CN116814700B

CN116814700B - Acsm5-p425t在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中的应用

Info

Publication number: CN116814700B
Application number: CN202310973886.7A
Authority: CN
Inventors: 何成禄; 李娅; 石洪琼; 段勇
Original assignee: First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority date: 2023-08-03
Filing date: 2023-08-03
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2043-08-03
Also published as: CN116814700A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开一种ACSM5‑P425T在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中的应用，所述ACSM5‑P425T序列为基因ACSM5中chr16:20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成，通过本发明构建的模型，可以为宣威肺癌的精准治疗，筛选更为有效的药物，并从体外细胞实验及体内动物成瘤实验层面，揭示药物对宣威肺癌发生发展的影响，为宣威肺癌的治疗获取理论依据。

Description

ACSM5-P425T在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种ACSM5-P425T在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中的应用。

背景技术

宣威肺癌是云南省颇具特色的地方病，具有非吸烟女性肺腺癌发病率和死亡率高、发病年龄年轻化、家族聚集性、放化疗敏感性差及耐药性高等特点，因其发病特征鲜明，受到世界瞩目。近些年来，已开发了多种靶向治疗药物如TK抑制剂(TyrosineKinaseinhibitors,TKIs)吉非替尼，这使得肺癌迈上了精准治疗的步伐。然而，仅有少数表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor,EGFR)发生突变(如L858R、G719C等)的患者才对吉非替尼治疗有效，无EGFR突变的病例对吉非替尼靶向治疗几乎无效，这提示我们，精准治疗的前提需要建立在精准诊断的基础上。尽管目前已经鉴定出许多肺癌相关的基因突变位点用于TKIs的靶向治疗，但是，宣威肺癌的发病特征独具特色，且TKIs治疗效果欠佳，它可能存在与非宣威肺癌不同的driver突变谱。

肿瘤发生发展的内在因素包括机体癌基因激活及抑癌基因失活。寻找宣威肺癌相关癌基因及抑癌基因，并深入并通过构建相关的细胞和动物模型，可以为宣威肺癌的精准治疗，筛选更为有效的药物，并从体外细胞实验及体内动物成瘤实验层面，揭示药物对宣威肺癌发生发展的影响。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种构建治疗宣威肺癌药物检测模型方法，所制备出的模型可为宣威肺癌的精准治疗，筛选更为有效的药物。

为实现以上目的本发明提供以下技术方案：

ACSM5-P425T在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中的应用，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16:20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成。

进一步的，所述模型过表达ACSM5-P425T基因序列。

进一步的，所述模型为宣威肺癌细胞系模型或动物模型。

进一步的，所述宣威肺癌细胞系模型构建方法为：细胞培养、含ACSM5-P425T基因序列的目的基因质粒构建、含目的基因质粒进行慢病毒包装、细胞感染、检测慢病毒包装的目的基因质粒滴度。

进一步的，所述动物模型的构建方法为：将过表达ACSM5-P425T基因序列的细胞注射进入小鼠中，培养后即可获得小鼠模型。

本发明还提供了一种重组质粒，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16:20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成。

本发明还提供了了一种，敲除或者抑制ACSM5基因和/或其编码蛋白的表达在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中的应用。

本发明达到的技术效果：

1、本发明通过前期试验和筛选，认为ACSM5-P425T为宣威肺癌相关癌基因，ACSM5为抑癌基因，并深入并通过构建相关的细胞和动物模型，可以为宣威肺癌的精准治疗，筛选更为有效的药物，并从体外细胞实验及体内动物成瘤实验层面，揭示药物对宣威肺癌发生发展的影响

2、通过本发明的方法成功构建的稳定表达野生型ACSM5，A549及JT细胞增殖、平板克隆形成能力、迁移及侵袭受到明显抑制，细胞周期阻滞于G0/G1期为主，早期凋亡细胞增加，相比之下，突变型ACSM5-P425T得到与之相反的结果。值得注意的是，ACSM5野生型和ACSM5-P425T突变型对JT细胞增殖的影响大于A549细胞，而平板克隆形成能力则相反，表明A549细胞的恶性程度高于JT细胞；与ACSM5野生型比较，紫杉醇在ACSM5-P425T突变型的A549细胞和JT细胞中，半数细胞死亡的药物浓度CC50分别为3.507μg/ml和75.95μg/m，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，表明紫杉醇对JT细胞更易耐药，更进一步的展示了ACSM5-P425T突变型细胞在对宣威肺癌治疗药物筛选中的应用。

3、体内裸鼠荷瘤实验结果显示，与稳定表达野生型ACSM5组比较，ACSM5-P425T突变型组的移植瘤生长速度增快、重量增加、ki-67表达增加、Tunel凋亡小体减少，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

附图说明

图1 ACSM5野生型序列和突变型序列(ORF区1273位碱基由C替换为A)及PReceiver-Lv201载体示意图；

图2宣肺肺癌JT细胞及不同NSCLC系ACSM5总蛋白表达的Western Blot分析结果图；

图3 Sanger反向测序ACSM5野生株和ACSM5-P425T突变株的质粒(A)及正向测序A549细胞和JT细胞(B)效果图；

图4慢病毒感染293T细胞后qPCR检测结果图；(其中滴度的扩增CT曲线图(A)，标准曲线(B)和滴度(C))

图5 A549及JT细胞构建对照空载株、ACSM5野生株及ACSM5-1突变株的情况和验证结果图；((A)A549细胞构建空载株、ACSM5野生株及ACSM5-1突变株的稳定载体及验证结果，(B)JT细胞构建空载株、ACSM5野生株及ACSM5-1突变株的稳定载体及验证结果，(C)A549和JT细胞在空载株、ACSM5野生株及ACSM5-1突变株中的Western Blot验证)

图6 NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549及JT细胞增殖能力的影响图；

图7 NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549及JT细胞克隆形成能力的影响(40×)图；

图8 NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549细胞(A)及JT细胞(B)周期的影响图；

图9 NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549细胞(A)及JT细胞(B)凋亡的影响图；

图10划痕实验检测NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549细胞(A)及JT细胞(B)迁移能力的影响(4×)图；

图11通过Transwell实验，检测NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549细胞(A)及JT细胞(B)迁移能力的影响(10×)图；

图12通过Transwell实验，检测NC、ACSM5-W野生型(ACSM5)及ACSM5-T突变型(ACSM5-1)对A549细胞(A)及JT细胞(B)侵袭能力的影响(10×)图；

