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CN116806159A - 包含激肽释放酶相关肽酶2抗原结合结构域的免疫缀合物及其用途 - Google Patents

包含激肽释放酶相关肽酶2抗原结合结构域的免疫缀合物及其用途 Download PDF

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CN116806159A
CN116806159A CN202280011566.7A CN202280011566A CN116806159A CN 116806159 A CN116806159 A CN 116806159A CN 202280011566 A CN202280011566 A CN 202280011566A CN 116806159 A CN116806159 A CN 116806159A
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CN
China
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antigen binding
binding domain
independently
immunoconjugate
group
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280011566.7A
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English (en)
Inventor
沈飞
T·麦克德维特
S·戈德伯格
K·威利
R·M·史密斯
S·文卡塔拉马尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Priority claimed from PCT/IB2022/050673 external-priority patent/WO2022162549A2/en
Publication of CN116806159A publication Critical patent/CN116806159A/zh
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Abstract

本文提供了免疫缀合物，诸如放射性免疫缀合物，其包含与对hK2具有结合特异性的抗体或抗原结合结构域缀合的治疗部分。在某些实施方案中，该hK2特异性免疫缀合物展示出短半衰期。本文还提供了使用该免疫缀合物选择性靶向癌细胞和治疗疾病诸如前列腺癌的方法。

Description

包含激肽释放酶相关肽酶2抗原结合结构域的免疫缀合物及 其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月27日提交的美国临时专利申请63/142,147和2021年2月2日提交的美国临时专利申请63/144,586的优先权权益，这两篇专利申请的内容全文以引用方式并入本文并用于所有目的。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。2022年1月20日创建的所述ASCII副本命名为JBI6462WOPCT1_Seq Listing.txt，大小为755KB。
技术领域
本发明提供免疫缀合物，诸如放射性缀合物，其包含结合激肽释放酶相关肽酶2(hK2)蛋白的抗原结合结构域，以及制备和使用它们的方法。
背景技术
对于男性而言，前列腺癌是第二常诊断出的癌症和第六大癌症致死原因，在全世界男性中占总新癌症病例的约14％以及总癌症死亡的约6％。基于疾病的程度、激素状态以及是否存在可检测到的转移，将前列腺癌从被诊断出到死亡的过程最恰当地分类为以下一系列临床分期：局部疾病、放射疗法或外科手术后前列腺特异性抗原(PSA)的水平升高但不存在可检测到的转移，以及在非去势或去势期的临床转移。虽然外科手术、放射或这两者的组合对于患有局部疾病的患者可能有效，但是这些患者中有相当比例会患上复发性疾病，如通过PSA的水平升高所证实，复发可导致转移发展，特别是在高风险组中-转变为该疾病的致死期。
雄激素耗竭疗法(ADT)是具有以下通常可预见到的结果的标准治疗：PSA水平下降，肿瘤不增殖的稳定期，然后是PSA水平升高并再生长为去势难治性疾病。在过去，ADT一直是转移性前列腺癌患者的护理标准。
激肽释放酶相关肽酶2(hK2，HK2)是具有对前列腺组织和前列腺癌有特异性的雄激素受体(AR)驱动表达的胰蛋白酶样酶。hK2表达限于前列腺和前列腺癌组织，然而最近已展示出，在通过类固醇激素适当活化AR-途径后，在乳腺癌系和原代患者样品中可检测到hK2(美国专利公布2018/0326102)。当前列腺的高度结构化组织在过度增大或恶性转化后受损时，发生无催化活性的hK2逆行释放到血液中。
仍然需要用于治疗和诊断目的的下一代hK2靶向疗法。
发明内容
本发明的实施方案涉及一种用于治疗用途或显像的抗-hk2放射性缀合物，其包含与结合放射性金属的螯合剂缀合的抗原结合结构域。根据特定的实施方案，与包含全长抗体的抗hK2放射性缀合物相比，包含抗原结合结构域的抗hK2放射性缀合物具有更短的半衰期。
在许多情况下，免疫球蛋白G(IgG)在人中的循环半衰期为大约10天-21天。完整IgG中的Fc结构域能够结合新生儿Fc受体(FcRn)，从而导致抗体再循环和最小的内体降解。FcRn在血清IgG体内稳态以及IgG分子从母亲到胎儿的胎盘转移中起关键作用。胞饮作用后，早期内体的酸性环境允许IgG(以及白蛋白)与FcRn结合，这提供了免于降解的保护并且促进了IgG运输回到细胞外环境，其中这些分子在暴露于生理pH时离解回到循环中。
抗原结合结构域诸如Fab的循环半衰期趋于比IgG的循环半衰期短得多。由于Fab片段缺乏Fc结构域，FcRn介导的增强的半衰期机制缺乏，因此单独的Fab具有较短的半衰期(例如，小于24小时，或小于12小时，并且在一些情况下为约2小时-3小时)。
本发明的一个实施方案提供了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合的治疗部分。
根据某些实施方案，治疗部分为细胞毒性剂。
根据某些实施方案，治疗部分为显像剂。
根据某些实施方案，治疗部分包含放射性金属。合适的放射性金属的非限制性示例包括：225Ac、177Lu、32P、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm、227Th、177Lu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。
根据某些实施方案，治疗部分为包含225Ac的细胞毒性剂。
根据某些实施方案，治疗部分为包含111In的显像剂。
根据某些实施方案，治疗部分包含放射性金属络合物，其中该放射性金属络合物包含与螯合剂结合的放射性金属，并且其中该螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
根据某些实施方案，螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-4,7,10-三(乙酸)(DO3A)或它们的衍生物。
根据某些实施方案，螯合剂为DOTA。
根据某些实施方案，螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
根据某些实施方案，放射性金属络合物为如本文所述的式(I-m)或式(II-m)或式(III-m)的放射性络合物，其中R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域，并且M为放射性金属。
根据某些实施方案，放射性金属络合物为如本文所述的式(IV-m)或式(V-m)或式(VI-m)的放射性络合物，其中R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域，并且M+为放射性金属。
根据某些实施方案，治疗部分为澳瑞他汀衍生物，诸如MMAE(一甲基澳瑞他汀E)或MMAF(一甲基澳瑞他汀F)。
根据某些实施方案，结合hK2的抗原结合结构域为scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
根据某些实施方案，对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域为Fab。
根据某些实施方案，抗原结合结构域包含分别为SEQ ID NO:170(SYYWS)、SEQ IDNO:171(YIYYSGSTNYNPSLKS)、SEQ ID NO:172(TTIFGVVTPNFYYGMDV)、SEQ ID NO:173(RASQGISSYLA)、SEQ ID NO:174(AASTLQS)和SEQ ID NO:175(QQLNSYPLT)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
根据某些实施方案，结合hK2的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:162(QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS)的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:163(DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK)的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
根据某些实施方案，结合hK2的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:162的VH和SEQ IDNO:163的VL。
根据某些实施方案，抗原结合结构域为Fab，其包含：A)分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或B)SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
根据某些实施方案，该免疫缀合物为短半衰期免疫缀合物。
根据某些实施方案，治疗受试者的表达hK2的癌症的方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项所述的免疫缀合物。
根据某些实施方案，减少受试者中表达hK2的肿瘤细胞的量的方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项所述的免疫缀合物。
根据某些实施方案，治疗受试者的前列腺癌的方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据前述实施方案中任一项所述的免疫缀合物。
根据某些实施方案，该前列腺癌是复发性前列腺癌、难治性前列腺癌、恶性前列腺癌或去势难治性前列腺癌、或它们的任何组合。
根据某些实施方案，该前列腺癌是转移性去势难治性前列腺癌。
根据某些实施方案，检测受试者的前列腺癌的存在的方法，包括向怀疑患有前列腺癌的受试者施用根据前述实施方案中任一项所述的免疫缀合物，并使该缀合物所结合的生物结构可视化(例如，通过计算机断层扫描或正电子发射断层扫描)，从而检测前列腺癌的存在，其中该免疫缀合物优选包含显像剂，诸如111-In或64-Cu。根据某些实施方案，该方法包括将治疗部分与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
根据某些实施方案，制备如本文所述的放射性免疫缀合物的方法包括将放射性金属与螯合剂结合，该螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
根据某些实施方案，短半衰期放射性免疫缀合物包含放射性金属络合物，其中该放射性金属络合物包含与螯合剂结合的225Ac，并且其中该螯合剂与对hK2具有结合特异性的Fab缀合，所述Fab包含分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。根据某些实施方案，所述Fab包含SEQ ID NO:162的VH和SEQID NO:163的VL。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
在附图中：
图1示出本发明的免疫缀合物在表达hK2的VCaP细胞中的细胞结合和内化，该免疫缀合物包含与MMAF(一甲基澳瑞他汀F)缀合的KL2B30Fab(鉴定为KL2B997)。
图2示出了KL2B997和KL2B1251的氨基酸序列(重链和轻链序列)。KL2B997在重链上具有His标签和分选酶标签(图2中带下划线)，并且KL2B1251是无标签的。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文引用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
为了帮助本申请的读者，已将说明书分成各个段落或章节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些分割不应被认为是将段落或章节或实施方案的实质与另一段落或章节或实施方案的实质拆开。相反，本领域技术人员将理解，本说明书具有广泛的应用，并且涵盖可设想到的各个章节、段落和句子的所有组合。对任何实施方案的讨论仅意图是示例性的，并且不旨在表明本公开(包括权利要求书)的范围限于这些示例。
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
当提供一个列表时，除非另行指出，否则应当理解，该列表中的每个单独元素和该列表的每种组合都是单独的实施方案。例如，作为“A、B或C”呈现的实施方案的列表将被理解为包括实施方案“A”、“B”、“C”、“A或B”、“A或C”、“B或C”或者“A、B或C”。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
过渡术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”旨在暗示它们在专利用语中的公认含义；即，(i)“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，并且是包括端值在内或末端开放的，并且不排除附加的、未列出的要素或方法步骤；(ii)“由……组成”排除权利要求书未指定的任何要素、步骤或成分；以及(iii)“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤“以及本质上不影响受权利要求书保护的发明的基本及新颖特征的材料或步骤”。还提供了以短语“包括”(或其等同形式)描述的实施方案，如以“由……组成”和“基本上由……组成”独立描述的那些实施方案。
“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被的靶细胞与具有溶解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。
“抗原”是指能够由抗原结合结构域或能够介导免疫应答的T细胞受体结合的任何分子(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、它们的部分或它们的组合)。示例性免疫应答包括抗体产生和免疫细胞诸如T细胞、B细胞或NK细胞的活化。抗原可以是基因表达的、合成的或从生物样本(诸如组织样本、肿瘤样本、细胞或具有其他生物组分的流体、生物体、蛋白质/抗原的亚基、杀伤或灭活的全细胞或裂解物)中纯化的。
“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”是指分离蛋白质的结合抗原的部分。抗原结合结构域可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程化的多肽，并且包括免疫球蛋白的结合抗原的部分，诸如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd和Fv片段；由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)；鲨鱼可变IgNAR结构域；驼峰化VH结构域；VHH结构域；由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元；结合抗原的替代支架；以及包含抗原结合片段的多特异性蛋白质。抗原结合片段(诸如VH和VL)可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链表达的那些情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双链抗体。如本文所用，“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”不是指具有Fc区的全长抗体。
