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CN116814790A - Pitx2基因作为标志物在检测肺癌中的应用 - Google Patents

Pitx2基因作为标志物在检测肺癌中的应用 Download PDF

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CN116814790A
CN116814790A CN202310836811.4A CN202310836811A CN116814790A CN 116814790 A CN116814790 A CN 116814790A CN 202310836811 A CN202310836811 A CN 202310836811A CN 116814790 A CN116814790 A CN 116814790A
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CN
China
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pitx2
gene
primer
lung cancer
actb
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CN202310836811.4A
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胡立夫
南熠郎
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Shenzhen Zeyi Cell Therapy Group Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Peoples Hospital
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Abstract

本发明公开了PITX2基因作为标志物在检测肺癌中的应用。本发明发现与早期肺癌诊断相关的基因为PITX2基因，它是从肺癌组织及癌旁正常组织提取的DNA和RNA，用全基因甲基化测序和表达分析法，经用另一组肺癌组织和正常人组织DNA进行筛选验证后原创结果。在肺组织中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到74％，特异性为94％。在血浆中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到58％，特异性为85％。由此可见，单个PITX2基因能够在血浆或肺组织中检测肺癌。本发明可对早期肺癌进行筛查及辅助诊断，具有重要的应用价值。

Description

PITX2基因作为标志物在检测肺癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及PITX2基因作为标志物在检测肺癌中的应用。
背景技术
肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。组织学上，NSCLC分为腺癌(adenocarcinoma，AC)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)和大细胞癌。与SCLC相比，非小细胞肺癌生长和扩散较慢。大多数NSCLC患者被诊断为晚期。尽管广泛使用肺癌筛查方法，如计算机断层扫描CT和MRI，这些技术可以发现2-3毫米的小结节，但仍不能评估其具体特征，即良性或恶性。与这些方法相关的许多问题(如假阳性结果率高、患者对辐射的恐惧、过高的费用、需要长时间的随访)进一步限制了这些方法的有效性。肺癌诊断较晚的一个重要原因是缺乏可靠的生物标志物。血清蛋白抗原(CEA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等广泛应用于肺癌的血液蛋白诊断生物标志物，检出率分别仅为26％和21-39％。循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞、血清非编码RNA和来自血液的外泌体已被探索。其中利用ctDNA进行肺癌检测备受关注，将可靠的生物标记物纳入使用ctDNA的肺癌筛查项目将有助于早期识别患者。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在调节基因表达和修饰染色质构象中起着至关重要的作用。DNA甲基化是癌症发展过程中的早期事件，因此可以将诊断性生物标志物检测肿瘤抑制基因调控区域的DNA甲基化变化作为最有前途的诊断和预后工具之一。利用DNA甲基化标记开发可靠的NSCLC早期检测方法将成为转化癌研究的重点。
肿瘤的早期诊断通常取决于两个关键因素：检查指标的高灵敏度和无创、简便的检测方法。随着科技的快速发展，肿瘤标志物已经发展成为肿瘤诊断和治疗的新领域、新的挑战和希望。肿瘤标志物可在体液或组织中检测，可反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和治疗效果。
发明内容
本发明的目的为早期诊断肺癌。