图13 Western blot实验检测A549细胞及JT细胞中各实验组EMT相关蛋白的表达水平图；

图14 CCK-8方法检测不同处理组中紫杉醇的CC50(单位：μg/ml)效果图；

图15裸鼠荷瘤模型建立(A)及各细胞组移植瘤生长速度的比较(B)图；

图16 A.皮下前腋下肢单点接种各组细胞15天后取出瘤体，比较各组细胞移植瘤大小图；B.统计分析各组细胞移植瘤重量图；

图17 A和C.各组细胞的移植瘤组织Ki-67染色情况及统计分析图(10×)；B和D.各组细胞的移植瘤组织TUNEL染色情况及统计分析图(10×)；

以上图中，涉及组间比较：*：P＜0.05；**；P＜0.01；***；P＜0.005；****P＜0.001；

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。除非本文另有定义，否则结合本发明公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义，试验方法中购入商品，如中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中ACSM5基因为公开序列，NCBI序列号为：NM_017888.2。

本发明附图中及说明书文本中ACSM5-T、ACSM5-1和ACSM5-P425T突变均指代基因ACSM5中chr16：20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性。

本发明前期研究显示ACSM5在宣威肺癌患者中发挥抑癌基因角色，当ACSM5的SNP位点chr16：20442608的1273位点C碱基错义突变为A碱基时，所编码的疏水性脯氨酸转变为亲水性苏氨酸后，导致其突变体ACSM5-P425T可能发挥癌基因作用。qPCR、Westernblot、免疫组化等实验也进一步证实高、低表达ACSM5与肿瘤大小、分期等临床相关信息具有相关性。综上所述，我们认为ACSM5-P425T突变体可能参与了宣肺肺癌的发生及发展，因此，构建含ACSM5-P425T突变体的细胞或动物模型，或低表达ACSM5的细胞或动物模型可针对性的筛选用于治疗宣威肺癌的药物。

作为一种具体的实施方式，ACSM5-P425T可应用在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中，ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16：20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成，所述模型过表达ACSM5-P425T基因序列。

作为一些实施方式，可选的模型为宣威肺癌细胞系模型或动物模型。

作为一种更具体的实施方式，宣威肺癌细胞系模型构建方法为：细胞培养、含ACSM5-P425T基因序列的目的基因质粒构建、含目的基因质粒进行慢病毒包装、细胞感染、检测慢病毒包装的目的基因质粒滴度。

作为另一种更具体的实施方式，动物模型的构建方法为：将过表达ACSM5-P425T基因序列的细胞注射进入小鼠中，培养后即可获得小鼠模型。

作为另一种实施方式，本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒含ACSM5-P425T碱基序列，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5中chr16：20442608位点的C碱基错义突变为A碱基后引起的单核苷酸多态性形成。

作为另一种实施方式，敲除或者抑制ACSM5基因和/或其编码蛋白的表达可应用在构建治疗宣威肺癌药物检测模型中。

如上所述，显示了优选的实施方案以便于理解。本发明的范围不限于本文具体描述的实施方案和实施例，并且仅受权利要求的范围限制。下文根据试验过程具体的展示本发明的实施例。

实施例1

1 ACSM5在宣威肺癌JT细胞株及NSCLC细胞系中各细胞株的蛋白表达情况

与HBE细胞比较，NSCLC细胞系(A549、H460、H1299、H1975)中的A549细胞的ACSM5蛋白表达水平略低于HBE，宣威肺癌JT细胞的ACSM5蛋白表达水平略高于HBE，以上差异均无统计学意义(P＞0.05)。然而，NSCLC系H1299和H1975的ACSM5的表达均明显高于HBE，H460明显低于HBE，组间比较具有统计学差异(P＜0.05)(图2)。因此，后续体内外细胞实验将选用A549细胞和JT细胞。

2 ACSM5野生株和ACSM5-P425T突变株的质粒构建及验证情况

根据本发明步骤2.3构建的ACSM5野生株(ACSM5-W)和ACSM5-P425T突变株(ACSM5-T)的质粒，在转染及稳定表达目的基因细胞株筛选之前，通过Sanger测序以保证对应质粒构建成功(具体过程委托北京擎科生物公司完成)。质粒的反向测序结果显示：ACSM5-W质粒的1273位碱基为C，ACSM5-T质粒的1273位碱基为A，表明目的基因的质粒构建成功(见图3-A)。

同时，对候选的A549细胞及JT细胞通过Sanger测序，以保证相应质粒转染及细胞株筛选之前，候选的A549细胞及JT细胞不存在天然的1273位点C碱基突变为碱基A，测序结果与野生型质粒测序结果一致，表明A549细胞及JT细胞的1273位点的碱基不存在天然突变的A碱基(见图3-B)。

以上结果表明：ACSM5野生株和ACSM5-P425T突变株的质粒构建成功，同时，A549细胞及JT细胞中ACSM5的1273位点不存在A碱基天然突变，这为后续的质粒转染及稳定表达目的基因的细胞株筛选提供了准确性保证。

3慢病毒滴度检测情况

根据发明步骤2.3.3，目的基因质粒经过慢病毒包装、感染293T细胞、浓缩纯化、提取上清液中的慢病毒RNA及逆转等一系列过程后，通过qPCR方法检测慢病毒包装的目的基因质粒滴度，以确保后续感染及筛选稳定表达目的基因质粒的细胞A549和JT的成功率。图4显示：目的基因ACSM5(野生型)及ACSM5-1(突变型)的滴度和空载PReceiver的滴度均高于中等浓度标准品值16.13。此结果表明：目的基因滴度符合后续感染及筛选稳转A549和JT细胞的浓度值。

4野生型ACSM5-W和突变型ACSM5-T稳定载体构建情况

通过本发明所构建的表达绿色荧光GFP的PReceiver-ACSM5-W野生型慢病毒载体、PReceiver-ACSM5-T突变型慢病毒载，及对照载体PReceiver-GFP，感染JT细胞和A549细胞，经1.5ug/ml浓度的嘌呤霉素筛选出感染阳性细胞，直到感染阳性率达到80％以上，将筛选出的阳性细胞传代扩大培养，收获细胞用于后续实验。并通过qPCR和WesternBlot实验验证稳定细胞株的构建效果(图5)。

以上结果表明：稳定表达对照空载、ACSM5-W野生型和ACSM5-T突变型的A549及JT细胞株构建成功。

实施例2

野生型ACSM5-W和突变型ACSM5-T细胞株体外生物学行为的影响1细胞增殖能力的影响

NC细胞(ngetivecontrol)、野生型A549细胞和JT细胞，突变型A549细胞和JT细胞，分别接种于96孔板，每24h采用CCK-8法检测细胞增殖能力，以时间为横轴、相对细胞变化的吸光度为纵坐标绘制生长曲线(图6)。结果表明：①各组JT细胞较A549细胞的增殖能力强，72小时开始尤为明显；②ACSM5-W野生型A549细胞和JT细胞组生长较其它两组明显受到抑制(P＜0.05)，提示ACSM5-P425T突变体可恢复ACSM5-W野生型A549细胞和JT细胞的增殖能力；③NC组与突变型A549细胞和JT细胞组无显著差异(P＜0.05)，提示慢病毒表达载体对细胞增殖无影响。