“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于身体中异常细胞的不受控制的生长。未受控制的细胞分裂和生长导致形成侵入相邻组织的恶性肿瘤，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。
“互补决定区”(CDR)是结合抗原的抗体区。VH中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且VL中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。CDR可使用各种描绘来定义，诸如Kabat(Wu等人，(1970)J Exp Med 132:211-50；Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia等人，(1987)J Mol Biol 196:901-17)、IMGT(Lefranc等人，(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)和AbM(Martin和Thornton，JBmol Biol 263:800-15,1996)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如Lefranc等人,(2003)Dev Comp Immunol,27:55-77；Honegger和Pluckthun，J Mol Biol(2001)309:657-70；国际免疫遗传学(IMGT)数据库；Web资源，http://www_imgt_org)。可用程序(诸如UCL Business PLC的abYsis)可用于描绘CDR。除非说明书中另有明确地说明，否则如本文所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia、IMGT或AbM)定义的CDR。
“降低”、“使……下降”、“减轻”、“减少”或“减弱”通常是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导减少的应答(即，下游效应)的能力。示例性应答是T细胞扩增、T细胞活化或T细胞介导的肿瘤细胞杀伤或蛋白质与其抗原或受体的结合，增强的与Fcγ的结合或增强的Fc效应子功能，诸如增强的ADCC、CDC和/或ADCP。下降可以是在测试分子与对照(或媒介物)之间测量的应答的统计学上显著的差异，或是测量的应答的下降，诸如下降约1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30倍或更多，诸如500、600、700、800、900或1000倍或更多(包括介于之间且高于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“分化”是指降低细胞的效力或增殖或者使细胞进入发育更受限状态的方法。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，这些聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同)和非编码链(其用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码该蛋白质，或者该基因或cDNA的其他产物。
“增强”、“促进”、“增加”、“扩增”或“改进”通常是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导更强的应答(即，下游效应)的能力。示例性应答是T细胞扩增、T细胞活化或T细胞介导的肿瘤细胞杀伤或蛋白质与其抗原或受体的结合，增强的与Fcγ的结合或增强的Fc效应子功能，诸如增强的ADCC、CDC和/或ADCP。增强可以是在测试分子与对照(或媒介物)之间测量的应答的统计学上显著的差异，或是测量的应答的增加，诸如增加约1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30倍或更多，诸如500、600、700、800、900或1000倍或更多(包括介于之间且高于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。抗体“表位”取决于用来鉴定表位的方法。
“扩增”是指细胞分裂和细胞死亡的结果。
“表达”是指在细胞中或体外发生的熟知的转录和翻译。表达产物(例如蛋白质)是由细胞表达的或体外表达的，并且可以是胞内蛋白质、胞外蛋白质或跨膜蛋白质。
“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“dAb”或“dAb片段”是指由VH结构域构成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544546(1989))。
“Fab”或“Fab片段”或“Fab区”是指结合抗原的抗体区。常规IgG通常包含两个Fab区，每个Fab区驻留在Y形IgG结构的两个臂中的一个臂上。每个Fab区通常由重链和轻链中的每一者的一个可变区和一个恒定区构成。更具体地，Fab区中重链的可变区和恒定区为VH和CH1区，并且Fab区中的轻链的可变区和恒定区为VL和CL区。Fab区中的VH、CH1、VL和CL可以各种方式布置以赋予根据本公开的抗原结合能力。例如，VH和CH1区可在一个多肽上，并且VL和CL区可在单独的多肽上，类似于常规IgG的Fab区。另选地，VH、CH1、VL和CL区可全部在同一多肽上并以不同的顺序取向。
“F(ab')2”或“F(ab')2片段”是指含有通过铰链区中的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
“Fd”或“Fd片段”是指由VH结构域和CH1结构域构成的抗体片段。
“Fv”或“Fv片段”是指由来自抗体的单臂的VH结构域和VL结构域构成的抗体片段。Fv片段缺乏Fab(CH1和CL)区的恒定区。Fv片段中的VH和VL通过非共价相互作用保持在一起。
二聚体Fc的“Fc多肽”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽中的一个多肽。例如，二聚体IgG FC的FC多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域序列。
“全长抗体”由通过二硫键以及它们的多聚体(例如IgM)互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)构成。每条重链由重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域构成，重链恒定结构域由亚结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)构成。VH和VL可被进一步细分成称作互补决定区(CDR)的超变区、散布其间的框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“宿主细胞”是指含有异源核酸的任何细胞。示例性异源核酸是载体(例如，表达载体)。
“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也源自人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区由使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含“源自”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。因为用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，所以体细胞突变的引入或有意将取代引入框架或CDR中或两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可以包含由人框架序列分析得出的共有框架序列(例如，如Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296:57-86所述)，或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如，如Shi等人，(2010)JMolBiol 397:385-96和国际专利公布WO2009/085462中。“人抗体”的定义中不包括至少一个CDR源自非人物种的抗体。
“人源化抗体”是指其中至少一个CDR来源于非人物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含取代，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
“与……组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用于受试者。
“分离的”是指已从产生分子的系统(诸如重组细胞)的其他组分中基本上分离和/或纯化出来的分子(诸如合成多核苷酸或多肽)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的分子，并且涵盖分离至更高纯度(诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度)的分子。
“激肽释放酶相关肽酶2”、“hK2”(本文也称为KLK2)是指已知的蛋白质，其也被称为激肽释放酶-2、腺激肽释放酶2或HK2。hK2作为前蛋白原产生并在蛋白水解期间裂解以生成活性蛋白酶。所有hK2同种型和变体均涵盖在“hK2”中。可从GenBank登录号NP_005542.1、NP_001002231.1和NP_001243009检索各种同种型的氨基酸序列。全长hK2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:62中。该序列包括信号肽(残基1-18)和前肽区(残基19-24)。
SEQ ID NO:62
MWDLVLSIALSVGCTGAVPLIQSRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWA
HCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSF
PHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEP
ALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHLLSNDMCARAYSEKVTEFM
LCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYT
KVVHYRKWIKDTIAANP
“调节”是指当与由对照或媒介物介导的应答相比时，测试分子介导增强或减少的应答(即，下游效应)的增强或降低的能力。
“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质群体中获得的抗体，即，除了可能熟知的改变(诸如从抗体重链移除C末端赖氨酸)或翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的、单价的、二价的或多价的。
“操作性连接”和类似短语在用于核酸或氨基酸时，分别是指彼此处于功能关系中的核酸序列或氨基酸序列的操作性连接。例如，操作性连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5'和3'UTR和终止子序列导致核酸分子(例如，RNA)的准确产生，并且在一些情况下导致多肽的产生(即，开放阅读框的表达)。操作性连接的肽是指其中肽的功能结构域彼此相距适当距离放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
术语“互补位”是指抗体分子的涉及抗原结合并且包含与抗原相互作用的残基的区域或区。互补位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。可以使用各种实验和计算方法以不同的细节水平定义和表征给定抗体的互补位。实验方法包括氢/氘交换质谱(HX-MS)。根据所采用的定位方法，互补位将被不同地定义。
“药物组合物”是指一起或单独施用的两种或更多种活性成分的组合。
“药物组合物”是指由活性成分和药学上可接受的载剂组合而成的组合物。
“药学上可接受的载剂”或“赋形剂”是指药物组合物中除活性成分之外的成分，该成分对受试者无毒。示例性的药学上可接受的载剂是缓冲液、稳定剂或防腐剂。
“多核苷酸”或“核酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其他等同共价化学物的合成分子。cDNA是多核苷酸的典型示例。多核苷酸可以是DNA或RNA分子。
“预防”疾病或病症意指预防受试者中出现病症。
“增殖”是指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)的增加。
“启动子”是指起始转录所需的最小序列。启动子还可以包括分别增强或阻抑转录的增强子或阻遏子元件。
“蛋白质”或“多肽”在本文中可互换使用，是指包含一个或多个多肽的分子，其中每个多肽各自包含由肽键连接的至少两个氨基酸残基。蛋白质可以是单体，或者可以是两个或更多个亚基的蛋白质复合物，所述亚基是相同的或不同的。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。蛋白质可以是异源融合蛋白、糖蛋白或通过翻译后修饰进行修饰的蛋白质，这些翻译后修饰诸如磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、瓜氨酸化、聚谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化或生物素化。蛋白质可以是重组表达的。
“重组”是指通过重组手段制备、表达、创建或分离的多核苷酸、多肽、载体、病毒和其他大分子。
“调控元件”是指控制核酸序列表达的一些方面的任何顺式或反式作用基因元件。
“复发”是指在先前用治疗剂治疗之后改善一段时间之后疾病或疾病的迹象和症状的再现。
“难治性”是指对治疗无应答的疾病。难治性疾病可在治疗之前或开始时对治疗具有抗性，或者难治性疾病可在治疗期间变得具有抗性。
“单链Fv”或“scFv”是指包含含有轻链可变区(VL)的至少一个抗体片段和含有重链可变区(VH)的至少一个抗体片段的融合蛋白，其中VL和VH经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。除非另外指明，否则如本文所用，scFv可以具有任一顺序的VL可变区和VH可变区，例如，相对于多肽的N末端和C末端，该scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
“(scFv)2”或“串联scFv”或“双scFv”片段是指包含两个轻链可变区(VL)和两个重链可变区(VH)的融合蛋白，其中两个VL区和两个VH区经由多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽。通过肽接头融合的两个VL区和两个VH区形成二价分子VLA-接头-VHA-接头-VLB-接头-VHB，以形成能够同时结合两个不同抗原或表位的两个结合位点。
