuc Acid Res.2000,28:2911-14，通过引用并入本文)。糖、核苷和核碱基模拟物的合成方法是本领域技术人员众所周知的。

核酸修饰(糖间连接)

本文描述了将单体(包括但不限于修饰的和未修饰的核苷和核苷酸)连接在一起从而形成寡核苷酸的连接基团。此类连接基团也被称为糖间连接。连接基团的两个主要种类由存在或不存在磷原子来定义。代表性的含磷连接包括但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性的非含磷的连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)₂-O-)；和N,N’-二甲基肼(-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-)。

如上所述，本文所述的是作为临时保护基团引入到寡核苷酸的一个或多个含磷核苷酸间连接基团的还可以使用下述方法修饰保留的含磷核苷酸间连接基团。

与天然磷酸二酯连接相比，修饰的连接可用于改变，通常增加，寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施方案中，具有手性原子的连接可以作为外消旋混合物、作为单独的对映异构体制备。代表性的手性连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷和非含磷的连接的方法是本领域技术人员众所周知的。

连接基团中的磷酸酯基团可以通过用不同的取代基替代氧中的一个来修饰。该修饰的一个结果是可以增加寡核苷酸对核酸裂解断裂的抗性。修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、磷硒酸酯、硼烷基磷酸、硼烷基磷酸酯、氢膦酸酯、酰胺磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在一些实施方案中，连接中的非桥接磷酸酯氧原子之一可被以下任何一种替代：S、Se、BR₃(R为氢、烷基、芳基)、C(即，烷基、芳基等)、H、NR₂(R为氢、任选地取代的烷基、芳基)或(R为任选地取代的烷基或芳基)。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子团之一替代非桥接氧之一使得磷原子具有手性；换句话说，以该方式修饰的磷酸酯基团中的磷原子是立体中心。立体异构磷原子可具有“R”构型(本文中Rp)或“S”构型(本文中Sp)。

二硫代磷酸酯具有被硫替代的非桥接氧两者。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，这妨碍了寡核苷酸非对映体的形成。因此，尽管不希望受理论束缚，但对消除手性中心的非桥接氧两者的修饰，其消除手性中心，例如二硫代磷酸酯形成，可能是期望的，因为其不能产生非对映异构体混合物。因此，非桥接氧可以独立地是O、S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一种。

磷酸酯接头也可以通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替代桥接的氧(即，将磷酸酯与单体的糖连接的氧)来修饰。替代可出现在连接氧的任一个或连接氧两者处。当桥接的氧是核苷的3’-氧时，优选的是用碳的替代。当桥接的氧是核苷的5’-氧时，优选的是用氮的替代。

修饰的磷酸酯连接(其中至少一个与磷酸酯连接的氧被替代或磷酸酯基团被非磷基团替代)也被称为“非磷酸二酯糖间连接”或“非磷酸二酯接头”。

在某些实施方案中，磷酸酯基团可以被非含磷的连接体，例如脱磷酸接头替代。脱磷酸接头在本文中也称为非磷酸二酯接头。尽管不希望受理论束缚，但据信由于带电荷的磷酸二酯基团是核酸裂解降解的反应中心，因此用中性结构模拟物替代其应赋予增强的核酸酶稳定性。而且，尽管不希望受理论束缚，但在一些实施方案中，可能期望引入其中带电荷的磷酸酯基团被中性部分替代的改变。

可以替代磷酸酯基团的部分的实例包括但不限于酰胺(例如酰胺-3(3’-CH₂-C(＝O)-N(H)-5’)和酰胺-4(3’-CH₂-N(H)-C(＝O)-5’))、羟氨基、硅氧烷(二烷基硅氧烷)、甲酰胺、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、羧酸酯、硫醚、环氧乙烷接头、硫化物、磺酸、磺酰胺、磺酸酯、硫代甲缩醛(3’-S-CH₂-O-5’)、甲缩醛(3’-O-CH₂-O-5’)、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基羰基氨基、亚甲基甲基亚氨基(MMI，3’-CH₂-N(CH₃)-O-5’)、亚甲基伸肼基、亚甲基二甲基伸肼基、亚甲氧基甲基亚氨基、醚(C3’-O-C5’)、硫醚(C3’-S-C5’)、硫代乙酰胺基(C3’-N(H)-C(＝O)-CH₂-S-C5’、C3’-O-P(O)-O-SS-C5’、C3’-CH₂-NH-NH-C5’、3’-NHP(O)(OCH₃)-O-5’和3’-NHP(O)(OCH₃)-O-5’以及含有混合N、O、S和CH₂组成部分的非离子键。参见，例如，Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编辑.ACS Symposium Series 580；第3和4章，(第40-65页)。优选的实施方案包括亚甲基甲基亚氨基(MMI)、亚甲基羰基氨基、酰胺、氨基甲酸酯和环氧乙烷接头。

本领域技术人员熟知，在某些情况下，非桥接的氧的替代可导致相邻2’-OH对糖间连接的裂解增强，因此在许多情况下，非桥接的氧的修饰可能需要2’-OH的修饰，例如，不参与相邻糖间连接的裂解的修饰，例如，阿拉伯糖、2’-O-烷基、2’-F、LNA和ENA。

优选的非磷酸二酯糖间连接包括硫代磷酸酯，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多对映体过量的Sp异构体的硫代磷酸酯，具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多对映体过量的Rp异构体的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如，甲基膦酸酯)、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯(例如，N-烷基氨基磷酸酯)和硼烷膦酸酯。

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个并且至多包括全部)修饰的或非磷酸二酯连接。在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个并且至多包括全部)硫代磷酸酯连接。

还可以构建寡核苷酸，其中磷酸酯接头和糖被核酸酶抗性核苷或核苷酸代理物替代。尽管不希望受理论束缚，但据信缺少重复带电主链减少与识别聚阴离子(例如核酸酶)的蛋白质的结合。再次，尽管不希望受理论束缚，但在一些实施方案中可能期望引入其中碱基被中性代理主链栓系的改变。实例包括吗啉基、环丁基、吡咯烷、肽核酸(PNA)、氨基乙基甘氨酰PNA(aegPNA)和主链延伸的吡咯烷PNA(bepPNA)核苷代理物。优选的代理物是PNA代理物。

本文所述的寡核苷酸可含有一个或多个不对称中心，并且因此产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构构型，其可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)，例如对于糖端基异构体，或定义为(D)或(L)，例如对于氨基酸等。包括在寡核苷酸中的是所有此类可能的异构体，及其外消旋的和光学纯的形式。

核酸修饰(末端修饰)

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步在反义链的5’-端包含磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一个实施方案中，磷酸酯模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。

在一些实施方案中，反义链的5’-端不含5’-乙烯基膦酸酯(VP)。

可以修饰iRNA剂的末端。此类修饰可以在一端或两端。例如，iRNA的3’和/或5’端可以缀合至其他功能性分子实体，例如标记部分，例如，荧光团(例如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(基于例如，硫、硅、硼或酯)。功能性分子实体可以通过磷酸酯基团和/或接头与糖连接。接头的末端原子可以连接或替代磷酸酯基团的连接原子或糖的C-3’或C-5’O、N、S或C基团。可替代地，接头可连接或替代核苷酸代理物(例如，PNA)的末端原子。

当接头/磷酸酯-功能性分子实体-接头/磷酸酯阵列插入双链寡核苷酸的两条链之间时，该阵列可以替换发夹型寡核苷酸中的发夹环。

可用于调节活性的末端修饰包括具有磷酸酯或磷酸酯类似物的iRNA的5’末端的修饰。在某些实施方案中，iRNA的5’-端被磷酸化或包括磷酰基类似物。示例性的5’-磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些。在5’-末端的修饰还可用于刺激或抑制受试者的免疫系统。在一些实施方案中，寡核苷酸的5’-端包含修饰其中W、X和Y各自独立地选自O、OR(R为氢、烷基、芳基)、S、Se、BR₃(R为氢、烷基、芳基)、BH₃ ^-、C(即烷基、芳基等)、H、NR₂(R为氢、烷基、芳基)或OR(R为氢、烷基或芳基)；A和Z在每次出现时各自独立地为不存在、O、S、CH₂、NR(R为氢、烷基、芳基)或任选地取代的亚烷基，其中亚烷基的主链可在内部和/或在末端包含O、S、SS和NR(R为氢、烷基、芳基)中的一个或多个；并且n为0-2。在一些实施方案中，n为1或2。应理解，A替代与糖的5’碳连接的氧。当n为0时，W和Y与其所连接的P一起可以形成任选地取代的5-8元杂环，其中W和Y各自独立地为O、S、NR’或亚烷基。优选地，杂环被芳基或杂芳基取代。在一些实施方案中，5’-末端核苷酸的C5’上的一个或两个氢被卤素，例如F替代。

示例性5’-修饰包括但不限于，5’-单磷酸((HO)₂(O)P-O-5’)；5’-二磷酸((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸(硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)；5’-单-二硫代磷酸(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫代磷酸((HO)2(O)P-S-5’)；5’-α-硫代三磷酸；5’-β-硫代三磷酸；5’-γ-硫代三磷酸；5’-氨基磷酸((HO)₂(O)P-NH-5’、(HO)(NH₂)(O)P-O-5’)。其它5’-修饰包括5’-烷基膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5’，R＝烷基，例如，甲基、乙基、异丙基，丙基等)、5’-烷基醚膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5’，R＝烷基醚，例如，甲氧基甲基(CH₂OMe)、乙氧基甲基等)；5’-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)，以及任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)。其它示例性5’-修饰包括，其中Z为任选地取代的烷基至少一次，例如，((HO)₂(X)P-O[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5’、((HO)₂(X)P-O[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5’、((HO)2(X)P-[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5’；二烷基末端磷酸酯和磷酸酯模拟物：HO[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5’、H₂N[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5’、H[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5’、Me₂N[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5’、HO[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5’、H₂N[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5’、H[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5’、Me₂N[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5’，其中a和b各自独立地为1-10。其它实施方案包括用BH₃、BH₃ ^-和/或Se替代氧和/或硫。

末端修饰还可用于监测分布，并且在此类情况下，待添加的优选基团包括荧光团，例如，荧光素或Alexa染料、例如，Alexa 488。末端修饰还可用于增强摄取，对此有用的修饰包括靶向配体。末端修饰还可用于使寡核苷酸与另一部分交联；对此有用的修饰包括丝裂霉素C、补骨脂素及其衍生物。

热去稳定修饰

可以通过在有义链中与反义链的种子区域相对的位点(即，在反义链的5’-端的2-8位)引入热去稳定修饰来增加iRNA双链体解离或解链的倾向(降低双链体缔合的自由能)而针对RNA干扰优化寡核苷酸，如iRNA或dsRNA剂。该修饰可以增加双链体在反义链的种子区域解离或解链的倾向。

热去稳定修饰可以包括无碱基修饰；与相对链中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰如2’-脱氧修饰或无环核苷酸，例如，未锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。

示例性的无碱基修饰是：

示例性的糖修饰是：

R＝H、OH、O-烷基R＝H、OH、O-烷基

术语“UNA”是指未锁的无环核酸，其中糖的任何键已被去除，从而形成未锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖在C1’-C4’之间的键被去除(即在C1’和C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)的单体。在另一个实例中，糖的C2’-C3’键(即在C2’和C3’碳之间的共价碳-碳键)被去除(参见Mikhailov等人，Tetrahedron Letters,26(17):2059(1985)；和Fluiter等人，Mol.Biosyst.,10:1039(2009)，其以其整体通过引用并入本文)。无环衍生物提供更大的主链柔性，而不影响沃森-克里克配对。无环核苷酸可以通过2’-5’或3’-5’键连接。

术语“GNA”是指二醇核酸，其是类似于DNA或RNA的聚合物，但其不同在于“主链”的组成，其由通过磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成：

热去稳定修饰可以是dsRNA双链体内热去稳定核苷酸与相对链中的相对核苷酸之间的错配(即，非互补碱基对)。示例性错配碱基对包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其它错配碱基配对也适用于本发明。错配可以出现在天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸之间，即，错配碱基配对可以出现在相应核苷酸的核碱基之间，而与核苷酸的核糖上的修饰无关。在某些实施方案中，寡核苷酸，例如siRNA或iRNA剂在错配配对中含有至少一个核碱基，其为2’-脱氧核碱基；例如，2’-脱氧核碱基在有义链中。

无碱基核苷酸、无环核苷酸修饰(包括UNA和GNA)和错配修饰的更多实例已详细描述于WO 2011/133876中，其以整体通过引用并入本文。

热去稳定修饰还可包括具有降低或消除与相对碱基形成氢键的能力的通用碱基和磷酸酯修饰。

如WO 2010/0011895中所述，已经针对dsRNA双链体的中心区域的去稳定化评估了具有受损或完全消除的与相对链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰，其以整体通过引用并入本文。示例性的核碱基修饰是：

已知与天然磷酸二酯键相比降低dsRNA双链体的热稳定性的示例性磷酸酯修饰是：

在一些实施方案中，寡核苷酸可包含2’-5’连接(与2’-H、2’-OH和2’-OMe以及与P＝O或P＝S)。例如，2’-5’连接修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可用于有义链的5’端处以避免有义链被RISC活化。

在另一实施方案中，寡核苷酸可以包含L糖(例如，L核糖、L-阿拉伯糖，具有2’-H、2’-OH和2’-OMe)。例如，这些L糖修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可用于有义链的5’端以避免有义链被RISC活化。

在一些实施方案中，一个或多个靶向配体通过的R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉中的任一个，任选地经由一个或多个接头/系链连接至修饰的磷酸酯前药化合物。

靶向配体通过在有义链或反义链或有义链和反义链两者上引入寡核苷酸中在以下实施例10的方案16中说明。这些靶向配体可以在siRNA寡核苷酸进入细胞溶质后与切除。

在一些实施方案中，靶向配体选自抗体、受体的配体结合部分、受体的配体、适体、基于碳水化合物的配体、脂肪酸、脂蛋白、叶酸、促甲状腺激素、促黑激素、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白、二磷酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、增强血浆蛋白结合的亲脂性部分、胆固醇、类固醇、胆汁酸、维生素B12、生物素、荧光团和肽。

在某些实施方案中，至少一种配体是靶向肝组织的基于碳水化合物的配体。在一个实施方案中，基于碳水化合物的配体选自半乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)、多价GalNAc、甘露糖、多价甘露糖、乳糖、多价乳糖、N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)、多价GlcNAc、葡萄糖、多价葡萄糖、岩藻糖和多价岩藻糖。

在某些实施方案中，至少一个配体是亲脂性部分。在一个实施方案中，通过logK_ow测量的亲脂性部分的亲脂性超过0，或通过化合物的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的化合物的疏水性超过0.2。

在一个实施方案中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C₄-C₃₀烃链和任选的选自羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔烃的官能团。例如，亲脂性部分含有饱和或不饱和的C₆-C₁₈烃链。

另外的亲脂性部分和关于亲脂性部分的亲脂性和寡核苷酸的疏水性的另外的细节可以在2020年11月6日递交的标题为“肝外递送”的PCT申请号PCT/US20/59399中找到，其内容整体通过引入并入本文。

在某些实施方案中，至少一个配体靶向介导至CNS组织的递送的受体。在一个实施方案中，靶向配体选自Angiopep-2、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体、转铁蛋白受体(TfR)配体、甘露糖受体配体、葡萄糖转运蛋白和LDL受体配体。

在某些实施方案中，至少一个配体靶向介导至眼组织的递送的受体。在一个实施方案中，靶向配体选自反式视黄醇、RGD肽、LDL受体配体和基于碳水化合物的配体。

靶向配体也可以直接(独立地)(即，不通过)引入寡核苷酸中。

在一些实施方案中，寡核苷酸在反义链的5’-端、3’-端和/或内部位置含有至少一个靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链的5’-端、3’-端和/或内部位置含有至少一个靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸在反义链的5’-端、3’-端和/或内部位置含有至少一个并且在有义链的5’-端、3’-端和/或内部位置含有至少一个靶向配体。

在一个实施方案中，寡核苷酸在反义链的5’-端含有至少一个 并且在有义链的3’-端含有至少一个靶向配体。

在一些实施方案中，如下所述，一个或多个靶向配体通过一个或多个接头/系链连接至修饰的磷酸酯前药化合物(通过 )。

在一些实施方案中，如下所述，一个或多个靶向配体通过一个或多个接头/系链直接(即，不通过)连接至寡核苷酸。

接头/系链

接头/系链在“系链附接点(TAP)”处连接至修饰的磷酸酯前药化合物。接头/系链可以包括任何C₁-C₁₀₀含碳部分，(例如C₁-C₇₅、C₁-C₅₀、C₁-C₂₀、C₁-C₁₀；C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉或C₁₀)，并且可以具有至少一个氮原子。在某些实施方案中，氮原子形成接头/系链上的末端氨基或酰氨基(NHC(O)-)基团的部分，其可用作修饰的磷酸酯前药化合物的连接点。接头/系链(下划线)的非限制性实例包括TAP-(CH₂)_nNH-；TAP-C(O)(CH₂)_nNH-；TAP-NR””(CH₂) _nNH-、TAP-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-；TAP-C(O)-(CH₂)_n-C(O)O-；TAP-C(O)-O-；TAP-C(O)-(CH₂)_n- NH-C(O)-；TAP-C(O)-(CH₂)_n-；TAP-C(O)-NH-；TAP-C(O)-；TAP-(CH₂)_n-C(O)-；TAP-(CH₂)_n-C (O)O-；TAP-(CH₂)_n-；或TAP-(CH₂)_n-NH-C(O)-；其中n是1-20(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)并且R””是C₁-C₆烷基。优选地，n是5、6或11。在其它实施方案中，氮可形成末端氧氨基的部分，例如-ONH₂或肼基、-NHNH₂。接头/系链可以任选地被例如羟基、烷氧基、全卤代烷基取代和/或任选地插入一个或多个另外的杂原子，例如，N、O或S。优选的系链配体可包括，例如，TAP-(CH₂)_nNH(配体)；TAP-C(O)(CH₂)_nNH(配体)；TAP-NR”” (CH₂)_nNH(配体)；TAP-(CH₂)_nONH(配体)；TAP-C(O)(CH₂)_nONH(配体)；TAP-NR””(CH₂)_nONH(配 体)；TAP-(CH₂)_nNHNH₂(配体)、TAP-C(O)(CH₂)_nNHNH₂(配体)；TAP-NR””(CH₂)_nNHNH₂(配体)；TAP-C(O)-(CH₂)_n-C(O)(配体)；TAP-C(O)-(CH₂)_n-C(O)O(配体)；TAP-C(O)-O(配体)；TAP-C (O)-(CH₂)_n-NH-C(O)(配体)；TAP-C(O)-(CH₂)_n(配体)；TAP-C(O)-NH(配体)；TAP-C(O)(配 体)；TAP-(CH₂)_n-C(O)(配体)；TAP-(CH₂)_n-C(O)O(配体)；TAP-(CH₂)_n(配体)；或TAP-(CH₂)_n- NH-C(O)(配体)。在一些实施方案中，氨基封端的接头/系链(例如，NH₂、ONH₂、NH₂NH₂)可与配体形成亚氨基键(即，C＝N)。在一些实施方案中，氨基封端的接头/系链(例如，NH₂、ONH₂、NH₂NH₂)可以例如用C(O)CF₃酰化。

在一些实施方案中，接头/系链可以用巯基(即，SH)或烯烃(例如，CH＝CH2)封端。例如，系链可以是TAP-(CH₂)_n-SH、TAP-C(O)(CH₂)_nSH、TAP-(CH₂)_n-(CH＝CH₂)或TAP-C(O) (CH₂)_n(CH＝CH₂)，其中n可以如别处所述。该系链可以任选地被，例如，羟基、烷氧基、全卤代烷基取代和/或任选地插入一个或多个另外的杂原子，例如，N、O或S。双键可以是顺式或反式或者E或Z。

在其它实施方案中，接头/系链可包括亲电部分，优选地在接头/系链的末端位置。示例性的亲电部分包括，例如，醛、烷基卤、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯或对溴苯磺酸酯，或活化的羧酸酯，例如NHS酯或五氟苯基酯。优选的接头/系链(下划线)包括TAP- (CH₂)_nCHO；TAP-C(O)(CH₂)_nCHO；或TAP-NR””(CH₂)_nCHO，其中n为1-6且R””为C₁-C₆烷基；或TAP-(CH₂)_nC(O)ONHS；TAP-C(O)(CH₂)_nC(O)ONHS；或TAP-NR””(CH₂)_nC(O)ONHS，其中n为1-6且R””为C₁-C₆烷基；TAP-(CH₂)_nC(O)OC₆F₅ ；TAP-C(O)(CH₂)_nC(O)OC₆F₅ ；或TAP-NR””(CH₂)_nC(O) OC₆F₅ ，其中n为1-11且R””为C₁-C₆烷基；或-(CH₂)_nCH₂LG；TAP-C(O)(CH₂)_nCH₂LG；或TAP-NR”” (CH₂)_nCH₂LG，其中n可如别处所述且R””为C₁-C₆烷基(LG可以是离去基团，例如，卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对硝基苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯)。可以通过将配体的亲核基团，例如，硫醇或氨基与系链上的亲电基团偶联来进行系链。

在其它实施方案中，可能期望单体在接头/系链的末端位置包含邻苯二甲酰亚氨基(K)。

在其它实施方案中，可能期望单体在接头/系链的末端位置包含苯二甲酰亚氨基(K)。

在其它实施方案中，其它被保护的氨基可以在接头/系链的末端位置，例如alloc、单甲氧基三苯甲基(MMT)、三氟乙酰基、Fmoc或芳基磺酰基(例如，芳基部分可以是邻-硝基苯基或邻,对-二硝基苯基)。

本文所述的任何接头/系链可进一步包括一个或多个另外的连接基团，例如，-O-(CH₂)_n-、-(CH₂)_n-SS-、-(CH₂)_n-或-(CH＝CH)-。

可裂解的接头/系链

在一些实施方案中，至少一个接头/系链可以是氧化还原可裂解的接头、酸可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头或肽酶可裂解的接头。