以上结果表明：ACSM5野生株可抑制细胞增殖(JT细胞＞A549细胞)；ACSM5-P425T突变株可促进以上生物学过程(JT细胞＞A549细胞)。

2细胞克隆形成的影响

细胞增殖实验提示ACSM5-P425T突变体可恢复ACSM5-W野生型A549细胞和JT细胞的增殖能力，为了进一步验证ACSM5-P425T突变体较ACSM5-W野生型的克隆形成能力高，分别对NC细胞、野生型A549细胞和JT细胞，突变型A549细胞和JT细胞，采用平板克隆形成实验加以验证(图7)。结果表明：①在A549细胞和JT细胞中，ACSM5-P425T突变体较ACSM5-W野生型的克隆形成能力强(P＜0.05)，但较NC组的克隆形成能力弱(P＜0.05)；②尽管JT细胞较A549细胞的增殖能力强(5.1)，但是A549细胞较JT细胞的克隆形成能力强。

以上结果表明：ACSM5野生株可抑制细胞克隆形成(恶性程度A549细胞＞JT细胞)；ACSM5-P425T突变株可促进以上生物学过程。

3细胞周期的影响

在A549细胞组中，与ACSM5-P425T突变体组及NC对照组相比(图8-A)，稳定转染ACSM5-W野生型的A549细胞：①G0-G1期细胞比例增高(P＜0.05)，且明显低于于JT细胞(53.85％＜70.71％，A549VSJT)；②G2-M期细胞比例介于ACSM5-P425T突变体组及NC对照组，与NC组间比较有差异(P＜0.05)，与ACSM5-P425T突变体组无差异(P＞0.05)；③S期细胞比例降低(P＜0.05)。

在JT细胞组中，与ACSM5-P425T突变体组及NC对照组相比(图8-B)，稳定转染ACSM5-W野生型的JT细胞：①G0-G1期细胞比例明显增高(P＜0.05)；②G2-M期细胞比例降低，组间比较无统计学差异(P＞0.05)；③S期细胞比例减低(P＜0.05)。

以上结果表明：ACSM5野生株可促进细胞停滞在G0-G1期；ACSM5-P425T突变株可抑制以上生物学过程。

4细胞凋亡的影响

Annexin-V/7-ADD流式细胞分析法检测NC、ACSM5-W野生型及ACSM5-T突变型在A549细胞和JT细胞中的早期凋亡细胞比例，如图9所示，流式分析早期凋亡细胞，即Q4群，统计分析早期凋亡细胞比率。结果显示：与ACSM5-P425T突变体组及NC对照组相比，稳定转染ACSM5-W野生型的A549和JT细胞，早期凋亡细胞比率均明显升高(P＜0.05)，其中ACSM5-T突变型JT细胞的早期凋亡细胞率比对应的A549细胞高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

以上结果表明：ACSM5野生株可促进细胞早期凋亡；ACSM5-P425T突变株可抑制A549细胞和JT细胞早期凋亡。

5细胞迁移能力的影响

5.1划痕实验

在A549细胞组中(图10-A)，其划痕面积下迁移细胞数量在ACSM5-W野生型组中，几乎不受时间依赖性影响。与之相反，ACSM5-P425T突变体组及NC对照组，其划痕面积下迁移细胞数量呈现时间依赖性增加，48h迁移细胞数量明显高于0h和24h(P＜0.05)，且NC对照组划痕面积下迁移细胞数量较ACSM5-P425T突变体组多，组间比较具有统计学差异(P＜0.05)。

在JT细胞组中(图10-B)，其划痕面积下迁移细胞数量的趋势与A549细胞基本一致，然而，其迁移的细胞数量明显少于A549细胞组。

以上结果表明：ACSM5野生株具有抑制细胞迁移的能力；ACSM5-P425T突变株具有促进细胞迁移的能力(A549细胞＞JT细胞)。

5.2 Transwell迁移实验

在A549细胞组(图11-A)和JT细胞组(图11-B)中，ACSM5-W野生型组进入下室的细胞数量约((443个/视野)和(385个/视野))少于ACSM5-P425T突变体组约((583个/视野)和(523个/视野))及NC对照组约((655个/视野)和(575个/视野))(P＜0.05)。说明ACSM5-W野生株显著影响A549细胞和JT细胞的迁移能力，结论与5.5.1划痕实验一致。

以上5.5.1+5.5.2结果表明：ACSM5野生株具有抑制细胞迁移的能力；ACSM5-P425T突变株具有促进细胞迁移的能力。

6细胞侵袭能力的影响

在A549细胞组(图12-A)和JT细胞组(图12-B)中，ACSM5-W野生型组穿透Matrigel胶、进入下室的细胞数量约((408个/视野)和(363个/视野))少于ACSM5-P425T突变体组约((487个/视野)和(408个/视野))及NC对照组约((624个/视野)和(558个/视野))(P＜0.05)。说明ACSM5-W野生株显著影响A549细胞和.JT细胞的侵袭能力。

7上皮细胞间质转化

上皮细胞间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)是上皮细胞失去上皮细胞特点而获得间充质细胞特征的过程，被相关文献判定为发生侵袭和转移的关键，其相关上皮蛋白E-Cadherin表达水平的降低，以及相关间质化蛋白N-Cadherin和Vimentin表达水平的升高，以上相关蛋白表达水平的变化趋势往往提示EMT的发生。

因此，ACSM5-W野生型具有抑制A549和JT细胞侵袭的能力，而ACSM5-T突变型与其相反，可促进A549和JT细胞发生侵袭。我们通过Western-blot实验，在分子水平上验证上述三种EMT相关蛋白的表达水平变化，以验证稳定表达ACSM5-W野生型和ACSM5-T突变型的A549和JT细胞是否抑制或促进了EMT过程。

图13的结果表明：①在A549细胞中，与ACSM5-W野生型组比较，间质细胞相关蛋白N-Cadherin和Vimentin的表达水平在NC组和ACSM5-T突变型组中不同程度上升，组间比较具有统计学差异(P＜0.05)，而上皮细胞相关蛋白E-Cadherin表达水平均明显较弱(未统计)；②在JT细胞中，仅有Vimentin蛋白的表达水平在三组间比较，具有统计学差异(P＜0.05)。