本发明首先保护PITX2基因作为标志物在制备肺癌检测试剂盒中的应用；PITX2基因的Gene ID为5308。
本发明还保护一种用于筛查肺癌试剂盒，可包括用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组；PITX2基因的Gene ID为5308。
所述试剂盒具体可由所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组组成。
上述任一所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组可为引物探针组PITX2-1、引物探针组PITX2-2或引物探针组PITX2-3。
上述任一所述引物探针组PITX2-1由SEQ ID NO：1所示的引物PITX2-F1、SEQ IDNO：2所示的引物PITX2-R1和SEQ ID NO：3所示的探针PITX2-P1组成。
上述任一所述引物探针组PITX2-2由SEQ ID NO：4所示的引物PITX2-F2、SEQ IDNO：5所示的引物PITX2-R2和SEQ ID NO：6所示的探针PITX2-P2组成。
上述任一所述引物探针组PITX2-3由SEQ ID NO：7所示的引物PITX2-F3、SEQ IDNO：8所示的引物PITX2-R3和SEQ ID NO：9所示的探针PITX2-P3组成。
上述任一所述试剂盒还可包括用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组。
上述任一所述试剂盒具体可由上述任一所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组和上述任一所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组组成。
所述内参基因可为ACTB基因。ACTB基因的Gene ID为60。
上述任一所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组可为引物探针组ACTB-1或引物探针组ACTB-2。
所述引物探针组ACTB-1由SEQ ID NO：10所示的引物ACTB-F1、SEQ ID NO：11所示的引物ACTB-R1和SEQ ID NO：12所示的探针ACTB-P1组成。
所述引物探针组ACTB-2由SEQ ID NO：13所示的引物ACTB-F2、SEQ ID NO：14所示的引物ACTB-R2和SEQ ID NO：15所示的探针ACTB-P2组成。
上述任一所述探针(如检测内参基因的探针、检测PITX2基因甲基化水平的探针)的一端均具有荧光标记，另一端均具有荧光猝灭标记。
上述任一所述试剂盒的检测对象具体可为肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA。
上述任一所述试剂盒还可包括数据处理系统；所述数据处理系统将PITX2基因的甲基化水平转化为待测者的dCTPITX2，用于判断待测者是否为肺癌患者；
所述待测者的dCTPITX2的计算方法为：将待测者的肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA进行化学修饰，之后以其作为模板、采用权利要求3和/或6中的引物和探针进行荧光PCR扩增，收集荧光信号，分别获得PITX2和ACTB的CT值，依次记为CTPITX2和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45；进一步计算PITX2的dCT值，dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB；
所述判断的方法为：如果待测者的PITX2基因发生甲基化，则待测者为肺癌患者；否则待测者不为肺癌患者；PITX2基因是否发生甲基化通过比较待测样本PITX2基因的dCT和dCT临界值来实现；
如果待测者PITX2基因的dCT<dCT临界值，则待测者基于PITX2基因发生甲基化；如果待测者PITX2基因的dCT≥dCT临界值，则待测者基于PITX2基因未发生甲基化。
当上述任一所述试剂盒的检测对象为肺结节组织的基因组DNA时，dCT临界值是通过比较大量病例证实的或数据库记载的肺癌组织和癌旁正常组织的PITX2基因dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
当上述任一所述试剂盒的检测对象为血浆cfDNA时，dCT临界值是通过比较大量病例证实的或数据库记载的已确诊肺癌患者和健康志愿者的血液中PITX2基因的dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
本发明还保护PITX2基因作为标志物在肺癌早期筛查中的应用。
上述任一所述肺癌分可为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
所述非小细胞肺癌可为肺腺癌或肺鳞癌。
