CN116813515B - 一种姜黄素衍生物前药、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种姜黄素衍生物前药、其制备方法和应用，该姜黄素衍生物前药是姜黄素衍生物通过2,2’‑硫代二乙酸、2,2’‑硫代二丙酸、3,3’‑二硫代二乙酸或2,2’‑二硫代二丙酸与油醇相连得到的单硫键或二硫键位于相邻羰基α位和β位的化合物，其可采用纳米粒沉淀法得到的非PEG化的姜黄素衍生物前药自组装纳米粒或PEG修饰的姜黄素衍生物前药自组装纳米粒。该姜黄素衍生物前药可用于乳腺癌或者肝癌的治疗，所得自组装纳米粒载药量高、稳定性好、毒副作用低和肿瘤部位特异性快速释药，延长体循环时间，增加生物利用度，提高治疗效果。

Description

一种姜黄素衍生物前药、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物制备领域，具体涉及一种单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药合成及其自组装纳米粒的制备及在制备抗肿瘤药物的应用。

背景技术

姜黄素是从姜黄的块茎中提取得到的一种具有二酮结构的多酚类化合物，对白血病细胞等具有显著的体外抗肿瘤活性，对于实体瘤，如结肠癌、肺癌、肝癌和乳腺癌等肿瘤细胞也表现出显著的抗增殖活性，具有广泛的抗瘤谱。目前姜黄素也已进行了大量的临床研究，在许多癌症的治疗上展示一定效果。姜黄素除了具有较强的抗肿瘤活性外，其安全性比较高，临床试验发现姜黄素即使在高达8g/天的剂量也未见明显的毒副作用。然而，由于姜黄素体内快速消除，口服生物利用度差限制了姜黄素的应用。基于姜黄素在体内的主要代谢途径是苯环上的酚羟基与葡萄糖醛酸结合，因此延缓姜黄素代谢和不降低其活性，酚羟基位引入甲氧基能增强化合物的活性，据此发明人设计并合成新的姜黄素衍生物C210(化学结构详见专利CN104030904A公开的4号化合物)，研究表明C210具有比姜黄素更强的抑制热休克90蛋白的分子伴侣功能以及更强的体外抗肿瘤活性，但该化合物的药代动力学特性相比姜黄素并无明显改善，成为其开发应用的瓶颈。

前药是一类在体外活性较低或无活性，但在体内能够代谢或释放出活性成分的药物，通过化学修饰的改良能够达到在特定的组织释放药物，从而提高药物的选择性作用。小分子前药还具有分子质量小、载药量高、可自组装形成纳米粒优点，因此小分子前药纳米粒得到了越来越多研究者的青睐。一些基于脂肪酸和脂肪醇修饰的前药可延长药物的体循环滞留时间，例如棕榈酸帕利哌酮是目前上市的一种脂质修饰的前药，一次注射可显著延长体内有效浓度的持续时间，这表明脂质修饰药物可能是改善药代动力学行为的有效策略。肿瘤组织具有比正常组织更高的氧化还原水平，肿瘤细胞胞质内谷胱甘肽含量是正常细胞的10倍以上，肿瘤细胞中活性氧(ROS)浓度要比正常细胞高100倍左右，因此基于肿瘤细胞氧化还原响应释放已被广泛应用。

发明内容

针对现有姜黄素类化合物药代动力学特性不佳的开发瓶颈，本发明提供一种姜黄素衍生物C210前药与其自组装纳米粒及其制备方法和应用，以改善C210药代动力学特性、提高其选择性抗肿瘤作用。该C210前药是使用不同链长的单硫键或者二硫键连接姜黄素衍生物C210与油酸，因为含有氧化还原响应的单硫键或者二硫键，使前药可以在高氧化还原水平的肿瘤细胞内特异释放C210，起到提高药物在肿瘤组织的特异分布和释放的作用，增强其选择性抗肿瘤作用。油酸修饰，可使该前药具有自组装形成纳米粒的能力，从而延长药物在体循环中的平均滞留时间时间，改善其药代动力学特性。所得纳米粒具有稳定性高、药动学特性好、肿瘤细胞内特异释放C210、肿瘤组织分布高、体内抗肿瘤活性强等特点。

