CN116814772A - 检测fanca基因突变的引物组合、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种检测FANCA基因突变的引物组合、试剂盒及方法，所述引物组合选自核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.210所示的引物对1至引物对105中的多对。本申请提供了一种通用性强和准确率高的胚胎植入前遗传学检测FANCA突变的方法，可用于高通量测序在胚胎水平检测FANCA突变，帮助范可尼贫血患儿生育史的家庭生育健康后代。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种检测FANCA基因突变的引物组合、试剂盒及方法。
背景技术
范可尼贫血(Fanconi anemia，FA)是一种罕见的单基因遗传疾病，以进行性骨髓造血功能衰竭为主要特征，是先天性造血衰竭性疾病中最常见的一种。范可尼贫血可由FANCA基因突变所致，呈常染色体隐性遗传，是一种影响身体多器官的疾病，临床异质性高，主要临床表现为身体异常、骨髓衰竭和患恶性肿瘤的风险增加。
胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation genetic testing，PGT)是预防范可尼贫血出生缺陷的有效手段。PGT是指当胚胎在体外发育至卵裂期或囊胚期时，活检若干细胞进行遗传学检测，最终选择无患病风险的胚胎植入母体子宫，从而达到生育健康后代的目的。PGT可有效避免因妊娠遗传病胎儿而终止妊娠所带来的身心伤害，越来越成为有生育遗传病高风险胎儿夫妇的首选。在胚胎水平进行FANCA基因检测的常见方法有多重巢式PCR及Karyomapping技术。多重巢式PCR法需要预先为FANCA基因携带者筛选出杂合的短串联重复序列(STR)，然后在淋巴细胞水平建立包含突变位点和杂合STR位点的多重PCR体系，并在细胞水平评估各位点扩增效率及等位基因脱扣率，合格后才能应用于胚胎检测。由于STR数量有限，且人群中杂合频率不同，所以多重巢式PCR法设计较为个性化，工作量大，周期长，通用性较低。相较于STR位点，单核苷酸多态位点(SNP)数量多分布广，在人群中的发生频率超过1％，其总数达300万个，平均1个/3Kb，在高通量测序平台易实现自动化分析。Karyomapping技术即通过SNP连锁分析间接排除基因缺陷。该芯片上有30万个SNP探针用于全基因组的连锁分析，是一种综合的通用的单基因病PGT技术。但是Karyomapping不能检测基因突变，所以必须要有先证者样本或合适的家系成员样本。如果没有足够的家系样本，则需要额外增加突变检测。
因此急需开发一种能更全面涵盖FANCA基因内及上下游SNP位点的方法，用于判断胚胎FANCA突变基因型。
发明内容
基于此，有必要提供一种通用性强和诊断率高的检测FANCA基因突变的引物组合、试剂盒及方法。
本申请的第一个方面，提供了一种检测FANCA基因突变的引物组合，所述引物组合选自核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.210所示的引物对1至引物对105中的多对。
在其中一个实施例中，所述引物组合包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ IDNo.210所示的引物对1至引物对105。
本申请的第二个方面，提供了一种检测FANCA基因突变的试剂盒，包括所述的引物组合。
在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
在其中一个实施例中，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs中的一种或多种。
本申请的第三个方面，提供了一种FANCA基因突变的检测方法，包括以下步骤：
获取样本的基因组DNA；
使用所述引物组合或者所述试剂盒对所述样本的基因组DNA的FANCA基因编码区及其上下游SNP位点进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行分析，根据分析结果确定FANCA突变类型。
在其中一个实施例中，所述FANCA基因编码区及其上下游SNP位点包括：chr16:86817040、chr16:86867197、chr16:86932609、chr16:86970454、chr16:86970479、chr16:86970503、chr16:87019166、chr16:87060416、chr16:87060483、chr16:87111668、chr16:87232383、chr16:87305229、chr16:87343729、chr16:87402133、chr16:87446368、chr16:87696272、chr16:87714622、chr16:87720579、chr16:87722157、chr16:87727927、chr16:87730041、chr16:87738853、chr16:87742056、chr16:87748198、chr16:87748298、chr16:87748315、chr16:87755154、chr16:87755155、chr16:87756047、chr16:87980060、chr16:87980067、chr16:88038557、chr16:88080922、chr16:88081884、chr16:88081904、chr16:88081951、chr16:88085428、chr16:88089478、chr16:88100321、chr16:88102208、chr16:88106046、chr16:88116559、chr16:88164860、chr16:88164924、chr16:88165210、chr16:88165235、chr16:88453572