“特异性结合”或“结合”是指蛋白质分子与抗原或该抗原内的表位以比对其他抗原更大的亲和力结合。通常，蛋白质分子与抗原或抗原内的表位结合，平衡解离常数(KD)为约1×10-7M或更低，例如约5×10-8M或更低、约1×10-8M或更低、约1×10-9M或更低、约1×10-10M或更低、约1×10-11M或更低或约1×10-12M或更低，通常KD比它与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的KD低至少一百倍。在本文所述的前列腺新抗原的上下文中，“特异性结合”是指蛋白质分子与前列腺新抗原的结合，而没有与新抗原为其变体的野生型蛋白质的可检测结合。如本文所用，“对hK2具有结合特异性”的抗体或抗原结合结构域是指分别与hK2特异性结合的抗体或抗原结合结构域。
“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。
“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且在本文中同义使用。T细胞包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、记忆T细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助性(Th)细胞，例如T辅助性1(Th1)或T辅助性2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)、CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润性细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞或T细胞的任何其他亚群。还包括“NKT细胞”，是指表达半不变αβT细胞受体但也表达通常与NK细胞相关联的多种分子标志物(诸如NK1.1)的特化T细胞群。NKT细胞包括NK1.1+细胞和NK1.1-细胞，以及CD4+细胞、CD4-细胞、CD8+细胞和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR的独特之处在于它识别由MHC I样分子CD Id递呈的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可具有保护作用或有害作用。还包括“gamma-delta T细胞(γδT细胞)”，其是指特化的群体，即在其表面上具有独特TCR的T细胞的小子集，与其中TCR由被命名为α-TCR链和β-TCR链的两种糖蛋白链构成的大多数T细胞不同，γδT细胞中的TCR由γ-链和δ-链组成。γδT细胞可以在免疫监视和免疫调节中起作用，并且被发现是IL-17的重要来源以及诱导强烈的CD8+细胞毒性T细胞应答。还包括“调节性T细胞”或“Treg”，其是指抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg通常是转录因子Foxp3-阳性CD4+T细胞，并且还可包括转录因子Foxp3-阴性调节性T细胞，它们是产生IL-10的CD4+T细胞。
“治疗有效量”或“有效量”在本文中互换使用，是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括，例如：患者健康状况的改善、肿瘤负荷的减少、肿瘤生长的遏止或减慢和/或癌细胞没有向身体其他部位转移的情况。
“转导”是指使用病毒载体将外来核酸引入细胞中。
疾病或病症(诸如癌症)的“治疗”是指实现以下结果中的一种或多种：降低病症的严重程度和/或缩短病症的持续时间、抑制所治疗病症的特征性症状的恶化、限制或防止先前患有病症的受试者中该病症的复发，或者限制或防止先前有病症的症状的受试者中症状的复发。
“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。然而转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、摄取外源核酸而发生，或者其也可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标志物水平调节、侵入、肿瘤生长。
“变体”、“突变体”或“改变的”是指由于一处或多处修饰(例如，一个或多个取代、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，根据EU索引进行抗体恒定区中的氨基酸残基的编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中描述的。
Ig恒定区中的突变称为如下：L351Y_F405A_Y407V，是指一个免疫球蛋白恒定区中的L351Y、F405A和Y407V突变。L351Y_F405A_Y407V/T394W是指一种多聚体蛋白质中存在的第一Ig恒定区中的L351Y、F405A和Y407V突变和第二Ig恒定区中的T394W突变。
“VHH”是指仅由重链的抗原结合结构域构成的单结构域抗体或纳米抗体。VHH单结构域抗体缺乏常规Fab区的轻链和重链的CH1结构域。
化学命名
通常，对某种元素诸如氢或H的提及意在包括该元素的所有同位素。例如，如果将R基团定义为包括氢或H，则其还包括氘和氚。包含放射性同位素诸如氚、C14、P32和S35的化合物因此在本技术的范围内。基于本文的公开内容，将此类标记物插入本技术的化合物中的方法对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
术语“取代的”是指至少一个氢原子被非氢基团置换，前提条件是保持所有正常化合价并且取代产生稳定的化合物。当特定基团被“取代”时，该基团可具有一个或多个取代基，优选地一至五个取代基，更优选地一至三个取代基，最优选地一至二个取代基，这些取代基独立地选自取代基列表。例如，“取代的”是指如以下定义的有机基团(例如，烷基基团)，其中一个或多个与其中所含的氢原子的键被与非氢原子或非碳原子的键置换。取代的基团还包括其中一个或多个与碳原子或氢原子的键被一个或多个与杂原子的键(包括双键或三键)置换。因此，除非另有说明，否则取代的基团被一个或多个取代基取代。在一些实施方案中，取代的基团被1、2、3、4、5或6个取代基取代。取代基基团的示例包括：卤素(即，F、Cl、Br和I)；羟基；烷氧基、烯氧基、芳氧基、芳烷氧基、杂环基、杂环基烷基、杂环氧基和杂环烷氧基基团；羰基(氧代)；羧酸盐；酯；氨基甲酸酯；肟；羟胺；烷氧基胺；芳烷氧基胺；硫醇；硫化物；亚砜；砜；磺酰基；五氟硫烷基(即SF)、磺酰胺；胺；N-氧化物；肼；酰肼；腙；叠氮化物；酰胺；脲；脒；胍；烯胺；酰亚胺；异氰酸酯；异硫氰酸酯；氰酸酯；硫氰酸酯；亚胺；硝基；腈(即，CN)；等。当参考取代基使用时，术语“独立地”是指当可能有多于一个此类取代基时，此类取代基可彼此相同或不同。
取代的环基团诸如取代的环烷基、芳基、杂环基和杂芳基基团还包括环和环系，其中与氢原子的键被与碳原子的键置换。因此，取代的环烷基、芳基、杂环基和杂芳基基团也可以被如以下定义的取代或未取代的烷基、烯基和炔基基团取代。
如本文所用，当在基团之前使用时，Cm-Cn诸如C1-C11、C1-C8或C1-C6是指含有m至n个碳原子的基团。
烷基基团包括具有1至12个碳原子，并且通常1至10个碳，或在一些实施方案中，1至8个、1至6个或1至4个碳原子的直链和支链烷基基团。直链烷基基团的示例包括诸如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基基团的基团。支链烷基基团的示例包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、异戊基和2,2-二甲基丙基基团。烷基基团可为取代或未取代的。代表性的取代的烷基基团可以被诸如以上列出的那些的取代基取代一次或多次，并且包括但不限于卤代烷基(例如，三氟甲基)、羟烷基、硫代烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、烷氧基烷基、羧基烷基等。
环烷基基团包括单环、二环或三环烷基基团，其在环中具有3至12个碳原子，或在一些实施方案中，3至10个、3至8个或3至4个、5个或6个碳原子。示例性单环环烷基基团包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基基团。在一些实施方案中，环烷基基团具有3至8个环成员，而在其他实施方案中，环碳原子的数目范围为3至5、3至6或3至7。二环和三环环系包括桥环烷基基团和稠环，诸如但不限于二环[2.1.1]己烷、金刚烷基、十氢萘基等。环烷基基团可为取代或未取代的。取代的环烷基基团可以被如以上所定义的非氢基团和非碳基团取代一次或多次。然而，取代的环烷基基团还包括被如以上所定义的直链或支链烷基取代的环。代表性的取代的环烷基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于可以被诸如以上所列那些的取代基取代的2,2-二取代的、2,3-二取代的、2,4-二取代的、2,5-二取代的或2,6-二取代的环己基基团。
环烷基烷基基团是如以上所定义的烷基基团，其中烷基基团的氢键或碳键被与如上定义的环烷基基团的键置换。在一些实施方案中，环烷基烷基基团具有4至16个碳原子、4至12个碳原子，并且通常4至10个碳原子。环烷基烷基基团可为取代或未取代的。取代的环烷基烷基基团可以在该基团的烷基部分、环烷基部分或烷基部分和环烷基部分两者处被取代。代表性的取代的环烷基烷基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于被诸如以上所列那些的取代基单取代、二取代或三取代。
烯基基团包括如以上所定义的直链和支链烷基基团，除了在两个碳原子之间存在至少一个双键。烯基基团具有2至12个碳原子，并且通常2至10个碳，或在一些实施方案中，2至8个、2至6个或2至4个碳原子。在一些实施方案中，烯基可具有一个碳-碳双键或多个碳-碳双键，诸如2个、3个、4个或更多个碳-碳双键。烯基基团的示例包括但不限于次甲基、乙烯基、丙烯基、丁烯基等。烯基基团可为取代的或未取代的。代表性的取代的烯基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于被诸如以上所列那些的取代基单取代、二取代或三取代。
环烯基基团包括如以上所定义的环烷基基团，其在两个碳原子之间具有至少一个双键。环烯基基团可为在环中具有3至12个、更优选地3至8个碳原子并且在两个碳原子之间包含至少一个双键的单环或多环烷基基团。环烯基基团可为取代或未取代的。在一些实施方案中，环烯基基团可具有一个、两个或三个双键或多个碳-碳双键，诸如2个、3个、4个或更多个碳-碳双键，但不包括芳族化合物。环烯基基团具有3至14个碳原子，或在一些实施方案中，5至14个碳原子、5至10个碳原子、或甚至5个、6个、7个或8个碳原子。环烯基基团的示例包括环己烯基、环戊烯基、环己二烯基、环丁二烯基和环戊二烯基。
环烯基烷基基团是如以上所定义的烷基基团，其中烷基基团的氢键或碳键被与如上定义的环烯基基团的键置换。环烯基烷基基团可为取代或未取代的。取代的环烯基烷基基团可以在该基团的烷基部分、环烯基部分或烷基部分和环烯基部分两者处被取代。代表性的取代的环烯基烷基基团可以被诸如以上所列那些的取代基取代一次或多次。
炔基基团包括如以上所定义的直链和支链烷基基团，除了在两个碳原子之间存在至少一个三键。炔基基团具有2至12个碳原子，并且通常2至10个碳，或在一些实施方案中，2至8个、2至6个或2至4个碳原子。在一些实施方案中，炔基基团具有一个、两个或三个碳-碳三键。示例包括但不限于-C＝CH、-C＝CCH3、-CH2C＝CCH3、-C＝CCH2CH(CH2CH3)2等。炔基基团可为取代或未取代的。末端炔烃具有至少一个结合到三键碳原子的氢原子。代表性的取代的炔基基团可以被单取代或取代多于一次，诸如但不限于被诸如以上所列那些的取代基单取代、二取代或三取代。“环状炔烃”或“环炔基”为在两个碳原子之间包含至少一个三键的环烷基环。环状炔烃或环炔基基团的示例包括但不限于环辛炔、双环壬炔(BCN)、二氟化环辛炔(DIFO)、二苯并环辛炔(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔(DIBAC)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)、单苯并环辛炔(MOBO)和四甲氧基DIBO(TMDIBO)。
芳基基团是不含杂原子的环状芳族烃。本文中的芳基基团包括单环、双环和三环环系。因此，芳基基团包括但不限于苯基、甘菊环基(azulenyl)、并环庚烯基(heptalenyl)、联苯基、芴基、菲基、蒽基、茚基、茚满基、并环戊二烯基(pentalenyl)和萘基基团。在一些实施方案中，芳基在基团的环部分中含有6-14个碳，并且在其他实施方案中含有6至12个或甚至6-10个碳原子。在一些实施方案中，芳基基团为苯基或萘基。芳基基团可为取代或未取代的。短语“芳基基团”包括含有稠环的基团，诸如稠合的芳族-脂族环系(例如茚满基、四氢萘基等)。代表性的取代的芳基基团可以是单取代的或被取代多于一次。例如，单取代的芳基基团包括但不限于可以被诸如以上所列那些的取代基取代的2-取代的、3-取代的、4-取代的、5-取代的或6-取代的苯基或萘基基团。芳基部分是熟知的，并且描述于例如Lewis,R.J.编辑，Hawley’s Condensed Chemical Dictionary，第13版，John Wiley&Sons,Inc.,NewYork(1997)。芳基基团可为单环结构(即单环)或包含为稠环结构的多环结构(即多环)。优选地，芳基基团为单环芳基基团。
烷氧基基团是其中与氢原子的键被与如以上所定义的取代或未取代的烷基基团的碳原子的键置换的羟基基团(-OH)。直链烷氧基基团的示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。支链烷氧基具有的示例包括但不限于异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异戊氧基、异己氧基等。环烷氧基基团的示例包括但不限于环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。烷氧基基团可为取代或未取代的。代表性的取代的烷氧基基团可以被诸如以上所列那些的取代基取代一次或多次。
类似地，烷硫基或硫代烷氧基是指-SR基团，其中R为通过硫桥附接到母体分子的烷基，例如-S-甲基、-S-乙基等。烷硫基的代表性示例包括但不限于-SCH3、-SCH2CH3等。
本文所用的术语“卤素”是指溴、氯、氟或碘。相应地，术语“卤代基”是指氟代基、氯代基、溴代基或碘代基。在一些实施方案中，卤素为氟。在其他实施方案中，卤素为氯或溴。
术语“羟基(hydroxy)”和“羟基(hydroxyl)”可互换使用并且是指-OH。
术语“羧基”是指-COOH。
术语“氰基”是指-CN。
术语“硝基”是指-NO2。
术语“异硫氰酸酯”是指-N＝C＝S。
术语“异氰酸酯”是指-N＝C＝O。
术语“叠氮基”是指-N3。
术语“氨基”是指-NH2。术语“烷基氨基”是指其中附接到氮的氢原子中的一个或两个氢原被烷基基团取代的氨基基团。烷基胺基团可表示为-NR2，其中每个R独立地为氢或烷基基团。例如，烷基胺包括甲胺(-NHCH3)、二甲胺(-N(CH3)2)、-NHCH2CH3等。如本文所用，术语“氨基烷基”旨在包括被一个或多个氨基基团取代的支链饱和脂族烃基团和直链饱和脂族烃基团两者。氨基烷基基团的代表性示例包括但不限于-CH2NH2、-CH2CH2NH2和-CH2CH(NH2)CH3。
如本文所用，“酰胺”是指-C(O)N(R)2，其中每个R独立地为烷基基团或氢。酰胺的示例包括但不限于-C(O)NH2、-C(O)NHCH3和-C(O)N(CH3)2。
术语“羟基烷基”和“羟烷基”可互换使用，并且是指被一个或多个羟基基团取代的烷基基团。烷基可为支链或直链脂族烃。羟基烷基的示例包括但不限于羟甲基(-CH2OH)、羟乙基(-CH2CH2OH)等。
如本文所用，术语“杂环基”包括含有至少一个杂原子环成员(诸如硫、氧或氮)的稳定单环和多环烃。如本文所用，术语“杂芳基”包括含有至少一个杂原子环成员(诸如硫、氧或氮)的稳定单环和多环芳族烃。杂芳基可为单环或多环的，例如双环或三环的。含有杂原子的杂环基或杂芳基基团的每个环可含有一个或两个氧或硫原子和/或一至四个氮原子，前提条件是每个环中的杂原子总数为四个或更少，并且每个环具有至少一个碳原子。多环(例如双环或三环)的杂芳基基团必须包括至少一个全芳环，但另一个或多个稠环可为芳族或非芳族的。杂环基或杂芳基基团可附接在杂环基或杂芳基基团的任何环的任何可用的氮或碳原子处。优选地，术语“杂芳基”是指在至少一个环中具有至少一个杂原子(O、S或N)的5元或6元单环基团和9元或10元双环基团，其中含杂原子的环优选地具有选自O、S和/或N的1、2或3个杂原子、更优选地1或2个杂原子。杂芳基的氮杂原子可为取代或未取代的。另外，杂芳基的氮和硫杂原子可任选地被氧化(即，N→O和S(O)r，其中r为0、1或2)。