具体来说，本申请使用不同的氧化还原型中间体连接不饱和脂肪酸油酸和姜黄素衍生物C210制备前药纳米药物递送系统，以改善姜黄素衍生物C210的成药性，从而提高其体内疗效的目的。共设计合成了4种前药。这些前药根据含有中心元素键(单硫S、二硫SS)和酯键(α为乙酯，β为丙酯)的键桥命名，并据此缩写为α-C210-S-OA、α-C210-SS-OA、β-C210-S-OA、β-C210-SS-OA。该类前药的自组装纳米粒能显著提升C210的体循环时间和生物利用度，并且基于肿瘤细胞及肿瘤微环境中具有高氧化还原水平的背景，设计的含硫键桥能够增强药物的靶向释放能力，使该前药纳米粒在肿瘤细胞或肿瘤组织特异分布，并基于肿瘤的高氧化还原触发C210的智能释放，提高药物在肿瘤组织的分布和释放，增强选择性抗肿瘤活性，提高药物体内抗肿瘤作用。

为实现上述目的，本发明提供一种单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药具有如下结构通式，此处以及下文中涉及到“单硫键/二硫键连接”的内容，其中“/”代表“或者”。

其中n为1-2的整数，R为单硫键或二硫键。

其中姜黄素衍生物C210记载在CN104030904A中，本申请中有的简写为C210，或者C210前药，结构式为：

其中具有单硫键和双乙酯结构的姜黄素衍生物C210前药结构为：

具有二硫键和双乙酯结构的姜黄素衍生物C210前药结构为：

具有单硫键和双丙酯结构的姜黄素衍生物C210前药结构为：

具有双硫键和双丙酯结构的姜黄素衍生物C210前药结构为：

本发明提供所含含有单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别称取2,2'-硫代二乙酸、2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-硫代二丙酸或者3,3'-二硫代二丙酸与油醇,DMAP,EDCI于100ml圆底烧瓶中，加入反应溶剂二氯甲烷30ml，氮气保护下室温反应24h，薄层色谱法检查反应进度。减压旋蒸除去溶剂，浓缩物通过硅胶柱色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝20:1)分离纯化，并在真空下干燥，得到白色油状物中间体α-S-OA、α-SS-OA、β-S-OA、β-SS-OA。

(2)分别称取步骤(1)所得α-S-OA、α-SS-OA、β-S-OA、β-SS-OA与姜黄素衍生物C210，DMAP，EDCI于100ml圆底烧瓶，加入反应溶剂二氯甲烷10ml，氮气保护下室温反应24h，薄层色谱法检查反应进度。反应液浓缩后加入饱和食盐水和乙酸乙酯萃取三次，用无水硫酸镁干燥后，过滤、浓缩。浓缩物通过硅胶柱色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝5:1-3:1)纯化，并在真空下干燥。得到目的产物α-C210-S-OA、α-C210-SS-OA、β-C210-S-OA、β-C210-SS-OA。

本发明还提供所述单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药的自组装纳米粒，包含PEG修饰的前药自组装纳米粒，制备方法为纳米沉淀法。

所述的单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药的自组装纳米粒的制备方法如下：将各前药和DSPE-PEG2000完全溶解于丙酮中。然后在磁力搅拌下将混合溶液逐滴加入适量生理盐水中，减压蒸发法去除丙酮，得到不含有机溶剂的纳米粒溶液。其中，非PEG化的C210前药纳米粒的制备方法中不加入DSPE-PEG2000。

本发明还提供所述单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药的自组装纳米粒在制备药物传递系统中的应用。

本发明还提供所述单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药的自组装纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供所述单硫键/二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物C210前药的自组装纳米粒在制备注射给药、口服给药或局部给药系统种的应用。