以上结果尚不能明确ACSM5野生株与ACSM5-P425T突变株可抑制或促进细胞发生上皮细胞间质转化过程。

8紫杉醇耐药指数检测

紫杉醇是晚期肺癌化疗中常与顺铂联合使用的抗肿瘤药物之一，但是在使用一段时间后易引起耐药而影响化疗效果。因此，本研究将不同浓度的紫杉醇(0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml及160μg/ml)处理NC、ACSM5-W野生型及ACSM5-T突变型的A549和JT细胞，采用CCK-8方法计算半数细胞死亡的药物浓度(50％cytoxicityconcentration，CC50)。图14的结果表明：与NC组和ACSM5-W野生型组比较，ACSM5-T突变型组对紫杉醇的敏感性较差(P＜0.05)，即耐药性更高(JT细胞＞A549细胞)。

以上结果表明：稳定表达ACSM5-P425T突变株比野生株ACSM5更容易对紫杉醇产生耐药(JT细胞＞A549细胞)。

实施例3

野生型ACSM5-W和突变型ACSM5-T细胞株体内成瘤能力的影响

1体内成瘤体积和质量的影响：

通过NC、稳定表达ACSM5-W野生型及ACSM5-T突变型的A549细胞和JT细胞，建立非宣威肺癌和宣威肺癌的动物模型(图15-A)。由于A549细胞裸鼠荷瘤模型较JT细胞显著(JT细胞裸鼠荷瘤形成欠佳，未在本文中显示)，故后续体内裸鼠成瘤实验选用A549细胞模型。

各组细胞(NC、稳定表达ACSM5-W野生型及ACSM5-T突变型的A549细胞)移植瘤生长曲线显示(图15-B和C)，稳定表达ACSM5-W野生型组生长速度明显低于NC及稳定表达ACSM5-T突变型组(P＜0.05)，说明稳定表达ACSM5-W野生型后，显著抑制肿瘤细胞生长速度，而ACSM5-T突变型可促进肿瘤细胞生长速度。

15天后，剥离瘤体称重，比较各组瘤体重量。结果显示(图16)：稳定表达ACSM5-W野生型组移植瘤重量较NC组及稳定表达ACSM5-T突变型组轻(P＜0.05)。说明ACSM5-W野生型能够抑制肿瘤细胞成瘤能力，而ACSM5-T突变型可促进肿瘤细胞成瘤。

2移植瘤细胞增殖及凋亡的影响：

15天后处死裸鼠，移植瘤经石蜡包埋、切片等处理后，通过Ki-67免疫组化染色，观察各组细胞增殖活性。如图所示(图17-A)：与稳定表达ACSM5-W野生型组比较，NC及稳定表达ACSM5-T突变型组组织切片Ki-67阳性染色(绿色荧光，红色箭头所示)细胞明显增多，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明ACSM5-W野生型可抑制肿瘤细胞增殖，而ACSM5-T突变型可促进肿瘤细胞增殖。这与前期体外细胞增殖实验分析结果一致。

采用TUNEL细胞凋亡检测法观察移植瘤组织细胞的早期凋亡情况。结果显示(图17-B)：与NC及稳定表达ACSM5-T突变型组比较，稳定表达ACSM5-W野生型组组织切片，TUNEL染色(绿色荧光，红色箭头所示)细胞明显增多。结果提示ACSM5-W野生型可显著促进NSCLC细胞凋亡，而ACSM5-T突变型可抑制NSCLC细胞凋亡。这与前期体外AnnexinV/7-AAD流式分析结果一致。

以上结果表明：ACSM5野生株可抑制NSCLC肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，反之，ACSM5-P425T突变株促进NSCLC肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡。

综上所述，本发明通过构建稳定表达ACSM5野生型和ACSM5-P425T突变型的A549和JT细胞，在体外细胞层面，观察上述两株细胞的增殖、平板克隆形成、细胞周期及凋亡、迁移及侵袭、上皮细胞间质转化及紫杉醇耐药等能力的变化，结果证明ACSM5可抑制宣威肺癌细胞增殖、平板克隆形成、迁移及侵袭，阻滞细胞在G0/G1期，促进早期凋亡，发挥着抑癌基因的角色，其突变体ACSM5-P425T可促进上述细胞生物学行为的改变，发挥着“driver突变”的功能，从而影响宣威肺癌患者的预后；在体内裸鼠移植瘤层面，也得到与体外细胞实验相一致的结论；紫杉醇耐药指数实验也提示JT细胞比A549细胞更易耐药。

研究材料和方法

1实验材料

1.1实验细胞系

人宣威肺癌细胞株JT，由昆明医科大学第一附属医院医学检验科实验室保存，细胞性质参看(马丽菊，王红治，边莉，等.宣威肺腺癌细胞系XLA-07的建立及特征[J].中华病理学杂志，2012，41(5)：335-339.本发明中的JT细胞为细胞系XLA-07的传代细胞)；4种非小细胞肺癌NSCLC细胞株(A549、H460、H1299、H1975)和正常人支气管上皮细胞株HBE均购自中科院昆明动物研究所细胞库。

1.2实验动物

4周龄BALB/C-nude雌性裸鼠(N0.430727210100378365)，湖南省斯莱克景达实验有限公司，购入时体重约120mg。生存环境维持于适宜的温度及湿度，定时添加水及饲料。

1.3主要试剂及耗材

1.4常规实验室试剂配制

(1)细胞培养用PBS磷酸盐缓冲液(1L，需高温高压灭菌后使用)：NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，Na2HPO4·12H2O(2.86g)，KH2PO4(0.27g)。(2)SDS电泳缓冲液(1mL)：Glycine(14.4g)，Tris(3g)，SDS(1g)。

(3)SDS转膜缓冲液(1mL)：Glycine(14.4g)，Tris(3g)，200ML甲醇。

(4)6×SDSloadingbuffer：4×Tris-HCl/SDS(pH6.8)(7mL)，Glycerol(3.0mL)，DTT(0.933g)，Bromophenolblue(1.2mg)。

2实验方法

2.1细胞培养

JT和A549细胞培养基为RPMI1640，10％FBS；其余细胞培养基均为DMEM，10％FBS。筛选稳定表达目的基因的JT和A549细胞培养基中均添加100U/mLPenicyllin和100μg/mLStreptomycin。

