CN116813622A

CN116813622A - 一种基于分子伴侣hsp90介导的靶向降解gpx4的嵌合体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116813622A
Application number: CN202310574629.6A
Authority: CN
Inventors: 覃江江; 董金云; 程向东; 李昊斌; 马富荣; 曹菲; 蔡茂华; 李玉龙; 管晓庆; 胡灿
Original assignee: Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Current assignee: Institute Of Basic Medicine And Oncology Chinese Academy Of Sciences Preparatory
Priority date: 2023-05-19
Filing date: 2023-05-19
Publication date: 2023-09-29

Abstract

本发明公开了一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明利用该技术制备了5个靶向降解GPX4的嵌合体。本发明涉及的分子伴侣HSP90介导蛋白靶向降解嵌合体能够有效诱导GPX4的降解，从而触发铁死亡。同时,对GPX4高表达的细胞株具有明显的抗增殖活性，对肿瘤靶向治疗具有重要的意义。

Description

一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体及其制备方法和应用。

背景技术

与凋亡、坏死、焦亡不同，铁死亡的特别之处在于铁依赖性脂质活性氧(ReactiveOxygen Species，ROS)自由基的积累为特征的程序性细胞死亡方式。大量研究发现，谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)可以作为判断细胞铁死亡的指标之一。GPX4催化活性中心为硒代半胱氨酸，以GSH作为辅因子，GPX4能够将细胞内的脂质氢过氧化物还原成为无毒性的脂醇类化合物，同时也能催化过氧化氢等其他有机过氧化物的还原，因而具有保护细胞免受氧化应激、抑制铁死亡发生的作用。因此，抑制GPX4的活性，会影响GPX4清除脂质过氧化物的能力，最终导致细胞铁死亡的发生。此外，抑制GPX4的功能会触发细胞持续性的铁死亡和阻止肿瘤复发，因此是解决耐药的策略之一。

目前对于GPX4靶向的小分子抑制剂仍然存在着一定的挑战性，且还没有进入临床研究阶段的GPX4抑制剂报道。主要原因在于：1)GPX4的分子表面缺少药物样结合口袋；2)目前报道的抑制剂均为共价型抑制剂，与GPX4的活性部位硒代半胱氨酸的结合发挥作用，但存在选择性低等问题。

利用蛋白降解技术诱导癌蛋白降解是最近研究较为广泛的主题之一。如利用蛋白靶向降解嵌合体(Proteolysis-Targeting Chimeras,PROTAC)技术，发明人曾已提交相关靶向降解GPX4的专利。与上一个专利不同，本专利首次公开利用分子伴侣介导靶向降解GPX4嵌合体的制备及其应用。分子伴侣介导靶向降解技术是一种新型的蛋白降解技术，具有克服耐药等多个优势。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种基于分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体及其制备方法和应用，本发明的嵌合体能够有效降解GPX4蛋白，从而诱导肿瘤细胞铁死亡。

为实现以上发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体，该分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体为通式(Ⅰ)所示的化合物或其药理或生理上可接受的盐，

通式(Ⅰ)中，Linker为连接基团，表示-亚烷基或-烷氧基或-哌嗪基或-1,2,3-三氮唑基，所述-亚烷基或-烷氧基或-哌嗪基或-1,2,3-三氮唑基选自以下基团中任一个或它们的任意组合，其中m和n表示1至20的自然数；

-(CH₂)_n-C(O)NH(CH₂CH₂O)_m-或-(CH₂CH₂O)_n-C(O)NH(CH₂CH₂O)_m-或

进一步地，本发明提供的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体，其为如下所示化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上或生理学可接受的盐或前药；

本发明所述药理或生理上可接受的盐是指，本发明所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体与药理或生理上可接受的酸或碱生成的盐。

本发明还提出一种药物组合物，该药物组合物包括所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药。

进一步地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或其组合。

进一步地，所述药物组合物为注射剂、口服剂、黏膜给药剂。

进一步地，所述的药物组合物进一步包括其它具有治疗或预防肿瘤效果的药物。

进一步地，本发明还提供所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体或包含该嵌合体的药物组合物的应用。具体如下：