术语“酯”是指-C(O)2R，其中R为烷基。
术语“氨基甲酸酯”是指-OC(O)NR2，其中每个R独立地为烷基或氢。
术语“醛”是指-C(O)H。
术语“碳酸酯”是指-OC(O)OR，其中R为烷基。
术语“马来酰亚胺”是指具有化学式H2C2(CO)2NH的基团。术语“马来酰亚胺基”是指共价连接到另一基团或分子的马来酰亚胺基团。优选地，马来酰亚胺基团为N-连接的，例如：
术语“酰卤”是指-C(O)X，其中X为卤代基(例如Br、Cl)。示例性酰卤包括酰基氯(-C(O)Cl)和酰基溴(-C(O)Br)。
根据本领域中使用的惯例：
用于本文的结构式中以描述作为部分、官能团或取代基与核心、母体或主链结构(诸如本发明的抗原结合结构域)的附接点的键。
当任何变量在化合物的任何成分或式中出现不止一次时，它在每次出现时的定义独立于它在其他每次出现时的定义。因此，例如，如果基团示出被0-3个R基团取代，则所述基团可任选地被至多三个R基团取代，并且在每次出现时，R独立地选自R的定义。
当与取代基连接的键显示为与连接环中两个原子的键交叉时，则此类取代基可结合到环上的任何原子。
如本文所用，术语“放射性金属离子(radiometal ion)”或“放射性金属离子(radioactive metal ion)”或“放射性同位素”或“放射性金属”是指发射粒子和/或光子的元素的一种或多种同位素。根据本公开，本领域技术人员已知的任何放射性金属离子可用于本发明中。根据本发明可用于治疗应用的放射性同位素的非限制性示例包括例如β发射体或α发射体，诸如例如225Ac、177Lu、32P、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm和227Th。根据本发明可用作显像剂的放射性同位素的其他非限制性示例包括发射γ的放射性同位素，诸如例如177Lu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。在某些实施方案中，放射性金属离子是“治疗发射体”，意指可用作治疗剂的放射性金属离子，例如用作能够减少或抑制癌细胞(诸如前列腺癌细胞)生长或具体地讲杀死癌细胞(诸如前列腺癌细胞)的细胞毒性剂。治疗发射体的示例包括但不限于β发射体或α发射体，诸如132La、135La、134Ce、144Nd、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、177Lu、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、225Ac、255Fm以及227Th、226Th、230U。优选地，本发明中使用的放射性金属离子为发射α的放射性金属离子，诸如锕-225(225Ac)。
如本文所用，“放射性金属络合物”是指包含与作为大环化合物的螯合剂缔合的放射性金属离子的络合物。通常，放射性金属离子经由配位键合与大环化合物结合或配位。大环的杂原子可参与放射性金属离子与大环化合物的配位键合。大环化合物可被一个或多个取代基基团取代，并且除了大环的杂原子以外或另选地，该一个或多个取代基基团也可参与放射性金属离子与大环化合物的配位键合。
免疫缀合物
本发明的实施方案涉及用于用短半衰期的基于Fab的放射性缀合物靶向hK2以在前列腺癌患者中实现有效的肿瘤细胞死亡的组合物和方法；优选地，此类放射性缀合物包含Fab(而不是全长抗体)并且与基于全长抗体的放射性缀合物相比展示出改善的安全性特征(例如，如通过骨髓毒性所测量的)。本发明的基于Fab的放射性缀合物的实施方案靶向表达hK2的前列腺癌细胞并展示出短半衰期。
如本文所用，“免疫缀合物”是指与第二分子诸如毒素、药物、放射性金属离子、螯合剂、放射性金属络合物等缀合(接合，例如，经由共价键结合)的抗体或其抗原结合结构域。具体地，“放射性免疫缀合物”(本文中也称为“放射性缀合物”)为其中抗体或抗原结合结构域用放射性金属标记或与放射性金属络合物缀合的免疫缀合物。
根据本发明的实施方案，免疫缀合物包含与本发明的对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域缀合的治疗部分。如本文所用，形成免疫缀合物的一部分的“治疗部分”可用于治疗应用和/或显像应用，即分别作为治疗剂(例如，细胞毒性剂)和/或显像剂。例如，本发明的治疗部分可包含放射性金属。注意，某些放射性金属可用作治疗剂(例如，225Ac)和/或显像剂(例如，111In)。合适的治疗剂是能够减少或抑制癌细胞(诸如前列腺癌细胞)的生长或具体地讲杀死癌细胞(诸如前列腺癌细胞)的治疗剂。在某些实施方案中，包含与抗原结合结构域缀合的放射性同位素的放射性缀合物可递送细胞毒性有效载荷，其具有通过结合到癌细胞表面抗原上并引发细胞死亡而在肿瘤附近发射α和/或β粒子的能力。
根据优选的实施方案，本发明涉及短半衰期免疫缀合物(例如短半衰期放射性免疫缀合物)。如本文所用，“短半衰期免疫缀合物”是指包含抗原结合结构域(例如，Fab)的免疫缀合物，其中该免疫缀合物具有的体内半衰期短于比较免疫缀合物的体内半衰期，其中该比较免疫缀合物与短半衰期免疫缀合物相同，除了该比较免疫缀合物的抗原结合结构域被包含该抗原结合结构域的全长抗体(例如，包含Fc区和抗原结合结构域的全长IgG)替代。在某些实施方案中，本发明的短半衰期免疫缀合物具有36小时或更少、或24小时或更少、或12小时或更少、或6小时或更少、或3小时或更少的半衰期。例如，本发明的短半衰期免疫缀合物可具有约1小时至约36小时，或约1小时至约24小时，或约1小时至约12小时，或约1小时至约6小时，或约1小时至约3小时，或约2小时至约3小时的半衰期。
锕-225(225Ac)是发射α的放射性同位素，其对于医学应用而言特别令人感兴趣。另一种用于医学应用的受关注的放射性同位素为镥-177(177Lu)，其发射适用于成像的γ辐射和适用于放射疗法的中能β辐射两者。根据本发明可用于治疗应用的放射性同位素的非限制性示例包括例如β发射体或α发射体，诸如例如225Ac、177Lu、32P、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm和227Th。根据本发明可用作显像剂的放射性同位素的其他非限制性示例包括发射γ的放射性同位素，诸如例如177Lu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。
在某些实施方案中，治疗部分是细胞毒性剂，其为澳瑞他汀衍生物，诸如MMAE(一甲基澳瑞他汀E)或MMAF(一甲基澳瑞他汀F)。例如，澳瑞他汀衍生物可通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端(WO02/088172)或经由工程化到抗体或抗原结合结构域中的任何半胱氨酸附接到本发明的抗体或抗原结合结构域。
抗-hK2抗体和抗原结合结构域
如本文所述，本发明的实施方案涉及一种免疫缀合物，其包含与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合的治疗部分。根据某些实施方案，抗原结合结构域为scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。根据一个优选的实施方案，对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域为Fab。
根据某些实施方案，结合hK2的抗原结合结构域(例如，Fab)包含分别为SEQ IDNO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
根据某些实施方案，结合hK2的抗原结合结构域(例如，Fab)包含与SEQ ID NO:162的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:163的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。例如，结合hK2的抗原结合结构域(例如，Fab)包含与SEQ ID NO:
162的VH有至少95％同一性的VH和与SEQ ID NO:163的VL有至少95％同一性的VL。根据某些实施方案，结合hK2的抗原结合结构域(例如，Fab)包含SEQ ID NO:162的VH和SEQID NO:163的VL。
根据某些实施方案，抗原结合结构域为“KL2B30 Fab”，也称为“KL2B30的Fab”，其是包含下列的Fab：(a)分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或(b)与SEQ ID NO:162有至少95％同一性或100％同一性的VH和与SEQ ID NO:163有至少95％同一性或100％同一性的VL。
KL2B30 Fab的非限制性示例包括KL2B997和KL2B1251，其在以下实施例部分中进行描述。表2中提供了KL2B997和KL2B1251的重链序列和轻链序列。KL2B997在重链上具有His标签和分选酶标签(图2中带下划线)，并且KL2B1251是无标签的。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含具有下述某些抗体的氨基酸序列的VL、VH或CDR，该抗体选自由以下项组成的组：m11B6、hu11B6、HCF3-LCD6、HCG5-LCB7、KL2B357、KL2B358、KL2B359、KL2B360、KL2B413、KL2B30、KL2B53、KL2B242、KL2B467和KL2B494。前述抗体和抗原结合结构域及其制备方法描述于PCT/IB2020/056972中，其以引用方式并入本文。
本发明的一个实施方案提供了具有以下结构的放射性免疫缀合物(其不示出与苯基硫脲部分连接的Fab的赖氨酸残基)：
(也称为TOPA-[C7]-苯基硫脲-Fab)，
其中M+为放射性同位素，诸如锕-225(225Ac)，并且
其中Fab对hK2具有结合特异性，诸如KL2B30 Fab(例如，KL2B997或KL2B1251)。Fab优选地包含(a)分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或(b)与SEQ ID NO:162有至少95％同一性或100％同一性的VH和与SEQ ID NO:163有至少95％同一性或100％同一性的VL。
本发明的一个实施方案提供了具有以下结构的放射性免疫缀合物(其不示出与苯基硫脲部分连接的Fab的赖氨酸残基)：
其中Fab对hK2具有结合特异性，诸如KL2B30 Fab(例如，KL2B997或KL2B1251)。Fab优选地包含(a)分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或(b)与SEQ ID NO:162有至少95％同一性或100％同一性的VH和与SEQ ID NO:163有至少95％同一性或100％同一性的VL。
具体编号的实施方案
下面提供了本发明的示例性编号的实施方案。
1.一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含：与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合的治疗部分。
2.根据实施方案1所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为细胞毒性剂。
3.根据实施方案1所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为显像剂。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分包含放射性金属。
5.根据实施方案4所述的免疫缀合物，其中该放射性金属选自由以下项组成的组：225Ac、177Lu、32P、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm、227Th、177Lu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。
6.根据实施方案1所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为包含225Ac的细胞毒性剂。
7.根据实施方案1所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为包含111In或64Cu的显像剂。
8.根据实施方案4至7中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分包含放射性金属络合物，其中该放射性金属络合物包含与螯合剂结合的放射性金属，并且其中该螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
9.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-4,7,10-三(乙酸)(DO3A)或它们的衍生物。
10.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该螯合剂为DOTA或NOTA或其衍生物。
11.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
12.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为如本文所述的式(I-m)或式(II-m)或式(III-m)的放射性络合物，其中R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域，并且M为放射性金属。
13.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为如本文所述的式(IV-m)或式(V-m)或式(VI-m)的放射性络合物，其中R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域，并且M+为放射性金属。
14.根据实施方案1所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为澳瑞他汀衍生物。
15.根据实施方案14所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为MMAE(一甲基澳瑞他汀E)。
16.根据实施方案14所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为MMAF(一甲基澳瑞他汀F)。
17.根据实施方案1至16或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该结合hK2的抗原结合结构域为scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
18.根据实施方案1至16或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域为Fab。
19.根据实施方案1至18或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该抗原结合结构域包含分别为SEQ ID NO:170(SYYWS)、SEQ ID NO:171(YIYYSGSTNYNPSLKS)、SEQ ID NO:172(TTIFGVVTPNFYYGMDV)、SEQ ID NO:173(RASQGISSYLA)、SEQ ID NO:174(AASTLQS)和SEQID NO:175(QQLNSYPLT)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
20.根据实施方案1至19或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该结合hK2的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:162(QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS)的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:163(DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK)的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