本发明所解决的技术问题是将不同链长的单硫键/二硫键引入油醇-姜黄素衍生物C210前药，设计不同单硫键/二硫键桥连的氧化还原双敏感型C210前药，并将该C210前药用于自组装纳米粒的构建，从而实现载药量高、稳定性好、毒副作用低和肿瘤部位特异性快速释药，延长体循环时间，增加生物利用度，提高治疗效果。同时，考察不同长度的单硫键/二硫键连接链在C210前药自组装方面的差异，以及对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响。

本发明的优势在于：

(1)设计合成了含有不同长度单硫键/二硫键连接链的C210前药，合成方法简单易行。

(2)制备了粒径均匀的C210前药自组装纳米粒，制备方法简单易行，实现药物的高效包载，可达约50％的超高载药量。

(3)考察了不同长度单硫键/二硫键连接链在自组装方面的差异，以及对前药自组装纳米粒的稳定性、药物释放、细胞毒性、药动学、组织分布以及药效学产生的影响。综合实验结果，含有单硫键和双乙酯结构的前药具有合适的粒径尺寸和化学稳定性，同时，其具有最好的体外氧化还原响应性释放C2120的能力，显著提高C210的生物利用度提高和体内抗肿瘤效果。本发明为开发肿瘤微环境智能响应型药物递送系统提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效选择性抗肿瘤药的迫切需求。

附图说明

图1C210前药的纯度确证；

图2C210前药自组装纳米粒的电镜表征；

图3C210前药自组装纳米粒的稳定性结果；

A：C210前药纳米粒在含10％FBS的PBS溶液中48h内稳定性；

B：C210前药纳米粒在4℃避光环境中放置3个月内的稳定性；

图4C210前药自组装纳米粒在模拟肿瘤高氧化还原条件下的体外释放试验；

A：C210前药纳米粒在含0mM H₂O₂的PBS(pH＝7.4)介质中释放；

B：C210前药纳米粒在含1mM H₂O₂的PBS(pH＝7.4)介质中释放；

C：C210前药纳米粒在含10mM H₂O₂的PBS(pH＝7.4)介质中释放；

D：C210前药纳米粒在含0mM DTT的PBS(pH＝7.4)介质中释放；

E：C210前药纳米粒在含1mM DTT的PBS(pH＝7.4)介质中释放；

F：C210前药纳米粒在含10mM DTT的PBS(pH＝7.4)介质中释放；

图5C210前药自组装纳米粒经静脉给药在大鼠的血浆C-T曲线；

图6C210前药自组装纳米粒在肿瘤组织的分布情况；

A：C210前药在肿瘤组织中1h、2h、4h、12h的分布及其释放的C210的情况；

B：0-12h内C210前药纳米粒释放的C210的肿瘤蓄积量；

图7C210前药自组装纳米粒在体抗肿瘤实验结果；

A：在C210前药纳米粒治疗后，Balb/C荷瘤小鼠的瘤体积生长曲线；

B：在C210前药纳米粒治疗后，Balb/C荷瘤小鼠的肿瘤照片；

C：在C210前药纳米粒治疗后，Balb/C荷瘤小鼠的瘤重；

D：在C210前药纳米粒治疗后，Balb/C荷瘤小鼠的体重变化。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1：含单硫键和双乙酯结构的C210前药(α-C210-S-OA)的合成

将油醇(268mg，1mmol)、2,2'-硫代二乙酸(150mg，1mmol)、EDCI(191mg，1mmol)和DMAP(24mg,0.2mmol)加入10ml二氯甲烷溶液中。在室温下在氮气保护下搅拌反应混合物。采用薄层色谱法检测目标产物的形成；反应结束后，蒸发二氯甲烷，加入饱和盐水。用二氯甲烷萃取水层产物，用NaCl饱和溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥。浓缩物经硅胶柱层析分离，得到中间产物(E)-2-[(2-(十八碳-9-烯-1-氧基)-2-氧基乙基)硫代)乙酸](α-S-OA)，产率为23％。