所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4嵌合体或包含该嵌合体的药物组合物在制备降解GPX4药物中的应用。

所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4嵌合体或包含该嵌合体的的药物组合物在制备治疗GPX4相关性疾病药物中的应用。所述GPX4相关疾病为肿瘤、神经退行性疾病如阿尔茨海默病病，帕金森氏病，亨廷顿病。

所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4嵌合体或包含该嵌合体的药物组合物在抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠腺癌、肾嫌色细胞、肾透明细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、直肠腺癌、甲状腺癌以及子宫内膜癌。进一步地，所述肿瘤为GPX4高表达的肿瘤。

本发明还提出了通式所示的分子伴侣介导靶向降解GPX4嵌合体的合成路线，具体包括如下步骤：

通式所示的化合物通过酰胺缩合、脱保护、和亲核取代等反应类型将HSP90蛋白的配体和GPX4蛋白的配体连接起来。

与现有技术比，本发明有益效果主要体现在：

与PROTAC技术直接拉拽E3泛素连接酶不同，本发明基于分子伴侣HSP90介导靶蛋白泛素化，从而诱导目标蛋白被蛋白酶体降解。发明人通过Western blot实验证实本发明分子伴侣介导蛋白靶向降解嵌合体能有效降解GPX4，并能够有效杀死GPX4高表达细胞株。

附图说明

图1嵌合体GDPU-1～5的合成路线图；

图2Western Blot检测嵌合体对GPX4的降解活性。

具体实施方式

下面结合附图和实施实例对本发明做详细的说明，以下实施例中所使用的技术和科学术语具有于本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。基础原料试剂从商业途径获得，纯度均在97％及以上。本发明所述室温为25-30℃。本发明对试验中所用到的材料以及实验方法进行一般性和具体性的描述。虽然为实现本发明的目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能的描述。

实施例1：靶向降解GPX4嵌合体的合成与结构确认

终产物GDPU 1-5的合成路线，如图1所示：

化合物2的合成：将嘧啶-4,5,6-三胺(1,42.75mmol,5.35g)、二硫化碳(256.52mmol,19.59g)和NaHCO₃(128.26mmol,10.77g)混合，使用乙醇和水作为溶剂(H₂O：EtOH＝2:1)，反应体系在90℃加热回流的条件下反应3天后，旋干多余的二硫化碳，用乙酸调pH至大量固体析出，抽滤，将固体烘干，得到浅黄色固体6-氨基-9H-嘌呤-8-硫醇约6g左右，产率83.94％，产物无需进一步纯化可用于下一步反应。

化合物3的合成：将6-氨基-9H-嘌呤-8-硫醇(1当量,1g)、5-碘苯并[d][1,3]二唑(3当量,4.45g)、叔丁醇钠(2当量,1.15g)、碘化亚铜(0.1当量,110mg)和Neocuproine(0.1当量,140mg)溶于DMF，110℃加热反应12小时，减压除DMF，柱层析法纯化，展开剂二氯甲烷：甲醇＝15:1,得到目标产物8-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-硫基)-9H-嘌呤-6-胺为黄褐色固体，产率75％。

化合物4的合成：0℃下，将1.3g反应物8-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-硫基)-9H-嘌呤-6-胺溶于乙腈，加入三氟乙酸(5当量,2.6g)，将6.1g N-碘代琥珀酰亚胺(6当量)溶于乙腈，缓慢滴加至反应体系中，反应过夜。反应完毕后，减压除乙腈，通过柱层析法进行纯化，用二氯甲烷：甲醇＝15:1进行洗脱，得到目标产物8-((6-碘代苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)硫代)-9H-嘌呤-6-胺为棕褐色固体，产率74.88％。