21.根据实施方案1至19或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该结合hK2的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
22.根据实施方案1至18或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该抗原结合结构域为Fab，该Fab包含：
a.分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或
b.SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
23.根据实施方案1至22或51至56中任一项所述的免疫缀合物，其中该免疫缀合物为短半衰期免疫缀合物。
24.一种治疗受试者的表达hK2的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至23或51至56中任一项所述的免疫缀合物。
25.一种减少受试者中表达hK2的肿瘤细胞的量的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至23或51至56中任一项所述的免疫缀合物。
26.一种治疗受试者的前列腺癌的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的根据实施方案1至23或51至56中任一项所述的免疫缀合物。
27.根据实施方案26所述的方法，其中该前列腺癌为复发性、难治性、恶性或去势难治性前列腺癌、或它们的任何组合。
28.根据实施方案26所述的方法，其中该前列腺癌为转移性去势难治性前列腺癌。
29.一种检测受试者中前列腺癌的存在的方法，包括向怀疑患有前列腺癌的受试者施用根据实施方案1至23或51至56中任一项所述的免疫缀合物，并使该缀合物所结合的生物结构可视化(例如，通过计算机断层扫描或正电子发射断层扫描)，从而检测前列腺癌的存在，其中该免疫缀合物优选地包含显像剂，诸如111-In或64-Cu。
30.一种制备根据实施方案1至23或51至56中任一项所述的免疫缀合物的方法，该方法包括：将该治疗部分与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
31.一种制备放射性免疫缀合物的方法，所述方法包括将放射性金属与螯合剂结合，所述螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
32.根据实施方案31所述的方法，其中该螯合剂为DOTA或NOTA或其衍生物。
33.根据实施方案31所述的方法，其中该螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
34.根据实施方案31所述的方法，其中该螯合剂选自由以下项组成的组：如本文所述的式(I)、式(II)和式(III)的螯合剂，其中R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域。
35.根据实施方案31所述的方法，其中该螯合剂选自由以下项组成的组：如本文所述的式(IV)、式(V)和式(VI)的螯合剂，其中R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域。
36.根据实施方案31至35中任一项所述的方法，其中该结合hK2的抗原结合结构域为scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。
37.根据实施方案31至35中任一项所述的方法，其中该结合hK2的抗原结合结构域为Fab。
38.根据实施方案31至37中任一项所述的方法，其中该抗原结合结构域包含分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
39.根据实施方案31至38中任一项所述的方法，其中该结合hK2的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:162的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:163的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
40.根据实施方案31至38中任一项所述的方法，其中该结合hK2的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
41.根据实施方案31至37中任一项所述的方法，其中该抗原结合结构域为Fab，该Fab包含：
a.分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或
b.SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
42.一种包含放射性金属络合物的短半衰期放射性免疫缀合物，其中该放射性金属络合物包含与螯合剂结合的225Ac，并且其中该螯合剂与对hK2具有结合特异性的Fab缀合，所述Fab包含：分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
43.根据实施方案42所述的短半衰期放射性免疫缀合物，所述Fab包含SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
44.根据实施方案42或实施方案43所述的短半衰期放射性免疫缀合物，其中该螯合剂为DOTA或NOTA或其衍生物。
45.根据实施方案42或实施方案43所述的短半衰期放射免疫缀合物，其中该螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
46.根据实施方案42或实施方案43所述的短半衰期放射性免疫缀合物，其中该放射性金属络合物选自由以下项组成的组：如本文所述的式(I-m)、式(II-m)和式(III-m)的螯合剂，其中R11包含对hK2具有结合特异性的Fab。
47.根据实施方案42或实施方案43所述的短半衰期放射性免疫缀合物，其中该放射性金属络合物选自由以下项组成的组：如本文所述的式(IV-m)、式(V-m)和式(VI-m)的螯合剂，其中R4包含对hK2具有结合特异性的Fab。
48.根据实施方案31至37中任一项所述的方法，还包括在将放射性金属与螯合剂结合之前，将该螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
49.根据实施方案48所述的方法，其中在将该螯合剂与抗原结合结构域缀合之前，该螯合剂具有结构
50.根据实施方案48所述的方法，其中在将该螯合剂与抗原结合结构域缀合之前，该螯合剂具有结构
51.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为式(I-m)的放射性金属络合物，
其中该式(I-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
其中：
M为该放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，并且更优选地锕-225(225Ac)；
环A和环B各自独立地为6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中环A和环B各自任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下项组成的组：卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和X；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；前提条件是该放射性金属络合物包含至少一个X，并且当X存在于环A或环B上时，L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢。
52.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为式(II-m)的放射性金属络合物，
其中该式(II-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
其中：
M为该放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，并且更优选地锕-225(225Ac)；
A1为N或CR1或不存在；
A2为N或CR2；
A3为N或CR3；
A4为N或CR4；
A5为N或CR5；
A6为N或CR6或不存在；
A7为N或CR7；
A8为N或CR8；
A9为N或CR9；
A10为N或CR10；
前提条件是A1、A2、A3、A4和A5中不超过三者为N，并且
A6、A7、A8、A9和A10中不超过三者为N；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地选自由以下项组成的组：氢、卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-
OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和-X，或者，另选地，任两个直接相邻的R1、R2、R3、R4、R5、R6、
R7、R8、R9和R10与它们所附接的原子合在一起以形成五元或六元
取代或未取代的碳环或含氮环；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；
前提条件是该放射性金属络合物包含至少一个X，并且当R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中任一者为X时，则L1为连接基，或R12和R14-R17中至少一者不是氢。
53.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为式(III-m)的放射性金属络合物，
其中该式(III-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
其中：
M为该放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，并且更优选地锕-225(225Ac)；
每个A11独立地为O、S、NMe或NH；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；并且
每个R18独立地选自由以下项组成的组：氢、卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和-X，
前提条件是该放射性金属络合物包含至少一个X，并且R18为X时，则L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢。
54.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为式(IV-m)的放射性金属络合物，
其中该式(IV-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为优选地选自由以下项组成的组的放射性金属：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域。
55.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为式(V-m)的放射性金属络合物，
其中该式(V-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为优选地选自由以下项组成的组的放射性金属：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；
R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域。
56.根据实施方案8所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为式(VI-m)的放射性金属络合物，
其中该式(VI-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为优选地选自由以下项组成的组的放射性金属：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；并且
R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域。
57.一种免疫缀合物，包含：与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合的治疗部分，其中该抗原结合结构域包含分别为SEQ ID NO:170(SYYWS)、SEQ ID NO:171(YIYYSGSTNYNPSLKS)、SEQ ID NO:172(TTIFGVVTPNFYYGMDV)、SEQID NO:173(RASQGISSYLA)、SEQ ID NO:174(AASTLQS)和SEQ ID NO:175(QQLNSYPLT)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
58.根据实施方案57所述的免疫缀合物，其中该结合hK2的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:162(QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGTTIFGVVTPNFYYGMDVWGQGTTVTVSS)的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO:163(DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK)的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
59.根据实施方案57所述的免疫缀合物，其中该结合hK2的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
60.根据实施方案57至59中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为细胞毒性剂。
61.根据实施方案57至59中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为显像剂。
62.根据实施方案57至59中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分包含放射性金属。
63.根据实施方案62所述的免疫缀合物，其中该放射性金属选自由以下项组成的组：225Ac、177Lu、32P、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm、227Th、177Lu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。
64.根据实施方案57至59中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为包含225Ac的细胞毒性剂。
65.根据实施方案57至59中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分为包含111In或64Cu的显像剂。
66.根据实施方案62至65中任一项所述的免疫缀合物，其中该治疗部分包含放射性金属络合物，其中该放射性金属络合物包含与螯合剂结合的放射性金属，并且其中该螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合。