、chr16:88460235、chr16:88469873、chr16:88504850、chr16:88520452、chr16:88535620、chr16:88627084、chr16:88635395、chr16:88664758、chr16:88668051、chr16:88680855、chr16:88791441、chr16:88822782、chr16:88880844、chr16:88902183、chr16:88902277、chr16:88909028、chr16:88921022、chr16:89042334、chr16:89161684、chr16:89216941、chr16:89304949、chr16:89437560、chr16:89568875、chr16:89590758、chr16:89600177、chr16:89649245、chr16:89675319、chr16:89697891、chr16:89800058、chr16:89818732、chr16:89909429、chr16:89933420、chr16:89950299、chr16:89954138、chr16:89957635、chr16:89958538、chr16:89961597、chr16:89967217、chr16:89972532、chr16:89975638、chr16:89985222、chr16:89986154、chr16:89994413、chr16:90008296、chr16:90008896、chr16:90013420、chr16:90020346、chr16:90024206、chr16:90024899、chr16:90031427、chr16:90044028、chr16:90046121、chr16:90060281、chr16:90074001、chr16:90076227、chr16:90098466、chr16:90098616和chr16:90107377。
在其中一个实施例中，在对所述PCR扩增产物进行分析的方法包括：对所述PCR扩增产物进行高通量测序。
在其中一个实施例中，所述样本选自外周血、精液、口腔粘膜细胞和胚胎细胞中的一种或多种。
本申请的第四个方面，提供了所述引物组合或所述试剂盒在用于制备检测FANCA基因突变的产品中的用途。
与传统的技术相比，本申请还包括如下有益效果：
本申请提供了一种检测FANCA基因突变的引物组合，通过对样本的FANCA基因编码区及其上下游SNP位点进行PCR扩增的方法，可检测出样本的FANCA的单体型和基因型。本申请采用上述引物组合构建了一种通用性强和诊断率高的胚胎植入前遗传学检测的方法，省去了细胞水平预实验，可用于高通量测序在胚胎水平检测FANCA突变，帮助范可尼贫血患儿生育史的家庭生育健康后代。本申请的优越性主要包括以下几点：
(1)检测到的SNP数量多：本申请能够更加全面地检测到FANCA基因编码区及其上下游SNP位点，还能检测到未知的SNP突变位点。
(2)通用性高和准确率高：在16个样本中进行测试，通过标准设定为基因两侧各有不小于2个有效SNP，样本的检测通过率为100％。
(3)成本低：采用本申请的检测方法进行检测时，对FANCA的单体型分析的成本较低。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关实施例对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本申请中，涉及“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。
本申请中，涉及“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，涉及“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，涉及“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，涉及“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个的整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
读段(reads)是指测序获得的序列片段。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
单体型(Haplotype)又称单倍体型或单元型，指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合。
测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值，可以理解为基因组中每个被测到的碱基重复被测序的的平均次数(以碱基数量为单位)，在本申请的一个实施方案中，测序深度为1000x，即代表该条特异PCR扩增产物被测序1000次。
为了解决上述问题，本申请的第一个方面，提供了一种检测FANCA基因突变的引物组合，所述引物组合选自核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.210所示的引物对1至引物对105中的多对。
可选地，所述引物组合包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.210所示的引物对1至引物对105。
本申请的第二个方面，提供了一种检测FANCA基因突变的试剂盒，包括所述的引物组合。
可选地，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
可选地，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs中的一种或多种。
本申请的第三个方面，提供了一种FANCA基因突变的检测方法，包括以下步骤：