化合物7的合成：将1倍当量的8-((6-碘代苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)硫代)-9H-嘌呤-6-胺和2.5倍当量不同的Boc甲基苯磺酸酯溶于DMF溶液，加入2倍当量的碳酸铯，于80℃下反应12小时。使用TLC检测反应完毕后，向反应体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，展开剂二氯甲烷：甲醇＝15：1，得到对应产物6。将上述产物溶于二氯甲烷，加入适量三氟乙酸，室温下反应2小时后，减压除溶剂，得到的产物无需进一步纯化即可用于下一步反应。

化合物10的合成：上述产物7与羧酸氨基Boc按1:1比例溶于DMF，加入1.5倍当量HATU和3倍当量DIPEA，室温反应过夜。TLC监测反应完毕后，用水、乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠进行干燥后过滤，浓缩得到粗产物，通过柱层析法进行纯化，得到目标产物9溶于二氯甲烷，加入适量三氟乙酸，室温继续反应两小时，减压浓缩，产物无需进一步纯化即可用于下一步反应。

化合物11的合成：上述产物与叠氮乙酸按1:1比例溶于DMF，加入1.5倍当量HATU和3倍当量DIPEA，室温反应过夜。TLC监测反应完毕后，用水、乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠进行干燥后过滤，浓缩得到粗产物，通过柱层析法进行纯化，使用二氯甲烷：甲醇＝15:1作为展开剂，合并浓缩后得到目标产物叠氮修饰化合物。

化合物14的合成：将丙炔基取代的苯胺(13,4.96g,27.44mmol)和2-噻吩甲醛(3.08g,27.44mmol)溶解在甲醇(25mL)中，25℃活化1h后，加入(2-异氰乙基)苯(3g,22.87mmol)、氯乙酸(2.16g，22.87mmol)，室温搅拌过夜。反应液减压浓缩至干，取浓缩物通过硅胶柱层析纯化(体积比1:1的乙酸乙酯:石油醚)，25℃干燥，得到中间体4(白色固体,2g,产率为20％)。

化合物15的合成：冰浴条件下，将叠氮修饰化合物和炔化合物按1:1.1比列溶于DMF，另将抗坏血酸钠和硫酸铜分别以2.5和0.5倍当量溶于水中，将两种体系混合后在氮气保护下反应过夜。反应完毕后加水处理有大量固体析出，抽滤后将所得固体通过柱层析法进行纯化，展开剂二氯甲烷：甲醇＝15:1，浓缩后即得最终产物。

终产物的核磁数据表征：

N-(4-((1-(2-(2-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)硫)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)-3-氯苯基)-2-氯-N-(2-氧代-2(苯乙基氨基)-1-(硫苯-2)乙基)乙酰胺(GDPU-1)：淡黄色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.52(q,J＝6.0Hz,1H),8.38(t,J＝5.7Hz,1H),8.23(d,J＝39.1Hz,1H),8.15(s,1H),7.48(s,1H),7.40(h,J＝8.6,5.4Hz,2H),7.25(dd,J＝7.8,6.4Hz,3H),7.20–7.15(m,3H),6.94(s,1H),6.85(dd,J＝5.1,3.5Hz,1H),6.82(dd,J＝3.6,1.3Hz,1H),6.24(s,1H),6.07(s,1H),5.76(s,1H),5.19(s,2H),5.05(d,J＝15.0Hz,2H),4.32(dt,J＝29.6,5.5Hz,2H),4.10–3.92(m,2H),3.56(dq,J＝53.5,5.9,5.1Hz,2H),3.46–3.37(m,1H),3.31–3.21(m,1H),2.81–2.63(m,2H)。