将C210(592mg，1mmol)、α-S-OA(400mg，1mmol)、EDCI(191mg，1mmol)和DMAP(24mg，0.2mmol)溶于10ml二氯甲烷水溶液中。然后在室温下在氮气保护下将反应混合物搅拌过夜。采用薄层色谱法检测目标产物的形成情况。

反应结束后，用二氯甲烷萃取反应溶液，用NaCl饱和溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。浓缩物经硅胶柱层析分离，得到目标产物[(2-{[(10E)-十八-9-烯基]氧基}-2-氧亚基乙基)硫基]乙酸-2-甲氧基-4-[(4E)-3-氧亚基-2-[(2E)-1-氧亚基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯基]-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)戊-4-烯基]苯基酯(α-C210-S-OA)，产率为78％。

采用高分辨质谱，核磁共振氢谱和核磁共振碳谱对其进行结构确证，谱图解析结果如下：检测到了[M-H]^-峰973.4774,证明α-C210-S-OA被成功合成,分子式为C₅₅H₇₄O₁₃S。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.69(d,J＝15.3Hz,2H),6.93–6.86(m,2H),6.83(d,J＝15.3Hz,2H),6.67(s,3H),5.35(dqd,J＝7.9,4.6,4.0,2.1Hz,2H),4.13(t,J＝6.9Hz,2H),3.98(s,2H),3.93–3.82(m,19H),3.77(s,3H),3.62(d,J＝5.6Hz,2H),3.48(s,2H),2.06–1.97(m,4H),1.64(t,J＝7.3Hz,2H),1.58(s,2H),1.35–1.22(m,24H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ183.56,169.82,168.05,153.44,151.27,140.40,140.20,138.17,130.72,130.01,129.76,122.79,119.92,111.82,108.68,105.92,105.40,,65.75,61.00,56.24,56.19,55.90,33.39,33.23,31.91,31.78,29.77,29.72,29.53,29.40,29.32,29.20,28.53,27.22,27.18,25.81,22.69,14.13。

实施例2：含二硫键和双乙酯结构的C210前药(α-C210-SS-OA)的合成

采用实施例1的制备方法，将2,2'-硫代二乙酸换成2,2'-二硫代二乙酸，制备得到[(2-{[(10E)-十八-9-烯基]氧基}-2-氧亚基乙基)二硫基]乙酸-2-甲氧基-4-[(4E)-3-氧亚基-2-[(2E)-1-氧亚基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯基]-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)戊-4-烯基]苯基酯(α-C210-SS-OA)。

采用高分辨质谱，核磁共振氢谱和核磁共振碳谱对其进行结构确证，谱图解析结果如下：检测到了[M-H]^-峰1005.4497，证明α-C210-SS-OA被成功合成，分子式为C₅₅H₇₄O₁₃S₂。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.69(d,J＝15.3Hz,2H),6.93–6.80(m,4H),6.67(s,3H),5.39–5.30(m,2H),4.13(dd,J＝7.3,6.2Hz,2H),3.98(s,2H),3.91–3.76(m,23H),3.62(s,2H),2.06–1.92(m,4H),1.68–1.60(m,3H),1.36–1.23(m,24H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H)。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ183.56,169.38,167.68,153.44,151.33,142.26,140.45,140.19,138.18,130.72,130.00,129.77,122.82,119.93,119.89,111.85,108.69,105.40,65.90,61.02,61.00,56.19,55.90,55.86,41.44,41.03,31.91,29.77,29.73,29.53,29.41,29.33,29.21,29.18,28.51,27.22,27.19,25.81,22.69,14.13。