获取样本的基因组DNA；
使用所述引物组合或者所述试剂盒对所述样本的基因组DNA的FANCA基因编码区及其上下游SNP位点进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行分析，根据分析结果确定FANCA突变类型。
可选地，所述FANCA基因编码区及其上下游SNP位点包括：chr16:86817040、chr16:86867197、chr16:86932609、chr16:86970454、chr16:86970479、chr16:86970503、chr16:87019166、chr16:87060416、chr16:87060483、chr16:87111668、chr16:87232383、chr16:87305229、chr16:87343729、chr16:87402133、chr16:87446368、chr16:87696272、chr16:87714622、chr16:87720579、chr16:87722157、chr16:87727927、chr16:87730041、chr16:87738853、chr16:87742056、chr16:87748198、chr16:87748298、chr16:87748315、chr16:87755154、chr16:87755155、chr16:87756047、chr16:87980060、chr16:87980067、chr16:88038557、chr16:88080922、chr16:88081884、chr16:88081904、chr16:88081951、chr16:88085428、chr16:88089478、chr16:88100321、chr16:88102208、chr16:88106046、chr16:88116559、chr16:88164860、chr16:88164924、chr16:88165210、chr16:88165235、chr16:88453572、chr16:88460235、chr16:88469873、chr16:88504850、chr16:88520452、chr16:88535620、chr16:88627084、chr16:88635395、chr16:88664758、chr16:88668051、chr16:88680855、chr16:88791441、chr16:88822782、chr16:88880844、chr16:88902183、chr16:88902277、chr16:88909028、chr16:88921022、chr16:89042334、chr16:89161684、chr16:89216941、chr16:89304949、chr16:89437560、chr16:89568875、chr16:89590758、chr16:89600177、chr16:89649245、chr16:89675319、chr16:89697891、chr16:89800058、chr16:89818732、chr16:89909429、chr16:89933420、chr16:89950299、chr16:89954138、chr16:89957635、chr16:89958538、chr16:89961597、chr16:89967217、chr16:89972532、chr16:89975638、chr16:89985222、chr16:89986154、chr16:89994413、chr16:90008296、chr16:90008896、chr16:90013420、chr16:90020346、chr16:90024206、chr16:90024899、chr16:90031427、chr16:90044028、chr16:90046121、chr16:90060281、chr16:90074001、chr16:90076227、chr16:90098466、chr16:90098616和chr16:90107377。
可选地，在对所述PCR扩增产物进行分析的方法包括：对所述PCR扩增产物进行高通量测序。
可选地，所述高通量测序的平台为IlluminaMiseq。
可选地，所述PCR扩增方法为多重PCR扩增。
可选地，所述样本选自外周血、精液、口腔粘膜细胞和胚胎细胞中的一种或多种。
进一步可选地，所述样本为卵裂期或囊胚期的胚胎细胞。
优选地，每份DNA样本中的DNA含量大于500ng。
在一个具体示例中，对所述PCR扩增产物进行高通量测序包括：将测序结果与所述样本的亲本双方的DNA序列进行比对，分析所述胚胎细胞FANCA的单体型。
在一个具体示例中，对所述PCR扩增产物进行高通量测序还包括：将测序结果与人类基因组参考序列进行比对，分析SNP覆盖倍数和基因型。
在其中一个具体实施例中，本申请的检测方法是针对受精卵在体外发育至卵裂期或囊胚期时取若干细胞进行遗传学检测，可以理解地是，该方法不是以有生命的人体或者动物体为直接实施对象，不属于疾病的诊断和治疗方法。
本申请的第四个方面，提供了所述的引物组合或所述试剂盒在用于制备检测FANCA基因突变的产品中的用途。
以下结合具体实施例进行进一步说明，以下具体实施例中所涉及的原料，若无特殊说明，均可来源于市售，所使用的仪器，若无特殊说明，均可来源于市售，所涉及到的工艺，如无特殊说明，均为本领域技术人员常规选择。
实施例1
SNP位点的筛选与引物设计
1.SNP位点的筛选原则：高频SNP选取自千人基因组计划数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)；最小等位基因频率均大于0.2的高频SNP位点；去除多聚核苷酸(polyN)和位点上下游50bp序列中GC含量>70％的SNP位点；去除上下游50bp序列比对到人类基因组hg19有多个位置的SNP位点(即去除同源性高的SNP位点)；