本发明发现与早期肺癌诊断相关的基因为PITX2基因，它是从肺癌组织及癌旁正常组织提取的DNA和RNA，用全基因甲基化测序和表达分析法，经用另一组肺癌组织和正常人组织DNA进行筛选验证后原创结果。在肺组织中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到74％，特异性为94％。在血浆中，PITX2基因检测肺癌的敏感度达到58％，特异性为85％。由此可见，单个PITX2基因能够在血浆或肺组织中检测肺癌，且操作简单、耗时短、具有较高的灵敏度和特异性。PITX2基因也可以联合已知用于检测肺癌的靶基因诊断早期肺癌，可以有效提高检出率。本发明可对早期肺癌进行筛查及辅助诊断，具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，“待测样本”指待检测的核酸样本；具体的，待测样本可以是分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种、细胞系、肺灌洗液、组织切片、手术组织、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、尿、血浆、血清、全血等gDNA，cfDNA和ctDNA。
下述实施例中，“肺癌”包括腺癌和鳞癌，是呼吸道中常见的恶性肿瘤，特别是非小细胞肺癌。早期症状不明显，从开始癌变发展到临床发现肿块大约5～7年；早期肺癌5年存活率达90以上，晚期则只有10％。
下述实施例中，“目标核酸”或“靶基因”指人PITX2基因的核酸片段，即人PITX2基因的甲基化DNA特异性片段。设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度特异的探针来识别，且设计的引物与探针能与待测位点互补。
下述实施例中，“探针”指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其核苷酸序列结构与目标核酸基本互补，可以与“目标核酸”形成双链。所述探针的5’末端可以携带荧光集团和/或3’末端携带淬灭集团标记物。引物和探针与样品DNA中甲基化特异性序列的结合，使分子标记物能够检测出疾病—肺癌。
本发明的方法中，需要对提取的DNA进行化学修饰，获得经过转换的DNA片段作为待测样品。亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐修饰均可应用于该种化学修饰，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，区分甲基化或非甲基化基因片段，可用特异设计的引物和探针进行识别和PCR扩增。
本领域技术人员可以使用定量测量来确定特异性CpG位置的甲基化水平，指甲基化水平超过某个临界值，其中该临界值可以是代表给定人群的平均或中值甲基化水平的值，或者它优选是最佳临界值。
本发明的方法是在一个反应管内进行两道荧光定量探针PCR扩增反应，通过荧光信号获得PITX2基因的Ct值，根据肺癌阳性临床样本PITX2基因的Ct值减去内参基因ACTB的Ct值成为该样品PITX2基因的dCt(△Ct)值，与用从大量已知肺癌组织和对照组织DNA样品中获得PITX2基因甲基化dCT阈值(临界值)做比较，小于阈值说明PITX2基因甲基化，即判断PITX2基因的甲基化状态。
考虑到临床检测的需要，采用液体活检的方法能有效降低对患者的伤害。应用实时荧光PCR进行检测时，所述探针连接有适合于判断不同基因甲基化DNA片段的荧光基团。探针的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团；其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时，利用聚合酶的正向外切活性将带有荧光基团的碱基切离，游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响，在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累，荧光信号不断地增强，从而可以检测到特异甲基化DNA的存在。作为本发明的优选方式，检测探针标记的荧光基团可以是VIC、ROX、FAM、Cy5、Cy5.5、HEX、TET、JOE、NED或TAMRA等；而淬灭基团可以是BHQ、MGB或Dabcy1。本发明适用于目前临床检测常用的多通道PCR检测技术，实现在一个反应管中进行多道荧光检测。
下述实施例中，所有患者均知情同意且实验经过伦理批准。
下述实施例中，人全基因甲基化DNA标准品(EpiTect PCR Control DNA Set，Qiagen Cat No./ID:59695，其中甲基化DNA，用+ve ctr表示)为阳性对照DNA。人全基因非甲基化DNA标准品(EpiTect PCR Control DNA Set，Qiagen CatNo./ID:59695，其中非甲基化DNA，用-ve ctr表示)或水均为阴性对照DNA。
实施例1、获得用于肺癌检测的标志物
本发明的发明人从16例临床Ⅰ-Ⅳ期肺癌组织(即肺癌患者的手术组织(经病理证实，C)，作为肿瘤阳性样本)及癌旁正常组织(同一病例手术时癌旁正常组织(经病理证实，A)，作为肿瘤阴性样本)提取的DNA和RNA，用全基因甲基化测序和表达分析法，结合多种数据库以及综合临床信息进行大规模筛选。之后，通过比较甲基化水平的差异，获得与肺癌相关的CpG岛(具体包括：1、设计探针富集相关基因的甲基化位点，对每个CpG岛设计多对引物，用甲基化特异PCR凝胶电泳方法扩增获得产生单一条带引物对；2、用人全基因甲基化DNA标准品的系列稀释液证实，PCR扩增产物量和标准品的用量成正比关系；3、经另一组肺癌组织和正常人组织DNA进行筛选验证后，其中有3对CpG引物对和肺癌有关)，进而获得用于肺癌检测的标志物。用于肺癌检测的标志物由PITX2(Gene ID：5308)和ACTB(Gene ID：60)2个基因组成。