67.根据实施方案66所述的免疫缀合物，其中该螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-4,7,10-三(乙酸)(DO3A)或它们的衍生物。
68.根据实施方案66所述的免疫缀合物，其中该螯合剂为DOTA或NOTA或其衍生物。
69.根据实施方案66所述的免疫缀合物，其中该螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
70.根据实施方案66所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为如本文所述的式(I-m)或式(II-m)或式(III-m)的放射性络合物，其中R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域，并且M为放射性金属。
71.根据实施方案66所述的免疫缀合物，其中该放射性金属络合物为如本文所述的式(IV-m)或式(V-m)或式(VI-m)的放射性络合物，其中R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域，并且M+为放射性金属。
72.根据实施方案57至71中任一项所述的免疫缀合物，其中对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域为Fab。
螯合剂
根据特定的实施方案，本发明涉及免疫缀合物，诸如放射性免疫缀合物，其包含螯合剂，优选放射性金属可经由配位键合与其螯合的螯合剂。根据特定的实施方案，本发明的螯合剂是指金属(优选地放射性金属)可与其络合以形成放射性金属络合物的螯合剂。优选地，螯合剂为大环化合物。在某些实施方案中，螯合剂包含含有一个或多个杂原子(例如，氧和/或氮)作为环原子的大环(macrocycle/macrocyclic ring)。
根据特定的实施方案，螯合剂包含大环螯合部分。大环螯合部分的示例包括但不限于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-4,7,10-三(乙酸)(DO3A)或它们的衍生物。在一些方面，该螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)。在其他方面，该螯合剂为S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)。在其他方面，该螯合剂为1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)。在其他方面，该螯合剂为3,6,9,15-四氮杂二环[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)。在另外的方面，该螯合剂为5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-4,7,10-三(乙酸)(DO3A)。在其他方面，该螯合剂为DOTA、DFO、DTPA、NOTA或TETA。
在某些实施方案中，该螯合剂包括NOTA或其衍生物。
在某些实施方案中，该螯合剂为4,13-二氮杂-18-冠-6的衍生物的大环。4,13-二氮杂-18-冠-6可以多种方式制备(参见，例如，Gatto等人，Org.Synth.1990,68,227；DOI:10.15227/orgsyn.068.0227)。根据本发明的其他实施方案，该螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物，诸如在WO2020/229974中所述的那些。H2bp18c6是指N,N'-双[(6-羧基-2-吡啶基)甲基]-4,13-二氮杂-18-冠-6，如本文所述。H2bp18c6和H2bp18c6衍生物也描述于例如Thiele等人，“An Eighteen-Membered Macrocyclic Ligand for Actinium-225Targeted Alpha Therapy”Angew.Chem.Int.Ed.(2017)56:14712-14717，和Roca-Sabio等人，“Macrocyclic Receptor Exhibiting Unprecedented Selectivity for LightLanthanides”J.Am.Chem.Soc.(2009)131,3331-3341中，其以引用方式并入本文。根据本发明适于使用的附加螯合剂描述于WO2018/183906和WO2020/106886中，其以引用方式并入本文。如本文所用，术语“TOPA”是指本领域已知为H2bp18c6的大环，并且可另选地被称为N,N'-双[(6-羧基-2-吡啶基)甲基]-4,13-二氮杂-18-冠-6(参见，例如，Roca-Sabio等人)。
式(I)、(II)和(III)的螯合剂
根据本发明适于使用的附加螯合剂描述于WO2020/229974中，其以引用方式并入本文。根据特定实施方案，例如，如WO2020/229974中所述，该螯合剂具有式(I)的结构：
其中：
环A和环B各自独立地为6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中环A和环B各自任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下项组成的组：卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和X；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11是亲核部分或亲电部分，或R11包含抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；
前提条件是该螯合剂包含至少一个X，并且当X存在于环A或环B上时，L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢。
根据本发明的实施方案，该螯合剂包含至少一个X基团，其中X为-L1-R11，其中L1不存在或为连接基，并且R11为亲电部分或亲核部分，或R11包含抗原结合结构域。当R11为亲核或亲电部分时，此类部分可用于将螯合剂直接或经由连接基间接地附接到抗原结合结构域。根据优选的实施方案，R11包含对hK2具有结合特异性的抗体或抗原结合结构域，诸如KL2B30的Fab。
在某些实施方案中，螯合剂包含单个X基团，并且优选地X基团的L1为连接基。
本发明的螯合剂可在大环的碳原子中任一者处、Z1或Z2位置处或在环A或环B上被X取代，前提条件是当环或环B包含X基团时，L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢(即Z1、Z2的碳原子和/或大环的碳原子中的至少一者例如被烷基基团诸如甲基或乙基取代)。优选地，此类位置处的取代不影响螯合剂对放射性金属离子，具体地225Ac的螯合效率，并且在一些实施方案中，取代可提高螯合效率。
在一些实施方案中，L1不存在。当L1不存在时，R11直接结合(例如，经由共价键联)到螯合剂。
在一些实施方案中，L1为连接基。如本文所用，术语“连接基”是指将螯合剂接合到亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域的化学部分。根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的连接基可用于本发明中。连接基可包含例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分、取代或未取代的芳基或杂芳基、聚乙二醇(PEG)连接基、肽连接基、基于糖的连接基或可裂解的连接基，诸如二硫键联或蛋白酶裂解位点，诸如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基(PAB)。适用于本发明的示例性连接基结构包括但不限于：
其中n为0至10的整数，优选地1至4的整数；并且m为0至12的整数，优选地0至6的整数。
在一些实施方案中，R11为亲核部分或亲电部分。“亲核部分”或“亲核基团”是指在化学反应中提供电子对以形成共价键的官能团。“亲电部分”或“亲电基团”是指在化学反应中接受电子对以形成共价键的官能团。亲核基团与亲电基团反应，并且反之亦然，以在化学反应中形成新的共价键。本发明的螯合剂的亲核基团或亲电基团与包含对应反应配偶体的抗原结合结构域或其他化学部分(例如连接基)的反应允许抗原结合结构域或化学部分共价键联到本发明的螯合剂。
亲核基团的示例性示例包括但不限于叠氮化物、胺和硫醇。亲电基团的示例性示例包括但不限于胺反应性基团、硫醇反应性基团、炔基和环炔基。胺反应性基团优选地与伯胺(包括存在于每个多肽链的N-末端和赖氨酸残基的侧链中的伯胺)反应。适用于本发明中的胺反应性基团的示例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、取代的NHS(诸如磺基-NHS)、异硫氰酸酯(-NCS)、异氰酸酯(-NCO)、酯、羧酸、酰卤、酰胺、烷基酰胺以及四氟苯基酯和全氟苯基酯。硫醇反应性基团与硫醇或巯基(优选地存在于多肽半胱氨酸残基侧链中的硫醇)反应。适用于本发明中的硫醇反应性基团的示例包括但不限于迈克尔受体(例如马来酰亚胺)、卤代乙酰基、酰卤、活化二硫化物和苯基噁二唑砜。
在特定实施方案中，R11为-NH2、-NCS(异硫氰酸酯)、-NCO(异氰酸酯)、-N3(叠氮基)、炔基、环炔基、羧酸、酯、酰氨基、烷基酰胺、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯，更具体地-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤(例如，-C(O)Cl、-C(O)Br)、四嗪或反式环辛烯，其中每个R13独立地为氢或烷基。
在一些实施方案中，R11为炔基、环炔基或叠氮基基团，从而允许使用点击化学反应将螯合剂附接到抗原结合结构域或其他化学部分(例如，连接基)。在此类实施方案中，可进行的点击化学反应为叠氮基(-N3)与炔基或环炔基基团之间的Huisgen环加成或1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑连接基或部分。在一个实施方案中，螯合剂包含炔基或环炔基基团，并且抗原结合结构域或其他化学部分包含叠氮基基团。在另一个实施方案中，螯合剂包含叠氮基基团，并且抗原结合结构域或其他化学部分包含炔基或环炔基基团。
在某些实施方案中，R11为具体地经由应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)与叠氮化物基团反应的炔基基团，更优选末端炔基基团或环炔基基团。可经由SPAAC与叠氮化物基团反应的环炔基基团的示例包括但不限于环辛炔基或双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在一个特定实施方案中，R11为二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)，其具有以下结构：
在其中R11为DBCO的此类实施方案中，DBCO可直接或经由连接基间接地共价连接到螯合剂，并且优选地经由连接基间接地附接到螯合剂。
在一些实施方案中，R11包含抗原结合结构域。抗原结合结构域可经由共价键联直接连接到螯合剂，或经由连接基间接连接到螯合剂。在优选的实施方案中，抗原结合结构域为抗体或其抗原结合片段。根据优选的实施方案，R11包含对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域，诸如KL2B30的Fab。
根据本发明的实施方案，环A和环B中的每一者独立地为6-10元芳基或5-10元杂芳基。在另选的实施方案中，设想环A和环B中的每一者为任选取代的杂环基环，诸如噁唑啉。环A和环B各自可任选地且独立地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下项组成的组：卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和X。适用于此目的的6至10元芳基基团的示例包括但不限于苯基和萘基。适用于此目的的5至10元杂芳基的示例包括但不限于吡啶基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基和咪唑基。5至10元杂芳基和6至10元芳基基团的合适取代基的示例包括但不限于-COOH、四唑基和-CH2COOH。在优选的实施方案中，取代基为-COOH或四唑基，其为-COOH的等排体。
在某些实施方案中，环A和环B中的每一者独立地且任选地被一个或多个羧基基团取代，该羧基基团包括但不限于-COOH和-CH2COOH。
在某些实施方案中，环A和环B中的每一者独立地且任选地被四唑基取代。
在一个实施方案中，环A和环B为相同的，例如环A和环B两者为吡啶基。在另一个实施方案中，环A和环B为不同的，例如环A和环中的一者为吡啶基，并且另一者为苯基。
在一个特定实施方案中，环A和环B两者为被-COOH取代的吡啶基。
在一个特定实施方案中，环A和环B两者为被四唑基取代的吡啶基。
在另一个特定实施方案中，环A和环B两者为具有以下结构的吡啶甲酸基团：
根据本发明的实施方案，Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；每个X独立地为-L1-R11；每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；每个n独立地为0、1、2、3、4或5；并且每个m独立地为1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，每个R12独立地为氢或烷基，更优选地为氢、-CH3或-CH2CH3。
在一些实施方案中，每个R12为氢。
在一些实施方案中，Z1和Z2两者均为-(CH2)m-，其中每个m优选地为1。在此类实施方案中，大环、环A或环B的碳原子被X基团取代。
在一些实施方案中，Z1和Z2中的一者为-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-并且另一者为-(CH2)m-。
在一些实施方案中，Z1和Z2-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-中的一者和另一者为-(CH2)m-；每个n为0；m为1；X为-L1-R11；并且L1为连接基。
在一些实施方案中，Z1和Z2两者均为-(CH2)m-；每个m独立地为0、1、2、3、4或5，优选地每个m为1；并且R14、R15、R16和R17中的一者为X，并且R14、R15、R16和R17中的其余者各自为氢。
在一些实施方案中，R14和R15与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环(即，环戊基或环己基)。此类5元或6元环烷基环可被X基团取代。
在一些实施方案中，R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环(即，环戊基或环己基)。此类5元或6元环烷基环可被X基团取代。
在某些实施方案中，螯合剂具有式(II)的结构：
其中：
A1为N或CR1或不存在；
A2为N或CR2；
A3为N或CR3；
A4为N或CR4；
A5为N或CR5；
A6为N或CR6或不存在；
A7为N或CR7；
A8为N或CR8；
A9为N或CR9；
A10为N或CR10；
前提条件是A1、A2、A3、A4和A5中不超过三者为N，并且A6、A7、A8、A9和A10中不超过三者为N；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地选自由以下项组成的组：氢、卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和-X，
或者，另选地，任两个直接相邻的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10与它们所附接的原子合在一起以形成五元或六元取代或未取代的碳环或含氮环；
并且Z1、Z2、X、n、m、p、L1和R11-R17如上文对于式(I)所述的，
前提条件是该螯合剂包含至少一个X，并且当R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中任一者为X时，则L1为连接基，或R12和R14-R17中至少一者不是氢。