2.2 ACSM5在宣威肺癌及肺癌各细胞系中的蛋白表达情况及候选细胞系筛选

(1)收集目标蛋白：预先将6孔板内密度为5×10⁵cells/mL/孔的对数生长期的JT细胞及NSCLC各细胞株细胞(A549、H460、H1299、H1975)和正常人支气管上皮细胞株HBE，经RPMI1640或DMEM无血清培养基培养24小时后，去除培养液并用PBS缓冲液清洗细胞三次，去除PBS缓冲液后，向6孔板内每孔加入RIPA裂解液200μL+蛋白酶抑制剂2μL+磷酸酶抑制剂2μL，冰上放置裂解30分钟，12000rpm离心5分钟，吸取上清液即为各细胞系总蛋白。(2)采用BCA法定量测目标总蛋白。(3)SDS-PAGE法进行电泳测试。(4)分析结果：根据Image软件分析各细胞系的灰度值，比较ACSM5的总蛋白表达量在各细胞系间的差异。(5)根据步骤(4)选择后续体内外实验的候选细胞株。

2.3构建ACSM5野生株和ACSM5-P425T突变株的质粒

从NCBI网站查询ACSM5基因的ORF序列，分别将其野生型序列和突变型序列(ORF区1273位碱基由C替换为A)搭载于PReceiver-Lv201空载体上，使用大肠杆菌扩增和氨苄青霉素筛选得到大量目的载体，此过程委托广州复能基因有限公司完成(图1)。

2.3.1载体测序鉴定

2.3.1.1载体扩增

(1)吸取10μL复能公司合成的慢病毒质粒分别加入100μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，轻弹管壁混匀后于冰上放置30min。将其放置于预加热至42℃循环水浴中约90s后快速移至冰水浴中孵育2min。随后加入500μLLB培养基后置于37℃摇床上振荡培养1h。取适量菌液均匀涂于含氨苄青霉素的平板上置于恒温培养箱中倒置培养16h。

(2)将单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基内，于37℃中培养12-16h。后用EndoFreemidiPlasmidKit试剂盒进行质粒抽提。

(3)收集上述过夜培养菌液于5mL离心管中，以12000rpm离心2min后收集菌液，弃上清后加入250μL细胞重悬液，充分振荡使菌液均匀悬浮后加入250μL细胞裂解液，随后加入10μL蛋白酶K后上下颠倒6次至混匀后静置1-2min使菌体裂解至澄清。加入350μL中和液后再次上下颠倒混匀使蛋白析出后，静置于冰浴5min，10000rpm离心10min后弃蛋白，收集上清液至无菌E管，12000rpm离心5min，将上清液转移至回收柱中12000rpm再次离心1min后弃下层废液。将600μL预先配置好的漂洗液加入后12000rpm离心1min，弃下层废液，12000rpm空离心2min后再次除去残留漂洗液，于超净台上将回收柱子转移至新的1.5mLEP管后静置10-20mmin，待其自然晾干后，将95μLNuclease-freeWater加入回收柱内，静置2min后以2000rpm离心2min后收集样品并进行编号后电泳、测定浓度并质检。

2.3.1.2电泳鉴定

(1)制胶：电子天平称取0.5g琼脂糖，微波炉煮沸1min溶解于50mlTAE缓冲液(1×)中，冷却至50-60℃后加入5μL核酸染料，轻轻混匀，小心倒入事先插好梳子的制胶槽中，动作一定要轻柔以防产生大量气泡，若不小心由气泡产生，可用无菌枪头将其刺破，静置40min，自然凝固后即为1％琼脂糖凝胶。

(2)上样：上样前先将制好的胶放入装有TAE缓冲液的电泳槽中，排尽胶孔中的气泡。上样时按照样品2μL混合1μLLoadingBuffer的比例上样，最左边孔或最右边孔上同体积的15000bp的DNAmarker。(3)电泳：电泳时电压设置为150V，电泳时间为15-20min。(4)判断：电泳结束关闭电源，取出胶块放入凝胶成像仪中，开紫外透射灯观察电泳条带，判断分子长度，选择条带明亮、单一且分子量相符的样品即可送去测序。

2.3.1.3测序

对载体搭载的ACSM5基因ORF区突变位点附近进行测序和比对，具体过程委托北京擎科生物技术公司完成。

2.3.2细胞测序鉴定

将慢病毒载体感染293T细胞后提取DNA进行测序，比对ACSM5是否发生了突变，具体测序过程由北京擎科生物技术公司完成。

2.3.3慢病毒滴度检测

2.3.3.1慢病毒包装

(1)准备慢病毒包装辅助细胞293T

复苏293T细胞，待293T细胞生长到90％时，弃旧培养液，加入PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液，加入适量EDTA-胰酶，在37℃中消化1～2min，于倒置显微镜下观察，当细胞相互分离而变圆时，倒掉胰酶溶液，加入新鲜的完全培养基，将细胞混匀，接种至10cm的细胞培养板中。待细胞增至80％时进行慢病毒包装。

(2)病毒包装在无菌离心管中，用200μL的Opti-MEM培养基稀释2.5ug待转染的载体和5μL的Lenti-PacHIV,在另一支离心管中，用200μL的Opti-MEM培养基稀释15μL的EndoFectinLenti,室温孵育5min。将稀释的EndoFectinLenti逐滴加到已稀释的载体中，轻轻震荡含有混合溶液的离心管，室温孵育20min。取接种于10cm培养板的细胞，待细胞生长至融合度达80％时，弃旧培养液，PBS液洗涤2次，用新的培养基(含10％灭活的胎牛血清，无双抗的DMEM培养基)更换培养板中旧的培养基。将孵育好的载体-EndoFectinLenti复合物加到293T细胞培养板中，混匀，放入细胞培养箱中培养8-14h。用含5％灭活胎牛血清，1％双抗的DMEM培养基更换旧的培养基，并加入1/500体积的TiterBoost。转染48h和72h后分别收集293T细胞培养液，500g离心10min，收集上清进行浓缩或分装冻存于-80℃中备用。

(3)慢病毒浓缩与纯化

完成慢病毒包装操作后，从工具细胞培养板或培养瓶收集上清液，上清液即含有慢病毒颗粒。上清液可通过4℃2000g离心10分钟去除细胞碎片、也可选择以0.45μm滤膜过滤细胞碎片；按慢病毒液体积：浓缩试剂体积＝5∶1的比例混合慢病毒上清液和浓缩试剂(浓缩试剂直接添加6X原液即可)，在0～4℃温度下孵育2小时或以上(也可孵育过夜)。完成孵育后，混合液在4℃温度下3500g离心25分钟；离心后，小心吸走、弃去上清液；量取原液的1/10-1/100体积的DMEM或PBS，重新吹打悬起慢病毒沉淀；重悬的慢病毒液已完成浓缩操作，可分装后保存在-80℃，并同时取少量测定浓缩后的慢病毒滴度。