根据PITX2基因和ACTB基因的核苷酸序列，分别设计并由南京金斯瑞生物科技公司合成表1中所使用的引物和探针。
表1
注：引物名称中含有“F”为表示上游引物，含有“R”为表示下游引物，含有“P”为表示探针；ROX表示探针由ROX荧光基团标记；CY5表示探针由CY5荧光基团标记；MGB表示探针另一端由荧光MGB基团猝灭标记；ACTB(GeneID：60)为内参基因。
实施例2、PITX2基因作为标志物在肺癌组织(C)和癌旁正常组织(A)中检测
1、将表1中PITX2和ACTB的上游引物、下游引物和探针分别用水稀释。
2、取待测样本(27例临床肺腺癌(LUAD)配对样品(肺癌组织(用C表示)和癌旁正常组织(用A表示)、4例临床肺鳞癌(LUSC)配对样品(肺癌组织(用C表示)和癌旁正常组织(用A表示)、2例人肺癌细胞株(分别为A549细胞、H1299细胞))进行匀浆，之后采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技(北京)有限公司，Cat.#DP304-03)提取基因组DNA，得到待测样本的基因组DNA。
3、取待测样本的基因组DNA，采用EZ DNA Methylation-DirectTM KIT(ZYMORESEARCH，D5001/D5002)进行亚硫酸氢盐修饰，得到待测者转化的DNA。
4、配制表2所示的反应体系(共25μL)，其中模板为待测者转化的DNA、阳性对照DNA、阴性对照DNA或空白对照，DNA酶为Accurate Tag HS DNA聚合酶(CM0008，5μ/μl，AGL生物公司，中国)。然后按照反应程序进行荧光PCR扩增，获得CT值。所使用的荧光定量PCR仪器为QuantStudio 5(Appliedbiosystem,Thermo Fisher Scientific，USA))和Quant Gene9600(中国杭州，博日科技公司)。
反应程序为：第一阶段：95℃5min，1个循环；第二阶段：95℃15sec；60℃30sec；45个循环；第三阶段：58℃时收集荧光信号，分别获得PITX2和ACTB的CT值，依次记为CTPITX2和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45。
表2.反应体系
引物探针组PITX2-1和引物探针组ACTB-1的扩增区域经亚硫酸盐转化后的DNA序列见表3。
表3
5、进一步计算PITX2的dCT，记为dCTPITX2(dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB)。dCTPITX2的检测结果见表4。
表4.肺癌组织(C)和癌旁正常组织(A)中dCTPITX2的统计结果
注：TE为10mM Tris HCl-EDTA(10mM/1mM)缓冲液，作为空白对照；“+”表示PITX2基因甲基化，“-”表示PITX2基因未甲基化。
6、PITX2基因作为标志物在肺癌组织(C)DNA中的测定结果
(1)表4中大部分的肺癌组织(C)、人肺癌细胞株A549细胞和H1299细胞为基因甲基化阳性DNA，大部分的癌旁正常组织(A)为基因甲基化阴性DNA。BS处理后的DNA进行荧光PCR扩增，检测得到的CT值，扣除内对照ACTB的CT值后的CT值即为PITX2的dCT。与经病理证实的肺癌组织和阳性对照DNA组成阳性样本组dCT值，癌旁正常组织和阴性对照DNA组成阴性样本组dCT。
(2)基因是否发生甲基化通过比较待测样本PITX2的dCT值(记为dCTPITX2)来实现：dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB。即检测得到的PITX2的CT值扣除ACTB的CT值后的CT值，如果待测者PITX2基因的dCT<dCT临界值，则待测者基于PITX2基因发生甲基化。而dCT临界值是通过比较大量病例证实的肺癌组织和癌旁正常组织的PITX2基因dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
结果表明，在所组成的PCR反应条件下，PITX2在组织中的dCT临界值为4。
按照上述步骤，将“引物探针组PITX2-1的引物和探针”替换为“引物探针组PITX2-2的引物和探针”或“引物探针组PITX2-3的引物和探针”，将“引物探针组ACTB-1的引物和探针”替换为“引物探针组ACTB-2的引物和探针”，其它步骤均不变。结果表明，在所组成的PCR反应条件下，PITX2的dCT临界值也均为4。
本文中，dCT Th为dCT临界值，dCT Th以4为组织的dCT临界值。
引物探针组PITX2-2、引物探针组PITX2-3和引物探针组ACTB-2的扩增区域经亚硫酸盐转化后的DNA序列见表3。
(3)判断样本是否来自肺癌患者是通过比较样品(如肺结节)中PITX2基因的dCT和dCT临界值决定：如果待测样本的PITX2基因dCT值<dCT临界值，说明样品发生甲基化，则待测样本为阳性，即来自或可能来自肺癌患者；如果待测样本的PITX2基因dCt值≥dCT临界值，样品未发生甲基化，待测样本为阴性，即不来自或可能不来自肺癌患者。