在一个实施方案中，接头/系链中的至少一个可以是可还原裂解的接头(例如，二硫化物基团)。

在一个实施方案中，接头/系链中的至少一个可以是酸可裂解的接头(例如，腙基、酯基、缩醛基或缩酮基)。

在一个实施方案中，接头/系链中的至少一个可以是酯酶可裂解的接头(例如，酯基)。

在一个实施方案中，接头/系链中的至少一个可以是磷酸酶可裂解的接头(例如，磷酸酯基团)。

在一个实施方案中，接头/系链中的至少一个可以是肽酶可裂解的接头(例如，肽键)。

可裂解的连接基团对裂解剂敏感，例如，pH、氧化还原电位或降解性分子的存在。通常，裂解剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性发现。此类降解剂的实例包括：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括，例如，存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂例如硫醇，其可通过还原降解氧化还原可裂解的连接基团；酯酶；可产生酸性环境的内体或试剂，例如，导致pH为五或更低的那些；可通过作为通用酸发挥作用来水解或降解酸可裂解的连接基团的酶、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶。

可裂解的连接基团，例如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为约7.1-7.3。内体具有更酸性的pH，在5.5-6.0的范围内，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，在5.0左右。一些系链将具有在优选的pH下裂解的连接基团，由此在细胞内将iRNA剂从配体(例如，靶向或细胞可渗透的配体，诸如胆固醇)释放，或释放到细胞的所需区室中。

将配体连接至iRNA剂的化学接合点(例如，连接基团)可以包括二硫键。当iRNA剂/配体复合物通过胞吞作用被摄取到细胞中时，内体的酸性环境将导致二硫键裂解，从而从配体释放iRNA剂(Quintana等人,Pharm Res.19:1310-1316,2002；Patri等人,Curr.Opin.Curr.Biol.6:466-471,2002)。配体可以是靶向配体或可以补充iRNA剂的治疗效果的第二治疗剂。

系链可包括可被特定酶裂解的连接基团。并入到系链中的连接基团的类型可以取决于iRNA剂所靶向的细胞。例如，靶向肝细胞中mRNA的iRNA剂可缀合于包含酯基的系链。肝细胞富含酯酶，因此与不富含酯酶的细胞类型相比，该系链在肝细胞中更有效地裂解。系链的裂解从连接至系链远端的配体释放iRNA剂，从而潜在地增强iRNA剂的沉默活性。其它富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。

含有肽键的系链可以缀合至靶向富含肽酶的细胞类型(例如，肝细胞和滑膜细胞)的iRNA剂。例如，靶向滑膜细胞的iRNA剂，例如用于治疗炎性疾病(例如，类风湿性关节炎)，可以缀合至含有肽键的系链。

通常，候选的可裂解连接基团的适合性可通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来评估。还期望的是也测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶组织(例如，向受试者施用iRNA剂将暴露于的组织)接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定第一条件和第二条件之间对裂解的相对敏感性，其中第一条件选择为指示靶细胞中的裂解，第二条件选择为指示其它组织或生物流体(例如，血液或血清)中的裂解。评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评估并通过在整个动物中进行进一步评估来确认可能是有用的。在优选的实施方案中，与血液或血清(或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞(或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)中裂解快至少2、4、10或100倍。

氧化还原可裂解的连接基团

一类可裂解的连接基团是在还原或氧化时裂解的氧化还原可裂解的连接基团。还原可裂解的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选的可裂解连接基团是否是合适的“还原可裂解的连接基团”，或例如适合与特定的iRNA部分和特定的靶向剂一起使用，可以考虑本文所述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的剂与二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂一起温育来评估候选物，其模拟在细胞，例如，靶细胞中观察到的裂解速率。也可以在选择为模拟血液或血清条件的条件下评估候选物。在优选的实施方案中，候选化合物在血液中裂解至多10％。在优选的实施方案中，与血液(或在选择来模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在选择来模拟细胞内条件的体外条件下)中降解快至少2、4、10或100倍。候选化合物的裂解速率可以使用标准酶动力学测定在选择用于模拟细胞内介质的条件下测定，并与选择用于模拟细胞外介质的条件进行比较。

基于磷酸酯的可裂解的连接基团

基于磷酸酯的连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂裂解。裂解细胞中磷酸酯基团的试剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施方案为-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。优选的实施方案为-O-P(O)(OH)-O-。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法来评估。

酸可裂解的连接基团

酸可裂解的连接基团是在酸性条件下裂解的连接基团。在优选的实施方案中，酸可裂解的连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中裂解，或通过可用作广义酸的试剂例如酶裂解。在细胞中，特定的低pH细胞器，例如内体和溶酶体，可以为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙、缩酮、缩醛、酯和氨基酸的酯。酸可裂解基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。优选的实施方案是当与酯的氧连接的碳(烷氧基)是芳基、取代的烷基或叔烷基例如二甲基戊基或叔丁基时。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法来评估。

基于酯的连接基团

基于酯的连接基团在细胞中被酶例如酯酶和酰胺酶裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法来评估。

基于肽的裂解基团

基于肽的连接基团在细胞中被酶例如肽酶和蛋白酶裂解。基于肽的可裂解的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可裂解基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。肽可裂解连接基团具有通式-NHCHR¹C(O)NHCHR²C(O)-，其中R¹和R²是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可以使用与上述那些类似的方法来评估。

可生物裂解的接头/系链

接头还可以包括可生物裂解的接头，其是连接分子的两个部分，例如，两个单独的siRNA分子的一条链或两条链以产生双(siRNA)的核苷酸和非核苷酸接头或其组合。在一些实施方案中，两个单独的siRNA之间的单纯静电或堆积相互作用可代表接头。非核苷酸接头包括衍生自单糖、二糖、寡糖及其衍生物、脂族、脂环族、杂环族及其组合的系链或接头。

在一些实施方案中，至少一种接头(系链)是选自DNA，RNA，二硫化物，酰胺，半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖和甘露糖的官能化单糖或寡糖，及其组合的生物可裂解的接头。

在一个实施方案中，生物可裂解碳水化合物接头可具有1至10个糖单元，其具有至少一个能够连接两个siRNA单元的异头连接。当存在两种或更多种糖时，这些单元可以通过1-3、1-4或1-6糖连接或通过烷基链连接。

示例性生物可裂解的接头包括：

关于可生物裂解接头的更多讨论可以在2018年1月18日递交的标题为“EndosomalCleavable Linkers”的PCT申请号PCT/US18/14213中找到，其内容整体通过引用并入本文。

载体

在一些实施方案中，一个或多个靶向配体通过一种或多种如本文所述的载体和任选地通过一个或多个如本文所述的接头/系链(经由 )连接至修饰的磷酸酯前药化合物。

在一些实施方案中，一个或多个靶向配体直接(即，不通过 )，通过如本文所述的一个或多个载体和任选地通过如上所述的一个或多个接头/系链连接至寡核苷酸。

载体可以是环状基团或无环基团。在一个实施方案中，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和萘烷基。在一个实施方案中，无环基团是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的部分。

载体可以替代iRNA剂的一个或多个核苷酸。

在一些实施方案中，载体替代iRNA剂内部位置的一个或多个核苷酸。

在其它实施方案中，载体替代有义链或反义链末端的核苷酸。在一个实施方案中，载体替代有义链的3’端上的末端核苷酸，从而充当保护有义链的3’端的末端帽。在一个实施方案中，载体是具有胺的环状基团，例如，载体可以是吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基或萘烷基。

其中亚基的核糖已被如此替代的核糖核苷酸亚基在本文中称为核糖取代修饰亚基(RRMS)。载体可以是环状或无环部分，并且包括两个“主链附接点”(例如，羟基)和配体。如上所述，靶向配体可以直接连接至载体或通过插入的接头/系链间接连接至载体。

配体缀合的单体亚基可以是iRNA分子的5’或3’-末端亚基，即，两个“W”基团之一可以是羟基，并且另一个“W”基团可以是两个或更多个未修饰或修饰的核糖核苷酸的链。可替代地，配体缀合的单体亚基可以占据内部位置，并且两个”W”基团可以是一个或多个未修饰或修饰的核糖核苷酸。iRNA剂中可存在多于一个配体缀合的单体亚基。、

基于糖替代的单体，例如配体缀合的单体(环状)

环状的基于糖取代的单体，例如，基于糖取代的配体缀合的单体，在本文中也称为RRMS单体化合物。载体可具有下文提供的通式(LCM-2)(在该结构中，优选的主链附接点可选自R¹或R²；R³或R⁴；或R⁹和R¹⁰，如果Y是CR⁹R¹⁰(选择两个位置以提供两个主链附接点，例如，R¹和R⁴或R⁴和R⁹))。优选的系链附接点包括R⁷；当X是CH₂时，R⁵或R⁶。下面将载体描述为可并入至链中的实体。因此，应理解，结构还涵盖其中附接点(例如R¹或R²；R³或R⁴；或R⁹或R¹⁰(当Y是CR⁹R¹⁰时))中的一个(在末端位置的情况下)或两个(在内部位置的情况下)连接至磷酸酯或修饰的磷酸酯(例如含硫的)主链的情况。例如：上述R基团之一可以是-CH₂-，其中一个键连接至载体，并且一个键连接至主链原子，例如，连接氧或中心磷原子。

其中：

X为N(CO)R⁷、NR⁷或CH₂；

Y为NR⁸、O、S、CR⁹R¹⁰；

Z为CR¹¹R¹²或不存在；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁹和R¹⁰各自独立地为H、OR^a或(CH₂)_nOR^b，条件是R¹、R²、R³、R⁴、R⁹和R¹⁰中的至少两个为OR^a和/或(CH₂)_nOR^b；

R⁵、R⁶、R¹¹和R¹²各自独立地为配体、H、任选地被1-3个R¹³取代的C₁-C₆烷基或C(O)NHR⁷；或R⁵和R¹¹一起为任选地被R¹⁴取代的C₃-C₈环烷基；

R⁷可以是配体，例如R⁷可以是R^d，或R⁷可以是间接系链至载体的配体，例如，通过系链部分，例如被NR^cR^d取代的C₁-C₂₀烷基；或被NHC(O)R^d取代的C₁-C₂₀烷基；

R⁸为H或C₁-C₆烷基；

R¹³为羟基、C₁-C₄烷氧基或卤素；

R¹⁴为NR^cR⁷；

R¹⁵为任选地被氰基取代的C₁-C₆烷基，或C₂-C₆烯基；

R¹⁶为C₁-C₁₀烷基；

R¹⁷为液相或固相支持试剂；

L为-C(O)(CH₂)_qC(O)-或-C(O)(CH₂)_qS-；

R^a为保护基团，例如，CAr₃；(例如，二甲氧基三苯甲基)或Si(X^5’)(X^5”)(X^5”‘)，其中(X^5’)、(X^5”)和(X^5”‘)如别处所述。

R^b为P(O)(O^-)H、P(OR¹⁵)N(R¹⁶)₂或L-R¹⁷；

R^c为H或C₁-C₆烷基；

R^d为H或配体；

Ar各自独立地为任选被C₁-C₄烷氧基取代的C₆-C₁₀芳基；

n为1-4；和q为0-4。

示例性载体包括其中，例如，X为N(CO)R⁷或NR⁷，Y为CR⁹R¹⁰和Z为不存在；或X为N(CO)R⁷或NR⁷、Y为CR⁹R¹⁰和Z为CR¹¹R¹²；或X为N(CO)R⁷或NR⁷、Y为NR⁸和Z为CR¹¹R¹²；或X为N(CO)R⁷或NR⁷、Y或O和Z为CR¹¹R¹²；或X为CH₂；Y为CR⁹R¹⁰；Z为CR¹¹R¹²，以及R⁵和R¹¹一起形成C₆环烷基(H，z＝2)的那些，或茚满环系统，例如，X为CH₂；Y为CR⁹R¹⁰；Z为CR¹¹R¹²，以及R⁵和R¹¹一起形成C₅环烷基(H，z＝1)。

在某些实施方案中，载体可以基于吡咯啉环系统或4-羟基脯氨酸环系统，例如，X为N(CO)R⁷或NR⁷、Y为CR⁹R¹⁰，并且Z为不存在(D)。OFG¹优选地连接至伯碳，例如，环外亚烷基，诸如亚甲基，其连接至五元环中的碳之一(D中的-CH₂OFG¹)。OFG²优选地直接连接至五元环中的碳之一(D中的-OFG²)。对于基于吡咯啉的载体，-CH₂OFG¹可连接至C-2并且OFG²可连接至C-3；或-CH₂OFG¹可连接至C-3并且OFG²可连接至C-4。在某些实施方案中，CH₂OFG¹和OFG²可以被偕取代至以上提及的碳之一。对于基于3-羟基脯氨酸的载体，-CH₂OFG¹可连接至C-2并且OFG²可连接至C-4。基于吡咯啉-和4-羟脯氨酸的单体因此可以含有连接(例如，碳-碳键)，其中键旋转被限制在该特定连接周围，例如由于环的存在引起的限制。因此，在上述任何配对中，CH₂OFG¹和OFG²相对于彼此可以是顺式或反式的。因此，明确包括所有顺式/反式异构体。单体还可以含有一个或多个不对称中心，因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单个非对映体和非对映体混合物存在。明确包括单体的所有此类异构形式(例如，携带CH₂OFG¹和OFG²的中心可以具有R构型；或两者具有S构型；或一个中心可具有R构型并且另一中心可具有S构型，并且反之亦然)。系链附接点优选地为氮。载体D的优选实例包括以下：

在某些实施方案中，载体可基于哌啶环系统(E)，例如，X为N(CO)R⁷或NR⁷、Y为CR⁹R¹⁰和Z为CR¹¹R¹²。OFG¹优选地连接至伯碳，例如，环外亚烷基，诸如，亚甲基(n＝1)或亚乙基(n＝2)，其连接至六元环中的碳之一[E中的-(CH₂)_nOFG¹]。OFG²优选地直接连接至六元环中的碳之一(E中的-OFG²)。-(CH₂)nOFG¹和OFG²可以偕方式布置在环上，即，两个基团可以例如在C-2、C-3或C-4处连接至相同的碳。可替代地，-(CH₂)_nOFG¹和OFG²可以邻位方式布置在环上，即，两个基团可以连接至相邻的环碳原子上，例如，-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-2并且OFG²可以连接至C-3；-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-3并且OFG²可以连接至C-2；-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-3并且OFG²可以连接至C-4；或-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-4并且OFG²可以连接至C-3。因此，基于哌啶的单体可以含有连接(例如，碳-碳键)，其中键旋转被限制在该特定连接周围，例如由于环的存在导致的限制。因此，在上述任何配对中，-(CH₂)nOFG¹和OFG²相对于彼此可以是顺式或反式的。因此，明确包括所有顺式/反式异构体。单体还可以含有一个或多个不对称中心，并且因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单个非对映体和非对映体混合物存在。明确包括单体的所有此类异构形式(例如，携带CH₂OFG¹和OFG²的中心可以具有R构型；或两者具有S构型；或一个中心可具有R构型，并且另一中心可具有S构型，并且反之亦然)。系链附接点优选地为氮。

在某些实施方案中，载体可基于哌嗪环系统(F)，例如，X为N(CO)R⁷或NR⁷，Y为NR⁸和Z为CR¹¹R¹²，或吗啉环系统(G)，例如，X为N(CO)R⁷或NR⁷、Y为O和Z为CR¹¹R¹²。

OFG1优选地附接至伯碳，例如，环外亚烷基，如亚甲基，其连接至六元环中的碳之一(F或G中的-CH₂OFG¹)。OFG²优选直接连接至六元环中的碳之一(F或G中的-OFG²)。对于F和G，-CH₂OFG¹可以连接至C-2并且OFG²可以连接至C-3；或反之亦然。在某些实施方案中，CH₂OFG¹和OFG²可以偕位取代至以上提及的碳之一。基于哌嗪和吗啉的单体因此可以含有连接(例如，碳-碳键)，其中键旋转被限制在该特定连接周围，例如由于环的存在导致的限制。因此，在上述任何配对中，CH₂OFG¹和OFG²相对于彼此可以是顺式或反式的。因此，明确包括所有顺式/反式异构体。单体还可以含有一个或多个不对称中心，且因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单个非对映体和非对映体混合物存在。明确包括单体的所有此类异构形式(例如，携带CH₂OFG¹和OFG²的中心可以具有R构型；或两者具有S构型；或一个中心可具有R构型并且另一中心可具有S构型，并且反之亦然)。R”’可以是例如C₁-C₆烷基，优选地CH₃。系链附接点优选地为F和G中的氮。

在某些实施方案中，载体可以基于十氢化萘环系统，例如，X为CH₂；Y为CR⁹R¹⁰；Z为CR¹¹R¹²以及R⁵和R¹¹一起形成C₆环烷基(H，z＝2)，或茚满环系统，例如，X为CH₂；Y为CR⁹R¹⁰；Z为CR¹¹R¹²以及R⁵和R¹¹一起形成C₅环烷基(H，z＝1)。

OFG¹优选地附接至伯碳，例如，连接至C-2、C-3、C-4或C-5之一的环外亚甲基(n＝1)或亚乙基(n＝2)[H中的-(CH2)_nOFG¹]。OFG²优选地直接连接至C-2、C-3、C-4或C-5之一(H中的-OFG²)。-(CH₂)_nOFG¹和OFG²可以偕方式布置在环上，即，两个基团可以例如在C-2、C-3、C-4或C-5处连接至相同的碳。可替代地，-(CH₂)_nOFG¹和OFG²可以邻位的方式布置在环上，即，两个基团可以连接至相邻的环碳原子上，例如，-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-2并且OFG²可以连接至C-3；-(CH₂)_nOFG¹可以附接至C-3并且OFG²可以附接至C-2；-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-3并且OFG²可以连接至C-4；或-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-4并且OFG²可以连接至C-3；-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-4并且OFG²可以连接至C-5；或-(CH₂)_nOFG¹可以连接至C-5并且OFG²可以附接至C-4。因此，基于十氢化萘或茚满的单体可含有链接(例如，碳-碳键)，其中键旋转被限制在该特定连接周围，例如由于环的存在导致的限制。因此，在上述任何配对中，-(CH₂)_nOFG¹和OFG²相对于彼此可以是顺式或反式的。因此，明确包括所有顺式/反式异构体。单体还可以含有一个或多个不对称中心，且因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单个非对映体和非对映体混合物存在。明确包括单体的所有此类异构形式(例如，携带CH₂OFG¹和OFG²的中心可以具有R构型；或两者具有S构型；或一个中心可具有R构型并且另一中心可具有S构型，并且反之亦然)。在优选的实施方案中，C-1和C-6处的取代基相对于彼此是反式的。系链附接点优选为C-6或C-7。

其它载体可包括基于3-羟基脯氨酸(J)的那些。

因此，-(CH₂)_nOFG¹和OFG²相对于彼此可以是顺式或反式的。因此，明确包括所有顺式/反式异构体。单体还可以含有一个或多个不对称中心，且因此作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单个非对映体和非对映体混合物存在。明确包括单体的所有此类异构形式(例如，携带CH₂OFG¹和OFG²的中心可以具有R构型；或两者具有S构型；或一个中心可具有R构型并且另一中心可具有S构型，并且反之亦然)。系链附接点优选地为氮。

关于更具代表性的环状的、基于糖取代的载体的细节可在美国专利号7,745,608和8,017,762中找到，其整体通过引用并入本文。

基于糖取代的单体(无环)

无环的基于糖取代的单体，例如基于糖取代的配体缀合的单体，在本文中也称为核糖取代单体亚基(RRMS)单体化合物。优选的无环载体可具有式LCM-3或LCM-4：

在一些实施方案中，x、y和z各自可以彼此独立地为0、1、2或3。在式LCM-3中，当y和z不同时，则叔碳可具有R或S构型。在优选的实施方案中，x为0，并且在式LCM-3(例如，基于丝氨醇)中，y和z各自为1，和在式LCM-3中，y和z各自为1。以下式LCM-3或LCM-4各自可任选地被，例如，羟基、烷氧基、全卤代烷基取代。

关于更具代表性的无环的基于糖取代的载体的细节可在美国专利号7,745,608和8,017,762中找到，其以整体通过引用并入本文。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含任选地通过载体和/或接头/系链缀合至有义链的5’端或反义链的5’端的一个或多个靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含任选地通过载体和/或接头/系链缀合至有义链的3’端或反义链的3’端的一个或多个靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含任选地通过载体和/或接头/系链缀合至有义链两端的一个或多个靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含任选地通过载体和/或接头/系链缀合至反义链两端的一个或多个靶向配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含任选地通过载体和/或接头/系链缀合至有义链或反义链的内部位置的一个或多个靶向配体。

在一些实施方案中，一个或多个靶向配体缀合至核糖、核碱基和/或核苷酸间连接处。在一些实施方案中，一个或多个靶向配体在核糖的2’位、3’位、4’位和/或5’位缀合至核糖。在一些实施方案中，一个或多个靶向配体缀合在天然(例如A、T、G、C或U)或如本文定义修饰的核碱基处。在一些实施方案中，一个或多个靶向配体在如本文定义的磷酸酯或修饰的磷酸酯基团处缀合。

在一些实施方案中，寡核苷酸包含缀合至有义链的5’端或3’端的一个或多个靶向配体，以及缀合至反义链的5’端或3’端的一个或多个相同或不同的靶向配体，

在一些实施方案中，至少一个靶向配体位于有义链或反义链的一个或多个末端位置上。在一个实施方案中，至少一个靶向配体位于有义链的3’端或5’端上。在一个实施方案中，至少一个靶向配体位于反义链的3’端或5’端上。

在一些实施方案中，至少一个靶向配体缀合至至少一条链上的一个或多个内部位置。链的内部位置是指，除了链的3’-端和5’-端的末端位置(例如，排除2个位置：从3’-端计数的位置1和从5’-端计数的位置1)外，链的任何位置上的核苷酸。

在一个实施方案中，至少一个靶向配体位于至少一条链上的一个或多个内部位置上，其包括除了链的每一端的末端两个位置之外的所有位置(例如，排除4个位置：从3’端计数的位置1和2，及从5’端计数的位置1和2)。在一个实施方案中，靶向配体位于至少一条链上的一个或多个内部位置上，其包括除了链的每一端的末端的三个位置之外的所有位置(例如，排除6个位置：从3’端计数的位置1、2和3及从5’端计数的位置1、2和3)。

在一个实施方案中，至少一个靶向配体位于双链体区域的至少一端的一个或多个位置上，其包括双链体区域内的所有位置，但不包括替代有义链的3’端上的末端核苷酸的突出端区域或载体。