实施例3：含单硫键和双丙酯结构的C210前药(β-C210-S-OA)的合成

采用实施例1的制备方法，将2,2'-硫代二乙酸换成3,3'-硫代二丙酸，制备得到3-[(3-{[(10E)-十九-10-烯基]氧基}-3-氧亚基丙基)硫基]丙酸-2-甲氧基-4-[(4E)-3-氧亚基-2-[(2E)-1-氧亚基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯基]-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)戊-4-烯基]苯基酯(β-C210-S-OA)。

采用高分辨质谱，核磁共振氢谱和核磁共振碳谱对其进行结构确证，谱图解析结果如下：检测到了[M-H]^-峰1001.5082，证明β-C210-S-OA被成功合成，分子式为C₅₇H₇₈O₁₃S。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.62(d,J＝15.3Hz,2H),6.85–6.73(m,3H),6.60(s,3H),5.33–5.21(m,3H),4.01(t,J＝6.8Hz,2H),3.90(s,2H),3.85–3.77(m,18H),3.70(d,J＝7.1Hz,3H),2.87–2.74(m,6H),2.59–2.52(m,2H),1.94(t,J＝6.3Hz,3H),1.59–1.46(m,4H),1.22–1.18(m,24H),0.81(d,J＝1.8Hz,3H)。¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ182.53,170.86,169.05,168.95,152.44,152.41,150.34,141.19,139.15,139.13,137.20,129.71,128.96,128.75,121.92,118.94,118.85,110.75,107.71,104.89,104.37,63.94,59.99,59.97,55.21,55.16,54.87,33.78,33.60,30.90,30.88,30.75,30.41,29.16,28.74,28.71,28.68,28.63,28.50,28.39,28.34,28.30,28.25,28.19,27.56,26.19,26.16,26.06,25.96,24.86,21.66,13.10。

实施例4：含二硫键和双丙酯结构的C210前药(β-C210-SS-OA)的合成

采用实施例1的制备方法，将2,2'-硫代二乙酸换成3,3'-二硫代二丙酸，制备得到3-[(3-{[(10E)-十八-9-烯基]氧基}-3-氧亚基丙基)二硫基]丙酸-2-甲氧基-4-[(4E)-3-氧亚基-2-[(2E)-1-氧亚基-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯基]-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)戊-4-烯基]苯基酯(β-C210-SS-OA)。

采用高分辨质谱，核磁共振氢谱和核磁共振碳谱对其进行结构确证，谱图解析结果如下：检测到了[M-H]^-峰1035.4805,证明β-C210-SS-OA被成功合成，分子式为C₅₇H₇₈O₁₃S₂。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.69(d,J＝15.3Hz,2H),6.92–6.78(m,4H),6.67(s,3H),5.40–5.30(m,2H),4.08(t,J＝6.8Hz,2H),3.97(s,1H),3.93–3.84(m,18H),3.76(s,3H),3.06–2.99(m,4H),2.95(t,J＝7.2Hz,2H),2.74(t,J＝7.2Hz,2H),2.17(d,J＝3.1Hz,2H),2.01(q,J＝6.7Hz,3H),1.63(h,J＝6.9Hz,4H),1.30–1.23(m,24H),0.88(d,J＝1.9Hz,3H)。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ183.56,171.73,169.93,153.47,153.43,151.36,142.23,140.18,138.21,130.89,130.73,129.99,129.78,122.91,119.96,119.87,111.78,108.73,105.92,105.39,68.15,65.03,64.62,61.02,61.00,56.23,56.19,55.90,38.72,34.14,33.89,33.23,33.02,31.91,31.44,30.94,30.19,29.77,29.73,29.70,29.66,29.52,29.41,29.36,29.32,29.27,29.21,28.92,28.57,27.22,27.19,25.89,23.74,22.99,22.69,14.13。