2.3.3.2慢病毒滴度检测

(1)病毒RNA提取：

加0.25mlRNAzol到装有50或100μL病毒原液或者10μL病毒浓缩液中，上下颠倒10次溶解病毒，室温孵育15分钟以上。加50μL纯水到含50μL病毒原液管中或者含10μL病毒浓缩液中，总之病毒液体积与水总体积之和为100μL。20℃，18000g，离心10min。将上清移至新的1.5ml离心管中，按每100μL上清加1μL1.5mg/ml的linearpolyacrylamide。加入等体积异丙醇或者三倍体积无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱中放置4小时或者过夜。10℃，18000g,离心20min，弃上清。用0.5ml75％乙醇洗RNA两次，每次18000g，10℃，离心5min。空气中干燥3min后加水50μL溶解RNA。

(2)DNA酶I处理：按以下体系加入试剂：DEPCwater--1.5μL、LentiviralRNA--20μL、DNaseIbuffer(10×)--2.5μL、DNaseI--1.0μL，37℃孵育30～60min，之后75℃处理10min使DNaseI失活。

(3)逆转录：按以下体系加入试剂：

(DNaseItreated)RNA--10μL、4.0umcDNAsynthesisprimer--5μL70℃孵育5min，之后于冰上冷却样品。

按以下体系加入试剂：

10×ReverseTranscriptionBuffer--2.0μL、25mMDNTP--1.0μL、RNaseInhibitor--1.0μL、ReverseTranscriptase--1.0μL，37℃孵育60min，90℃，10min，产物直接用于后续qPCR或者保存于-20℃冰箱中。

(4)qPCR检测病毒滴度：按以下体系加入试剂：Water--6.0μL、2XAll-in-OneqPCRMIX--10.0μLqPCRprimermix(2.5uMeach)--2.0μL、DNAstrandardorcDNAsampleorwater--2.0μL。

按照以下程序反应

Temperature	Interval	Duration	Read
				72--95℃	0.5℃	6sec/each	On
30℃		30sec	off

(5)数据分析

CT值对应标准曲线拷贝数＝CT值对应滴度×PCR体系标准品(样品)体积，病毒滴度＝CT值对应标准曲线拷贝数×稀释倍数(copies/ml)

稀释倍数＝(RNA体积/病毒样品体积)×(DNaseI处理总体积/用于DNaseI处理的RNA体积)×(逆转录总体积/用于逆转录的RNA体积)×(1000μL/ml/用于qPCR的体积)。

2.4构建稳转细胞系

2.4.1细胞培养

(1)细胞复苏：将水浴锅温度调至37℃。根据记录从液氮灌中取出冻存A549和JT细胞，于37℃水浴锅中迅速摇荡，待其溶解后迅速转移到含有PBS的15ml离心管中，1000r/min离心5min。倒掉上清液，加入培养基重悬细胞，吹打混匀后将细胞悬液转移至T25细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

(2)细胞传代：当细胞长至80％时，吸弃细胞培养瓶内的培养液，用PBS冲洗细胞2次，加入适量0.25％的胰酶消化，待大部分细胞变圆且相互分离时，加入适量的含有胎牛血清的RPMI1640完全培养基终止消化，轻轻吹打，制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，按1/3传代。

(3)测序鉴定：传代后的部分JT和A549细胞提取DNA进行测序，比对ACSM5是否发生了天然突变，具体测序过程由北京擎科生物技术公司完成。

2.4.2野生型和突变型ACSM5慢病毒感染A549和JT细胞

将上述慢病毒与培养基按照1∶1比例感染生长密度为75％的A549、JT细胞(106)，加入终浓度为8ug/ml的Polybrene，有利于病毒的感染。感染后8h，用含有5％FBS(灭活)和1％双抗的新鲜培养基更换旧的培养基，继续放入C02培养箱培养。72h后加入含有1.5ug/ml浓度的嘌呤霉素的新鲜培养基，进行感染阳性细胞筛选。每隔2天换液一次，一直用最佳浓度的嘌呤霉素进行感染阳性细胞筛选。直到感染阳性率达到80％以上，将筛选出的阳性细胞传代扩大培养，收获细胞用于后续实验。分别取A549、JT两株细胞的野生型ACSM5和突变型ACSM51细胞，并分别以正常培养的A549、JT细胞作为空白株及A549、JT细胞PReceiver-Lv201作为空载株进行qPCR、增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡等检测。

2.4.3稳转细胞株相关ACSM5基因的mRNA水平变化检测

2.4.3.1细胞总RNA的提取

(1)待测的贴壁细胞培养好后，小心倒掉培养液，轻轻加入提前配制好的PBS清洗两次，4000rpm离心10min，弃上清备用。(2)向培养瓶中加入1mlTrizol试剂，左右摇晃培养瓶，使之与细胞充分接触，并于冰上静置10分钟，让细胞充分裂解。(3)细胞裂解后，将其转移至标记好并遇冷过的1.5ml无RNaesEP管中。(4)按1mlTrizol试剂加入200μL氯仿的量加入氯仿，手动剧烈摇动15秒，室温静置2-3分钟。(5)12000g、4℃离心15分钟，可见液体分为三层，下层粉红色的酚和氯仿、中间层为白色，RNA保留在无色的上层水相中。(6)小心吸取上层水相放入另一个EP管中，注意不要吸到中间层及下层(若不小心吸到，必须轻轻挤出)，接着加入0.5ml100％的异丙醇，颠倒混匀，静置10分钟(当样品量较少时可放在-20度冰箱过夜，以提高RNA提取率)。(7)12000g、4℃离心10分钟，可见管底有白色RNA沉淀物生成(样本量少时沉淀肉眼不可见，亦不影响正常操作)。(8)轻轻倾斜管口弃去上清，注意不要把沉淀倒掉，吸水纸吸干管口，向沉淀中加入1ml75％的乙醇，颠倒几下使沉淀漂浮，静置2分钟。(9)7500g、4℃离心5分钟，再次使沉淀附着在管底，需要时可重复此步骤两次以便将杂质清洗干净。(10)弃尽上清，将离心管倒扣在吸水纸上，自然干燥10分钟或放入超净工作台吹干，使乙醇及水分尽量挥发但又不能太干燥，否则影响后续RNA的溶解。(11)向干燥完成的RNA沉淀中加入30～50μL的RNase的水，静置15分钟，使RNA彻底溶解，并取2μL做电泳检测，取3μLRNA用TAE缓冲液稀释到3ml后上分光光度仪检测OD260和OD280，计算RNA纯度/浓度和下述步骤的上样量。(12)剩余RNA立即进行逆转录或冻存于-80℃冰箱中。