在一个实施方案中，至少一个靶向配体位于双链体区域的反义链的5’端的前五个、四个、三个、二个或第一个碱基对内的有义链上。

在一个实施方案中，至少一个靶向配体(例如，亲脂性部分)位于至少一条链上的一个或多个内部位置上，除了有义链的切割位点区域，例如，靶向配体(如，亲脂性部分)不位于从有义链的5’-端计数的位置9-12上，例如，靶向配体(如，亲脂性部分)不位于从有义链的5’-端计数的位置9-11上。可替代地，内部位置排除从有义链的3’-末端计数的位置11-13。

在一个实施方案中，至少一个靶向配体(例如，亲脂性部分)位于至少一条链上的一个或多个内部位置上，其排除反义链的切割位点区域。例如，内部位置排除从反义链的5’-端计数的位置12-14。

在一个实施方案中，至少一个靶向配体(例如，亲脂性部分)位于至少一条链上的一个或多个内部位置上，其排除有义链上3’-端开始计数的位置11-13和反义链上5’-端开始计数的位置12-14。

在一个实施方案中，一个或多个靶向配体(例如，亲脂性部分)位于以下内部位置中的一个或多个上：从每条链的5’端计数，有义链的位置4-8和13-18，以及反义链的位置6-10和15-18。

在一个实施方案中，一个或多个靶向配体(例如，亲脂性部分)位于以下内部位置中的一个或多个上：从每条链的5’端计数，有义链的位置5、6、7、15和17，以及反义链的位置15和17。

靶基因

不受限制，siRNA的靶基因包括但不限于促进不需要的细胞增殖的基因、生长因子基因、生长因子受体基因、表达激酶的基因、衔接蛋白基因、编码G蛋白超家族分子的基因、编码转录因子的基因、介导血管生成的基因、病毒基因、病毒复制所需的基因、介导病毒功能的细胞基因、细菌病原体的基因、阿米巴病原体的基因、寄生虫病原体的基因、真菌病原体的基因、介导不需要的免疫应答的基因、介导疼痛的加工的基因、介导神经疾病的基因、在以杂合性丧失为特征的细胞中发现的等位(allene)基因或多态性基因的一个等位基因。

siRNA的具体示例性靶基因包括但不限于PCSK-9、ApoC3、AT3、AGT、ALAS1、TMPR、HAO1、AGT、C5、CCR-5、PDGFβ基因；Erb-B基因、Src基因；CRK基因；GRB2基因；RAS基因；MEKK基因；JNK基因；RAF基因；Erk1/2基因；PCNA(p21)基因；MYB基因；c-MYC基因；JUN基因；FOS基因；BCL-2基因；细胞周期蛋白D基因；VEGF基因；EGFR基因；细胞周期蛋白A基因；细胞周期蛋白E基因；WNT-1基因；β-连环蛋白基因；c-MET基因；PKC基因；NFKB基因；STAT3基因；存活蛋白基因；Her2/Neu基因；拓扑异构酶I基因；拓扑异构酶IIα基因；p73基因；p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因；PPM1D基因；小窝蛋白I基因；MIB I基因；MTAI基因；M68基因；肿瘤抑制基因；p53基因；DN-p63基因；pRb肿瘤抑制基因；APC1肿瘤抑制基因；BRCA1肿瘤抑制基因；PTEN肿瘤抑制基因；MLL融合基因，例如，MLL-AF9、BCR/ABL融合基因；TEL/AML1融合基因；EWS/FLI1融合基因；TLS/FUS1融合基因；PAX3/FKHR融合基因；AML1/ETO融合基因；αv-整联蛋白基因；Flt-1受体基因；微管蛋白基因；人乳头瘤病毒基因、人乳头瘤病毒复制所需的基因、人免疫缺陷病毒基因、人免疫缺陷病毒复制所需的基因、甲型肝炎病毒基因、甲型肝炎病毒复制所需的基因、乙型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒复制所需的基因、丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒复制所需的基因、丁型肝炎病毒基因、丁型肝炎病毒复制所需的基因、戊型肝炎病毒基因、戊型肝炎病毒复制所需的基因、己型肝炎病毒基因、己型肝炎病毒复制所需的基因、庚型肝炎病毒基因、庚型肝炎病毒复制所需的基因、辛型肝炎病毒基因、辛型肝炎病毒复制所需的基因、呼吸道合胞病毒基因、呼吸道合胞病毒复制所需的基因、单纯疱疹病毒基因、单纯疱疹病毒复制所需的基因、疱疹巨细胞病毒基因、疱疹巨细胞病毒复制所需的基因、疱疹爱泼斯坦巴尔病毒基因、疱疹爱泼斯坦巴尔病毒复制所需的基因、卡波西肉瘤相关疱疹病毒基因、卡波西肉瘤相关疱疹病毒复制所需的基因、JC病毒基因、JC病毒复制所需的人基因、粘液病毒基因、粘液病毒基因复制所需的基因、鼻病毒基因、鼻病毒复制所需的基因、冠状病毒基因、冠状病毒复制所需的基因、西尼罗病毒基因、西尼罗病毒复制所需的基因、圣路易斯脑炎基因、圣路易斯脑炎复制所需的基因、蜱传脑炎病毒基因、蜱传脑炎病毒复制所需的基因、墨累谷脑炎病毒基因、墨累谷脑炎病毒复制所需的基因、登革热病毒基因、登革热病毒基因复制所需的基因、猿病毒40基因、猿病毒40复制所需的基因、人嗜T淋巴细胞病毒基因、人嗜T淋巴细胞病毒复制所需的基因、莫洛尼鼠白血病病毒基因、莫洛尼鼠白血病病毒复制所需的基因、脑心肌炎病毒基因、脑心肌炎病毒复制所需的基因、麻疹病毒基因、麻疹病毒复制所需的基因、水痘带状疱疹病毒基因、水痘带状疱疹病毒复制所需的基因、腺病毒基因、腺病毒复制所需的基因、黄热病毒基因、黄热病毒复制所需的基因、脊髓灰质炎病毒基因、脊髓灰质炎病毒复制所需的基因、痘病毒基因、痘病毒复制所需的基因、疟原虫基因、疟原虫基因复制所需的基因、溃疡分枝杆菌基因、溃疡分枝杆菌复制所需的基因、结核分枝杆菌基因、结核分枝杆菌复制所需的基因、麻风分枝杆菌基因、麻风分枝杆菌复制所需的基因、金黄色葡萄球菌基因、金黄色葡萄球菌复制所需的基因、肺炎链球菌基因、肺炎链球菌复制所需的基因、化脓链球菌基因、化脓链球菌复制所需的基因、肺炎衣原体基因、肺炎衣原体复制所需的基因、肺炎支原体基因、肺炎支原体复制所需的基因、整联蛋白基因、选择蛋白基因、补体系统基因、趋化因子基因、趋化因子受体基因、GCSF基因、Gro1基因、Gro2基因、Gro3基因、PF4基因、MIG基因、前血小板碱性蛋白基因、MIP-1I基因、MIP-1J基因、RANTES基因、MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、CMBKR1基因、CMBKR2基因、CMBKR3基因、CMBKR5v、AIF-1基因、I-309基因、离子通道组分基因、神经递质受体基因、神经递质配体基因、淀粉样蛋白家族基因、早老蛋白基因、HD基因、DRPLA基因、SCA1基因、SCA2基因、MJD1基因、CACNL1A4基因、SCA7基因、SCA8基因、杂合性缺失(LOH)细胞中发现的等位基因、多态性基因的一种等位基因及其组合。

杂合性丧失(LOH)可导致LOH区域中序列(例如基因)的半合子性。这可导致正常细胞和疾病状态细胞(例如癌细胞)之间的显著遗传差异，并提供正常细胞和疾病状态细胞(例如癌细胞)之间的有用差异。该差异可能是因为基因或其它序列在二倍体细胞中是杂合的，而在具有LOH的细胞中是半合的而产生。LOH的区域将通常包括其损失促进不需要的增殖的基因，例如肿瘤抑制基因，和包括例如其它基因的其它序列，在一些情况下是对于正常功能例如生长必需的基因。本发明的方法部分依赖于用本发明的组合物对必需基因的一个等位基因的特异性调节。

在某些实施方案中，本发明提供了调节微RNA的寡核苷酸。

靶向CNS

在一些实施方案中，本发明提供了靶向早发性家族性阿尔茨海默病的APP、脊髓小脑性共济失调2和ALS的ATXN2，以及肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶痴呆的C9orf72的寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明提供了靶向ALS的TARDBP、额颞叶痴呆的MAPT(Tau)，以及亨廷顿病的HTT的寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明提供了靶向帕金森病的SNCA、ALS的FUS、脊髓小脑共济失调3的ATXN3、SCA1的ATXN1、SCA7和SCA8的基因、DRPLA的ATN1、XLMR的MeCP2、朊病毒病的PRNP、隐性CNS病症：Lafora病、DM1(CNS和骨骼肌)的DMPK，以及hATTR(CNS、眼和全身)的TTR。

脊髓小脑性共济失调是遗传性脑功能障碍。脊髓小脑性共济失调的显性遗传形式，例如SCA1-8，是没有疾病改善疗法的破坏性病症。示例性的靶标包括SCA2、SCA3和SCA1。

关于这些CNS靶向受体和相关疾病的更详细描述可在2020年11月6日递交的标题为“肝外递送”的PCT申请号PCT/US20/59399中，其以整体通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本发明提供了靶向疾病的基因的寡核苷酸，其包括但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD)(干性和湿性)、鸟弹性脉络膜视网膜病、显性色素性视网膜炎4、Fuch营养不良、hATTR淀粉样变性，遗传性和散发性青光眼和斯塔加特氏病。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向湿性(或渗出性)AMD的VEGF。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向干性(或非渗出性)AMD的C3。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向干性(或非渗出性)AMD的CFB。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向青光眼的MYOC。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向青光眼的ROCK2。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向青光眼的ADRB2。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向青光眼的CA2。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向白内障的CRYGC。

在一些实施方案中，寡核苷酸靶向干眼综合征的PPP3CB。

配体

在某些实施方案中，寡核苷酸通过共价附接一个或多个缀合物基团进一步修饰。通常，缀合物基团改变所连接的本发明化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除。缀合物基团通常用于化学领域，并且直接或通过任选的连接部分或连接基团连接至母体化合物例如寡核苷酸。优选的缀合物基团列表包括但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含靶向配体，其靶向介导至特定CNS组织的递送的受体。这些靶向配体也可以与亲脂性部分组合缀合以实现特异性鞘内和全身递送。

靶向受体介导的至CNS组织的递送的示例性靶向配体是肽配体，例如Angiopep-2、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体；转铁蛋白受体(TfR)配体(其可以利用脑中的铁转运系统并将货物转运到脑实质中)；甘露糖受体配体(其靶向嗅鞘细胞、神经胶质细胞)、葡萄糖转运蛋白和LDL受体配体。

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含靶向介导至特定眼组织的递送的受体的靶向配体。这些靶向配体还可以与亲脂性部分组合缀合以实现特异性的眼递送(例如，玻璃体内递送)和全身性递送。靶向受体介导的至眼组织的递送的示例性靶向配体是亲脂性配体，例如全反式视黄醇(其靶向视黄酸受体)；RGD肽(其靶向视网膜色素上皮细胞)，例如H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或环(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)；LDL受体配体；和基于碳水化合物的配体(其靶向后眼中的内皮细胞)。

适用于本发明的优选缀合物基团包括脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)；胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765)；硫代胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20,533)；脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.,1991,10,111；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259,327；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75,49)；磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵-1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969)；金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651)；棕榈酰基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923)。

通常，多种多样的实体，例如配体，可以与本文所述的寡核苷酸偶联。配体可包括天然存在的分子或重组或合成分子。示例性配体包括但不限于聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如，PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚膦嗪、聚乙烯亚胺、阳离子基团、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽-聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白、双磷酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、适体、脱唾液酸胎球蛋白、透明质酸、原胶原、免疫球蛋白(例如，抗体)、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、糖-白蛋白缀合物、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如，TPPC4、泰克萨菲林(texaphyrin)、沙菲林(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，类固醇、胆汁酸、胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如，α螺旋肽、两亲性肽、RGD肽、细胞渗透肽、内体裂解/融合肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，萘普生、阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP、AP、抗体、激素和激素受体、凝集素、碳水化合物、多价碳水化合物，维生素(例如，维生素A、维生素E、维生素K、维生素B，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素和吡哆醛)、维生素辅因子、脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂、NF-κB的激活剂、紫杉醇(taxon)、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、茉莉花内酯、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine、myoservin、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β、γ干扰素、天然或重组低密度脂蛋白(LDL)、天然或重组高密度脂蛋白(HDL)和细胞渗透剂(例如，螺旋细胞渗透剂)。

肽和肽模拟物配体包括具有天然存在的或修饰的肽的那些，例如，D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键取代的酰胺(即肽)键的肽；或环状肽。肽模拟物(本文也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的限定三维结构的分子。肽或肽模拟物配体可以是约5-50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。

示例性的两亲性肽包括但不限于天蚕抗菌肽、lycotoxins、paradaxins、蟾蜍素(buforin)、CPF、铃蟾肽样肽(BLP)、抗菌肽(cathelicidins)、ceratotoxins、柄瘤海鞘(S.clava)肽、盲鳗肠抗微生物肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽(magainines)、brevinins-2、皮抑菌肽、蜂毒肽、pleurocidin、H₂A肽、爪蟾肽、esculentinis-1和caerins。

如本文所用，术语“内体裂解配体”是指具有内体裂解性质的分子。内体裂解配体促进本发明的组合物或其组分从细胞区室(例如，内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体或细胞内的其它囊泡体)裂解和/或转运到细胞的细胞质。一些示例性内体裂解配体包括但不限于咪唑、聚咪唑或低聚咪唑、直链或支链聚乙烯亚胺(PEI)、直链和支链聚胺，例如，精胺、阳离子直链和支链聚胺、聚羧酸盐、聚阳离子、掩蔽的低聚或多聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的直链或支链聚合物、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物、聚阴离子肽、聚阴离子肽模拟物、pH-敏感肽、天然和合成的促融合脂质、天然和合成的阳离子脂质。

示例性的内体裂解/促融合肽包括但不限于

AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC(GALA)；

AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC(EALA)；

ALEALAEALEALAEA；GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG(INF-7)；

GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(Inf HA-2)；

GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGCGLFEAIEGFIENGWEGMID

GWYGC(diINF-7)；

GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGGC

(diINF-3)；GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC

(GLF)；GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC(GALA-

INF3)；GLF EAI EGFI ENGW EGnIDG K GLF EAI EGFI ENGW EGnI

DG(INF-5，n是正亮氨酸)；LFEALLELLESLWELLLEA(JTS-1)；

GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(ppTG1)；

GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(ppTG20)；

WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(KALA)；

GLFFEAIAEFIEGGWEGLIEGC(HA)；

GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(蜂毒肽)；H₅WYG；和

CHK₆HC。

不希望受理论束缚，促融合脂质与膜融合并因此使膜失稳定。促融合脂质通常具有小的头部基团和不饱和的酰基链。示例性的促融合脂质包括但不限于1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲胺(DLiN-k-DMA)和N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)乙胺(本文也称为XTC)。

适合于本发明的具有内体裂解活性的合成聚合物描述于美国专利申请公开号2009/0048410；2009/0023890；2008/0287630；2008/0287628；2008/0281044；2008/0281041；2008/0269450；2007/0105804；20070036865；和2004/0198687中，其内容整体通过引用并入本文。

示例性的细胞渗透肽包括但不限于RQIKIWFQNRRMKWKK(穿膜肽)；GRKKRRQRRRPPQC(Tat片段48-60)；

GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(基于信号序列的肽)；

LLIILRRRIRKQAHAHSK(PVEC)；

GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(转运素)；

KLALKLALKALKAALKLA(两亲模型肽)；RRRRRRRRR(Arg9)；

KFFKFFKFFK(细菌细胞壁渗透肽)；

LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(LL-37)；

SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR(天蚕素P1)；

ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(α-防御素)；

DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK(β-防御素)；

RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2(PR-39)；ILPWKWPWWPWRR-NH₂(indolicidin)；AAVALLPAVLLALLAP(RFGF)；AALLPVLLAAP(RFGF类似物)；和RKCRIVVIRVCR(杆菌素)。

示例性阳离子基团包括但不限于衍生自例如，O-AMINE(AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)的质子化氨基；氨基烷氧基，例如，O(CH₂)_nAMINE，(例如，AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)；氨基(例如NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；和NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-AMINE(AMINE＝NH₂；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)。

如本文所用，术语“靶向配体”是指对所选靶标(例如，细胞、细胞类型、组织、器官、身体区域或隔室(例如，细胞、组织或器官隔室))提供增强的亲和力的任何分子。一些示例性靶向配体包括但不限于抗体、抗原、叶酸、受体配体、碳水化合物、适体、整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。

基于碳水化合物的靶向配体包括但不限于D-半乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)、多价GalNAc，例如GalNAc₂和GalNAc₃(GalNAc和多价GalNAc在本文中统称为GalNAc缀合物)；D-甘露糖、多价甘露糖、多价乳糖、N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、多价葡萄糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸和凝集素。术语多价表示存在多于一个单糖单元。此类单糖亚基可以通过糖苷键彼此连接或连接至支架分子。

适合于本发明作为配体的许多叶酸和叶酸类似物描述于美国专利号2,816,110；5,552,545；6,335,434和7,128,893中，其内容整体通过引用并入本文。

如本文所用，术语“PK调节配体”和“PK调节剂”是指可调节本发明组合物的药代动力学的分子。一些示例性PK调节剂包括但不限于亲脂性分子、胆汁酸、甾醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、维生素、脂肪酸、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、舒洛芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、PEG、生物素和甲状腺素运载蛋白结合配体(例如，四碘甲状腺乙酸、2,4,6-三碘苯酚和氟芬那酸)。还已知包含许多硫代磷酸酯糖间连接的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此短寡核苷酸，例如包含约5至30个核苷酸(例如，5至25个核苷酸，优选地，5至20个核苷酸，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)的寡核苷酸，以及在主链中包含多个硫代磷酸酯连接的寡核苷酸也适合于本发明作为配体(例如作为PK调节配体)。PK调节寡核苷酸可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，PK调节性寡核苷酸中的所有核苷酸间连接为硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯连接。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体也适用于本发明作为PK调节配体。与血清组分(例如血清蛋白)的结合可从白蛋白结合测定预测，例如Oravcova,等人,Journal of Chromatography B(1996),677:1-27中所述的那些。

当存在两个或更多个配体时，配体可以全部具有相同的性质、全部具有不同的性质或一些配体具有相同的性质而其它配体具有不同的性质。例如，配体可具有靶向特性、具有内体裂解活性或具有PK调节特性。在优选的实施方案中，所有配体具有不同的性质。

当单体并入本发明化合物的组分(例如，本发明的化合物或接头)中时，配体或系链配体可存在于所述单体上。在一些实施方案中，在“前体”单体已并入本发明化合物的组分(例如，本发明的化合物或接头)中之后，配体可通过偶联并入所述“前体”单体中。例如，具有例如氨基封端的系链(即，不具有缔合的配体)的单体，例如，单体-接头-NH₂，可以并入本发明化合物的组分(例如，本发明的化合物或接头)中。在随后的操作中，即，在将前体单体并入本发明化合物的组分(例如，本发明的化合物或接头)中之后，具有亲电基团(例如，五氟苯基酯或醛基)的配体可随后通过使配体的亲电基团与前体单体的系链的末端亲核基团偶联而连接至前体单体。

在另一个实例中，可以并入具有适合参与点击化学反应的化学基团的单体，例如，叠氮化物或炔封端的系链/接头。在随后的操作中，即，在将前体单体并入链中之后，具有互补化学基团的配体，例如炔烃或叠氮化物可以通过将炔烃和叠氮化物偶联在一起连接至前体单体上。

在一些实施方案中，配体可缀合至寡核苷酸的核碱基、糖部分或核苷间连接。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以出现在任何位置，包括环内和环外原子。在一些实施方案中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位附接至缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可以出现在任何位置。在一些实施方案中，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位可以被共轭部分取代。当配体与核碱基缀合时，优选的位置是不干扰杂交的位置，即不干扰碱基配对所需的氢键相互作用。

与核苷的糖部分的缀合可以出现在任何碳原子处。可附接至缀合物部分的糖部分的示例性碳原子包括2’、3’和5’碳原子。1’位还可以连接至缀合部分，例如在无碱基残基中。核苷间连接也可以携带缀合部分。对于含磷连接(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，缀合物部分可直接连接至磷原子或连接至与磷原子结合的O、N或S原子。对于含胺或含酰胺的核苷间连接(例如，PNA)，缀合物部分可连接至胺或酰胺的氮原子或相邻碳原子。

存在许多制备寡核苷酸的缀合物的方法。通常，通过使寡核苷酸上的反应基团(例如，OH、SH、胺、羧基、醛等)与缀合物部分上的反应基团接触，将寡核苷酸连接至缀合部分。在一些实施方案中，一个反应基团是亲电子的，而另一个是亲核的。

例如，亲电子基团可以是含羰基的官能团，并且亲核基团可以是胺或硫醇。用于在具有和不具有连接基团的情况下缀合核酸和相关寡核苷酸的方法在文献中已有充分描述，例如，Manoharan in Antisense Research and Applications，Crooke和LeBleu编辑，CRC出版社，Boca Raton,Fla.,1993，第17章，其以整体通过引用并入本文。

配体可以通过接头或载体单体，例如，配体载体与寡核苷酸连接。载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选地两个“主链附接点”和(ii)至少一个“系链附接点”。如本文所用的“主链附接点”是指可用于并适合于将载体单体并入到寡核苷酸主链中的官能团，例如羟基或通常是键，例如磷酸酯或修饰的磷酸酯(例如含硫的)主链。“系链附接点”(TAP)是指连接所选部分的载体单体的原子，例如，碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)。所选部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，所选部分通过插入系链连接至载体单体。因此，载体将通常包括官能团，例如氨基或通常提供适合于将另一化学实体，例如，配体并入或系链于组成原子的键。

教导制备核酸的缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,149,782；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,672,662；5,688,941；5,714,166；6,153,737；6,172,208；6,300,319；6,335,434；6,335,437；6,395,437；6,444,806；6,486,308；6,525,031；6,528,631；6,559,279；其内容整体通过引入并入本文。