通过检测PITX2基因的甲基化程度，在31例配对样本的肺癌组织中，发现甲基化阳性检出23例，敏感度或检测率为74％；在肺癌旁正常组织样本中，甲基化阳性检出2例，特异性为94％。由此可见，本申请提供的PITX2基因甲基化检测方法可以区分肺癌组织(C)和正常组织(A)。倘若PITX2基因和其他基因协同检测，将有助于提高肺癌肿瘤检出率和鉴别率。
以上为单独测定PITX2基因判断样本甲基化或判断样本是否来自肺癌患者的方法。实际应用中，PITX2基因也可联合其它已知用于检测肺癌的靶基因的甲基化状况对肺癌进行联合早期筛查和诊断。
实施例3、灵敏度实验
待测样本为分别为100％MetBisDNA(100％+ve ctr DNA)、10％MetBisDNA(10％+ve ctr DNA加入90％-ve ctr DNA)、1％MetBisDNA(1％+ve ctr DNA加入99％-ve ctrDNA)、0％MetBisDNA(100％-ve ctr DNA)和TE(没有DNA的阴性对照，只有TE缓冲液)。这5个待测样本为连续稀释样本。
每个待测样本进行如下实验：
1、将表1中“引物探针组PITX2-1的引物和探针”和“引物探针组ACTB-1的引物和探针”分别用水稀释。
2、取待测样本，采用EZ DNAMethylation-DirectTM KIT进行亚硫酸氢盐修饰，得到待测样本转化的DNA。
3、配制表2所示的反应体系(共25μL)，其中模板为待测样本转化的DNA、阳性对照DNA或阴性对照DNA；然后按照反应程序进行PCR扩增。反应程序为：第一阶段：95℃5min，1个循环；第二阶段：95℃15sec；60℃30sec；45个循环；第三阶段：58℃时收集荧光信号，分别获得PITX2和ACTB的CT值，依次记为CTPITX2和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45。进一步计算PITX2基因的dCT值(记为dCTPITX2)，dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB。
4、按照实施例1中步骤6的方法，判断5个待测样本即(5个连续稀释样本)为阳性还是阴性。
5个待测样本的结果见表5。结果表明，本发明提供的方法可以检测PITX2基因是否发生甲基化，且最小检出限为10％MetBisDNA，相当于0.5ng cfDNA。
表5
注：“+”表示PITX2基因甲基化，“-”表示PITX2基因未甲基化。
按照上述步骤，将“引物探针组PITX2-1的引物和探针”替换为“引物探针组PITX2-2的引物和探针”或“引物探针组PITX2-3的引物和探针”，将“引物探针组ACTB-1的引物和探针”替换为“引物探针组ACTB-2的引物和探针”，其它步骤均不变。
结果表明，PITX2的3个引物探针组中的任一个和ACTB的2个引物探针组中的任一个组成的引物探针组合均可以检测PITX2基因是否发生甲基化，且最小检出限为10％
MetBisDNA，相当于0.5ng cfDNA。
实施例4、以血液为检测样本进行肺癌检测
待测样品分别为伦理批准的、病理确诊的肺癌患者的全血样品31个和健康志愿者的全血样品60个。
1、将表1中“引物探针组PITX2-1的引物和探针”和“引物探针组ACTB-1的引物和探针”分别用水稀释。
2、分别取8ml待测样品于EDTA抗凝真空采血管，在2h内进行两次离心(第一次1600g离心15min，第二次15000g离心15min)，得到无细胞血浆。
3、分别取所述无细胞血浆，采用血浆游离DNA离心法试剂盒(D3182-03S，美基公司，广州)提取游离DNA，得到待测者血浆的cfDNA。
4、分别取待测者血浆cfDNA，应用EZ DNAMethylation-DirectTM KIT(Cat.no.D5002,Zymo Research,USA)进行亚硫酸氢盐修饰，得到待测者转化的cfDNA。
5、配制表2所示的反应体系(共25μL)，其中模板为待测者转化的cfDNA、100％MetBisDNA(100％+ve ctr DNA)(作为阳性对照)、10％MetBisDNA(10％+ve ctr DNA加入90％-ve ctr DNA)(作为阳性对照)或TE(作为阴性对照)；然后按照反应程序进行PCR扩增。反应程序为：第一阶段：95℃5min，1个循环；第二阶段：95℃15sec；60℃30sec；45个循环；第三阶段：58℃时收集荧光信号，分别获得PITX2和ACTB的CT值，依次记为CTPITX2和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45。进一步计算PITX2基因的dCT值(记为dCTPITX2)，dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB，即检测得到的PITX2基因的CT值扣除内对照ACTB的CT值后的CT值。
6、基因是否发生甲基化通过比较待测样本PITX2的dCT值(记为dCTPITX2)来实现：dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB。如果待测者PITX2基因的dCT<dCT临界值，则待测者基于PITX2基因发生甲基化。而dCT临界值是通过比较大量已确诊肺癌患者和健康志愿者的血液中PITX2基因的dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