2.4.3.2电泳检测

(1)制胶：电子天平称取0.5g琼脂糖，微波炉煮沸1min溶解于50mlTAE缓冲液(1×)中，冷却至50～60℃后加入5μL核酸染料，轻轻混匀，小心倒入事先插好梳子的制胶槽中，动作一定要轻柔以防产生大量气泡，若不小心由气泡产生，可用无菌枪头将其刺破，静置40min，自然凝固后即为1％琼脂糖凝胶。(2)上样：上样前先将制好的胶放入装有TAE缓冲液的电泳槽中，排尽胶孔中的气泡。上样时按照样品2μL混合1μLLoadingBuffer的比例上样，最左边孔或最右边孔上同体积的DNAmarker。(3)电泳：电泳时电压设置为150V，电泳时间为15～20min。(4)判断：电泳结束关闭电源，取出胶块放入凝胶成像仪中，开紫外透射灯观察电泳条带，判断RNA质量(18s条带，28s条带，亮度等)，拍照保存。

2.4.3.3浓度测定

提前开启分光光度计，后取3μL提好的RNA样品，用TAE稀释至3ml的体积，用TAE缓冲液调零后，比色皿中换成待测样品，分别测定OD260和OD280，计算两者比值，若在1.8～2.0之间则说明RNA纯度较好。再计算RNA浓度，

公式为RNA浓度(ug/ml)＝OD260×稀释倍数×0.04。

2.4.3.4 AMSC5基因的mRNA表达水平检测

(1)mRNA逆转录至cDNA

使用广州Genecopoeia公司的

SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit试剂盒，按照说明书操作，具体为：取出逆转录试剂盒各成分、室温融化后，短暂离心、置于冰上，在冰上依次加入下列表格中各个试剂和溶液：

短暂离心后，按照下述表中的条件在普通PCR仪上进行逆转录：

注意，因SureScriptRTaseMix(20×)和SureScriptRTReactionBuffer(5×)两种试剂的上样量极少，可将两者与适量的ddH2O(RNase/DNasefree)提前混合后，再分别与RNA混合，如此操作可提高上样准确性，减少不必要的误差，所有上样操作均可参照此法。

(2)RT-PCR(实时荧光定量PCR)检测

先将上述逆转录产物cDNA稀释5～20倍(所有样品必须按照同一倍数进行稀释，浓度过高过低都会影响检测结果，可先做梯度验证以确定最佳稀释倍数)再进行下述Q-PCR反应。mRNA的RT-PCR检测使用广州Genecopoeia公司的BlazeTaq^TM GreenqPCRMix2.0试剂盒，按顺序加入下列表格中试剂:

可事先按照计算好的比例混合5×BlazeTaqqPCRMix、PCRforwardprimer(2μM)、PCRreverseprimer(2μM)和ddH2O(RNase/DNasefree)，再按它们的总体积与cDNA混合，如此操作可提高上样准确性。

上样操作时，每吸取一次液体都应该检查一下枪头内是否有气泡，将液体吹进孔内后也要检查一下枪头内是否有液体残留，若有残留，应将残留液体仪器吹进相应的孔中，且上样操作必须一气呵成，不可同时进行其它实验操作或做无关的事情，以此保证重复孔的一致性。

短暂离心后，按下列条件在CFX96实时定量荧光PCR仪进行40个循环的反应：

采集记录荧光，制作扩增曲线和溶解曲线，读取Ct值，分析ACSM5的相对表达量。注：ACSM5引物序列如下：

上游引物为：5′-TTGTGGATGATGAGGGCAACG-3′

下游引物为：5′-AGAAACAGAAGGGCCGAGTGG-3′

2.4.3.5 AMSC5蛋白表达水平检测：此步骤同发明2.2。

2.5稳转细胞株功能实验

2.5.1细胞增殖检测

将对数生长期的A549、JT细胞(空载对照细胞、转染ACSM5野生型或突变型的细胞)分别消化重悬后分别接种于96孔板，每个孔100μL(2000个细胞)，分别培养24h、48h、72h、96h和120h后，向每孔加入10μLCCK8溶液，空白对照加相应量细胞培养基和CCK8溶液但不加细胞。将培养板在培养箱内孵育4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，分析各组细胞增殖差异。

2.5.2细胞凋亡检测

(1)将A549、JT细胞(空载对照细胞、转染ACSM5野生型或突变型的细胞)消化后，转移细胞液至EP管，1000rpm离心5min，弃上清。(2)加入1ml预冷的PBS漂洗两次后弃上清，用1×bindingbuffer(10×，双蒸水稀释)将细胞重悬至1×106个/ml。(3)转移100μL细胞悬液(105个)至离心管，加入5μL的AnnexinV-PE和5μL的7-AAD，混匀后室温避光孵育15min。(4)再加入300μL的1×bindingbuffer，一小时内上流式仪检测。(5)取第二象限(晚期凋亡)、第四象限(早起凋亡)之和，比较转染慢病毒后的细胞凋亡改变。

2.5.3细胞周期检测

(1)染色液的配置：根据样品数量配置相应PI染色液。

(2)收集样本细胞：小心吸除细胞培养液，用胰酶消化细胞，制备成单细胞悬液。1000g离心3-5min，沉淀细胞，弃上清，用1ml冰浴预冷的PBS润洗细胞一次。离心收集细胞，再次加入约1ml预冷的PBS，重悬细胞，离心沉淀细胞，小心吸除上清，加入1ml冰浴遇冷的PBS，重悬细胞。细胞数量在1×10⁶个/ml。(3)细胞固定：取4ml预冷的95％乙醇，低速涡旋振荡，同时逐滴加入1ml的细胞悬液。使乙醇的终浓度维持在70～75％之间。混匀后立刻放于冰上。4℃固定细胞2h或更长时间，固定12-24h效果更佳。固定后的细胞可在4℃保存2天，-20℃保存1周。(4)细胞重悬：1000g离心3～5min，沉淀细胞，对于特定的细胞如果沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留50μL左右的乙醇，以免吸走细胞。加入约5ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，离心收集细胞，小心吸除上清，可以预留50μL的PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。(5)细胞染色：每管样品加入500μL配置好的染色液，缓慢并充分重悬细胞。37℃避光孵育30min。然后完成后可于4℃避光短暂保存，但是样品需要在24h内检测完毕，在当日完成流式检测。(6)流式检测和分析：用流式细胞仪进行检测，在激发波长488nm波长处检测，同时检测光散射情况。采用适当分析软件modfit-1进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