SNP选取范围：优先选择FANCA基因内及基因(或突变位点)上下游1Mb以内的SNP位点，若1Mb以内的SNP数量少，可适当扩大范围，如上下游2Mb。
按照上述方法筛选到FANCA基因编码区及其上下游SNP位点。
2.引物设计：通过在线平台(https://www.ampliseq.com/)针对上述SNP位点的筛选原则设计对应引物；引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.210所示，所述的引物的特异性高，具有相近的退火温度及PCR产物片段大小在125bp-375bp范围内。
SNP位点及所述引物的序列详见表1，序号1-77为FANCA基因下游2M以内SNP位点及引物对，序号77-105为FANCA基因上游2M以内SNP位点及引物对。
表1
实施例2
一对夫妇疑似有范可尼贫血患儿生育史，基因检测结果提示患儿的FANCA基因(NM_000135)存在c.3948delG(母源)和c.2101A>G(p.Lys701Glu)(父源)复合杂合变异。该对夫妻申请针对上述致病突变进行胚胎植入前遗传学检测(PGT)，生育健康后代。由于患儿的遗传物质不足，故采集该对夫妇的双方父母血样进行遗传学检测。采集该对夫妇的双方父母血样进行遗传学检测，结果提示，女方所携带突变遗传自母亲，男方所携带突变遗传自父亲，通过家系信息明确了男女方的风险染色体单体型。
该夫妇经PGT助孕，获得3枚胚胎(LYX-6、LYX-7和LYX-8)，胚胎发育至囊胚期进行滋养层细胞活检，活检细胞经全基因组扩增后，进一步检测FANCA基因已知变异及单体型。3枚胚胎中，2枚为正常，1枚为患者。该对夫妇移植了一枚正常胚胎，孕16周行产前超声诊断和基因诊断，B超提示胎儿发育正常，遗传学检测提示胎儿FANCA基因不存在c.3948delG和c.2101A>G突变，与PGT结果一致。具体的检测步骤如下：
1多重PCR捕获：将表1中的105对引物对混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中对活检细胞样本DNA进行105重反应，对活检细胞样本的FANCA基因内及上下游SNP进行多重PCR扩增，得活检细胞样本全基因组扩增产物。每份样本DNA含量大于500ng。
2按照Illumina标准建库流程进行建库和测序。
按照Illumina标准建库流程对待测活检细胞样本全基因组扩增产物进行建库，用Miseq进行测序。
当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分，从而实现同时对多个样品进行测序。
3数据分析：利用trimmomatic软件对Illumina测序仪产生的原始数据去除接头序列，用BWA软件比对到人类hg19参考基因组，通过BWA(Burrow-Wheeler-Aligner)进行比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。最后分析待测样本的单体型SNP覆盖倍数和基因型。平均测序深度达到100x以上，即视为合格。
待测样本的单体型的检测结果如表2所示。测序的质控结果如表3所示，测序深度均在100×以上，30×覆盖度均在70％以上，100×覆盖度均在50％以上，质控合格。其中，F0表示男方风险染色体，F1表示男方正常染色体；M0表示女方风险染色体，M1表示女方正常染色体。
表2
| 姓名 | 单体型 | 致病基因检测(PGT-M) |
| 女方 | M0/M1 | 携带 |
| 男方 | F0/F1 | 携带 |
| 男方母亲 | F1/ | 正常 |
| 女方母亲 | M0/ | 携带 |
| LYX-6 | M0/F0 | 致病 |
| LYX-7 | M1/F1 | 正常 |
| LYX-8 | M1/F1 | 正常 |
表3
表4为SNP突变的检测结果，由于设计方案覆盖了FANCA基因全部的编码区，所以发生在编码区的基因突变，可以有效地检测到，并且测序深度均大于100×。
表4
注：*杂合性：Hom表示此突变位点为纯合突变，Het表示此突变位点为杂合突变，Hemi表示此突变位点为半合子突变，Normal表示此位点未检出突变。
SNP单体型如表5所示，其中，“？”代表未检测到，黑色加粗方框框住位点为脱扣位点。F0表示男方风险染色体，F1表示男方正常染色体；M0表示女方风险染色体，M1表示女方正常染色体。
表5
采用一代测序对子代胚胎的样本进行验证，验证结果如表6所示，与PGT结果一致。
表6
| 姓名 | 一代验证(c.3948delG) | 一代验证(c.2101A>G) |
| LYX-6 | Het | Het |
| LYX-7 | Normal | Normal |
| LYX-8 | Normal | Normal |
注：*杂合性：Hom表示此突变位点为纯合突变，Het表示此突变位点为杂合突变，Hemi表示此突变位点为半合子突变，Normal表示此位点未检出突变。
实施例3
采用实施例2的方法在16人份样本中进行了测试，检测了16位FANCA携带者，突变位点覆盖FANCA致病基因43个外显子，通过标准设定为基因两侧各有不小于2个的有效SNP，16名受检者通过率为100％。表明本申请的FANCA基因突变的检测方法具有较高的通用性和准确性。