结果表明，在所组成的PCR反应条件下，PITX2在血液中的dCT临界值为6。
本文中，dCT Th为dCT临界值，dCT Th以6为血液的dCT临界值。
判断样本是否来自肺癌患者是通过比较样品(如血液)中PITX2基因的dCT和dCt临界值决定：如果待测样本的PITX2基因dCT值<dCT临界值，说明样品发生甲基化，则待测样本为阳性，即来自或可能来自肺癌患者；如果待测样本的PITX2基因dCt值≥dCT临界值，样品未发生甲基化，待测样本为阴性，即不来自或可能不来自肺癌患者。
部分检测结果见表6。结果表明，在31个肺癌患者的全血样品中，甲基化阳性检出18个，敏感度或检测率为58％；在60个健康志愿者的全血样品中，甲基化阳性检出9个，即假阳性率为15％，特异性为85％。由此可见，单个PITX2基因能够在血浆cfDNA样品中区分肺癌组织(C)和正常组织(A)，只是检测对象为血浆的检测效果略低于肺组织。但血浆的获取基本属于无创，与获得肺组织相比，具有不可替代性。当待测样品为血浆时，通过检测PITX2基因可以进行广泛的肺癌早期筛查。当然，PITX2基因也可以和已知用于检测肺癌的靶基因联合，共同对肺癌进行联合早期筛查和诊断。
表6
注：TE为10mM Tris HCl-EDTA(10mM/1mM)缓冲液，作为空白对照；“+”表示PITX2基因甲基化，“-”表示PITX2基因未甲基化。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.PITX2基因作为标志物在制备肺癌检测试剂盒中的应用；PITX2基因的GeneID为5308。
2.一种用于筛查肺癌试剂盒，包括用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组；
PITX2基因的GeneID为5308。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组PITX2-1、引物探针组PITX2-2或引物探针组PITX2-3；
引物探针组PITX2-1由SEQ ID NO：1所示的引物PITX2-F1、SEQ ID NO：2所示的引物PITX2-R1和SEQ ID NO：3所示的探针PITX2-P1组成；
引物探针组PITX2-2由SEQ ID NO：4所示的引物PITX2-F2、SEQ ID NO：5所示的引物PITX2-R2和SEQ ID NO：6所示的探针PITX2-P2组成；
引物探针组PITX2-3由SEQ ID NO：7所示的引物PITX2-F3、SEQ ID NO：8所示的引物PITX2-R3和SEQ ID NO：9所示的探针PITX2-P3组成。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因为ACTB基因；ACTB基因的GeneID为60。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组ACTB-1或引物探针组ACTB-2；
引物探针组ACTB-1由SEQ ID NO：10所示的引物ACTB-F1、SEQ ID NO：11所示的引物ACTB-R1和SEQ ID NO：12所示的探针ACTB-P1组成；
引物探针组ACTB-2由SEQ ID NO：13所示的引物ACTB-F2、SEQ ID NO：14所示的引物ACTB-R2和SEQ ID NO：15所示的探针ACTB-P2组成。
7.根据权利要求3或6所述试剂盒，其特征在于：所述探针一端均具有荧光标记，另一端均具有荧光猝灭标记。
8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的检测对象为肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA。
9.根据权利要求2至8任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括数据处理系统；所述数据处理系统将PITX2基因的甲基化水平转化为待测者的dCTPITX2，用于判断待测者是否为肺癌患者；
所述待测者的dCTPITX2的计算方法为：将待测者的肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA进行化学修饰，之后以其作为模板、采用权利要求3和/或6中的引物和探针进行荧光PCR扩增，收集荧光信号，分别获得PITX2和ACTB的CT值，依次记为CTPITX2和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45；进一步计算PITX2的dCT值，dCTPITX2＝CTPITX2-CTACTB；
所述判断的方法为：如果待测者的PITX2基因发生甲基化，则待测者为肺癌患者；否则待测者不为肺癌患者；
PITX2基因是否发生甲基化通过比较待测样本PITX2基因的dCT和dCT临界值来实现；
如果待测者PITX2基因的dCT<dCT临界值，则待测者基于PITX2基因发生甲基化。
10.PITX2基因作为标志物在肺癌早期筛查中的应用。
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