2.5.4细胞侵袭检测

(1)分装好的Matrige胶预先用培养基稀释成300ug/ml，取200μL加入孔径为8um的Transwell小室的底部多聚碳酸膜上，使膜上所有孔径都能被Mattige基质胶覆盖。37℃干燥过夜。(2)24孔板中加入500μL五血清培养基至刚好接触Transwell小室底部。(3)A549、JT细胞(空载对照细胞、转染ACSM5野生型或突变型的细胞)各组取3.5×104个/孔细胞悬成200μL(含10％FBS完全培养基中，接种于Transwell上室，将其置于培养箱中培养5h，待细胞贴壁更换培养基，上室用PBS清洗后添加无血清培养基，下室添加含10％FBS完全培养基培养24h。(4)24h后取出用甲醇固定10min，弃去甲醇，晾干。(5)染色：用0.5％的结晶紫溶液(甲醛配制)染色20min，棉签擦去PET膜上部细胞再用PBS再次漂洗至背景清晰。(6)醋酸脱色读取OD值。(7)重复步骤4。(8)封片，细胞计数。

2.5.5细胞迁移检测

(1)24孔板中加入500μL无血清培养基至刚好接触Transwell小室底部。

(2)A549、JT细胞(空载对照细胞、转染ACSM5野生型或突变型的细胞)，每组各取3.5×10⁴个/孔细胞悬成200μL(含10％FBS完全培养基中，接种于Transwell上室，将其置于培养箱中培养5h，待细胞贴壁更换培养基，上室用PBS清洗后添加无血清培养基，下室添加含10％FBS完全培养基培养24h。(3)24h后取出用甲醇固定10min，弃去甲醇，晾干。(4)染色：用0.5％的结晶紫溶液(甲醛配制)染色20min，棉签擦去PET膜上部细胞再用PBS再次漂洗至背景清晰。

2.5.6划痕实验

(1)细胞准备：取出处于对数生长期的A549、JT细胞(空载对照细胞、转染ACSM5野生型或突变型的细胞)，吸掉原来的培养液，用无菌PBS清洗细胞。加入1m10.25％胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后加入完全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中，800rpm/min室温离心5min。用高精度流式图像计数仪FILPLUS进行细胞计数，弃去上清，加入培养基重悬细胞。以每孔3.5～4×10⁴细胞的密度接种到6孔培养板上，在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养一天。以过夜能铺满为宜。(2)直线划痕：取出铺满六孔板的细胞，用200μL枪头垂直于细胞表面，由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。(3)PBS清洗细胞及培养：吸掉旧培养基，用无菌PBS洗各组细胞表面3次，去除划下的细胞，加入含有1％胎牛血清的培养基。轻轻摇动六孔板，使细胞培养液覆盖整个6孔板，放入37℃，5％C02培养箱中培养。(4)结果观察：分别取划痕0小时、24hr、48hr后观察不同处理组的划痕痕道宽度。结果可见：细胞划痕后48h观察到对照组细胞划痕宽度恢复约90％，实验组恢复约60％，表明实验组的细胞迁移受到抑制，而对照组细胞保持原有的迁移能力，在48h后通过迁移将划痕掩盖。

2.5.7平板克隆形成实验

(1)细胞准备：将处于对数生长期的各实验组A549、JT细胞(空载对照细胞、转染ACSM5野生型或突变型的细胞)胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。(2)细胞接种：于6孔培养板中接种各实验组约100个细胞/孔(正常增殖速度为1∶5～1∶10传代，3天长满细胞，可以接种50～200个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800～1000；接种时注意梯度稀释细胞悬液，观察细胞密度，以免因计数不准确导致实验结果偏差)，每个实验组设3个复孔，培养基为含10％FBS的完全培养基。(3)将接种好的细胞摇匀后轻放于培养箱中继续培养，每隔3天进行换液并观察细胞状态，并显微镜下观察克隆大小。(4)约培养10～14天，待孔中大多数单个克隆中细胞数约50时终止培养，弃上清，PBS洗涤细胞1次。

(5)每孔加入1mL4％多聚甲醛(有毒，注意在安全柜中操作)，4℃冰箱固定细胞60min，PBS洗涤细胞1次。(6)每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000μL，染细胞2min。(配成0.5％稀释到0.1％用就行，溶剂用甲醇，稀释用PBS)，(50mg加入10ml甲醇，然后再用PBS稀释5倍)。(7)ddH20洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数。

2.5.8 ACSM5及ACSM5-P425T对紫杉醇耐药

(1)将紫杉醇按如下比例稀释：0、5、10、20、40、80及160μg/ml。

(2)各实验组细胞传代并贴壁后，加入上述浓度梯度稀释后的紫杉醇继续培养细胞，余下步骤同发明2.5.1。

2.6体外动物实验

(1)实验分组：BALB/c裸鼠随机分为三组，分别为A549-NC组、

A549-ACSM5-1组(突变型)和A549-ACSM5组(野生型)，每组6只，共计18只。(2)实验前，将处于对数生长期的A549-NC组、A549-ACSM5-1(突变型)和A549-ACSM5组(野生型)三组细胞重悬为1×106，然后与基质胶按照1∶1比例配置及充分混匀。(3)将上述三组细胞混悬液无菌注射100μL至步骤(1)随机分组的各只裸鼠前肢腋下。(4)参数记录：从肿瘤成形开始，每隔一天测量一次成瘤大小(长径和短径)，两周后处死裸鼠，取完整肿瘤，测量和拍照后，分成两部分，部分固定于多聚甲醛(后续做病理切片)，部分冻存于-80℃冰箱(可做PCR等相关检测)。

2.6统计学分析

每个实验至少重复三次。采用SPSS21.0软件进行分析。计量资料分析前数据前进行正态性检验。正态数据以X±SD表示，偏态数据以中位数(P25-P75)表示。正态分布数据两组间比较采用两组独立样本的t检验，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析；偏态分布数据两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。计数资料以率(％)表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

Claims

1.ACSM5-P425T在构建治疗非小细胞肺癌药物检测模型中的应用，其特征在于，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5功能序列中1237位点的C碱基错义突变为A碱基，ACSM5序列的NCBI序列号为:NM_017888.2；

所述模型过表达ACSM5-P425T基因序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述模型为细胞系模型或动物模型。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞系模型构建方法为：细胞培养、含ACSM5-P425T基因序列的目的基因质粒构建、含目的基因质粒进行慢病毒包装、细胞感染、检测慢病毒包装的目的基因质粒滴度。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述动物模型的构建方法为：将过表达ACSM5-P425T基因序列的细胞注射进入小鼠中，培养后即可获得小鼠模型。

5.一种重组质粒在构建治疗非小细胞肺癌药物检测模型中的应用，其特征在于，所述重组质粒含ACSM5-P425T碱基序列，所述ACSM5-P425T序列为基因ACSM5功能序列中1237位点的C碱基错义突变为A碱基，ACSM5序列的NCBI序列号为:NM_017888.2。