在一些实施方案中，任两个直接相邻的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10与它们所附接的原子合在一起以形成五元或六元取代或未取代的碳环或含氮环。可形成的此类碳环的示例包括但不限于萘基。可形成的此类含氮环的示例包括但不限于喹啉基。碳环或含氮环可为未取代的或被一个或多个合适的取代基，例如-COOH、-CH2COOH、四唑基等取代。
在一些实施方案中，L1不存在。当L1不存在时，R11直接结合(例如，经由共价键联)到螯合剂。
在一些实施方案中，L1为连接基。根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的连接基可用于本发明中，诸如上述的那些。
在一些实施方案中，A1、A2、A3、A4和A5中的一者为氮，A1、A2、A3、A4和A5中的一者是被-COOH取代的碳并且其余者为CH，即形成被羧酸取代的吡啶基环。
在一些实施方案中，A6、A7、A8、A9和A10中的一者为氮，A6、A7、A8、A9和A10中的一者是被-COOH取代的碳，并且其余者为CH，即形成被羧酸取代的吡啶基环。
在一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-COOH。在一个实施方案中，R6、R7、R8、R9和R10中的至少一者为-COOH。在另一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-COOH；并且R6，R7、R8、R9和R10中的至少一者为-COOH。
在一些实施方案中，A1和A10各自为氮；A2为CR2且R2为-COOH；
A9为CR9且R9为-COOH；A3-A8各自分别为CR2、CR3、CR4、CR5、CR6、CR7和CR8；并且R3至R8各自为氢。
在一些实施方案中，A1、A2、A3、A4和A5中的一者为氮，A1、A2、A3、A4和A5中的一者为被四唑基取代的碳，并且其余者为CH。
在一些实施方案中，A6、A7、A8、A9和A10中的一者为氮，A6、A7、A8、A9和A10中的一者为被四唑基取代的碳，并且其余者为CH。
在一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为四唑基。在一个实施方案中，R6、R7、R8、R9和R10中的至少一者为四唑基。在另一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为四唑基；并且R6，R7、R8、R9和R10中的至少一者为四唑基。
在一些实施方案中，每个R12为氢。
在一些实施方案中，R11为炔基基团或环炔基基团，优选环辛炔基或环辛炔基衍生物，例如DBCO。
在式(II)的螯合剂的特定实施方案中：
A1和A10各自为氮；
A2为CR2且R2为-COOH；
A9为CR9且R9为-COOH；
A3-A8各自分别为CR2、CR3、CR4、CR5、CR6、CR7和CR8；
R3至R8各自为氢；
Z1和Z2中的一者为-(CH2)m-，并且Z1和Z2中的另一者为-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
R12为氢；
m为1；
每个n为0；
X为-L1-R11，其中L1为连接基并且-R11为亲电基团，例如，环辛炔基或环辛炔基衍生物诸如DBCO；并且
R14-R17各自为氢，或另选地R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环。
在某些实施方案中，螯合剂具有式(III)的结构：
其中：
每个A11独立地为O、S、NMe或NH；
每个R18独立地选自由以下项组成的组：氢、卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-COOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和-X，
并且Z1、Z2、X、n、m、L1、R11-R17如上文对于式(I)所述，
前提条件是该螯合剂包含至少一个X，并且R18为X时，则L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢。
在一些实施方案中，每个A11相同，并且每个A11为O、S、NMe或NH。例如，每个A11可为S。在其他实施方案中，每个A11不同，并且各自独立地选自O、S、NMe和NH。
在一些实施方案中，每个R18独立地为-(CH2)p-COOR13或四唑基，其中R13为氢并且每个p独立地为0或1。
在一些实施方案中，每个R18为-COOH。
在一些实施方案中，每个R18为-CH2COOH。
在一些实施方案中，每个R18为四唑基。
在式(III)的螯合剂的特定实施方案中：
每个R18为COOH；
Z1和Z2中的一者为-(CH2)m-，并且Z1和Z2中的另一者为-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
R12为氢；
m为1；每个n为0；
X为-L1-R11，其中L1为连接基并且-R11为亲电基团，例如环辛炔基或环辛炔基衍生物诸如DBCO或BCN；并且
R14-R17各自为氢，或另选地R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环。
在本发明的特定实施方案中，螯合剂选自由以下项组成的组：
其中：
L1不存在或为连接基；
R11为亲核部分或亲电部分，或R11包含抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)；并且
每个R12独立地为氢、-CH3或-CH2CH3，前提条件是至少一个R12为-CH3或-CH2CH3。
在一些实施方案中，R11为-NH2、-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯。
在某些实施方案中，R11为环辛炔基或选自由以下项组成的组的环辛炔基衍生物：双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
优选地，R11为炔基基团或环炔基基团，更优选地环炔基基团，例如DBCO或BCN。
本发明的示例性螯合剂包括但不限于：
此类螯合剂可共价附接到抗原结合结构域，以通过使螯合剂与叠氮化物标记的抗原结合结构域反应以经由点击化学反应形成1,2,3-三唑连接基来形成免疫缀合物或放射性免疫缀合物，如WO2020/229974中描述的。
根据本公开，本发明的螯合剂可通过本领域已知的任何方法产生。例如，侧芳族/杂芳族基团可通过本领域已知的方法(诸如WO2020/229974中举例说明和描述的那些)附接到大环部分。
式(IV)、(V)和(VI)的螯合剂
在一个实施方案中，螯合剂涉及式(IV)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；以及
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)。
在一些实施方案中，L1不存在。当L1不存在时，R4直接结合(例如，经由共价键联)到化合物。
在一些实施方案中，L1为连接基。如本文所用，术语“连接基”是指将本发明的化合物接合到亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域的化学部分。根据本公开，本领域技术人员已知的任何合适的连接基可用于本发明中。连接基可具有例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分、取代或未取代的芳基或杂芳基、聚乙二醇(PEG)连接基、肽连接基、基于糖的连接基或可裂解的连接基，诸如二硫键联或蛋白酶裂解位点，诸如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基(PAB)。适用于本发明的示例性连接基结构包括但不限于：
其中m为0至12的整数。
在一些实施方案中，R4为亲核部分或亲电部分。“亲核部分”或“亲核基团”是指在化学反应中提供电子对以形成共价键的官能团。“亲电部分”或“亲电基团”是指在化学反应中接受电子对以形成共价键的官能团。亲核基团与亲电基团反应，并且反之亦然，以在化学反应中形成新的共价键。本发明的化合物的亲核基团或亲电基团与包含对应的反应配偶体的抗原结合结构域或其他化学部分(例如连接基)的反应允许抗原结合结构域或化学部分共价键联到本发明的化合物。
亲核基团的示例性示例包括但不限于叠氮化物、胺和硫醇。亲电基团的示例性示例包括但不限于胺反应性基团、硫醇反应性基团、炔基和环炔基。胺反应性基团优选地与伯胺(包括存在于每个多肽链的N-末端和赖氨酸残基的侧链中的伯胺)反应。适用于本发明中的胺反应性基团的示例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、取代的NHS(诸如磺基-NHS)、
异硫氰酸酯(-NCS)、异氰酸酯(-NCO)、酯、羧酸、酰卤、酰胺、烷基酰胺以及四氟苯基酯和全氟苯基酯。硫醇反应性基团与硫醇或巯基(优选地存在于多肽半胱氨酸残基侧链中的硫醇)反应。适用于本发明中的硫醇反应性基团的示例包括但不限于迈克尔受体(例如马来酰亚胺)、卤代乙酰基、酰卤、活化二硫化物和苯基噁二唑砜。
在某些实施方案中，R4为-NH2、-NCS(异硫氰酸酯)、-NCO(异氰酸酯)、-N3(叠氮基)、炔基、环炔基、羧酸、酯、酰氨基、烷基酰胺、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯，更具体地-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤(例如，-C(O)Cl、-C(O)Br)、四嗪或反式环辛烯，其中每个R13独立地为氢或烷基。
在一些实施方案中，R4为炔基、环炔基或叠氮基基团，从而允许使用点击化学反应将本发明的化合物附接到抗原结合结构域或其他化学部分(例如，连接基)。在此类实施方案中，可进行的点击化学反应为叠氮基(-N3)与炔基或环炔基基团之间的Huisgen环加成或1,3-偶极环加成，以形成1,2,4-三唑连接基或部分。在一个实施方案中，本发明的化合物包含炔基或环炔基基团，并且抗原结合结构域或其他化学部分包含叠氮基基团。在另一个实施方案中，本发明的化合物包含叠氮基基团，并且抗原结合结构域或其他化学部分包含炔基或环炔基基团。
在某些实施方案中，R4为具体地经由应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)与叠氮化物基团反应的炔基基团，更优选地末端炔基基团或环炔基基团。可经由SPAAC与叠氮化物基团反应的环炔基基团的示例包括但不限于环辛炔基或双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在某些实施方案中，R4为二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)，其具有以下结构：
在其中R4为DBCO的实施方案中，DBCO可直接或经由连接基间接地共价连接到化合物，并且优选地经由连接基间接地附接到化合物。
在某些实施方案中，R4包含抗原结合结构域。抗原结合结构域可经由共价键联直接连接到化合物，或经由连接基间接连接到化合物。在优选的实施方案中，抗原结合结构域对hK2具有结合特异性，诸如KL2B30的Fab。
在另一个实施方案中，螯合剂涉及式(V)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域。
在另一个实施方案中，螯合剂为式(VI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1不存在或为连接基；以及
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，其中：R1为-L1-R4；R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基；L1不存在或为连接基；并且R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域；或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种化合物，其中R1为H；R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成被-L1-R4取代的5元或6元环烷基；L1不存在或为连接基；并且R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域；或其药学上可接受的盐：
附加的实施方案包括其中R4为抗原结合结构域的那些。根据优选的实施方案，R4包含对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域，诸如KL2B30的Fab。
在一个实施方案中，螯合剂为独立地选自由以下项组成的组的任一者或多者：
其中n为1至10。
所述螯合剂可共价附接到抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)，以通过使化合物与叠氮化物标记的抗原结合结构域反应以例如经由点击化学反应形成1,2,3-三唑连接基来形成免疫缀合物或放射性免疫缀合物，如WO2020/229974中描述的。
根据本公开，本发明的螯合剂、放射性金属络合物和放射性免疫缀合物可通过本领域已知的任何方法产生；例如，侧芳族/杂芳族基团可通过本领域已知的方法(诸如WO2020/229974中举例说明和描述的那些)附接到大环部分。
放射性金属络合物
在另一个总的方面，本发明涉及一种放射性金属络合物，该放射性金属络合物包含经由配位键合与本发明的螯合剂配位的放射性金属离子。本文所述的本发明的螯合剂中的任一种可包含放射性金属离子。优选地，放射性金属离子为发射α的放射性金属离子，更优选地225Ac。本发明的螯合剂可在不考虑金属杂质的情况下以任何特定活性与放射性金属离子(具体地225Ac)稳健螯合，从而形成在体内和体外具有高螯合稳定性并且对测试试剂(例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))稳定的放射性金属络合物。
根据本发明的实施方案，放射性金属络合物具有式(I-m)的结构：
其中可变基团如上文在本发明的螯合剂(例如式(I)的螯合剂)中所定义；并且M为放射性金属离子。放射性金属离子M经由配位键合结合到螯合剂以形成放射性金属络合物。螯合剂大环的杂原子以及侧臂的任何官能团(即-Z1-环A和/或-Z2-环B)可参与放射性金属离子的配位键合。
上述式(I)的螯合剂中的任一种可用于形成式(I-m)的放射性金属络合物。
在某些实施方案中，放射性金属离子M为发射α的放射性金属离子。优选地，发射α的放射性金属离子为225Ac。
根据本发明的实施方案，放射性金属络合物包含至少一个X基团，其中X为-L1-R11，其中L1不存在或为连接基，并且R11为亲电部分或亲核部分，或R11包含抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)。当R11为亲核或亲电部分时，此类部分可用于将放射性金属络合物直接或经由连接基间接地附接到抗原结合结构域。
在某些实施方案中，放射性金属包含单个X基团，并且优选地X基团的L1为连接基。
在特定实施方案中，R11为-NH2、-NCS(异硫氰酸酯)、-NCO(异氰酸酯)、-N3(叠氮基)、炔基、环炔基、羧酸、酯、酰氨基、烷基酰胺、马来酰亚胺基、酰卤、四嗪或反式环辛烯，更具体地-NCS、-NCO、-N3、炔基、环炔基、-C(O)R13、-COOR13、-CON(R13)2、马来酰亚胺基、酰卤(例如，-C(O)Cl或-C(O)Br)，其中每个R13独立地为氢或烷基。
在一些实施方案中，R11为炔基、环炔基或叠氮基基团，从而允许使用点击化学反应将螯合剂附接到抗原结合结构域或其他化学部分(例如，连接基)。
在某些实施方案中，R11为具体地经由应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC)而与叠氮基基团反应的炔基基团，更优选末端炔基基团或环炔基基团。可经由SPAAC与叠氮化物基团反应的环炔基基团的示例包括但不限于环辛炔基或环辛炔基衍生物，诸如双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在一个特定实施方案中，R11为二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)，其具有以下结构：