在一些实施方案中，寡核苷酸进一步包含靶向肝组织的靶向配体。在一些实施方案中，靶向配体是基于碳水化合物的配体。在一个实施方案中，靶向配体是GalNAc缀合物。

因为配体可以通过接头或载体缀合至iRNA剂，并且因为接头或载体可以含有支链接头，然后iRNA剂可以通过与载体的相同或不同的主链附接点或通过支链接头含有多个配体。例如，支链接头的分支点可以是二价、三价、四价、五价或六价原子，或呈现此类多价的基团。在某些实施方案中，分支点是-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C或-N(Q)C(O)O-C；其中Q在每次出现时独立地为H或任选地取代的烷基。在其他实施方式中，分支点是甘油或甘油衍生物。

候选iRNA的评估

可以通过将iRNA剂或修饰的分子和对照分子暴露于适当的条件并评估所选特性的存在来评估候选iRNA剂，例如，修饰的RNA的所选特性。例如，可以如下评估对降解剂的抗性。候选的修饰的RNA(和对照分子，通常是未修饰的形式)可以暴露于降解条件，例如，暴露于包括降解剂，例如，核酸酶的环境。例如，可以使用生物样品，例如，与治疗用途中可能遇到的环境相似的生物样品，例如，血液或细胞级分，例如，无细胞匀浆或破坏的细胞。然后可以通过多种方法中的任何一种评估候选物和对照的降解抗性。例如，可以在暴露之前用例如放射性或酶标记或荧光标记诸如Cy3或Cy5标记候选物和对照。对照和修饰的RNA可以与降解剂，和任选地对照，例如灭活的(如热灭活的)降解剂温育。然后测定修饰和对照分子的物理参数，例如大小。它们可以通过物理方法测定，例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或分级柱，以评估分子是否保持其原始长度，或功能性评估。可替代地，Northern印迹分析可用于测定未标记的修饰分子的长度。

还可以使用功能测定来评估候选试剂。可以在最初或在较早的非功能性测定(例如，针对降解抗性的测定)之后应用功能性测定以确定修饰是否改变分子沉默基因表达的能力。例如，可以用表达荧光蛋白例如GFP的质粒和与编码荧光蛋白的转录物同源的候选RNA剂共转染细胞，例如哺乳动物细胞，诸如小鼠或人细胞(参见，例如，WO 00/44914)。例如，与其中转染不包括候选dsiRNA的对照细胞(例如不添加试剂的对照和/或添加未修饰RNA的对照)相比，可以通过监测细胞荧光的降低测定与GFP mRNA同源的修饰的dsiRNA抑制GFP表达的能力。候选剂对基因表达的效力可以通过比较在修饰的和未修饰的dssiRNA存在下的细胞荧光来评估。

在替代的功能性测定中，可以将与内源性小鼠基因(例如，母系表达的基因，诸如c-mos)同源的候选dssiRNA注射到未成熟的小鼠卵母细胞中，以评估试剂抑制体内基因表达的能力(参见，例如，WO 01/36646)。卵母细胞的表型，例如维持中期II停滞的能力，可以作为试剂抑制表达的指示来监测。例如，dssiRNA对c-mos mRNA的裂解将导致卵母细胞退出中期停滞并启动孤雌生殖发育(Colledge等人，Nature 370:65-68,1994；Hashimoto等人，Nature,370:68-71,1994)。与阴性对照相比，通过Northern印迹来测定靶mRNA水平的降低，或通过Western印迹来测定靶蛋白水平的降低，可以证实修饰的试剂对靶RNA水平的影响。对照可以包括其中不添加试剂的细胞和/或其中添加未修饰RNA的细胞。

生理效应

本文所述的siRNA可被设计成使得通过siRNA与人和非人动物序列的互补性更容易确定治疗毒性。通过这些方法，siRNA可由与来自人的核酸序列和来自至少一种非人动物(例如，非人哺乳动物，诸如，啮齿动物、反刍动物或灵长类动物)的核酸序列完全互补的序列组成。例如，非人哺乳动物可以是小鼠、大鼠、狗、猪、山羊、绵羊、牛、猴、倭黑猩猩、黑猩猩、猕猴或食蟹猴。siRNA的序列可以与非人哺乳动物和人的同源基因，例如，癌基因或肿瘤抑制基因内的序列互补。通过测定siRNA在非人哺乳动物中的毒性，可以外推siRNA在人中的毒性。对于更剧烈的毒性试验，siRNA可以与人和多于一种，例如，两种或三种或更多种非人动物互补。

本文所述的方法可用于关联siRNA对人的任何生理效应，例如，任何不需要的效应，诸如，毒性效应或任何积极或期望的效应。

增加siRNA的细胞摄取

本文描述了含有共价连接的缀合物的各种siRNA组合物，其增加siRNA的细胞摄取和/或细胞内靶向。

另外提供了本发明的方法，其包括施用siRNA和影响siRNA摄取进入细胞的药物。可以在施用siRNA之前、之后或同时施用药物。药物可以与siRNA共价或非共价连接。药物可以是例如脂多糖、p38MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。药物可以对细胞具有瞬时作用。药物可以增加siRNA进入细胞的摄取，例如，通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝。药物可以是，例如，紫杉烷、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、茉莉花内酯、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine茚满辛或myoservin。例如，药物还可以通过激活炎症反应来增加siRNA摄取到给定细胞或组织中。具有此类作用的示例性药物包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β、CpG基序、γ干扰素或更一般地活化toll样受体的试剂。

siRNA产生

siRNA可以通过多种方法例如批量产生。示例性方法包括：有机合成和RNA裂解，例如，体外裂解。

有机合成。siRNA可通过分别合成单链RNA分子或双链RNA分子的各条相应链来制备，然后可将组成链退火。

大的生物反应器，例如来自Pharmacia Biotec AB(Uppsala Sweden)的OligoPilot II，可用于产生大量的给定siRNA的特定RNA链。OligoPilot II反应器可以仅使用1.5摩尔过量的亚磷酰胺核苷酸有效地偶联核苷酸。为了制备RNA链，使用核糖核苷酸亚酰胺(amidites)。单体添加的标准循环可用于合成siRNA的21至23个核苷酸的链。通常，两条互补链分别产生，然后退火，例如在从固体支持物释放和脱保护后。

有机合成可用于产生离散的siRNA种类。可以精确地指定该种类与特定靶基因的互补性。例如，该种类可以与包括多态性，例如，单核苷酸多态性的区域互补。此外，可以精确地定义多态性的位置。在一些实施方案中，多态性位于内部区域，例如，距离一个或两个末端的至少4、5、7或9个核苷酸。

dsiRNA裂解。siRNA还可以通过裂解较大的siRNA来制备。裂解可在体外或体内介导。例如，为了通过体外裂解产生iRNA，可以使用以下方法：

体外转录。dsiRNA通过双向转录核酸(DNA)片段产生。例如，HiScribe^TMRNAi转录试剂盒(新英格兰生物实验室)提供了一种载体和一种用于产生核酸片段的dsiRNA的方法，该核酸片段被克隆到载体中任一侧有T7启动子的位置。产生单独的模板用于dsiRNA的两条互补链的T7转录。通过添加T7 RNA聚合酶在体外转录模板并产生dsiRNA。使用PCR和/或其它RNA聚合酶(例如，T3或SP6聚合酶)的类似方法也可以是可能污染重组酶的制剂的dotoxin。

体外裂解。在一个实施方案中，将通过该方法产生的RNA仔细地纯化以除去末端siRNA。例如，使用Dicer或相当的基于RNAse III的活性将siRNA体外裂解成siRNA。例如，dsiRNA可以在来自果蝇的体外提取物中或使用纯化的组分，例如，纯化的RNAse或RISC复合物(RNA-诱导的沉默复合物)温育。参见，例如，Ketting等人Genes Dev2001Oct 15；15(20):2654-9；和Hammond Science 2001 Aug 10；293(5532):1146-50。

dsiRNA裂解通常产生多种siRNA种类，每种是来源dsiRNA分子的特定的21至23nt片段。例如，可以存在包括与来源dsiRNA分子的重叠区域和相邻区域互补的序列的siRNA。

不管合成方法如何，siRNA制剂可以在适合于配制的溶液(例如，水性和/或有机溶液)中制备。例如，可以将siRNA制剂沉淀并再溶解在纯的双蒸馏水中，并冻干。然后可以将干燥的siRNA重新悬浮在适合于预期配制过程的溶液中。

使iRNA剂缀合至靶向配体

在一些实施方案中，靶向配体通过核碱基、糖部分或核苷间连接缀合至iRNA剂。

与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以出现在任何位置，包括环内和环外原子。在一些实施方案中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位置附接至缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可以出现在任何位置。在一些实施方案中，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位可以被缀合物部分取代。当靶向配体与核碱基缀合时，优选的位置是不干扰杂交，即不干扰碱基配对所需的氢键相互作用的位置。在一个实施方案中，靶向配体可以通过含有烷基、烯基或酰胺键的接头与核碱基缀合。

与核苷的糖部分的缀合可以出现在任何碳原子处。靶向配体可连接的糖部分的示例性碳原子包括2’、3’和5’碳原子。靶向配体还可以连接至1’位置，例如在无碱基残基中。在一个实施方案中，靶向配体可以在具有或不具有接头的情况下通过2’-O修饰缀合至糖部分。

核苷间连接还可以带有靶向配体。对于含磷连接(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，靶向配体可直接连接至磷原子或连接至与磷原子结合的O、N或S原子。对于含有胺或酰胺的核苷间连接(例如，PNA)，靶向配体可连接至胺或酰胺的氮原子或相邻碳原子。

存在许多用于制备寡核苷酸的缀合物的方法。通常，寡核苷酸通过使寡核苷酸上的反应基团(例如，OH、SH、胺、羧基、醛等)与缀合物部分上的反应基团接触而连接至缀合部分。在一些实施方案中，一个反应基团是亲电子的，而另一个是亲核的。

例如，亲电子基团可以是含羰基的官能团，而亲核基团可以是胺或硫醇。在文献中，例如Manoharan in Antisense Research and Applications,Crooke和LeBleu编辑，CRC出版社，Boca Raton,Fla.,1993,第17章中充分描述了在具有和不具有连接基团的情况下核酸和相关寡核苷酸的缀合方法，其以整体通过映入并入本文。

在一个实施方案中，第一(互补)RNA链和第二(有义)RNA链可以分别合成，其中RNA链之一包含侧接靶向配体，并且第一和第二RNA链可以混合以形成dsRNA。合成RNA链的步骤优选地涉及固相合成，其中单个核苷酸通过在连续合成循环中形成核苷酸间3’-5’磷酸二酯键而首尾相连。

在一个实施方案中，具有亚磷酰胺基团的靶向配体在最后的合成循环中偶联至第一(互补)或第二(有义)RNA链的3’-端或5’-端。在RNA的固相合成中，核苷酸最初是核苷亚磷酰胺的形式。在每个合成循环中，进一步的核苷亚磷酰胺与先前并入的核苷酸的-OH基团连接。如果靶向配体具有亚磷酰胺基团，其可以类似于核苷亚磷酰胺的方式偶联到先前在固相合成中合成的RNA的游离OH端。合成可以使用常规RNA合成仪以自动化和标准化的方式进行。具有亚磷酰胺基团的靶向配体的合成可以包括游离羟基的亚磷酸酯化以产生亚磷酰胺基团。

通常，可以使用本领域已知的方案合成寡核苷酸，例如，如Caruthers等人,Methods in Enzymology(1992)211:3-19；WO 99/54459；Wincott等人,Nucl.Acids Res.(1995)23:2677-2684；Wincott等人,Methods Mol.Bio.,(1997)74:59；Brennan等人,Biotechnol.Bioeng.(1998)61:33-45；和美国专利号6,001,311中所述；其各自以整体通过引用并入本文。通常，寡核苷酸的合成涉及常规的核酸保护和偶联基团，例如，5’-端的二甲氧基三苯甲基和3’-端的亚磷酰胺。在非限制性实例中，小规模合成在AppliedBiosystems,Inc.(Weiterstadt,Germany)出售的Expedite 8909RNA合成仪上，使用ChemGenes Corporation(Ashland,Mass.)出售的核糖核苷亚磷酰胺进行。可替代地，合成可以在96孔板合成仪上进行，例如由Protogene(Palo Alto,Calif.)生产的仪器，或由例如Usman等人,J.Am.Chem.Soc.(1987)109:7845；Scaringe等人,Nucl.Acids Res.(1990)18:5433；Wincott等人,Nucl.Acids Res.

(1990)23:2677-2684；和Wincott,等人,Methods Mol.Bio.(1997)74:59中所述的那些的方法，其各自以整体通过引用并入本文。

本发明的核酸分子可以分别合成并在合成后连接在一起，例如，通过连接(Moore等人,Science(1992)256:9923；WO 93/23569；Shabarova等人,Nucl.Acids Res.(1991)19:4247；Bellon等人,Nucleosides&Nucleotides(1997)16:951；Bellon等人,BioconjugateChem.(1997)8:204；或通过合成后杂交和/或脱保护。核酸分子可以使用常规方法通过凝胶电泳纯化，或可以通过高压液相色谱纯化(HPLC；参见Wincott等人，同上，其全部内容通过引用并入本文)，并再悬浮于水中。

药物组合物

在一个方面，本发明的特征在于包括iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA，(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)的药物组合物，其包括与靶RNA互补，例如基本上和/或完全互补的核苷酸序列。靶RNA可以是内源性人基因的转录物。在一个实施方案中，siRNA(a)为19-25个核苷酸长，例如，21-23个核苷酸，(b)与内源靶RNA互补，并且任选地，(c)包括至少一个1-5nt长的3’突出端。在一个实施方案中，药物组合物可以是乳剂、微乳剂、乳膏剂、胶冻剂或脂质体。

在一个实例中，药物组合物包括与局部递送剂混合的iRNA(siRNA)。局部递送剂可以是多个微观囊泡。微观囊泡可以是脂质体。在一些实施方案中，脂质体是阳离子脂质体。

在另一个方面，药物组合物包括与局部渗透增强剂混合的iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)。在一个实施方案中，局部渗透增强剂是脂肪酸。脂肪酸可以是花生四烯酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯(monolein)、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C_1-10烷基酯、单甘油酯、二甘油酯或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，局部渗透增强剂是胆盐。胆盐可以是胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、牛磺-24、25-二氢-夫西地酸钠、甘氨二氢夫西地酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，渗透增强剂是螯合剂。螯合剂可以是EDTA、柠檬酸、水杨酸盐、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9、β-二酮的N-氨基酰基衍生物或其混合物。

在另一个实施方案中，渗透增强剂是表面活性剂，例如，离子或非离子表面活性剂。表面活性剂可以是月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚、全氟化学乳液或其混合物。

在另一个实施方案中，渗透增强剂可以选自不饱和环脲、1-烷基-烷酮、1-烯基氮杂环-烷酮、类固醇抗炎剂及其混合物。在又一个实施方案中，渗透增强剂可以是二醇、吡咯、氮酮或萜烯。

在一个方面，本发明的特征在于药物组合物，其包括适合于口服递送形式的iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA，(例如，前体，诸如可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)。在一个实施方案中，口服递送可用于将siRNA组合物递送至胃肠道的细胞或区域，例如，小肠，结肠(例如，治疗结肠癌)等。口服递送形式可以是片剂、胶囊或凝胶胶囊。在一个实施方案中，药物组合物的siRNA调节细胞粘附蛋白的表达，调节细胞增殖速率，或具有抗真核病原体或逆转录病毒的生物活性。在另一个实施方案中，药物组合物包括基本上防止片剂、胶囊或凝胶胶囊在哺乳动物胃中溶出的肠溶材料。在一些实施方案中，肠溶材料是包衣。包衣可以是邻苯二甲酸乙酸酯、丙二醇、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙酸偏苯三酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或乙酸邻苯二甲酸纤维素。

在另一个实施方案中，药物组合物的口服剂型包括渗透增强剂。渗透增强剂可以是胆盐或脂肪酸。胆盐可以是熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸及其盐。脂肪酸可以是癸酸、月桂酸及其盐。

在另一个实施方案中，药物组合物的口服剂型包括赋形剂。在一个实例中，赋形剂是聚乙二醇。在另一个实例中，赋形剂是precirol。

在另一个实施方案中，药物组合物的口服剂型包括增塑剂。增塑剂可以是邻苯二甲酸二乙酯、三醋精癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯或柠檬酸三乙酯。

在一个方面，本发明的特征在于包括iRNA(siRNA)和递送载体的药物组合物。在一个实施方案中，siRNA(a)为19-25个核苷酸长，例如，21-23个核苷酸，(b)与内源靶RNA互补，并且任选地，(c)包括至少一个1-5个核苷酸长的3’突出端。

在一个实施方案中，递送媒介可以通过局部施用途径向细胞递送iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可以加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)。递送媒介可以是微观囊泡。在一个实例中，微观囊泡是脂质体。在一些实施方案中，脂质体是阳离子脂质体。在另一个实例中，微观囊泡是胶束。在一个方面，本发明的特征在于包括可注射剂型的siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物的可注射剂型包括无菌水溶液或分散体和无菌粉末。在一些实施方案中，无菌溶液可包括稀释剂例如水；盐水溶液；不挥发性油、聚乙二醇、甘油或丙二醇。

在一个方面，本发明的特征在于包含口服剂型的iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)的药物组合物。在一个实施方案中，口服剂型选自片剂、胶囊和凝胶胶囊。在另一个实施方案中，药物组合物包括基本上防止片剂、胶囊或凝胶胶囊在哺乳动物胃中溶出的肠溶材料。在一些实施方案中，肠溶材料是包衣。包衣可以是邻苯二甲酸乙酸酯、丙二醇、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙酸偏苯三酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或乙酸邻苯二甲酸纤维素。在一个实施方案中，药物组合物的口服剂型包括渗透增强剂，例如，本文所述的渗透增强剂。

在另一个实施方案中，药物组合物的口服剂型包括赋形剂。在一个实例中，赋形剂是聚乙二醇。在另一个实例中，赋形剂是precirol。

在另一个实施方案中，药物组合物的口服剂型包括增塑剂。增塑剂可以是邻苯二甲酸二乙酯、三醋精癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯或柠檬酸三乙酯。

在一个方面，本发明的特征在于包括直肠剂型的iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体))的药物组合物。在一个实施方案中，直肠剂型是灌肠剂。在另一个实施方案中，直肠剂型是栓剂。

在一个方面，本发明的特征在于阴道剂型的包括iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)的药物组合物。在一个实施方案中，阴道剂型是栓剂。在另一个实施方案中，阴道剂型是泡沫、乳膏或凝胶。

在一个方面，本发明的特征在于包括肺或鼻剂型的iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA，例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)的药物组合物。在一个实施方案中，将siRNA掺入颗粒，例如，大颗粒，诸如微球中。颗粒可以通过喷雾干燥、冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或其组合来制备。微球可以配制成悬浮液、粉末或可植入固体。

治疗方法和递送途径

本发明的另一个方面涉及降低细胞中靶基因表达的方法，其包括使所述细胞与寡核苷酸接触。在一个实施方案中，细胞是肝外细胞。

本发明的另一个方面涉及降低受试者中靶基因表达的方法，其包括向受试者施用寡核苷酸。

本发明的另一个方面涉及治疗患有CNS病症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的双链iRNA剂，从而治疗受试者。可通过本发明方法治疗的示例性CNS病症包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、帕金森病、脊髓小脑病、朊病毒和lafora。

根据所靶向的基因的类型和待治疗的病症的类型，寡核苷酸可以通过多种途径向受试者递送。在一些实施方式中，寡核苷酸被肝外施用，例如眼施用(例如，玻璃体内施用)或鞘内或脑室内施用。

在一个实施方案中，寡核苷酸是鞘内或脑室内施用的。通过鞘内或脑室内施用双链iRNA剂，该方法可以降低靶基因在脑或脊柱组织，例如，皮质、小脑、颈椎、腰椎和胸椎中的表达。

在一些实施方案中，示例性靶基因是APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK和TTR。为了减少受试者中这些靶基因的表达，可将寡核苷酸直接(例如，玻璃体内)施用于眼睛。通过玻璃体内施用双链iRNA剂，该方法可以降低眼组织中靶基因的表达。

为了便于阐述，本节中的制剂、组合物和方法主要关于修饰的siRNA进行讨论。然而，可以理解，这些制剂、组合物和方法可以与其它siRNA，例如，未修饰的siRNA一起实施，并且此类实施在本发明内。包括iRNA的组合物可通过多种途径递送至受试者。示例性途径包括：静脉内、局部、直肠、肛门、阴道、鼻、肺、眼。

本发明的iRNA分子可掺入适合于施用的药物组合物中。此类组合物通常包括一种或多种iRNA种类和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类用于药物活性物质的介质和试剂的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的用途。补充活性化合物也可掺入组合物中。

本发明的药物组合物可以多种方式施用，这取决于需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内、透皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注入、或鞘内或心室内或脑室内施用。

可以选择施用途径和部位以增强靶向。例如，为了靶向肌细胞，向感兴趣的肌肉进行肌内注射将是合理的选择。可以通过施用气雾剂形式的iRNA靶向肺细胞。通过用iRNA涂覆球囊导管并机械导入DNA，可以靶向血管内皮细胞。

用于局部施用的制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。涂覆的避孕套、手套等也可能是有用的。

用于口服施用的组合物包括粉末或颗粒、在水中的悬浮液或溶液、糖浆、酏剂或非水性介质、片剂、胶囊、锭剂或糖锭。在片剂的情况下，可以使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸的盐。片剂中通常使用各种崩解剂，例如淀粉和润滑剂，诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石。对于以胶囊形式口服施用，有用的稀释剂是乳糖和高分子量聚乙二醇。当口服使用需要水性悬浮液时，核酸组合物可以与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂。

用于鞘内或心室内或脑室内施用的组合物可包括灭菌水溶液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。

用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。心室内注射可通过例如附接至贮库的心室内导管来促进。对于静脉内使用，可以控制溶质的总浓度以使制剂等渗。

对于眼施用，软膏或滴用液体可以通过本领域已知的眼递送系统，例如施用器或滴眼器来递送。此类组合物可以包括粘液模拟物例如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)、防腐剂如山梨酸、EDTA或苯扎氯铵(benzychronium chloride)，以及通常量的稀释剂和/或载体。

在一个实施方案中，iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA组合物的施用是肠胃外的，例如，静脉内(例如，作为推注或作为可扩散输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、脑室内、颅内、皮下、经粘膜、口腔、舌下、内窥镜、直肠、口服、阴道、局部、肺部、鼻内、尿道的或眼。施用可由受试者或通过另一个人(例如，健康护理提供者)提供。药物可以按测量的剂量或在递送定量剂量的分配器中提供。下面更详细地讨论所选择的递送模式。