N-(2-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)硫)-9H-嘌呤-9-基)乙基)-3-(2-(4-((2-氯-4-(2-氧代-2-(苯乙基氨基)-1-(噻吩-2-基)乙基)乙酰胺)苯氧基)-1H-1,2,3-三唑-1基)乙酰胺)丙酰胺(GDPU-2)：浅褐色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.37(t,J＝5.7Hz,2H),8.18(d,J＝5.0Hz,1H),8.08(q,J＝8.3,7.2Hz,1H),7.45(s,1H),7.40(d,J＝5.0Hz,2H),7.24(t,J＝7.2Hz,3H),7.20–7.12(m,3H),6.90(s,1H),6.85(dd,J＝5.1,3.5Hz,1H),6.81(d,J＝3.5Hz,1H),6.23(s,1H),6.05(s,1H),5.18(s,2H),5.10(d,J＝13.9Hz,2H),4.39–4.17(m,2H),4.09–3.91(m,2H),3.45(d,J＝6.3Hz,2H),3.36(s,1H),3.26(q,J＝6.8Hz,3H),3.17(d,J＝5.0Hz,1H),2.70(dt,J＝12.3,5.8Hz,2H),2.20(t,J＝7.1Hz,2H)。

N-(2-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)硫)-9H-嘌呤-9-基)乙基)-6-(2-(4-((2-氯-4-(2-氧代-2-(苯乙基氨基)-1-(噻吩-2-基)乙基)乙酰胺)苯氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酰胺)六酰胺(GDPU-3)：淡黄色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.36(dt,J＝19.1,5.5Hz,2H),8.18(d,J＝15.6Hz,2H),7.94(q,J＝7.0,6.4Hz,1H),7.41(dd,J＝21.9,16.3Hz,3H),7.25(t,J＝7.3Hz,3H),7.21–7.05(m,4H),6.94–6.77(m,3H),6.25(s,1H),6.05(d,J＝6.6Hz,2H),5.19(s,2H),5.12(s,2H),4.28(dt,J＝21.9,5.5Hz,2H),4.13–3.90(m,3H),3.60–3.33(m,6H),3.07(q,J＝6.7Hz,2H),2.73(dq,J＝13.3,7.2Hz,2H),2.05–1.92(m,3H),1.40(dt,J＝15.5,7.4Hz,4H)。

N-(4-((1-(2-((5-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)硫)-9H-嘌呤-9-基)戊基)氨基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)-3-氯苯基)-2-氯-N-(2-氧代-2(苯乙基氨基)-1-(硫酚-2)乙基)乙酰胺(GDPU-4)：黄白色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.37(dt,J＝15.3,5.6Hz,2H),8.18(d,J＝10.5Hz,2H),7.50(s,1H),7.41(d,J＝4.7Hz,3H),7.25(t,J＝7.3Hz,3H),7.17(t,J＝8.5Hz,3H),6.89–6.80(m,3H),6.24(s,1H),6.06(s,2H),5.19(s,2H),5.11(s,2H),4.23–3.91(m,4H),3.45–3.38(m,1H),3.27(dq,J＝13.2,6.6Hz,1H),3.07(dq,J＝12.8,6.2Hz,2H),2.71(dt,J＝12.4,5.9Hz,2H),1.68(p,J＝7.4Hz,2H),1.44(t,J＝7.4Hz,2H),1.26(dt,J＝11.4,5.8Hz,2H).

N-(4-(1-(2-(2-(2-(2-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1,3]二氧醇-5-基)硫代)-9H-嘌呤-9-基)乙氧基)乙氧基)乙基)乙基)-2-氧乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)-3-氯苯基)-2-氯-N-(2-氧代-2-(苯乙氨基)-1-(噻吩-2-基)乙基)乙酰胺(GDPU-5)：黄白色固体；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.41(dt,J＝17.5,5.6Hz,2H),8.19(s,1H),7.47(s,1H),7.41(d,J＝5.1Hz,2H),7.21(dt,J＝30.8,7.5Hz,7H),6.88–6.83(m,2H),6.82(d,J＝3.6Hz,1H),6.24(s,1H),6.05(d,J＝5.7Hz,2H),5.19(s,2H),5.14(d,J＝5.6Hz,2H),4.38(t,J＝5.5Hz,2H),4.08–3.95(m,2H),3.86–3.72(m,2H),3.55–3.41(m,6H),3.24(tq,J＝13.7,8.3,7.6Hz,4H),2.71(q,J＝6.6Hz,2H)。