实施例5:C210前药的纯度确证

利用高效液相色谱对C210前药的纯度进行了测定，结果如图1所示，4种前药的纯度都在98％以上，满足后续实验要求。

实施例6：C210前药自组装纳米粒的制备和稳定性考察

称量4mg前药(分别为实施例1-4合成的α-C210-S-OA、α-C210-SS-OA、β-C210-S-OA或β-C210-SS-OA)和0.8mg DSPE-PEG2000完全溶解于1ml丙酮中。然后在磁力搅拌下将混合溶液逐滴加入4ml生理盐水中，减压蒸发去除丙酮。将纳米粒与含10％胎牛血清的PBS混合后，置于37℃震荡培养箱中，分别于第0、2、4、6、8、12、24、48h取样，稀释后测定纳米粒的粒径，以粒径及PDI作为评价稳定性的指标考察纳米粒短期稳定性。

将纳米粒放置于4℃，避光环境中，分别于1、3、5、7、14、28、60、90天取样，稀释后测定纳米粒的粒径，以粒径及PDI作为评价稳定性的指标考察长期稳定性。结果如表1，图2所示，DSPE PEG2K修饰的前药纳米粒呈球形，粒径都在120nm左右，粒径分布均匀，表面电荷都在36mV左右，证明纳米粒状态稳定，不易聚集，并且各前药纳米粒的载药量均在50％左右，有效减少辅料的使用及其带来潜在风险。然后考察了前药纳米粒的稳定，如图3所示，前药纳米粒在含10％胎牛血清的PBS(pH＝7.4)中，在37℃环境下48h内粒径基本无任何变化，稳定性良好。将制备好的纳米粒置于4℃避光环境下保存3个月仍未见粒径发生改变，说明其稳定性十分良好，具备长期保存的潜力。

表1C210前药自组装纳米粒的粒径、粒径分布、表面电荷、包封率和载药量

实施例7：C210前药自组装纳米粒的体外模拟肿瘤高氧化还原响应性释放实验

含有5％ SDS的PBS(pH 7.4)用作释放介质来研究C210从前药纳米粒中的释放曲线。分别将1ml C210前药纳米粒加入30ml含有0、1、10mM H₂O₂或DTT的不同释放介质中于37℃孵育。在预定的时间点0、2、4、6、8、12、24h，取出100μl溶液并补充等量释放介质。释放的C210量采用高效液相色谱法测定。氧化释放结果如图4A-C所示，将每个前药纳米粒在37℃的PBS(pH 7.4)溶液中孵育24h时，只有少量的C210(小于10％w/w)被释放，而在含有1mMH₂O₂或10mM H₂O₂的PBS中孵育时，前药纳米粒能够迅速释放C210，释放速率依次为α-C210-S-OA＞α-C210-SS-OA＞β-C210-S-OA＞β-C210-SS-OA。还原释放结果如图4D-F所示，在含有1mM/10mM DTT的PBS中孵育，含有二硫键的前药表现出更敏感的还原反应，响应速率分别为α-C210-SS-OA＞β-C210-SS-OA＞β-C210-S-OA＞α-C210-S-OA，其中α-C210-SS-OA在约2h内基本被完全还原。相比之下，在非还原条件下，纳米粒在24小时内转化缓慢。该结果说明无论是单硫键还是二硫键，其均具有氧化还原双重响应性，其中单硫键对氧化环境更加敏感，二硫键对还原环境更敏感，长链前药释放速率慢于短链前药。

实施例8：C210前药自组装纳米粒对肿瘤细胞的选择性细胞毒性

用MTT法测定以确定用C210和前药纳米粒处理的MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、4T1细胞、MCF-10A细胞(正常乳腺上皮细胞)和HepG2细胞的细胞活力。使用96孔板接种癌细胞，每孔3000个细胞，培养12h，直至细胞完全贴壁。然后，将培养基更换为具有C210的培养基或C210浓度范围为0至200μmol/l的前药纳米粒。然后将细胞培养48h或72h。之后每孔加入15μl MTT溶液，细胞在37℃继续培养4h。除去培养基后，用200μl DMSO溶解甲臜晶体。然后用酶标仪在570nm波长处测量板的吸光度。