鞘内施用。在一个实施方案中，通过鞘内注射(即注射到浸泡脑和脊髓组织的脊髓液中)递送。iRNA剂鞘内注射到脊髓液中可作为推注或通过可植入皮下的微型泵进行，从而提供siRNA定期且持续递送到脊髓液中。脊髓液从产生脊髓液的脉络丛，向下围绕脊髓和背根神经节，并随后向上通过小脑并通过皮质到达蛛网膜颗粒(其中流体可以离开CNS)的循环(其取决于注射的化合物的尺寸、稳定性和溶解度)，鞘内递送的分子可以命中遍及整个CNS的靶标。

在一些实施方案中，鞘内施用是通过泵进行的。该泵可以是手术植入的渗透泵。在一个实施方案中，将渗透泵植入椎管的蛛网膜下腔中以促进鞘内施用。

在一些实施方案中，鞘内施用是通过用于药物的鞘内递送系统进行的，其包括含有一定体积的药剂的储器和被配置成递送包含在储器中的一部分药剂的泵。关于该鞘内递送系统的更多细节可以在2015年1月28日递交的PCT/US2015/013253中找到，其以整体通过引用并入本文。

鞘内或脑室内注射的iRNA剂的量可以从一个靶基因到另一个靶基因变化，并且针对每个靶基因单独确定必须施用的适当量。通常，该量的范围为10μg至2mg，优选地50μg至1500μg，更优选地100μg至1000μg。

直肠施用。本发明还提供了用于直肠施用或递送本文所述的siRNA的方法、组合物和试剂盒。

因此，本文所述的iRNA(siRNA)，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)，例如，治疗有效量的本文所述的siRNA，例如，具有小于40个，例如，小于30个核苷酸的双链体区域，并且具有一个或两个1-3个核苷酸的单链3’突出端的siRNA可直肠施用，例如，通过直肠引入下结肠或上结肠中。该方法特别适用于治疗炎性病症，特征在于不需要的细胞增殖的病症，例如，息肉或结肠癌。

通过引入分配装置，例如，类似于用于检查结肠或去除息肉的柔性的摄像机引导装置，其包括用于递送药物的装置，可以将药物递送至结肠中的部位。

siRNA的直肠施用是通过灌肠的方式进行的。灌肠剂的siRNA可溶解于盐水或缓冲溶液中。直肠施用也可以通过栓剂，其可以包括其它成分，例如，赋型剂，诸如可可脂或羟丙基甲基纤维素。

眼递送。本文所述的iRNA剂可以施用于眼组织。例如，可以将药物应用于眼睛的表面或附近的组织，例如眼睑的内部。它们可以局部应用，例如，通过喷雾、以滴剂的形式、作为洗眼剂或软膏剂。施用可由受试者或另一个人(例如，健康护理提供者)提供。药物可以测量的剂量或在递送定量剂量的分配器中提供。药物也可以被施用到眼睛的内部，并且可以通过可以将药物引入到选定的区域或结构的针或其它递送装置引入。眼治疗对于治疗眼睛或附近组织的炎症是特别理想的。

在某些实施方案中，双链iRNA剂可以通过眼组织注射直接递送至眼睛，例如眼周、结膜、眼球筋膜下、前房内、玻璃体内、眼内、前或后巩膜旁、视网膜下、结膜下、眼球后或小管内注射；通过使用导管或其它放置装置例如视网膜球粒、眼内插入物、栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入物直接施用于眼睛；通过局部滴眼剂或软膏剂；或通过在结膜囊中或邻近巩膜(经巩膜)或巩膜中(巩膜内)或在眼内植入的缓释装置。前房内注射可以通过角膜进入前房中以允许药剂到达小梁网。管内注射可以进入引流施莱姆氏管的静脉收集通道中或在施莱姆氏管中。

在一个实施方案中，双链iRNA剂可以通过玻璃体内注射，例如使用供医务人员使用的即时注射形式的预填充注射器施用至眼睛，例如眼睛的玻璃体腔中。

对于眼递送，双链iRNA剂可与眼科可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘度增强剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠或水组合以形成水性、无菌眼用悬浮液或溶液。溶液制剂可以通过将缀合物溶解在生理上可接受的等渗水性缓冲液中来制备。此外，溶液可包括可接受的表面活性剂以帮助溶解双链iRNA剂。可将粘度增强剂，例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等添加到药物组合物中以改善双链iRNA剂的保留。

为了制备无菌眼用软膏制剂，将双链iRNA剂在合适的媒介，例如矿物油、液体羊毛脂或白矿脂中与防腐剂组合。无菌眼用凝胶制剂可以根据本领域已知的方法，通过将双链iRNA剂悬浮在由例如-940(BF Goodrich,Charlotte,N.C.)等的组合制备的亲水性基质中来制备。

局部递送。本文所述的任何siRNA可直接施用至皮肤。例如，药物可以局部施用或在皮肤层中递送，例如，通过使用穿透进入皮肤但例如不进入下面的肌肉组织的微针或一组微针。siRNA组合物的施用可以是局部的。局部应用可例如将组合物递送至受试者的真皮或表皮。局部施用可以是透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体或粉末的形式。用于局部施用的组合物可以配制成脂质体、胶束、乳液或其它亲脂性分子组装体。透皮施用可以与至少一种渗透增强剂一起应用，例如离子电渗疗法、超声透入疗法和超声促渗。

为了便于阐述，本节中的制剂、组合物和方法大多关于修饰的siRNA进行讨论。然而，可以理解，这些制剂、组合物和方法可以与其它siRNA，例如，未修饰的siRNA一起实施，并且此类实施在本发明内。在一些实施方案中，siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)通过局部施用递送至受试者。“局部施用”是指通过使制剂直接接触受试者的表面来递送至受试者。局部递送的最常见形式是至皮肤，但本文公开的组合物也可直接应用于身体的其它表面，例如至眼、粘膜、体腔表面或内表面。如上所述，最常见的局部递送是至皮肤。该术语涵盖几种施用途径，包括但不限于局部施用和透皮施用。这些施用模式通常包括穿透皮肤的渗透屏障和有效递送至靶组织或层。局部施用可用作穿透表皮和真皮，并最终实现组合物的系统性递送的手段。局部施用还可以用作选择性地将寡核苷酸递送到受试者的表皮或真皮，或递送到其特定层，或递送到下方组织的手段。

如本文所用，术语“皮肤”是指动物的表皮和/或真皮。哺乳动物皮肤由两个主要的、不同的层组成。皮肤的外层称为表皮。表皮由角质层、颗粒层、棘层和基底层组成，其中角质层位于皮肤表面，基底层是表皮的最深部分。根据在身体上的位置，表皮的厚度在50μm和0.2mm之间。

在表皮下方是真皮，其明显比表皮厚。真皮主要由纤维束形式的胶原组成。胶原束尤其为血管、淋巴毛细管、腺体、神经末梢和免疫活性细胞提供支持。

皮肤作为器官的主要功能之一是调节物质进入体内。皮肤的主要渗透屏障由角质层提供，角质层由处于各种分化状态的多个细胞层形成。角质层中细胞之间的空间充满了排列为格状构造的不同脂质，其提供密封以进一步增强皮肤渗透屏障。

由皮肤提供的渗透屏障使得其对分子量大于约750Da的分子大部分不可渗透。为了使较大的分子穿过皮肤的渗透屏障，必须使用不同于正常渗透的机制。

几个因素决定了皮肤对施用的药剂的渗透性。这些因素包括所治疗皮肤的特征、递送剂的特征、药物和递送剂及药物和皮肤之间的相互作用、所施用药物的剂量、治疗形式和治疗后方案。为了选择性地靶向表皮和真皮，有时可以配制包含一种或多种能够使药物渗透至预选层的渗透增强剂的组合物。

透皮递送是施用脂溶性治疗剂的有价值的途径。真皮比表皮更具有渗透性，因此通过擦伤、烧伤或裸露的皮肤吸收快得多。炎症和增加流向皮肤的血流的其它生理状况也增强透皮吸收。通过该途径的吸收可以通过使用油性溶媒(涂油)或通过使用一种或多种渗透增强剂来增强。通过透皮途径递送本文公开的组合物的其它有效方式包括皮肤的水合和使用控释局部贴剂。透皮途径提供了递送本文公开的组合物用于全身性和/或局部治疗的潜在有效手段。

此外，离子电渗疗法(离子溶质在电场的影响下通过生物膜的转移)(Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第163页)、超声透入疗法或超声促渗(使用超声来增强各种治疗剂跨过生物膜，特别是皮肤和角膜的吸收)(Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第166页)，以及相对于施用部位的剂量位置和保留的溶媒特征的优化(Lee等人,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991，第168页)可以是用于增强局部施用的组合物跨皮肤和粘膜部位的转运的有用方法。

所提供的组合物和方法还可用于检测体外培养或保持的真皮组织中和动物中各种蛋白质和基因的功能。因此，本发明可应用于检查任何基因的功能。本发明的方法还可以治疗性或预防性使用。例如，用于治疗已知或疑似患有疾病例如银屑病、扁平苔藓、毒性表皮坏死松解症、多形性红斑、基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、佩吉特氏病、卡波西肉瘤、肺纤维化、莱姆病和皮肤的病毒、真菌和细菌感染的动物。

肺部递送。本文所述的任何siRNA可施用至肺系统。肺施用可通过吸入或通过将递送装置引入肺系统，例如通过引入可分配药物的递送装置来实现。某些实施方案可以使用通过吸入肺部递送的方法。药物可以在分配器中提供，该分配器以足够小的形式递送药物，例如，湿的或干的药物，使得其可以被吸入。该装置可以递送定量剂量的药物。受试者或另一个人可以施用药物。肺部递送不仅对直接影响肺组织的病症有效，而且对影响其它组织的病症也有效。siRNA可以配制成用于肺部递送的液体或非液体，例如，粉末、晶体或气雾剂。

为了便于阐述，本节中的制剂、组合物和方法大部分关于修饰的siRNA进行讨论。然而，可以理解，这些制剂、组合物和方法可以与其它siRNA，例如，未修饰的siRNA一起实施，并且此类实施在本发明内。包括siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA(例如，前体，诸如，可加工成ssiRNA的较大siRNA，或编码siRNA，例如，双链siRNA或ssiRNA的DNA，或其前体)的组合物可通过肺部递送施用于受试者。肺部递送组合物可通过患者吸入分散体来递送，使得分散体内的组合物，例如，iRNA可到达肺部，在肺部可容易地通过肺泡区域直接吸收到血液循环中。肺部递送对于全身递送和局部递送可以有效地治疗肺部疾病。

肺部递送可以通过不同的方法来实现，包括使用雾化的、气溶胶化的、胶束的和基于干粉的制剂。递送可以通过液体雾化器、基于气雾剂的吸入器和干粉分散装置实现。可以使用定量剂量装置。使用雾化器或吸入器的益处之一是由于装置是独立的，因此可以最大程度地减少污染的可能性。例如，干粉分散装置递送可以容易地配制成干粉的药物。iRNA组合物可以本身或与合适的粉末载体组合作为冻干或喷雾干燥的粉末稳定储存。用于吸入的组合物的递送可通过给药定时元件介导，其可包括计时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当其整合入到装置中时，能够在气雾剂药物的施用期间对患者进行剂量跟踪、顺应性监测和/或剂量触发。

术语“粉末”意指由精细分散的固体颗粒组成的组合物，该颗粒是自由流动的，并且能够容易地分散在吸入装置中，并且随后被受试者吸入，使得颗粒到达肺以允许渗透到肺泡中。因此，该粉末被称为是“可吸的”。例如，平均颗粒尺寸直径小于约10μm，具有相对均匀的球形分布。在一些实施方案中，直径小于约7.5μm，并且在一些实施方案中，小于约5.0μm。通常，颗粒尺寸分布在直径约0.1μm至约5μm，有时为约0.3μm至约5μm之间。

术语“干燥”意指组合物的水分含量低于约10重量％(％w)的水，通常低于约5％w，并且在一些情况下低于约3％w。干燥组合物可以使得颗粒易于分散在吸入装置中以形成气雾剂。

术语“治疗有效量”是在待治疗的受试者中，提供期望的药物水平以产生预期的生理反应所需的组合物中存在的量。

术语“生理有效量”是指递送至受试者以产生期望的减轻或治疗效果的量。

术语“药学上可接受的载体”意指载体可以被摄入肺中，而对肺没有显著的不良毒理学作用。

可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂例如人血清白蛋白(HSA)、填充剂如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐如氯化钠；等。这些载体可以是晶体或无定形形式或者可以是两者的混合物。

特别有价值的增容剂包括相容性碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。合适的碳水化合物包括单糖如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、海藻糖等；环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，如棉子糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等；醛醇，如甘露醇、木糖醇等。一组碳水化合物可包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精和甘露醇。合适的多肽包括阿斯巴甜。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，在一些实施方案中使用甘氨酸。

为了喷雾干燥期间的构象稳定性和改善粉末的分散性，可以包括作为本发明组合物的次要组分的添加剂。这些添加剂包括疏水性氨基酸，例如色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等。

合适的pH调节剂或缓冲剂包括由有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；在一些实施方案中可以使用柠檬酸钠。

胶束iRNA制剂的肺部施用可以通过具有推进剂例如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚和其它非-CFC和CFC推进剂的定量剂量喷雾装置来实现。

口腔或鼻递送。本文所述的任何siRNA可以，例如，以片剂、胶囊、凝胶胶囊、锭剂、糖锭或液体糖浆的形式口服施用。此外，组合物可局部应用于口腔表面。

本文所述的任何siRNA可以经鼻施用。鼻施用可以通过将递送装置引入鼻中来实现，例如通过引入可以分配药物的递送装置。鼻递送的方法包括喷雾、气雾剂、液体，例如通过滴剂，或通过局部施用至鼻腔的表面。药物可以在分配器中，并以足够小的形式递送药物，例如湿的或干的药物，使得其可以被吸入。该装置可以递送定量剂量的药物。受试者或另一个人可以施用药物。

鼻递送不仅对直接影响鼻组织的病症有效，而且对影响其它组织的病症也有效。siRNA可配制成液体或非液体，例如，粉末、晶体，或用于鼻递送。如本文所用，术语“晶体”描述了具有晶体的结构或特征的固体，即，三维结构的颗粒，其中平面以确定角度相交并且其中存在规则的内部结构。本发明的组合物可以具有不同的晶体形式。晶体形式可通过多种方法制备，包括，例如，喷雾干燥。

为了便于阐述，本节中的制剂、组合物和方法大部分关于修饰的siRNA进行讨论。然而，可以理解，这些制剂、组合物和方法可以与其它siRNA，例如，未修饰的siRNA一起实施，并且此类实施在本发明内。与其它施用途径相比，口腔和鼻腔膜具有优势。例如，通过这些膜施用的药物具有快速起效、提供治疗性血浆水平、避免肝代谢的首过效应，并避免药物暴露于不利的胃肠(GI)环境。另外的优点包括容易接近膜部位，使得药物可以容易地应用、定位和除去。

在口服递送中，组合物可以靶向口腔表面，例如，包括舌头腹侧表面的膜和口腔底部或构成脸颊内壁的颊粘膜的舌下粘膜。舌下粘膜是相对可渗透的，因此给出许多药物的快速吸收和可接受的生物利用度。此外，舌下粘膜是方便的、可接受的和易于接近的。

分子渗透通过口腔粘膜的能力似乎与分子尺寸、脂溶性和肽蛋白离子化有关。小于1000道尔顿的小分子似乎迅速跨过粘膜。随着分子尺寸增加，渗透性迅速降低。脂溶性化合物比非脂溶性分子更具渗透性。当分子未离子化或电荷为中性时发生最大吸收。因此，带电分子对通过口腔粘膜的吸收提出了最大的挑战。

iRNA的药物组合物还可以通过从定量剂量喷雾分配器，将如上所述的混合胶束药物制剂和推进剂喷雾到颊腔中而非吸入来施用至人的颊腔。在一个实施方案中，在将药物制剂和推进剂喷雾到颊腔之前，首先摇动分配器。例如，可以将药物喷雾到颊腔中或例如以液体、固体或凝胶形式直接应用到颊腔的表面。该施用对于治疗颊腔，例如，齿龈或舌的炎症是特别期望的，例如，在一个实施方案中，颊腔施用是通过从分配器，例如，分配药物组合物和推进剂的定量剂量喷雾分配器喷雾到颊腔，例如非吸入。

本发明的方面还涉及通过鞘内或脑室内递送将寡核苷酸递送到CNS中，或通过眼递送，例如，玻璃体内递送，递送到眼组织中的方法。

一些实施方案涉及降低受试者中靶基因表达的方法，其包括向受试者施用本文所述的寡核苷酸。在一个实施方案中，鞘内或脑室内施用寡核苷酸(以减少靶基因在脑或脊柱组织中的表达)。在一个实施方案中，寡核苷酸经眼施用，例如，玻璃体内施用(以减少靶基因在眼组织中的表达)。

通过以下实施例进一步说明本发明，其不应被解释为进一步的限制。在本申请中通篇引用的所有参考文献、在审申请专利申请和公开专利的内容明确通过引用并入本文。

实施例

现在总体上描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，该实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的而被包括，并且不旨在限制本发明。

实施例1.环状二硫化物修饰的磷酸酯前药衍生物的合成

方案1

化合物800：在惰性气氛下，将反式-1,2-二噻烷-4,5-二醇(3.04g，20mmol)溶解于无水THF(30mL)中，并在水/冰浴中冷却。添加氢化钠在油中的60％分散体(0.84g，21mmol)，并将混合物搅拌30分钟。添加碘甲烷(3.7mL，60mmol)，并将混合物缓慢温热至室温过夜。将反应混合物在真空下浓缩成无色液体。产物通过粗产物(3.66g)的硅胶快速色谱法用等度30％乙酸乙酯/己烷(1:9至1:1梯度)分离。获得1.11g(33％)的800，为淡黄色油状物。¹HNMR,(400MHz,DMSO-d₆)δ5.29(d,J＝4.8Hz,1H)；3.44(septet,J＝4.8Hz,1H)；3.30(dd,J＝3.6,13.2Hz,1H)；3.11-3.03(m,2H)；2.74(dd,J＝10.0,13.6Hz,1H)；2.67(dd,J＝10.0,13.6Hz,1H)。

化合物801：在Ar气氛下，将2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(1.80mL，8mmol)添加到甲醇800(1.07g，6.4mmol)和DIEA(1.40mL，8mmol)在无水乙酸乙酯(30mL)中的搅拌溶液中。将混合物在室温下搅拌1小时并淬灭。分离有机相，用5％ NaCl、饱和NaCl洗涤两次，经无水硫酸钠干燥，并将粗残留物在硅胶柱上用含有1％ TEA的己烷溶液的等度25％乙酸乙酯纯化，得到1.88g(80％)纯亚磷酰胺801，为淡黄色油状物。¹H NMR(400MHz,CD₃CN):δ3.94-3.74(m,2.5H)；3.74-3.55(m,2.5H)；3.39(s,1.5H)；3.38(s,1.5H)；3.36-3.15(m,3H)；2.91(dd,J＝9.2,13.6Hz,1H)；2.85-2.77(m,1H)；2.72-2.59(m,2H)；1.24-1.13(m,12H)。¹³C NMR(101MHz,CD₃CN)δ119.64；119.61；59.84；59.67；59.11；58.91；58.38；58.10；57.64；44.10；43.98；25.03；24.96；24.95；24.92；24.90；24.84；24.76；21.09；21.03.³¹P NMR(202MHz,CD₃CN):δ150.68；150.37。

方案2

化合物802：在惰性气氛下，将反式-1,2-二噻烷-4,5-二醇(5.0g，32.8mmol)溶解于吡啶(160mL)中，并在水/冰浴中冷却。在5分钟内添加三甲基乙酰氯(14.2mL，98.5mmol)，将混合物温热至室温，并搅拌1.5小时。在真空下浓缩混合物，再溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用5％NaCl(2×100mL)、饱和NaCl(1×100mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩成油状物。产物通过硅胶快速色谱法(120g硅胶柱)，用乙酸乙酯:己烷(1:4至1:2梯度)纯化。将含产物的级分浓缩，用乙腈(2×)冲洗，并在高真空下干燥。获得化合物802，为白色固体，66％产率(5.12g)。¹H NMR,(500MHz,DMSO-d₆)δ5.43(d,J＝5.9Hz,1H),4.67-4.60(m,1H),3.64-3.55(m,1H),3.14(dd,J＝13.2,3.9Hz,2H),2.90-2.80(m,2H),1.15(s,9H).¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ176.54,38.28,26.79。

化合物803：在惰性气氛下，将化合物802(3.0g，12.7mmol)溶解于无水乙酸乙酯(60mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(2.9mL，16.5mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(3.7mL，16.5mmol)，并将混合物在室温搅拌2小时。反应混合物淬灭，用5％ NaCl(3×200mL)、饱和NaCl(1×100mL)洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。产物通过硅胶快速色谱法，80g硅胶柱，使用等度乙酸乙酯(+0.5％三乙胺):己烷(1:10)纯化。将含产物的级分在真空中浓缩，用乙腈(2×)冲洗，并在高真空中干燥。分离化合物803，为无色油状物，77％产率(4.24g)。¹H NMR,(500MHz，乙腈-d₃)δ4.88-4.75(m,1H),4.03-3.92(m,1H),3.89-3.68(m,2H),3.67-3.56(m,2H),3.46-3.32(m,1H),3.03-2.84(m,2H),2.71-2.59(m,2H),1.25-1.11(m,21H)。¹³C NMR(101MHz，乙腈-d₃)δ178.02,119.47,59.71,59.51,59.25,59.05,44.29,44.16,44.09,43.96,39.59,27.55,27.52,25.10,25.04,25.03,24.96,24.90,24.82,21.13,21.10,21.06,21.03.³¹P NMR(202MHz，乙腈-d₃)δ151.22,148.72。