实施例2：验证合成的嵌合体对细胞内的GPX4的降解效应

免疫印迹：将HT1080细胞(3×10⁵个细胞)接种到添加有2mL含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素链霉素的1640培养基的6孔培养板(Titan)中，37℃培养24h。细胞生长至70％融合后，弃去原有培养基后，每孔换入2mL含有一系列浓度(0.1μM、0.3μM、1μM和3μM)待测化合物分子的含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素链霉素的DMEM培养基，37℃孵育24h后，弃培养液，将细胞用PBS洗涤两次，弃去洗涤液，培养孔中加入100μL含有1％苯甲基磺酰氟(PMSF)和10％磷酸酶抑制剂的RIPA，冰上裂解10min后，用刮刀将细胞刮取下来并置于1.5mL EP管中。在EP管中加入20μL 5×SDS上样缓冲液，99℃加热10min。样品通过15％SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。膜在室温下用5％脱脂牛奶(在TBST缓冲液中)封闭1.5h后，将膜从30kD左右剪开，<30kD膜部分与兔抗anti-GPX4(1:1000稀释)孵育4℃过夜，然后加入HRP偶联的山羊抗兔IgG(1:2000稀释)，室温孵育2小时；>30kD的PVDF膜与HRP偶联小鼠anti-GAPDH(1:100000稀释)孵育4℃过夜，然后加入HRP偶联的鼠抗IgG(1:1000稀释)室温孵育2小时。并使用Invitrogen iBright 1500记录印迹。

实验结果如图2所，WB结果显示：嵌合体GDPU-4能够明显降解GPX4。

实施例3：验证嵌合体对GPX4高表达肿瘤细胞株的杀伤效应

抗细胞增殖活性测定：采用CCK8法评估所有目标化合物在HT1080细胞(DMEM培养基)和MGC803细胞(1640培养基)的细胞毒性和IC₅₀。将细胞以5×10³个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板中24小时。然后，用不同浓度的化合物处理细胞48h。随后，在每孔中加入10μLCCK8溶液，培养1.5h后，使用酶标仪(TECAN)检测450nm处的吸光度。吸光度值转化为抑制率后，用Graphpad Prism5计算IC₅₀值。结果如表1所示：

表1.嵌合体抗细胞增殖活性评价

从表中可以看出：嵌合体GDPU-1、GDPU-4和GDPU-5具有明显的抗细胞增殖活性。

Claims

1.一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体，其特征在于，该分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体为通式(Ⅰ)所示的化合物或其药理或生理上可接受的盐，

-(CH₂)_n-C(O)NH(CH₂CH₂O)_m-或-(CH₂CH₂O)_n-C(O)NH(CH₂CH₂O)_m-或

2.根据权利要求1所述的一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体，其特征在于，所述靶向降解GPX4的嵌合体为如下化合物GDPU-1～GDPU-5中任一种：

3.一种权利要求2所述的一种基于分子伴侣HSP90介导的靶向降解GPX4的嵌合体的制备方法，其特征在于该嵌合体或其药理或生理上可接受的盐采用以下合成路线制备：

4.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1-2任一项所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体或其药理或生理上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或其组合。

5.一种权利要求1-2任一项所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体或其药理或生理上可接受的盐或权利要求4所述的药物组合物在制备GPX4降解剂或抑制GPX4药物中的应用。

6.一种权利要求1-2任一项所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体或其药理或生理上可接受的盐或权利要求4所述的药物组合物在制备治疗GPX4相关性疾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述GPX4相关疾病为肿瘤、神经退行性疾病。

8.一种权利要求1-2任一项所述的分子伴侣介导靶向降解GPX4的嵌合体或其药理或生理上可接受的盐或权利要求4所述的药物组合物在抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠腺癌、肾嫌色细胞、肾透明细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、直肠腺癌、甲状腺癌以及子宫内膜癌。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为GPX4高表达的肿瘤。