结果如表2所示，4种前药纳米粒对于乳腺癌细胞和肝癌的细胞毒性具有较为显著的差异，α-C210-S-OANPs和α-C210-SS-OANPs具有较强的抗肿瘤活性，β-C210-S-OA NPs和β-C210-SS-OA NPs的抗肿瘤活性则稍弱一些。从C210和各前药纳米粒对乳腺癌和肝癌的细胞毒性结果发现虽然C210前药纳米粒比游离C210表现出较低的细胞毒性，但从表3可见，各前药纳米粒对正常乳腺细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7具有显著选择性，其相对治疗指数高于原药物。

表2C210和各前药纳米粒对肿瘤细胞的IC₅₀值

表3C210和各前药纳米粒对肿瘤细胞和正常细胞的IC₅₀值(相对治疗指数＝正常细胞IC₅₀/肿瘤细胞IC₅₀)

实施例9：C210前药自组装纳米粒的药代动力学及肿瘤组织特异分布研究

用SD大鼠进行药代动力学研究。实验前大鼠禁食12小时，饮水自由。将18只大鼠分为6组，分别以20μmol/kg C210等量静脉注射游离C210或C210前药纳米粒。在预定时间点(0.08、0.15、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12h)采集血样，离心获得血浆。LC-MS法测定C210及相应前药的浓度。使用药物与统计2.0(DAS)软件分析药代动力学参数。通过测定4T1荷瘤BALB/c小鼠主要器官中C210和前药纳米粒的浓度，研究C210和前药纳米粒的生物分布。将60只小鼠随机分为5组，静脉注射游离C210或C210前药纳米粒，C210等量剂量为20μmol/kg。静脉给药1、2、4、12h后处死小鼠，取肿瘤组织，LC-MS测定肿瘤内C210的蓄积量。

结果如图5和表4所示，游离C210会迅速从血液中消除。与游离C210相比，前药纳米粒释放的C210在血液循环中的平均滞留时间(MRT)显著延长，α-C210-S-OA NPs、α-C210-SS-OA NPs、β-C210-S-OA NPs和β-C210-SS-OA NPs的MRTs分别为游离C210组的7.3、6.8、8.7和6.1倍。与游离C210组相比，C210前药物纳米粒显著增加了C210的AUC，α-C210-S-OANPs、α-C210-SS-OA NPs、β-C210-S-OA NPs和β-C210-SS-OA NPs的AUC分别为游离C210组的9.9、9.6、3.4和2.2倍。说明前药纳米粒能够有效改善C210的药动学行为。肿瘤组织特异分布如图6所示，在肿瘤组织中，α-C210-S-OA NPs的积累量远高于游离C210组。α-C210-S-OANPs、α-C210-SS-OA NPs、β-C210-S-OANPs、β-C210-S-OA NPs释放的C210在肿瘤组织中的蓄积量是游离C210组的3.3、1.5、1.2、0.8倍，说明纳米给药体系能有效增加肿瘤组织中的药物蓄积量。

表4C210及前药纳米粒的药代动力学参数

实施例10：C210前药自组装纳米粒的在体抗肿瘤研究

小鼠乳腺癌4T1皮下肿瘤模型构建：将1×10⁶ 4T1细胞注射到雌性BALB/c小鼠右腹，观察C210和前药纳米粒的抗肿瘤疗效。当肿瘤体积达到100mm3时，将荷瘤小鼠随机分为7组(生理盐水、CTX、C210和α-C210-S-OA-NPs、α-C210-SS-OA-NPs、β-C210-S-OA-NPs、β-C210-SS-OA-NPs)，每组8只。CTX(剂量:30mg/kg)每3天腹腔注射1次。其余组每天静脉注射1次(相当于C210 80μmol/kg)。治疗14天或肿瘤大小达到2000mm³时处死小鼠。收集肿瘤组织，称重并拍照，计算抑瘤率。