方案3

化合物804：在惰性气氛下，将反式-1,2-环己二醇(10.1g，87.0mmol)溶解于THF(120mL)中，并在水/冰浴中冷却。添加氢化钠在油中的60％分散体(3.96g，91.4mmol)，并将反应搅拌1.5小时。添加碘甲烷(16.3mL，261.1mmol)，并使反应物在17小时内缓慢升温至室温。将反应混合物在真空下浓缩成无色液体。产物通过硅胶快速色谱法，220g硅胶柱，使用乙酸乙酯:己烷(1:9至1:1梯度)分离。将含产物的级分浓缩，并用二氯甲烷(2×)冲洗。得到化合物804，为无色油状物，14％产率(1.6g)。¹H NMR,(400MHz,DMSO-d₆)δ4.57(d,J＝4.2Hz,1H),3.30-3.22(m,4H),2.89-2.79(m,1H),1.93-1.85(m,1H),1.77-1.66(m,1H),1.62-1.48(m,2H),1.17-1.00(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ83.29,71.52,56.35,32.64,28.30,23.14,23.03。

化合物805：在惰性气氛下，将化合物804(0.51g，3.9mmol)溶解于无水乙酸乙酯(20mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(1.0mL，5.9mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(1.3mL，5.9mmol)，并将混合物在室温搅拌3小时。将混合物淬灭，并用乙酸乙酯(60mL)稀释。分离有机相，用5％ NaCl(3×150mL)、饱和NaCl(1×150mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩。产物通过硅胶快速色谱法在用三乙胺(10mL)淬灭的24g硅胶柱上，使用乙酸乙酯:己烷(1:9至1:2梯度)纯化。将含产物的级分浓缩，用乙腈(2×)冲洗，并在高真空下干燥。得到化合物805，为无色油状物，79％产率(1.02g)。¹H NMR,(400MHz，乙腈-d₃)δ3.87-3.54(m,5H),3.32(d,J＝2.4Hz,3H),3.14-3.02(m,1H),2.70-2.57(m,2H),2.02-1.83(m,2H),1.66-1.55(m,2H),1.47-1.21(m,4H),1.21-1.13(m,12H)。¹³C NMR(126MHz，乙腈-d₃)δ83.00,82.75,76.03,75.55,59.64,59.50,59.13,58.98,57.46,56.97,44.05,44.03,43.95,43.93,32.77,32.42,29.34,29.17,25.07,25.05,25.01,25.00,24.87,24.83,24.81,24.77,23.89,23.76,23.63,23.60,21.19,21.13,21.08.³¹P NMR(162MHz，乙腈-d₃)δ148.85,148.56。

方案4

化合物807：将九水硫化钠(4.08g，17mmol)和元素硫(1.09g，34mmol)在MMA(N-甲基乙酰胺)(35mL)中的悬浮液在30℃下搅拌过夜以形成均匀的淡黄色溶液。滴加二溴酮806(3.45g，14mmol)在MMA(10mL)中的溶液约30分钟，同时保持30℃浴温。将混合物在30℃下再搅拌2小时，冷却至室温，并通过添加5％ NaCl水溶液(200mL)淬灭。混合物用乙酸乙酯萃取，分离有机相，用5％ NaCl水溶液、饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠干燥。真空蒸发溶剂，得到粗残留物(2.17g)，将其在硅胶柱上用5％乙酸乙酯/己烷纯化，得到0.97g(47％)纯二甲基酮807。¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.58(s,2H)；1.52(s,6H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl3):δ210.5；55.8；41.7；23.7。

化合物808：在Ar气氛下，将硼氢化钠(122mg，3.2mmol)添加至酮807(0.94g，6.4mmol)和乙酸(0.37mL，6.4mmol)在无水乙醇(15mL)中的冷却(-78℃)和搅拌溶液中。在-78℃下搅拌混合物2小时，除去冷却浴，并通过添加饱和氯化铵(15mL)和乙酸乙酯(20mL)淬灭混合物。使混合物升温至室温，并添加水(8mL)以溶解固体。分离有机相，依次用15％NaCl水溶液、饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂，得到粗产物(0.93g)，将其在硅胶柱上用10至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到0.66g(70％)808，为缓慢结晶的淡黄色油状物。¹H NMR(500MHz,CD₃CN):δ4.10-4.05(m,1H)；3.39(dd,J＝5.5,11.0Hz,1H)；3.17(d,J＝8Hz,1H)；3.03(dd,J＝4.0,11.0Hz,1H)；1.41(s,3H)；1.37(s,3H).C13 NMR(126MHz,CDCl3):δ82.7；65.0；43.4；26.6；21.4。

方案5

化合物809和810：在惰性气氛下，将N-甲基乙酰胺(100mL)加热至30℃。添加九水合硫化二钠(8.38g，34.8mmol)和硫(2.24g，69.7mmol)，并将悬浮液在35℃下搅拌24小时以溶解固体。在20分钟内缓慢添加2,4-二溴-3-戊酮(8.47g，34.8mmol)在N-甲基乙酰胺(10mL)中的溶液。将混合物在30℃下搅拌20小时，并通过缓慢倒入5％ NaCl的搅拌溶液(400mL)中淬灭。混合物用乙酸乙酯(400mL)稀释，分离有机层，用5％ NaCl(1×300mL)、饱和NaCl(1×300mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将油状残留物在己烷(200mL)中稀释，并搅拌18小时。通过过滤除去固体，并将滤液浓缩成油状物。产物通过硅胶快速色谱法，120g硅胶柱，使用乙酸乙酯:己烷(0至10％梯度)纯化。分离早期洗脱的化合物809，为黄色液体，31％产率(1.31g)。分离后期洗脱的化合物810，为黄色油状物，9％产率(0.38g，810与809的4:1混合物)。化合物809：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.84(q,J＝6.9Hz,2H),1.35(d,J＝6.9Hz,6H)。化合物810：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.93(q,J＝7.0Hz,2H),1.37(d,J＝7.0Hz,6H)。

化合物811：在惰性气氛下，将酮809(1.02g，6.75mmol)溶解于乙醇(15mL)中，并冷却至-78℃。添加乙酸(0.39mL，6.75mmol)，然后添加硼氢化钠(130mg，3.37mmol)。将混合物搅拌5小时，并添加第二部分硼氢化钠(130mg，3.37mmol)。将混合物再搅拌2小时，用饱和NH₄Cl(10mL)淬灭，并使其升温至室温。添加乙酸乙酯(20mL)、饱和NH₄Cl(10mL)和水(10mL)，并将混合物在室温下搅拌过夜。分离有机层，用1:1饱和NH₄Cl:水(1×20mL)、饱和NaHCO₃(1×25mL)和饱和NaCl(1×25mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。产物通过硅胶快速色谱法，24g硅胶柱，使用乙酸乙酯：己烷(1:15至1:9梯度)纯化。将含产物的级分浓缩，用二氯甲烷冲洗(2×)，并在高真空下干燥过夜。得到化合物811，为无色油状物，42％产率(427mg)。¹HNMR,(400MHz,DMSO-d₆)δ5.35(d,J＝5.6Hz,1H),3.93(q,J＝5.1Hz,1H),3.62-3.53(m,1H),3.44-3.35(m,1H),1.28(t,J＝6.9Hz,6H)。

化合物812：在惰性气氛下，将化合物811(0.40g，2.66mmol)溶解于无水乙酸乙酯(13mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.70mL，4.0mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.95mL，4.0mmol)，并将混合物在室温下搅拌1.5小时。将混合物淬灭，用5％ NaCl(3×40mL)、饱和NaCl(1×40mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。产物通过硅胶快速色谱法，24g硅胶柱，使用乙酸乙酯(+1％三乙胺):己烷(1:15至1:9梯度)纯化。将含产物的级分在真空下浓缩，用乙腈(2×)冲洗，并在高真空下干燥。分离出化合物812，为黄色油状物，20％产率(182mg)。¹H NMR,(500MHz，乙腈-d₃)δ4.28-4.19(m,1H),3.89-3.57(m,6H),2.73-2.61(m,2H),1.42-1.35(m,6H),1.22-1.16(m,12H).³¹P NMR(202MHz，乙腈-d₃)δ150.85,150.47。

方案6

化合物813：在惰性气氛下，将2-甲基-3-戊酮(23.3g，233mmol)溶解于乙醚(100mL)中。将单独制备的溴(25.7mL，465mmol)在二氯甲烷(50mL)(12滴)中的溶液添加到酮溶液中，并搅拌1分钟以引发反应。将混合物在冰/水浴中冷却，并在3小时内将溴溶液(65mL)滴加到冷却并搅拌的酮溶液中。除去冰浴，并将混合物在室温下搅拌20分钟。将混合物用乙醚(300mL)稀释，并分批添加到搅拌的5％ NaCl水溶液(300mL)中，并搅拌10分钟。将有机层用5％ NaCl(2×500mL)、5％Na₂S₂O₅(1×450mL)和饱和NaCl(1×500mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。分离化合物813，为淡黄色液体，95％产率(57.1g)。¹H NMR,(500MHz,DMSO-d₆)δ5.41(q,J＝6.6Hz,1H),1.98(s,3H),1.87(s,3H),1.74(d,J＝6.6Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ198.94,64.58,41.06,29.35,28.59,22.10。

化合物814：在惰性气氛下，在33℃下加热N-甲基乙酰胺(300mL)。添加九水合硫化二钠(27.9g，116mmol)和硫(7.46g，233mmol)，并将悬浮液在35℃下搅拌24小时以溶解固体。将反应冷却至30℃，并在15分钟内缓慢添加化合物813(30g，116mmol)在N-甲基乙酰胺(20mL)中的溶液。将混合物在30℃下搅拌22小时，并通过缓慢倒入5％ NaCl(1200mL)的搅拌溶液中来淬灭。将混合物用乙酸乙酯(1200mL)稀释，并用5％ NaCl(3×1200mL)和饱和NaCl(1×800mL)洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将油状残留物在己烷(600mL)中稀释，并搅拌18小时。通过倾析除去固体，并将上清液浓缩成油状物。产物通过硅胶快速色谱法，220g硅胶柱，使用二氯甲烷:己烷(1:9至1:8梯度)纯化。将含产物的级分浓缩，并用二氯甲烷(2×)冲洗。分离出化合物814，为黄色油状物，32％产率(6.1g)。¹H NMR,ELN0021-16-7(400MHz,DMSO-d₆)δ3.98(q,J＝7.0Hz,1H),1.45(d,J＝9.0Hz,6H),1.37(d,J＝7.0Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ211.58,56.27,50.15,24.69,24.11,16.00.。

化合物815和816：在惰性气氛下，将化合物814(2.3g，14.2mmol)溶解于乙醇(35mL)中，并冷却至-78℃。添加硼氢化钠(531mg，4.17mmol)，将反应混合物搅拌15分钟，温热至室温，并再搅拌3小时。将混合物冷却至-78℃，并用饱和NH₄Cl(10mL)淬灭。添加乙酸乙酯(50mL)、饱和NH₄Cl(35mL)和水(20mL)，并将混合物在室温下搅拌过夜。分离有机层，用1:1饱和NH4Cl:水(1×50mL)、饱和NaHCO₃(1×50mL)、饱和NaCl(1×50mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。产物通过硅胶快速色谱法，80g硅胶柱，使用乙酸乙酯:己烷(1:20至1:9梯度)分离。将含产物的级分浓缩，并用二氯甲烷(2×)冲洗。分离早期洗脱的化合物815，为黄色固体，40％产率(0.93g)。分离后期洗脱的化合物816，为黄色油状物，10％产率(0.23g)。化合物815：¹H NMR,(500MHz,DMSO-d₆)δ5.13(d,J＝6.9Hz,1H),3.88-3.82(m,1H),3.76(dd,J＝6.9,4.5Hz,1H),1.37(d,J＝6.5Hz,6H),1.28(d,J＝6.8Hz,3H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ83.39,63.88,51.88,28.15,22.83,15.24。化合物816：¹H NMR,(400MHz,DMSO-d₆)δ5.67(d,J＝6.3Hz,1H),3.36(dd,J＝8.4,6.2Hz,1H),3.27-3.19(m,1H),1.37(d,J＝6.5Hz,3H),1.31(d,J＝3.9Hz,6H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ88.45,57.99,48.86,25.74,21.63,19.17。

化合物817：在惰性气氛下，将化合物815(0.2g，1.2mmol)溶解于无水乙酸乙酯(6mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.32mL，1.8mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.41mL，1.8mmol)，并将混合物在室温搅拌3小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(20mL)稀释，用5％NaCl(3×40mL)、饱和NaCl(1×40mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。产物通过硅胶快速色谱法在用三乙胺(10mL)淬灭的标准24g硅胶柱上，使用乙酸乙酯/己烷(1:9至1:2)的梯度分离。将含产物的级分浓缩，用乙腈(2×)冲洗，并在高真空下干燥。得到化合物817，为缓慢结晶的黄色油状物，54％产率(0.24g)。¹H NMR(500MHz，乙腈-d₃)δ4.19-4.10(m,1H),4.01-3.64(m,5H),2.75-2.63(m,2H),1.52(s,3H),1.50-1.37(m,6H),1.27-1.20(m,12H).³¹P NMR(202MHz，乙腈-d₃)δ152.39,150.75。

方案7

化合物819：将九水合硫化钠(4.08g，17mmol)和元素硫(1.09g，34mmol)在MMA(N-甲基乙酰胺)(35mL)中的悬浮液在30℃下搅拌过夜以形成均匀的黄色溶液。滴加二溴酮818(2.4mL，14mmol)在MMA(10mL)中的溶液约20分钟，同时保持浴温在30℃。将混合物在30℃下再搅拌3小时，冷却至室温，并通过添加5％ NaCl水溶液(200mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯萃取，分离有机相，用5％ NaCl水溶液、饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠干燥。真空蒸发溶剂，得到粗残留物(2.49g)，将其在硅胶柱上用0-10％乙酸乙酯/己烷梯度纯化，得到1.18g(48％)纯四甲基酮819。¹H NMR(400MHz,CD3CN):δ1.50(s,12H)。¹³C NMR(126MHz,CD3CN):δ215.4；58.6；25.7。

化合物820：在Ar气氛下，在3小时内将硼氢化钠(420mg，11mmol)分批添加到酮819(0.78g，4.4mmol)和乙酸(0.5mL，8.7mmol)在无水乙醇(15mL)中的冷却(0℃)和搅拌的溶液中。将混合物在0℃下再搅拌3小时，移除冷却浴，并通过添加饱和氯化铵(30mL)和乙酸乙酯(10mL)淬灭混合物。使混合物升温至室温，添加水(5mL)以溶解固体，并将混合物在空气存在下剧烈搅拌48小时。分离有机相，用饱和NaCl洗涤，并用无水硫酸钠干燥。真空除去溶剂，得到粗产物(0.84g)，将其在硅胶柱上用5-20％乙酸乙酯/己烷梯度纯化，得到0.65g(83％)820，为缓慢结晶的淡黄色液体。¹H NMR(500MHz,CD₃CN):δ3.50(d,J＝6.5Hz,1H)；3.43(d,J＝7.0Hz,1H)；1.44(s,6H)；1.36(s,6H)。

化合物821：在Ar气氛下，将2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.45mL，2mmol)添加到四甲基甲醇820(0.27g，1.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.35mL，2mmol)在无水乙酸乙酯(7mL)中的冷却(0℃)和搅拌的溶液中。除去冷却浴，将混合物在室温搅拌24小时，冷却至0℃，并通过添加饱和碳酸氢钠溶液淬灭。分离有机相，无水硫酸钠上干燥，并且粗残留物在硅胶柱上用35至100％二氯甲烷/己烷梯度纯化，得到0.37g(65％)的纯亚磷酰胺821，为淡黄色油状物。¹H NMR(400MHz,CD₃CN):δ3.89-3.80(m,1H)；3.77(d,J＝12.4Hz,1H)；3.73-3.59(m,3H)；2.65(t,J＝6.0Hz,2H)；1.55(s,3H)；1.50(s,3H)；1.44(s,3H)；1.42(s,3H)；1.22(d,J＝6.8Hz,6H)；1.18(d,J＝6.8Hz,6H).³¹P NMR(202MHz,CD₃CN):δ150.8。

方案8

化合物825：3-甲基-1-苯基-2-丁酮，化合物822(4.0g，24.7mmol)溶解于无水乙醚(20mL)中。向酮溶液中添加3滴溴(7.9g，2.5mL，49.3mmol)和DCM(10mL)的溶液以引发反应。一旦反应物从橙色变为无色，在一小时内滴加剩余的溴溶液。将反应物再搅拌2小时，然后用乙醚(100mL)稀释，并分批添加到5％氯化钠(100mL)的搅拌溶液中。然后将有机层用5％NaCl(3×100mL)、5％ Na₂S₂O₅(1×100mL)和饱和NaCl(1×100mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。淡褐色粗残留物在硅胶柱上用2％至7％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物825，为白色固体，96％产率(7.6g)。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ7.67-7.63(m,2H),7.41-7.33(m,3H),6.60(s,1H),1.99(s,3H),1.79(s,3H)。

化合物826：在氩气氛下，1-(4-甲基)-3-甲基丁-2-酮、化合物823(4.51g，25.6mmol)溶解在无水乙醚(20mL)中。向酮溶液中添加10滴溴(8.18g，2.62mL，51.2mmol)和DCM(15mL)的溶液以引发反应。一旦反应从橙色变为浅橙色，在1小时内滴加剩余的溴溶液。将反应物再搅拌2小时，然后用乙醚(100mL)稀释，并分批添加到5％氯化钠(100mL)的搅拌溶液中。然后用5％ NaCl(3×100mL)、5％ Na₂S₂O₅(1×100mL)和饱和NaCl(1×100mL)洗涤有机层。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。淡褐色粗残留物在硅胶柱上用3％至20％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物826，为白色固体状，79％产率(6.77g)。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.53(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(d,J＝7.7Hz,2H),6.57(s,1H),2.28(s,3H),1.97(s,3H),1.78(s,3H)。

化合物827：在氩气氛下，1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基丁-2-酮、化合物824(4.82g，25.1mmol)溶解于无水乙醚(20mL)中。向酮溶液中添加3滴溴(8.01g，2.6mL，50.1mmol)和DCM(15mL)的溶液以引发反应。一旦反应物从橙色变为浅橙色，在1小时内滴加剩余的溴溶液。将反应物再搅拌2小时，然后用乙醚(100mL)稀释，并分批添加到5％氯化钠(100mL)的搅拌溶液中。然后用5％ NaCl(3×100mL)、5％Na₂S₂O₅(1×100mL)和饱和NaCl(1×100mL)洗涤有机层。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。淡褐色粗残留物在硅胶柱上用0％至15％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物827，为白色固体，91％产率(8.0g)。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.59(d,J＝6.8Hz,2H),6.95(d,J＝6.8Hz,2H),6.61(s,1H),3.76(s,3H),1.97(s,3H),1.79(s,3H)。

化合物828：向加热至33℃的含有N-甲基乙酰胺(40mL)的反应器中装入九水合硫化钠(6.0g，25mmol)和硫(1.6g，50mmol)。将该悬浮液在35℃下搅拌过夜以溶解固体。将混合物冷却至30℃，然后添加化合物825(4.0g，25.0mmol)。将反应物搅拌3小时，然后通过添加搅拌的5％ NaCl溶液(200mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取，并用5％ NaCl(2×150mL)和饱和NaCl(1×150mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。用己烷(100mL)稀释粗产物，并通过真空过滤除去沉淀的残余硫。浓缩滤液，得到粗残留物，将其在硅胶柱上用4％至10％乙酸乙酯/己烷梯度纯化，得到纯化合物828，为黄色固体，89％产率(2.49g)。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.44-7.25(m,6H),5.28(s,1H),1.62(s,3H),1.52(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ210.06,135.77,129.16,128.75,128.32,58.97,56.66,24.56,24.16。

化合物829：向加热至33℃的含有N-甲基乙酰胺(40mL)的反应器中装入九水合硫化钠(6.0g，25mmol)和硫(1.6g，50mmol)。将该悬浮液在35℃下搅拌过夜以溶解固体。将混合物冷却至30℃，然后添加化合物826(4.0g，25.0mmol)。将反应搅拌3小时，然后通过添加搅拌的5％ NaCl溶液(200mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取，并用5％ NaCl(2×150mL)和饱和NaCl(1×150mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。用己烷(100mL)稀释粗产物，并通过真空过滤除去沉淀的残余硫。浓缩滤液，得到粗残留物，将其在硅胶柱上用4％至10％乙酸乙酯/己烷梯度纯化，得到纯化合物829，为黄色固体，53％产率(1.51g)。¹HNMR(500MHz,DMSO)δ7.17(s,4H),5.23(s,1H),2.28(s,3H),1.62(s,3H),1.50(s,3H)。¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ210.21,137.81,132.70,129.32,129.09,58.91,56.59,24.65,24.19,20.71。

化合物830：向加热至33℃的含有N-甲基乙酰胺(30mL)的反应器中装入九水合硫化钠(4.71g，19.6mmol)和硫(1.26g，39.2mmol)。将该悬浮液在35℃下搅拌过夜以溶解固体。将混合物冷却至30℃，然后添加化合物827(3.43g，9.8mmol)。将反应搅拌3小时，然后通过添加到搅拌的5％ NaCl溶液(150mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取，并用5％NaCl(2×150mL)和饱和NaCl(1×150mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。用己烷(100mL)稀释粗产物，并通过真空过滤除去沉淀的残余硫。浓缩滤液，得到粗残留物，将其在硅胶柱上用0％至15％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物830，为黄色固体，78％产率(1.75g)。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.21(d,J＝6.9Hz,2H),6.94(d,J＝6.9Hz,2H),5.24(s,1H),3.75(s,3H),1.63(s,3H),1.50(s,3H)。¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ210.87,159.73,131.03,127.99,114.71,59.26,56.98,55.65,25.23,24.72。

化合物831和832：在氩气下于烘箱干燥的烧瓶中将化合物828(2.32g，10.34mmol)溶解于乙醇(25mL)中，并且然后冷却至-78℃。添加乙酸(0.62g，0.60mL，10.34mmol)，然后添加NaBH₄(0.39g，10.34mmol)。将反应物在-78℃下搅拌10分钟，在0℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。将反应冷却至0℃，并添加额外等份的NaBH₄(0.10g，2.59mmol)。将反应物在0℃下搅拌5小时，然后通过缓慢添加饱和NH₄Cl(15mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯(80mL)、饱和NH₄Cl(40mL)和水(35mL)稀释。将混合物在室温下搅拌18小时。有机层用1:1饱和NH₄Cl:水(1×50mL)、饱和NaHCO₃(1×50mL)和饱和NaCl(1×50mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗黄色残留物在硅胶柱上用6％至10％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到早期洗脱化合物832(外消旋混合物)，为黄色固体(1.45g，62％产率)和晚期洗脱化合物831(外消旋混合物)，为黄色固体(0.13g，6％产率)。化合物831：¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.51-7.42(m,2H),7.38-7.24(m,3H),5.68(d,J＝6.7Hz,1H),4.29(d,J＝8.7Hz,1H),3.93(dd,J＝8.6,6.6Hz,1H),1.46(s,3H),1.38(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ140.17,128.44,128.15,127.59,89.28,58.61,57.01,25.32,21.12。化合物832：¹H NMR(500MHz,DMSO)δ7.56-7.46(m,2H),7.33-7.22(m,3H),5.23(d,J＝7.2Hz,1H),5.00(d,J＝3.8Hz,1H),3.94(dd,J＝6.9,3.8Hz,1H),1.52(s,3H),1.44(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ136.49,130.01,127.66,127.40,83.58,65.70,61.53,28.68,23.27。