由于FANCA基因的单核苷酸多态位点(SNP)数量多分布广，在人群中的发生频率超过1％，其总数达300万个，平均1个/3Kb。本申请提供了一种胚胎植入前遗传学检测方法，能够对210个SNP进行分析，检测的SNP数量多，通用性高；采用本申请的方法检测了16位FANCA携带者，通过标准设定为突变位点两侧各有不小于2个有效SNP，16名受检者通过率100％，通用性较高；省去了细胞水平预实验，本申请的检测方法能够在高通量测序平台易实现自动化分析，基于高通量测序技术基础上，在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次性对大量样品进行分析，降低了FANCA的单体型分析的成本；本申请的检测方法能用于检测染色体非整倍性，染色体结构异常以及单基因疾病，测序深度高，平均测序深度不小于100X，弥补了芯片检测易受探针影响的缺陷。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测FANCA基因突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合选自核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.210所示的引物对1至引物对105中的多对。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括核苷酸序列如SEQID No.1～SEQ ID No.210所示的引物对1至引物对105。
3.一种检测FANCA基因突变的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs中的一种或多种。
6.一种FANCA基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取样本的基因组DNA；
使用权利要求1或2所述引物组合或者权利要求3～5任一项所述试剂盒对所述样本的基因组DNA的FANCA基因编码区及其上下游SNP位点进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行分析，根据分析结果确定FANCA突变类型。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述FANCA基因编码区及其上下游SNP位点包括：chr16:86817040、chr16:86867197、chr16:86932609、chr16:86970454、chr16:86970479、chr16:86970503、chr16:87019166、chr16:87060416、chr16:87060483、chr16:87111668、chr16:87232383、chr16:87305229、chr16:87343729、chr16:87402133、chr16:87446368、chr16:87696272、chr16:87714622、chr16:87720579、chr16:87722157、chr16:87727927、chr16:87730041、chr16:87738853、chr16:87742056、chr16:87748198、chr16:87748298、chr16:87748315、chr16:87755154、chr16:87755155、chr16:87756047、chr16:87980060、chr16:87980067、chr16:88038557、chr16:88080922、chr16:88081884、chr16:88081904、chr16:88081951、chr16:88085428、chr16:88089478、chr16:88100321、chr16:88102208、chr16:88106046、chr16:88116559、chr16:88164860、chr16:88164924、chr16:88165210、chr16:88165235、chr16:88453572、chr16:88460235、chr16:88469873、chr16:88504850、chr16:88520452、chr16:88535620、chr16:88627084、chr16:88635395、chr16:88664758、chr16:88668051、chr16:88680855、chr16:88791441、chr16:88822782、chr16:88880844、chr16:88902183、chr16:88902277、chr16:88909028、chr16:88921022、chr16:89042334、chr16:89161684、chr16:89216941、chr16:89304949、chr16:89437560、chr16:89568875、chr16:89590758、chr16:89600177、chr16:89649245、chr16:89675319、chr16:89697891、chr16:89800058、chr16:89818732、chr16:89909429、chr16:89933420、chr16:89950299、chr16:89954138、chr16:89957635、chr16:89958538、chr16:89961597、chr16:89967217、chr16:89972532、chr16:89975638、chr16:89985222、chr16:89986154、chr16:89994413、chr16:90008296、chr16:90008896、chr16:90013420、chr16:90020346、chr16:90024206、chr16:90024899、chr16:90031427、chr16:90044028、chr16:90046121、chr16:90060281、chr16:90074001、chr16:90076227、chr16:90098466、chr16:90098616和chr16:90107377。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在对所述PCR扩增产物进行分析的方法包括：对所述PCR扩增产物进行高通量测序。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述样本选自外周血、精液、口腔粘膜细胞和胚胎细胞中的一种或多种。
10.权利要求1或2所述的引物组合或权利要求3～5任一项所述试剂盒在用于制备检测FANCA基因突变的产品中的用途。
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