结果如图7所示，在几个前药纳米粒中α-C210-S-OANPs的抗肿瘤作用最为显著，其抗肿瘤作用强于等剂量游离C210，比阳性药物环磷酰胺30mg/kg的作用略强，而且α-C210-S-OANPs的抗肿瘤效果是要强于β-C210-S-OANPs，即短链前药活性明显好于长链前药。

综上所述，α-C210-S-OANPs具有良好的胶体稳定性、快速的前药释放、高效的细胞摄取、较长的血液循环时间以及较高的肿瘤特异性积累等多种优势。

Claims (10)

1.一种姜黄素衍生物前药，其特征在于，该前药是采用不同链长的单硫键或者二硫键连接的油醇-姜黄素衍生物，结构式如通式(1)所示：

其中n为1-2的整数，R为单硫键或二硫键；

所述的姜黄素衍生物的结构式如下：

2.如权利要求1所述的姜黄素衍生物前药，其特征在于，是姜黄素衍生物通过2,2’-硫代二乙酸、2,2’-硫代二丙酸、3,3’-二硫代二乙酸或2,2’-二硫代二丙酸与油醇相连得到的单硫键或二硫键位于相邻羰基α位和β位的化合物，结构式如下:

3.权利要求2所述的姜黄素衍生物前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别将2,2’-硫代二乙酸、2,2’-硫代二丙酸、3,3’-二硫代二乙酸、2,2’-二硫代二丙酸、与油醇、EDCI和DMAP加入二氯甲烷溶液中，反应混合物在氮气保护下室温搅拌，经硅胶柱层析分离得到4种中间产物α-S-OA、α-SS-OA、β-S-OA、β-SS-OA；

(2)将步骤(1)所得α-S-OA、α-SS-OA、β-S-OA、β-SS-OA分别与姜黄素衍生物、EDCI、DMAP溶于二氯甲烷中,反应混合物在氮气保护下室温搅拌，经硅胶柱层析分离得到目标产物α-C210-S-OA、α-C210-SS-OA、β-C210-S-OA和β-C210-SS-OA。

4.携载权利要求1所述姜黄素衍生物前药的自组装纳米粒，其特征在于，所述的自组装纳米粒为非PEG化的姜黄素衍生物前药自组装纳米粒或PEG修饰的姜黄素衍生物前药自组装纳米粒；粒径在120nm左右，粒径分布均匀，表面电荷都在36mV左右。

5.根据权利要求4所述的携载姜黄素衍生物前药的自组装纳米粒，其特征在于，是采用纳米粒沉淀法得到的，是将所述姜黄素衍生物前药与DSPE-PEG2000溶解到溶剂丙酮中，搅拌下，将所得溶液缓缓滴加到水中，姜黄素衍生物前药自发形成均匀的纳米粒，采用减压蒸发除去溶剂，得到不含有机溶剂的PEG修饰的姜黄素衍生物前药自组装纳米粒溶液；

其中，非PEG化的C210前药纳米粒的制备方法中不加入DSPE-PEG2000。

6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的姜黄素衍生物前药或权利要求4所述的携载姜黄素衍生物前药的自组装纳米粒，以及药学可接受的赋形剂。

7.权利要求1或2所述的姜黄素衍生物前药用于制备治疗肿瘤药的用途，所述的姜黄素衍生物前药含有氧化还原响应的单硫键或者二硫键，使前药可以在高氧化还原水平的肿瘤细胞内特异释放姜黄素衍生物，起到提高药物在肿瘤组织的特异分布和释放的作用，增强其选择性抗肿瘤作用。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的肿瘤是乳腺癌或者肝癌。

9.权利要求4所述的携载姜黄素衍生物前药的自组装纳米粒用于制备治疗肿瘤药的用途，所述的姜黄素衍生物前药采用油酸修饰，可使该前药具有自组装形成纳米粒的能力，从而延长药物在体循环中的平均滞留时间时间，改善其药代动力学特性。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的肿瘤是乳腺癌或者肝癌。