化合物833和834：在氩气下于烘箱干燥的烧瓶中将化合物829(1.25g，5.24mmol)溶解在乙醇(13mL)中，然后冷却至-78℃。添加乙酸(0.31g，0.30mL，5.24mmol)，然后添加NaBH₄(0.20g，5.24mmol)。将反应物在-78℃搅拌10分钟，在0℃搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。将反应冷却至0℃，并添加额外等份的NaBH₄(0.05g，1.31mmol)。将反应物在0℃搅拌5小时，然后通过缓慢添加饱和NH₄Cl(10mL)淬灭。将混合物用乙酸乙酯(50mL)、饱和NH₄Cl(25mL)和水(20mL)稀释。将混合物在室温下搅拌18小时。有机层用1:1饱和NH₄Cl:水(1×50mL)、饱和NaHCO₃(1×50mL)和饱和NaCl(1×50mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗黄色残留物在硅胶柱上用5％至20％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到早期洗脱化合物834(外消旋混合物)，为黄色固体(0.87g，69％产率)，和晚期洗脱化合物833(外消旋混合物)，为黄色固体(0.052g，4％产率)。化合物833：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.37-7.32(m,2H),7.16(d,J＝7.6Hz,2H),5.66(d,J＝6.7Hz,1H),4.26(d,J＝8.6Hz,1H),3.91(dd,J＝8.8,6.5Hz,1H),2.29(s,3H),1.45(s,3H),1.38(s,3H)。化合物834：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.44-7.36(m,2H),7.13-7.08(m,2H),5.24 -5.16(m,1H),4.97(d,J＝3.1Hz,1H),3.93-3.86(m,1H),2.28(s,3H),1.52(s,3H),1.44(s,3H)。¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ137.11,133.81,130.38,128.75,84.03,66.08,61.83,29.28,23.84,21.17。

化合物835和836：在氩气下于烘干的烧瓶中将化合物830(1.9g，7.5mmol)悬浮于乙醇(20mL)中，并且然后冷却至-78℃。添加乙酸(0.45g，0.43mL，7.5mmol)，然后添加NaBH₄(0.28g，7.5mmol)。将反应物在-78℃搅拌10分钟，在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌过夜。将反应冷却至0℃，并添加额外等份的NaBH₄(0.05g，1.31mmol)。将反应物在0℃下搅拌5小时，然后通过缓慢添加饱和NH₄Cl(40mL)和水(35mL)淬灭。将混合物搅拌48小时。有机层用1:1饱和NH₄Cl:水(1×50mL)、饱和NaHCO₃(1×50mL)和饱和NaCl(1×50mL)洗涤。有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将粗黄色残留物在硅胶柱上用3:48.5:48.5的二乙醚:DCM:己烷纯化，得到早期洗脱化合物836(外消旋混合物)，为黄色固体(1.0g，52％产率)，和晚期洗脱化合物835(外消旋混合物)，为黄色固体(0.07g，4％产率)。化合物835：¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.37(d,J＝8.7Hz,2H),6.91(d,J＝8.7Hz,2H),5.66(d,J＝6.7Hz,1H),4.27(d,J＝8.8Hz,1H),3.89(dd,J＝8.8,6.6Hz,1H),3.74(s,3H),1.43(s,3H),1.38(s,3H)。¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ159.21,131.67,128.54,113.60,83.93,66.04,61.41,55.54,29.36,23.88。化合物836:¹H NMR(600MHz,DMSO)δ7.45(d,J＝8.7Hz,2H),6.86(d,J＝8.8Hz,2H),5.27(d,J＝7.2Hz,1H),4.97(d,J＝3.7Hz,1H),3.85(d,J＝3.3Hz,1H),3.73(s,3H),1.51(s,3H),1.43(s,3H)。¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ159.29,132.02,129.81,114.37,89.34,58.74,57.19,55.62,26.10,21.89。

化合物837：在惰性气氛下，将化合物831(0.1g，0.44mmol)溶解于无水乙酸乙酯(1mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.15mL，0.88mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.15mL，0.66mmol)，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(20mL)稀释，用5％ NaCl(3×20mL)和饱和NaCl(1×40mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗残留物在硅胶柱上用5％至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物837，为黄色油状物，77％产率(0.15g)。¹H NMR(600MHz,CD₃CN)δ7.55-7.50(m,2H),7.41-7.30(m,3H),4.57-4.43(m,2H),3.68-3.49(m,3H),3.27-3.13(m,1H),2.560-2.56(m,1H),2.26-2.20(m,1H),1.62-1.56(m,6H),1.16(d,J＝6.8Hz,3H),1.10(d,J＝6.8Hz,3H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H)。¹³C NMR(151MHz,CD₃CN)δ140.19,139.67,129.22,129.17,129.14,129.07,128.60,128.46,92.49,92.40,92.22,92.15,59.68,59.65,59.62,59.20,59.16,58.38,58.25,58.19,58.05,43.55,43.47,43.40,43.31,26.16,25.94,25.91,24.37,24.32,24.29,24.26,24.20,24.14,22.59,22.00,20.39,20.34,20.14,20.09.³¹P NMR(243MHz,CD₃CN)δ150.08,148.64。

化合物839：在惰性气氛下，将化合物833(0.05g，0.21mmol)溶解于无水乙酸乙酯(0.5mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.07mL，0.42mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.07mL，0.31mmol)，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(10mL)稀释，用5％ NaCl(3×15mL)(3×15mL)和饱和NaCl(1×15mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗残留物在硅胶柱上用5％至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物839，为黄色油状物，46％产率(0.042g)。¹H NMR(600MHz,CD₃CN)δ7.42-7.37(m,2H),7.24-7.14(m,2H),4.54-4.40(m,2H),3.68-3.48(m,3H),3.25-3.11(m,1H),2.59-2.57(m,1H),2.34(d,J＝12.2Hz,3H),2.26-2.20(m,1H),1.61-1.56(m,5H),1.16(d,J＝6.8Hz,3H),1.10(d,J＝6.8Hz,3H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H)。¹³C NMR(151MHz,CD₃CN)δ138.49,138.43,136.85,136.42,129.70,129.67,129.09,129.08,92.42,92.31,92.12,92.04,59.74,59.71,59.43,59.40,59.09,58.99,58.44,58.30,58.17,58.03,43.59,43.51,43.41,43.32,26.31,26.05,26.02,24.38,24.33,24.30,24.29,24.26,24.15,24.09,22.71,22.12,20.71,20.70,20.39,20.34,20.08,20.03.³¹P NMR(243MHz,CD₃CN)δ150.32,148.64。

化合物841：在惰性气氛下，将化合物835(0.042g，0.16mmol)溶解于无水乙酸乙酯(0.5mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.04mL，0.25mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.05mL，0.25mmol)，并将混合物在室温搅拌18小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(10mL)稀释，用5％ NaCl(3×15mL)和饱和NaCl(1×15mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗残留物在硅胶柱上用5％至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物841，为黄色油状物，44％产率(0.033g)。¹H NMR(600MHz,CD₃CN)δ7.46-7.40(m,2H),6.97-6.87(m,2H),4.52-4.37(m,2H),3.80(d,J＝11.7Hz,3H),3.70-3.19(m,4H),2.59(t,J＝5.9Hz,1H),2.31-2.27(m,1H),1.63-1.55(m,6H),1.16(d,J＝6.8Hz,3H),1.11(d,J＝6.8Hz,3H),1.06(d,J＝6.8Hz,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,3H).³¹P NMR(243MHz,CD₃CN)δ150.16,148.78。

化合物838：在惰性气氛下，将化合物832(0.40g，1.77mmol)溶解于无水乙酸乙酯(9mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.4mL，2.65mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.59mL，2.65mmol)，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(40mL)稀释，用5％ NaCl(3×80mL)和饱和NaCl(1×80mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗残留物在硅胶柱上用5％至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物838，为黄色油状物，80％产率(0.60g)。¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ7.48-7.42(m,2H),7.34-7.21(m,3H),5.01(d,J＝5.6Hz,1H),4.36-4.31(m,1H),3.76-3.66(m,1H),3.62-3.43(m,3H),2.64-2.55(m,2H),1.66(s,3H),1.61(s,3H),1.04(d,J＝6.8Hz,6H),0.94(d,J＝6.8Hz,6H).³¹P NMR(162MHz,CD₃CN)δ150.93。

化合物840：在惰性气氛下，将化合物834(0.61g，2.53mmol)溶解于无水乙酸乙酯(10mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.66mL，3.8mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.85mL，3.8mmol)，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(50mL)稀释，用5％ NaCl(3×50mL)和饱和NaCl(1×50mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗残留物在硅胶柱上用5％至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物840，为黄色油状物，83％产率(0.93g)。¹H NMR(600MHz,CD₃CN)δ7.43-7.32(m,2H),7.19-7.10(m,2H),5.06-4.97(m,1H),4.36-4.29(m,1H),3.77-3.23(m,4H),2.67-2.39(m,2H),2.36-2.27(m,3H),1.70-1.55(m,6H),1.13-0.93(m,12H)。¹³C NMR(151MHz,CD₃CN)δ138.08,137.85,134.25,133.76,131.16,130.77,129.34,128.85,119.28,86.81,86.73,86.00,85.94,64.40,62.96,62.94,61.09,58.37,58.28,58.24,58.13,43.69,43.60,43.59,43.51,27.99,27.56,27.54,24.59,24.52,24.47,24.43,24.39,24.31,24.27,24.22,23.83,23.80,20.73,20.69,20.56,20.51,20.41,20.36.³¹P NMR(243MHz,CD₃CN)δ 151.40,149.14。

化合物842：在惰性气氛下，将化合物836(0.50g，1.95mmol)溶解于无水乙酸乙酯(8mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.51mL，2.9mmol)和2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.65mL，2.9mmol)，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应淬灭，用乙酸乙酯(50mL)稀释，用5％ NaCl(3×50mL)和饱和NaCl(1×50mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。粗残留物在硅胶柱上用5％至30％乙酸乙酯/己烷的梯度纯化，得到纯化合物842，为黄色油状物，77％产率(0.68g)。¹H NMR(600MHz,CD₃CN)δ7.48-7.35(m,2H),6.92-6.83(m,2H),5.05-4.98(m,1H),4.34-4.24(m,1H),3.84-3.26(m,7H),2.66-2.42(m,2H),1.71-1.54(m,6H),1.15-0.95(m,12H)。¹³C NMR(151MHz,CD₃CN)δ159.94,159.84,132.42,132.06,131.44,129.25,128.73,119.30,114.13,113.56,86.68,86.60,85.84,85.78,64.31,62.83,62.79,62.46,62.44,60.71,58.39,58.31,58.25,58.16,55.49,55.48,43.71,43.62,43.57,43.49,27.95,27.51,27.49,24.55,24.51,24.50,24.44,24.40,24.38,24.33,24.33,24.28,23.77,23.75,22.94,20.56,20.52,20.46,20.40.³¹P NMR(243MHz,CD₃CN)δ151.42,149.09。

方案9

化合物843：在惰性气氛下，将化合物816(0.4g，2.4mmol)溶解于无水乙酸乙酯(12mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(0.41g，3.2mmol)，随后添加2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.75g，3.2mmol)，并将混合物在室温下搅拌3小时。用饱和碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯淬灭反应。将有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，并减压浓缩，得到粗残留物，将其通过硅胶快速色谱法纯化，得到纯化合物843，为黄色油状物，89％产率(0.79g)。¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ3.91-3.42(m,6H),2.69-2.61(m,2H),1.52-1.43(m,9H),1.23-1.15(m,12H)。¹³CNMR(101MHz,CD₃CN)δ119.62,92.89,92.76,92.58,92.46,60.15,60.10,59.76,59.74,59.11,59.07,58.91,58.87,52.19,52.15,51.96,44.17,44.15,44.05,44.02,26.90,26.68,26.63,25.10,25.02,24.96,24.94,24.88,23.39,22.91,21.04,20.96,19.92,19.81,19.75.³¹P NMR(162MHz,CD₃CN)δ150.00,149.81。

方案10

酮846：在氩气气氛下，向配备有回流冷凝器的1L三颈烧瓶中添加丙酸甲酯845(6.48g，73.5mmol)、二苯基甲酮844(6.70g，36.8mmol)和锌粉(9.62g，147mmol)。在搅拌下向混合物中添加无水THF(180mL)。将悬浮液在冰水浴中冷却至0-5℃，并将氯化钛(IV)(13.95g，8.1mL，73.5mmol)缓慢添加到混合物中。将深蓝色悬浮液在25℃下搅拌2小时，然后在50℃下加热6小时。将混合物冷却至室温，并添加1M HCl(800mL)。将混合物在室温下搅拌10分钟，并用乙酸乙酯(250mL×3)萃取。合并有机层，用NaCl水溶液洗涤，并用MgSO₄干燥。过滤固体并真空除去溶剂后，残留物通过硅胶快速柱色谱(330g，120mL/min，30％ DCM至60％ DCM/己烷的梯度纯化，得到化合物846：(6.44g，78％)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ0.93(t,3H,J＝6Hz),2.56(q，2h，J＝6Hz),5.39(s,1H),7.23-7.27(m,6H),7.31-7.34(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ8.5,35.8,62.8,127.3,129.0,129.3,139.6,209.4。

二溴-酮847：在氩气氛下，将1,1-二苯基-丁-2-酮(846)(7.2g，32.1mmol)溶解在无水乙醚(45mL)中。添加12滴溴(12.8g，80.3mmol)在无水DCM(15mL)中的溶液以引发反应。一旦反应混合物溶液的颜色从橙色变为几乎无色，在35分钟内滴加剩余的溴溶液。将反应混合物再搅拌2小时，用乙醚(120mL)稀释，并缓慢地分批倒入到5％ NaCl(150mL)的搅拌溶液中。分离有机层，用5％ NaCl(2×150mL)、5％焦亚硫酸钠(1150mL)和饱和NaCl(1×150mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并真空浓缩，得到淡黄色液体，其冷却后缓慢固化，得到化合物847：95％纯度，11.2g(91％)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ1.69(d,3H,J＝5Hz),4.99(q，2h，J＝5Hz),7.30-7.32(m,4H),7.41-7.48(m,6H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ24.5,44.4,76.1,128.9,129.1,129.5,129.8,130.0,130.1,137.6,138.5,198.7。

环状酮848：向含有N-甲基乙酰胺(15mL)并加热至33℃的100mL RBF中添加九水合硫化钠(1.20g，5.0mmol)和硫(320mg，10mmol)。将悬浮液在35℃下搅拌24小时以溶解固体。将反应混合物冷却至30℃，并将847(1.27g，3.33mmol)在N-甲基乙酰胺(3mL)中的溶液缓慢滴加至反应混合物中。将反应物在30℃下搅拌3小时，并通过倒入到5％ NaCl(60mL)的搅拌溶液中淬灭。将混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取，用5％ NaCl(3×40mL)和饱和NaCl(1×40mL)洗涤。分离有机层，并用Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到黄色油状物，将其用己烷(80mL)研磨以沉淀出固体硫，其通过过滤除去。将所得滤液真空浓缩，得到黄色油状物，其通过硅胶快速柱色谱法纯化(40g，20mL/min，用5％至35％乙酸乙酯/己烷溶液梯度洗脱)。合并含产物的级分，并在真空下浓缩，得到作化合物848，为黄色油状物：265mg(27％)。¹HNMR(600MHz,DMSO-d₆)δ1.08(d,3H,J＝5Hz),4.33(q,1H,J＝5Hz),7.30-7.39(m,8H),7.49-7.51(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ11.3,51.6,68.24,125.9,126.1,126.3,126.4,126.8,126.9,137.7,140.9,205.5。

方案11

酮854：向烘干的100mL圆底烧瓶中添加1-(4-溴苯基)-3-甲基-丁-2-酮(853)(3.50g，14.5mmol)、钯(0)四-三苯基膦(1.34g，1.2mmol)和氰化锌(1.70g，14.5mmol)。添加无水DMF(35mL)，然后将反应混合物脱气，并在氩气氛下于90℃加热过夜。将混合物冷却，用150mL EtOAc稀释，并用氢氧化铵(2M，150mL×2)洗涤，然后用饱和NaHCO₃(140mL)和饱和NaCl(100mL)洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩，得到3.22g粗残留物。粗残留物通过硅胶上快速柱色谱(220g，60mL/min，20％至35％乙酸乙酯/己烷的梯度)纯化，得到无色油状物，其缓慢固化，得到化合物854，为白色固体：(2.13g，77％)。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ1.17(d,6H,J＝5Hz),2.74(m,1H),3.84(s,2H),7.31-7.33(m,2H),7.62-7.64(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ18.2,41.0,47.1,110.9,118.8,130.4,132.3,139.8,210.2。

二溴-酮855：在氩气氛下，将1-(4-氰基苯基)-3-甲基-丁-2-酮854(2.10g，11.2mmol)溶解在无水乙醚(12mL)中。添加12滴溴(3.85g，24.1mmol)在无水DCM(5mL)中的溶液以引发反应。一旦反应混合物溶液的颜色从橙色变为几乎无色，在25分钟内滴加剩余的溴溶液。然后将反应物再搅拌2小时，用乙醚(40mL)稀释，并缓慢地分批倒入到搅拌的5％NaCl(55mL)的溶液中。分离有机层，用5％ NaCl(55mL×2)、5％焦亚硫酸钠(1×55mL)和饱和NaCl(1×55mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩，得到化合物855(～95％纯度)，为黄色液体，其在冷却时缓慢固化：3.35g(86％)。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ11.79(s,3H),2.05(s,3H),6.04(s,1H),7.59(d，2h，J＝8Hz),7.73(d，2h，J＝8Hz)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ27.2,28.5,41.5,62.2,111.1,116.3,128.2,130.5,138.9,194.1。

环状酮856：向含有N-甲基乙酰胺(15mL)并加热至33℃的100mL RBF中添加九水合硫化钠(1.20g，5.0mmol)和硫(320mg，10mmol)。将悬浮液在35℃下搅拌24小时以溶解固体。将反应混合物冷却至30℃，并将855(1.27g，3.33mmol)在N-甲基乙酰胺(3mL)中的溶液缓慢滴加到反应混合物中。将反应物在30℃下搅拌3小时，并通过倒入到5％ NaCl(60mL)的搅拌溶液中淬灭。将混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取，用5％ NaCl(3×40mL)和饱和NaCl(1×40mL)洗涤。分离有机层，用Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到黄色油状物，将其用己烷(80mL)研磨以沉淀出固体硫，其通过过滤除去。将所得滤液真空浓缩，得到黄色油状物，将其通过硅胶快速柱色谱法纯化(40g，20mL/min，用5％至35％乙酸乙酯/己烷溶液梯度洗脱)。合并含产物的级分，并在真空下浓缩，得到856，为黄色油状物：265mg(27％)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ1.56(s,3H),1.60(s,3H),5.50(s,1H),7.52-7.54(m,2H),7.86-7.88(m,2H)。¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ24.5,24.8,57.5,58.3,111.6,119.0,130.5,133.2,142.0,209.7。

方案12

二溴-酮861：在氩气氛下，将1-(4-溴苯基)-3-甲基-丁-2-酮853(2.00g，8.3mmol)溶解在无水乙醚(12mL)中。添加12滴溴(3.98g，24.9mmol)在无水DCM(6mL)中的溶液以引发反应。一旦反应混合物的颜色从橙色变为几乎无色，在25分钟内滴加剩余的溴溶液。将混合物再搅拌2小时，用乙醚(40mL)稀释，并缓慢地分批倒入到5％ NaCl(60mL)的搅拌溶液中。分离有机层，用5％ NaCl(60mL×2)、5％偏亚硫酸氢钠(60mL×1)和饱和NaCl(60mL×1)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到化合物861(～95％纯度)，为黄色液体，其在冷却时缓慢固化：3.15g(95％)。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ1.74(s,3H),1.98(s,3H),6.00(s,1H),7.17-7.45(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ29.3,30.5,44.5,63.8,123.6,130.9,132.0,134.9,196.6。

环状酮862：向含有N-甲基乙酰胺(14mL)并加热至33℃的100mL圆底烧瓶中添加九水合硫化钠(1.00g，4.2mmol)和硫(0.268g，8.4mmol)。将悬浮液在35℃下搅拌24小时以溶解固体。将混合物冷却至30℃，并缓慢滴加化合物861(1.11g，2.8mmol)在N-甲基乙酰胺(3mL)中的溶液。将反应混合物在30℃下搅拌3小时，并通过倒入到5％NaCl(50mL)的搅拌溶液中来淬灭。混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取，分离有机层，用5％ NaCl(3×40mL)和饱和NaCl(1×40mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机层，过滤，并真空浓缩，得到黄色油状物，用己烷(80mL)研磨以沉淀硫，其通过过滤除去。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状的粗残留物，其通过硅胶快速柱色谱法(40g，20mL/min，用5％至35％乙酸乙酯/己烷的梯度洗脱)纯化。合并含产物的级分，并在真空下浓缩，得到化合物862(～80％纯度)，为黄色油状物：(156mg，18％)。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ1.60(s,3H),1.69(s,3H),4.75(s,1H),7.19-7.20(m,2H),7.51-7.55(m,2H)。

方案13

酮868：在氩气气氛下，向配备有回流冷凝器的1L三颈烧瓶中添加2-甲基丙酸甲酯化合物867(10.2g，100mmol)、二苯基甲酮化合物844(9.10g，49.9mmol)和锌粉(13.06g，199.8mmol)。在搅拌下添加无水THF(200mL)，将悬浮液在冰水浴中冷却至0-5℃，并缓慢添加氯化钛(IV)(18.9g，10.9mL，100mmol)。将深蓝色悬浮液在25℃搅拌2小时，然后在50℃加热过夜。将反应混合物冷却至室温，并添加1M HCl(800mL)。将混合物在室温下搅拌10分钟，并用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。合并有机层，用NaCl水溶液洗涤，用MgSO₄干燥。过滤固体并真空除去溶剂后，粗残留物通过硅胶快速柱色谱法(330g，120mL/min，30％至60％ DCM/己烷梯度)纯化，得到化合物868：(8.87g，74％)。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ1.15(d,6H,J＝6Hz),2.83(m,1H),5.33(s,1H),7.25-7.29(m,6H),7.32-7.35(m,4H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ18.6,41.0,62.2,127.1,128.7,129.0,138.6,212.1。

实施例2.在寡核苷酸的5’-端含有修饰的磷酸酯前药的寡核苷酸的合成

所有寡核苷酸均如本文所述或如表7中另外所述合成。使用标准固相寡核苷酸方案以1或10μmol规模合成寡核苷酸，其使用具有来自Prime Synthesis的500-受控孔玻璃(CPG)固体载体和来自ChemGenes的市售亚磷酰胺。亚磷酰胺溶液为0.15M的无水乙腈溶液，其中15％THF作为用于2’-O-甲基尿苷、2’-O-甲基胞苷和修饰的磷酸酯前药的共溶剂。修饰的磷酸酯前药单体在合成仪上或手动地偶联。对于手动偶联，添加活化剂(0.25M 5-乙硫基-1H-四唑(ETT)的无水ACN溶液)，然后添加等体积的前药溶液。将溶液混合20分钟。偶联后，将柱置于ABI上进行氧化或硫化。将氧化溶液(0.02M碘的THF/吡啶溶液)或硫化溶液(0.1M 3-(二甲基氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)的吡啶溶液)分别输送至柱1分钟或30秒，然后在溶液中保持10分钟。重复该过程进行硫化。固相合成(SPS)完成后，将CPG固体载体用无水乙腈洗涤，并用氩气干燥。通过在氨水中与5％二乙醇胺(DEA)一起在室温下温育2小时，将寡核苷酸脱保护。

使用强阴离子交换通过TSKgel SuperQ-5PW(20)树脂与含有溴化钠的磷酸盐缓冲液(pH＝8.5)在65℃下纯化粗寡核苷酸。合并适当的级分并通过SEC脱盐。

表7.在5’端具有修饰的磷酸酯前药的单寡核苷酸链

大写字母后跟随f-2’-脱氧-2’-氟(2’-F)糖修饰；小写字母-2’-O-甲基(2’-OMe)糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；VP-乙烯基膦酸酯；

前药-

其中X是O或S。

合成了在反义链的5’-端具有环状二硫化物磷酸酯修饰的siRNA双链体，并列于表8中。

表8：在反义链的5’-端具有修饰的磷酸酯前药的siRNA

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；VP-乙烯基膦酸酯；前药与上表7相同；配体-

实施例3.在5’-端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体的体外评估

转染程序：使用0.1、1、10和100nm浓度的RNAiMAX将5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体(表9)转染至原代小鼠肝细胞中，并在转染后24小时分析。通过qPCR测定残留F12信使的百分比。结果相对于对照作图，如图1所示。

自由摄取程序：将5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体(表9)与原代小鼠肝细胞以0.1、1、10和100nm浓度在细胞培养基中一起温育，并在48小时后分析。通过qPCR测定残留F12信使的百分比。结果相对于对照作图，如图2所示。

表9.用于体外评估的siRNA双链体

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；VP-乙烯基膦酸酯；前药和配体与上表8相同。

转染程序：使用0.1、1、10和100nm浓度的RNAiMAX将5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体转染至原代小鼠肝细胞中，并在转染后24小时分析。通过qPCR测定残留F12信使的百分比。结果相对于对照作图，如图3所示。

表10.图3中用于体外评估的siRNA双链体

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；前药Pmds和配体L96的结构与上表8相同。

实施例4.DTT还原测定以检查环状磷酸酯前药类似物的可裂解性。

通过将100μM修饰的寡核苷酸(23-nt长度)与100mM DTT在1×PBS中温育来研究二硫苏糖醇(DTT)将5’-环状修饰的磷酸酯前药还原为5’磷酸酯或5’硫代磷酸酯。通过LCMS分析(Agilent Single-Quad MS或Novatia HTSC)观察全长(非还原)寡核苷酸的量直到温育后72小时。

表11.来自Novatia LCMS的MS数据

表12.来自Agilent LCMS的MS数据

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；前药的结构与上表8相同。

在DTT还原测定中测试的寡核苷酸的代表性LCMS谱显示在图4A-J中。

实施例5.谷胱甘肽测定以检查环状前药类似物的可裂解性。

将修饰的寡核苷酸(11-nt或23-nt长)以100μM添加来自马肝的250μg(6.25U/mL)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(Sigma目录号G6511)和0.1mg/mL NADPH(Sigma目录号481973)在0.1M Tris pH 7.2中的溶液。谷胱甘肽(GSH)(MP Biomedicals,Inc.目录号101814#)添加到混合物中，最终浓度为10mM。在添加GSH之后，立即将样品在30℃下注射到Dionex DNAPacPA200柱(4×250mm)上，并且在35-65％的阴离子交换梯度(20mM磷酸钠，10-15％ CH₃CN，1M溴化钠pH 11)上以1mL/min运行6.5分钟。

每小时监测谷胱甘肽介导的裂解动力学，持续24小时。将每小时的主峰下面积相对于0h时间点(第一次注射)的面积标准化。一级衰变动力学用于计算半衰期。在每天的检测运行中，在N6和N7之间运行含有具有5’硫醇修饰剂C6(Glen Research目录号10-1936-02)的修饰寡核苷酸(23-nt长)的对照序列。每组序列还运行一次含有在N1处具有相同5’硫醇修饰剂C6的修饰寡核苷酸(23-nt长)的第二对照序列。半衰期相对于对照序列的半衰期报告。谷胱甘肽和GST分别在水中制备为100mM和10mg/mL的储备液，并且等分到1mL管中，并且储存在-80℃下。每天使用新的等分试样进行测定。

表13.寡核苷酸5’修饰的磷酸酯前药与谷胱甘肽温育后的半衰期

寡核苷酸ID	序列	半衰期(h)
			A-515432	(Pmd)dTdTdTdTdTdTdTdTdTdT	>24
A-515433	(Pmds)dTdTdTdTdTdTdTdTdTdT	>24
			A-801703(对照1)	Q51uUfaUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfuuu	<1
A-801704(对照2)	uUfaUfaGfQ51GfcAfagaAfcAfcUfgUfuuu	4.2
			A-1875173	(Cymd)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
A-1875172	(Cymds)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
			A-1875175	(Pd)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
A-1875174	(Pds)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
			A-1875179	(Pmmd)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
A-1875178	(Pmmds)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
			A-1875180	(Ptmd)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24
A-1875181	(Ptmds)usCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	>24

大写字母后跟随f-2’-脱氧-2’-氟(2’-F)糖修饰；小写字母-2’-O-甲基(2’-OME)糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；前药的结构与上表9相同；Q51-

实施例6.在5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体的体内评估

体内研究程序：向C57bl6雌性小鼠(n＝3/组)施用0.3mg/mL的在表14中的5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体。在给药后第11、22和35天收集血清，并通过ELISA分析以确定相对F12蛋白水平。结果如图5所示。

表14.图5所示的体内评估中使用的siRNA双链体

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；前药Pmds和配体L96的结构与上表8相同。

体内研究程序：对C57bl6雌性小鼠(n＝3/组)施用0.1mg/mL或0.3mg/mL的在表15中的5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体。在给药后第11、22和35天收集血清，并通过ELISA分析以确定相对F12蛋白水平。结果如图6所示。

表15.图6中用于体内评估的siRNA双链体

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；前药Pmds和配体L96的结构与上表8相同。

实施例7.5’-磷酸酯的体内代谢稳定性和测定

代谢稳定性研究程序：向C57bl6雌性小鼠(n＝2/组)小鼠给药10mg/kg在表16中的5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体。给药后5天收集肝脏，并通过LC-MS分析。

表16.用于代谢评估的siRNA双链体

大写字母后跟随f-2’-F糖修饰；小写字母-2’-OMe糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；前药的结构与上表8相同。

代谢稳定性研究的结果示于表17和18中。

表17.体内研究后发现的siRNA代谢物

表18.在小鼠中5天后在反义链上发现的5’-磷酸酯、硫代磷酸酯或羟基的百分比

双链体ID	5’PO(％)	5’PS(％)	5’OH(％)
				AD-326760	0	0	5
AD-1023155	0	0	8
				AD-1023156	0	0	18
AD-1023152	1.6	1.3	1
				AD-1023157	0	0	0

5’环状二硫化物修饰的磷酸酯前药呈现5’-磷酸酯的可能的体内细胞溶质解掩蔽机制示于图7中。

实施例8：在CNS中在5’端含有修饰的磷酸酯前药的siRNA双链体的体内评估

CNS的体内研究程序(IT-鞘内施用)：向雌性大鼠(n＝3/组)施用0.1mg/大鼠、0.3mg/大鼠或0.9mg/大鼠的在表19中的5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1 siRNA双链体。在IT施用14或84天后收集脑并在不同区域中解剖用于qPCR分析以确定相对SOD1 mRNA水平。结果如图8-13所示。

CNS的体内研究程序(ICV-颅内脑室施用)：向C57bl6雌性小鼠(n＝4/组)施用100μg在表19中的5’端含有修饰的磷酸酯前药的SOD1siRNA双链体。ICV施用7天后收集脑，并且右半球用于qPCR分析以确定相对SOD1 mRNA水平。结果示于图14中。

表19.用于CNS研究的siRNA

大写字母后跟随f-2’-脱氧-2’-氟代(2’-F)糖修饰；小写字母-2’-O-甲基(2’-OME)糖修饰；s-硫代磷酸酯(PS)连接；Uhd：2’-O-十六烷基尿苷(2’-C16)；VP-乙烯基膦酸酯；前药：

Pmmds(((4SR,5SR)-3,3,5-三甲基-1,2-二硫杂环戊-4-醇)磷酸二酯)；

cPmmds(((4SR,5RS)-3,3,5-三甲基-1,2-二硫杂环戊-4-醇)磷酸二酯(顺式Pmmds))；

PdAr1s(((4SR,5RS)-5-苯基-3,3-二甲基-1,2-二硫杂环戊-4-醇)磷酸二酯)；

PdAr3s(((4SR,5RS)-5-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-1,2-二硫杂环戊-4-醇)磷酸二酯)；

PdAr5s(((4SR,5RS)-5-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-1,2-二硫杂环戊-4-醇)磷酸二酯)；

PdAr2sPdAr4sPdAr6s

Pmmd/PmmdsPmds

Cymd/Cymds(X为O/S)；Ptmd/Ptmds(X为O/S)、Pd/Pds(X为O/S)。

如图8-11所示，在5’-端含有Pmmds和cPmmds前药的siRNA双链体在CNS组织中表现出与含有5’-VP对照的siRNA双链体相似的活性和持续时间。

如图12-13所示，在5’-端含有PdAr1、PdAr3和PdAr5前药的siRNA双链体在CNS组织中与含有5’-VP对照的siRNA双链体相比表现出更好或至少相当的活性。

总之，代谢稳定的5’-磷酸酯模拟物例如5’-VP可改善肝外组织中的siRNA活性，而修饰的siRNA的内源5’-磷酸化效率较低。本文所述的新型5’修饰的磷酸酯前药在血浆和内体环境中显示出稳定性。这些5’修饰的磷酸酯前药在细胞溶质中去掩蔽，以呈现有效RISC装载所需的天然5’-磷酸酯(或硫代磷酸酯)。在5’端含有新型5’修饰的磷酸酯前药的siRNA表现出与含有稳定的5’-磷酸酯模拟物设计，例如5’-VP的siRNA相当或甚至更好的活性。

例如，含有以下列表的5’修饰的磷酸酯前药的siRNA的活性，

通常与含有5’-VP的siRNA的活性相当。含有以下列表的5’修饰磷酸酯前药的siRNA，

通常比含有5’-VP的siRNA具有改善的稳定性，并且比含有5’-VP的siRNA具有更好或相当的活性。

实施例9.引入修饰的磷酸酯前药用于掩蔽核苷酸间磷酸酯连接以掩蔽电荷

如方案14-19中所示，可以将不同的环状磷酸酯前药衍生物作为对有义链或反义链或者有义链和反义链两者上的任何核苷酸间磷酸酯基团的临时保护基团引入到磷酸酯基团。

方案14

方案15

方案16

方案17

方案18

方案19

实施例10.使用修饰的磷酸酯前药产生具有不同靶向配体的可裂解siRNA缀合物

如方案20所示，可通过环状磷酸酯衍生物将不同的靶向配体引入siRNA双链体中。这些衍生物将在siRNA进入细胞溶质后裂解。

方案20

Claims (48)

1.一种化合物，其包含式(I)的结构：

其中所述具有以下结构：

其中：

R₁是O或S，并且键合至所述的P原子；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环；

G是O、N(R’)、S或C(R¹⁴)(R¹⁵)；

n是0-6的整数；

R¹³在每次出现时独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地是H、卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、杂芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、N(R’)(R”)；

R’和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基、羟基、烷氧基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基或ω-羟基炔基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；并且

R^sub每次出现时独立地是卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧代、硝基、氨基、酰基氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基氨基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷基、链烷磺酰基、芳烃磺酰基、链烷磺酰胺基、芳烃磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、酰氧基、氰基或脲基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中在所述 中：

R₁是O；

G是CH₂；

n是0或1；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或C₁-C₆亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或C₁-C₆亚烷基-N(R’)(R”)、C₁-C₆烷基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或C₁-C₆亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或C₁-C₆亚烷基-N(R’)(R”)、C₁-C₆烷基、芳基、杂芳基、其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成6-8个原子的第二环；

R¹³在每次出现时独立地是H、C₁-C₆烷基、芳基、烷基羰基或芳基羰基；并且

R’和R”各自独立地是H或C₁-C₆烷基。

3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述具有以下结构：

4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述具有以下结构：

5.根据权利要求3或4所述的化合物，其中R₂是任选地取代的芳基。

6.根据权利要求3或4所述的化合物，其中R₂是任选地取代的C_1-6烷基。

7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述具有选自下式Ia)、Ib)和II)基团之一的结构：

Ia)：

Ib)：

和

II)：

8.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述 具有以下结构：

其中

X₁和Z₁各自独立地是H、OH、OM、OR¹³、SH、SM、SR¹³、C(O)H、S(O)H或烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代、N(R’)(R”)、B(R¹³)₃、BH₃ ^-、Se；或D-Q，其中D在每次出现时独立地是不存在、O、S、N(R’)、亚烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，并且Q在每次出现时独立地是核苷或寡核苷酸；

X ₂和Z₂各自独立地是N(R’)(R”)、OR¹⁸或D-Q，其中D在每次出现时独立地是不存在、O、S、N、N(R’)、亚烷基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代，并且Q在每次出现时独立地是核苷或寡核苷酸，

Y₁是S、O或N(R’)；

M是有机或无机阳离子；并且

R¹⁸是H或烷基，任选地被一个或多个R^sub基团取代。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述 具有以下结构：

其中：

X₁和Z₁各自独立地是OH、OM、SH、SM、C(O)H、S(O)H、任选地被一个或多个羟基或卤素基团取代的C₁-C₆烷基或D-Q；

D每次出现时独立地是不存在、O、S、NH、任选地被一个或多个卤素基团取代的C₁-C₆亚烷基；并且

Y₁是S或O。

10.根据权利要求9所述的化合物，其中X₁是OH或SH；且Z₁是D-Q。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述 具有以下结构：

其中：

X₂是N(R’)(R”)；

Z₂是X₂、OR¹⁸或D-Q；

R¹⁸是H或氰基取代的C₁-C₆烷基；并且

R’和R”各自独立地是C₁-C₆烷基。

12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述具有选自以下的结构：

13.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有选自以下的结构：

14.根据权利要求8所述的化合物，其中所述具有(P-I)的结构，并且所述-具有选自以下的结构：

其中X是O或S。

15.根据权利要求1所述的化合物，其中一个或多个靶向配体任选地通过一个或多个接头连接至所述的R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉中的任一个。

16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述配体选自抗体、受体的配体结合部分、受体的配体、适体、基于碳水化合物的配体、脂肪酸、脂蛋白、叶酸、促甲状腺激素、促黑素、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白、二膦酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、亲脂性部分、胆固醇、类固醇、胆汁酸、维生素B12、生物素、荧光团和肽。

17.一种寡核苷酸，其包含一个或多个式(II)的结构：

其中，所述具有以下结构：

或其盐，

其中：

*代表连接至所述寡核苷酸的键，

Y是不存在、＝O或＝S，X是-OH、-SH或X’，其中X’是-OR¹³或-SR¹³；

R₁是O或S，并且键合至-P(Y)(X)-*基团的P原子；

R₂、R₄、R₆、R₇、R₈和R₉各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R₃和R₅各自独立地是H、卤素、OR¹³或亚烷基-OR¹³、N(R’)(R”)或亚烷基-N(R’)(R”)、烷基、C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)或亚烷基-C(R¹⁴)(R¹⁵)(R¹⁶)、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；或R₃和R₅与相邻碳原子和两个硫原子一起形成第二环；

G是O、N(R’)、S或C(R¹⁴)(R¹⁵)；

n是0-6的整数；

R¹³在每次出现时独立地是H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；

R¹⁴、R¹⁵和R¹⁶各自独立地是H、卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、杂芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、N(R’)(R”)；

R’和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基、羟基、烷氧基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基或ω-羟基炔基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代；并且

R^sub每次出现时独立地是卤素、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、氧代、硝基、氨基、酰基氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、烷基氨基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷基、链烷磺酰基、芳烃磺酰基、链烷磺酰胺基、芳烃磺酰胺基、芳烷基磺酰胺基、烷基羰基、芳基羰基、酰氧基、氰基或脲基；

其中，当所述具有式(C-III)的结构时，至少一个连接在所述核苷或寡核苷酸的5’端。

18.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述 具有选自下式Ia)、Ib)和II)基团之一的结构：

Ia)：

Ib)：

和

II)：

19.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述 具有选自下式(III)基团之一的结构：

20.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述 基团具有选自以下的结构：

或其盐，其中X是O或S。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的寡核苷酸，其包含具有下式的结构： 或其盐。

22.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述 具有选自以下的结构：

其中*指示与-P(X)(Y)-*基团的磷原子的键。

23.根据权利要求22所述的寡核苷酸，其中所述 具有选自以下的结构：其中X是O或S。

24.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’-端含有至少一个

25.根据权利要求24所述的寡核苷酸，其中在所述寡核苷酸5’-端的第一核苷酸具有以下结构：

或其盐，其中：

*代表与随后任选地修饰的核苷酸间连接的键；

碱基是任选地修饰的核碱基；

R^s是所述并且

R是H、OH、O-甲氧基烷基、O-甲基、O-烯丙基、CH₂-烯丙基、氟、O-N-甲基乙酰胺基(O-NMA)、O-二甲基氨基乙氧基乙基(O-DMAEOE)、O-氨基丙基(O-AP)或ara-F。

26.根据权利要求24所述的寡核苷酸，其中在所述寡核苷酸5’-端的第一核苷酸具有以下结构：

或其盐。

27.根据权利要求24所述的寡核苷酸，其中在所述寡核苷酸5’-端的第一核苷酸具有以下结构：

或其盐。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的寡核苷酸，其中碱基是尿苷。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的寡核苷酸，其中R是甲氧基或氢。

30.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的3’-端含有至少一个

31.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的内部位置含有至少一个

32.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是单链寡核苷酸。

33.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是包含有义链和反义链的双链寡核苷酸。

34.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述寡核苷酸的反义链、有义链或两条链处含有至少一个

35.根据权利要求34所述的寡核苷酸，其中所述有义链长度为21个核苷酸，并且所述反义链长度为23个核苷酸，其中所述链形成21个连续碱基对的双链区域，在3’-端处具有2个核苷酸长的单链突出端。

36.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在所述反义链的5’-端含有至少一个并且在所述有义链的3’-端含有至少一个靶向配体。

37.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有一个或多个选自2’-脱氧、2’-O-甲氧基烷基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)和2’-ara-F的2’-O修饰。

38.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含不超过十个2’-氟修饰的核苷酸。

39.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含至少50％、至少60％或至少70％的2’-OMe修饰的核苷酸。

40.根据权利要求33所述的寡核苷酸，其中所述有义链或反义链在5’-端或在3’-端包含至少两个硫代磷酸酯连接。

41.一种药物组合物，其包含根据权利要求17所述的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。

42.一种用于减少或抑制受试者中靶基因表达的方法，其包括：

以足以抑制所述靶基因的表达的量向所述受试者施用根据权利要求17所述的寡核苷酸。

43.一种用于修饰寡核苷酸的方法，其包括：

在适合于使根据权利要求1所述的化合物与所述寡核苷酸反应的条件下使所述寡核苷酸与所述化合物接触，其中所述寡核苷酸包含游离羟基。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述游离羟基是5’-末端核苷酸的部分或3’-末端核苷酸的部分。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述寡核苷酸包含5’-OH基团或3’-OH基团。

46.一种用于制备修饰寡核苷酸的方法，其包括：

在适合于形成包含式(B)基团的修饰寡核苷酸或其盐的条件下：

其中Y是O或S；并且X是-OH、-SH或X’，

氧化包含式(A)基团的第一寡核苷酸：

或其盐，其中：

R^S是

X’是-OR¹³或-SR¹³，其中R¹³是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、ω-氨基烷基、ω-羟基烷基、ω-羟基烯基、烷基羰基或芳基羰基，其各自可任选地被一个或多个R^sub基团取代。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸为根据式(C)：

或其盐，其中：

*代表与随后任选地修饰的核苷酸间连接的键；

碱基是任选地修饰的核碱基；并且

R是H、OH、O-甲氧基烷基、O-甲基、O-烯丙基、CH₂-烯丙基、氟、O-N-甲基乙酰胺基(O-NMA)、O-二甲基氨基乙氧基乙基(O-DMAEOE)、O-氨基丙基(O-AP)或ara-F，并且

所述修饰寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸具有式(D)的结构：

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸的5’-端的第一核苷酸具有式(E)或(F)的结构：

或其盐，其中**代表与随后核苷酸的键。