在其中R11为DBCO的此类实施方案中，DBCO可直接或经由连接基间接地共价连接到放射性金属络合物，并且优选地经由连接基间接地附接到放射性金属络合物。
在另一个特定实施方案中，R11为双环壬炔基(BCN)。
根据本发明的实施方案，环A和环B中的每一者独立地为6-10元芳基或5-10元杂芳基。在另选的实施方案中，设想环A和环B中的每一者为任选取代的杂环基环，诸如噁唑啉。环A和环B各自可任选地且独立地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下项组成的组：卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和X。适用于此目的的6至10元芳基基团的示例包括但不限于苯基和萘基。适用于此目的的5至10元杂芳基的示例包括但不限于吡啶基、异噻唑基、异噁唑基和咪唑基。5至10元杂芳基和6至10元芳基基团的合适取代基的示例包括但不限于-COOH、四唑基和-CH2COOH。
在某些实施方案中，环A和环B中的每一者独立地且任选地被一个或多个羧基基团取代，该羧基基团包括但不限于-COOH和-CH2COOH。
在一个实施方案中，环A和环B为相同的，例如环A和环B两者为吡啶基。在另一个实施方案中，环A和环B为不同的，例如环A和环中的一者为吡啶基，并且另一者为苯基。
在一个特定实施方案中，环A和环B两者为被-COOH取代的吡啶基。
在一个特定实施方案中，环A和环B两者为被四唑基取代的吡啶基。
在另一个特定实施方案中，环A和环B两者为具有以下结构的吡啶甲酸基团：
根据本发明的实施方案，Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；每个X独立地为-L1-R11；每个n独立地为0、1、2、3、4或5；并且每个m独立地为1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，Z1和Z2两者均为-(CH2)m-，其中每个m优选地为1。在此类实施方案中，大环、环A或环B的碳原子被X基团取代。
在一些实施方案中，Z1和Z2中的一者为-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-并且另一者为-(CH2)m-。
在一些实施方案中，Z1和Z2-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-中的一者和另一者为-(CH2)m-；每个n为0；m为1；X为-L1-R11；并且L1为连接基。
在一些实施方案中，Z1和Z2两者均为-(CH2)m-；每个m独立地为0、1、2、3、4或5，优选地每个m为1；并且R14、R15、R16和R17中的一者为X，并且R14、R15、R16和R17中的其余者各自为氢。
在一些实施方案中，R14和R15与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环(例如，环戊基或环己基)。此类5元或6元环烷基环可被X基团取代。
在一些实施方案中，R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环(例如，环戊基或环己基)。此类5元或6元环烷基环可被X基团取代。
在某些实施方案中，放射性金属络合物具有式(II-m)的结构：
其中可变基团如上文在本发明的螯合剂(例如式(II)的螯合剂)中所定义；并且M为放射性金属离子，优选发射α的放射性金属离子，更优选225Ac。
上述式(II)的螯合剂中的任一种可用于形成式(II-m)的放射性金属络合物。
在一些实施方案中，A1、A2、A3、A4和A5中的一者为氮，A1、A2、A3、A4和A5中的一者是被-COOH取代的碳并且其余者为CH，即形成被羧酸取代的吡啶基环。
在一些实施方案中，A6、A7、A8、A9和A10中的一者为氮，A6、A7、A8、A9和A10中的一者是被-COOH取代的碳，并且其余者为CH，即形成被羧酸取代的吡啶基环。
在一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-COOH。在一个实施方案中，R6、R7、R8、R9和R10中的至少一者为-COOH。在另一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为-COOH；并且R6，R7、R8、R9和R10中的至少一者为-COOH。
在一些实施方案中，A1和A10各自为氮；A2为CR2且R2为-COOH；
A9为CR9且R9为-COOH；A3-A8各自分别为CR2、CR3、CR4、CR5、CR6、CR7和CR8；并且R3至R8各自为氢。
在一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为四唑基。在一个实施方案中，R6、R7、R8、R9和R10中的至少一者为四唑基。在另一个实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者为四唑基；并且R6，R7、R8、R9和R10中的至少一者为四唑基。
在一些实施方案中，每个R12为氢。
在一些实施方案中，R11为炔基基团或环炔基基团，优选环辛炔基或环辛炔基衍生物，例如DBCO。
在式(II-m)的放射性金属络合物的特定实施方案中：
M为225Ac；
A1和A10各自为氮；
A2为CR2且R2为-COOH；
A9为CR9且R9为-COOH；
A3-A8各自分别为CR2、CR3、CR4、CR5、CR6、CR7和CR8；
R3至R8各自为氢；
Z1和Z2中的一者为-(CH2)m-，并且Z1和Z2中的另一者为-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
R12为氢；
m为1；
每个n为0；
X为-L1-R11，其中L1为连接基并且-R11为亲电基团，例如，环辛炔基或环辛炔基衍生物诸如DBCO；以及
R14-R17各自为氢，或另选地R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环。
在某些实施方案中，放射性金属络合物具有式(III-m)的结构：
其中可变基团如上文在本发明的螯合剂(例如式(III)的螯合剂)中所定义；并且M为放射性金属离子，优选发射α的放射性金属离子，更优选225Ac。
上述式(III)的螯合剂中的任一种可用于形成式(III-m)的放射性金属络合物。
在一些实施方案中，每个A11相同，并且每个A11为O、S、NMe或NH。例如，每个A11可为S。在其他实施方案中，每个A11不同，并且各自独立地选自O、S、NMe和NH。
在一些实施方案中，每个R18独立地为-(CH2)p-COOR13，其中R13为氢且每个p独立地为0或1。
在一些实施方案中，每个R18为-COOH。
在一些实施方案中，每个R18为-CH2COOH。
在一些实施方案中，每个R18为四唑基。
在式(III-m)的放射性金属络合物的特定实施方案中：
每个R18为COOH；
Z1和Z2中的一者为-(CH2)m-，并且Z1和Z2中的另一者为-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
R12为氢；
m为1；每个n为0；
X为-L1-R11，其中L1为连接基并且-R11为亲电基团，例如，环辛炔基或环辛炔基衍生物诸如DBCO；以及
R14-R17各自为氢，或另选地R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基环。
在本发明的特定实施方案中，放射性金属络合物具有以下结构中的一种：
其中：
M为锕-225(225Ac)，L1不存在或为连接基；
R11为亲核部分或亲电部分，或R11包含抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)；并且
每个R12独立地为氢、-CH3或-CH2CH3，前提条件是至少一个R12为-CH3或-CH2CH3。
在某些实施方案中，本发明涉及式(IV-m)的放射性金属络合物结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(V-m)的放射性金属络合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(VI-m)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种放射性金属络合物，其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；R1为-L1-R4；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基；
L1不存在或为连接基；并且
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)；
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种放射性金属络合物，其中
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；R1为H；
R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成被-L1-R4取代的5元或6元环烷基；
L1不存在或为连接基；以及
R4为亲核部分、亲电部分或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明涉及任一种或多种选自由以下项组成的组的放射性金属络合物：
其中n为1至10并且M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)。
根据本公开，放射性金属络合物可通过本领域已知的任何方法产生。例如，可将本发明的螯合剂与放射性金属离子混合，并将该混合物温育以允许形成放射性金属络合物。在一个示例性实施方案中，将螯合剂与225Ac(NO3)3的溶液混合以形成放射性络合物，该放射性络合物包含经由配位键合与该螯合剂结合的225Ac。如上所述，本发明中的螯合剂有效地螯合放射性金属，具体地225Ac。因此，在特定实施方案中，本发明的螯合剂与225Ac离子的溶液以螯合剂与225Ac离子的浓度比率为1:1000、1:500、1:400、1:300、1:200、1:100、1:50、1:10或1:5、优选地1:5至1:200、更优选地1:5至1:100混合。因此，在一些实施方案中，本发明的螯合剂与可用于形成放射性金属络合物的225Ac的比率远低于用其他已知的225Ac螯合剂(例如DOTA)可达到的比率。放射性络合物可通过瞬时薄层色谱法(例如，iTLC-SG)、HPLC、LC-MS等来表征。示例性方法描述于例如WO2020/229974中。
免疫缀合物和放射性免疫缀合物的附加实施方案
如本文所述，本发明的螯合剂和放射性金属络合物可缀合(即，共价连接)到抗原结合结构域，诸如免疫物质，以产生适用于例如受试者(例如，人)的医学应用诸如靶向放射疗法的免疫缀合物和/或放射性免疫缀合物。使用本发明的螯合剂和放射性金属络合物，抗原结合结构域，具体地讲可特异性结合感兴趣的靶标(诸如癌细胞)的抗体或其抗原结合片段，可用放射性金属离子进行位点特异性标记以产生放射性免疫缀合物。具体地讲，使用本发明的螯合剂和/或放射性金属络合物，可产生对放射性金属离子(具体地225Ac)具有高收率螯合和期望的螯合剂-抗体比率(CAR)的放射性免疫缀合物。根据特定实施方案，本发明的方法提供了小于10、小于8、小于6或小于4的平均CAR；或约2至约8之间、或约2至约6、或约2至约4、或约2至约3的CAR；或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7或约8的CAR。
根据本发明的实施方案，免疫缀合物包含优选地经由连接基共价连接到抗体或其抗原结合片段(例如，KL2B30的Fab)的本发明的螯合剂，例如如本文所述的式(I)、式(II)或式(III)的螯合剂。根据螯合剂和抗体或其抗原结合片段上的反应性官能团(即，亲核试剂和亲电试剂)，在螯合剂与抗体或其抗原结合片段之间具有不同键联的许多附接模式是可能的。
根据本发明的实施方案，放射性免疫缀合物包含优选地经由连接基共价连接到抗体或其抗原结合片段(例如，KL2B30的Fab)的本发明的放射
性金属络合物，例如如本文所述的式(I-m)、式(II-m)或式(III-m)的放射性金属络合物。
本发明的螯合剂或放射性金属络合物中的任一种，诸如本文所述的那些，可用于产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物。
在一些实施方案中，本发明的放射性免疫缀合物的放射性金属络合物包含与放射性络合物的螯合剂部分配位的发射α的放射性金属离子。优选地，发射α的放射性金属离子为225Ac。
在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段经由三唑部分连接到放射性络合物以形成本发明的放射性免疫缀合物。
在特定实施方案中，本申请的免疫缀合物或放射性免疫缀合物中的抗体或抗原结合片段可特异性结合肿瘤抗原。优选地，抗体或抗原结合片段特异性地结合到hK2。
根据本公开，本发明的免疫缀合物和放射性免疫缀合物可通过本领域已知的用于将配体(例如抗体)缀合到螯合剂的任何方法(包括化学和/或酶方法)来制备。例如，免疫缀合物和放射性免疫缀合物可通过偶联反应来制备，包括但不限于由活化的酸或酰卤形成酯、硫酯或酰胺；亲核置换反应(例如，诸如卤化物环的亲核置换或应变环系的开环)；叠氮-炔Huisgen环加成(例如，叠氮化物与炔烃之间的1,3-偶极环加成以形成1,2,3-三唑连接基)；巯基炔加成；亚胺形成；四嗪与反式环辛烯(TCO)之间的狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alderreaction)；以及迈克尔加成(Michael addition)(例如，马来酰亚胺加成)。根据所用的反应性官能团，具有不同键联的许多其他附接模式也是可能的。配体的附接可在与放射性金属离子配位的螯合剂上进行，或在不与放射性金属离子配位的螯合剂上进行。
根据一个实施方案，放射性免疫缀合物可通过例如点击化学反应将本发明的放射性金属络合物共价连接到抗体或其抗原结合片段产生。另选地，放射性免疫缀合物可通过以下方式产生：首先通过例如点击化学反应将本发明的螯合剂共价连接到抗体或其抗原结合片段来制备本发明的免疫缀合物；随后可用放射性金属离子标记免疫缀合物以产生放射性免疫缀合物(称为“一步直接放射性标记”)。缀合的残基特异性方法和位点特异性方法两者可用于产生本发明的免疫缀合物和放射性免疫缀合物。此类方法描述于例如WO2020/229974中。
根据本发明的实施方案，一种产生放射性免疫缀合物的方法包括使其中R11为亲核或亲电部分的本发明螯合剂或放射性络合物与包含亲核或亲电部分的抗体或其抗原结合片段(例如，KL2B30的Fab)、或经修饰的抗体或其抗原结合片段反应。
在一个实施方案中，一种方法包括使本发明的螯合剂与包含亲核或亲电官能团的抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段反应，以形成在螯合剂与抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段之间具有共价键联的免疫缀合物，以及使免疫缀合物与放射性金属离子反应，使得放射性金属离子经由配位键合与免疫缀合物的螯合剂结合，从而形成放射性免疫缀合物。该实施方案可被称为“一步直接放射性标记”方法，因为仅存在一个涉及放射性金属的化学反应步骤。
在另一个实施方案中，一种方法包括使本发明的放射性络合物与包含亲核或亲电官能团的抗体或其抗原结合片段、或经修饰的抗体或其抗原结合片段反应，从而形成放射性免疫缀合物。该实施方案可被称为“点击放射性标记”方法。根据本公开，经修饰的抗体或其抗原结合片段可通过本领域已知的任何方法产生，例如通过使用上述方法中的一种或多种在特定残基处用双正交反应性官能团标记抗体，或通过使用上述方法中的一种或多种将非天然氨基酸(例如叠氮基-或炔基-氨基酸)位点特异性地掺入到抗体中。标记度(DOL)，有时称为取代度(DOS)，是用于表征和优化生物缀合物(诸如由非天然氨基酸修饰的抗体)的特别有用的参数。它被表示为偶联到蛋白质分子(例如抗体)的非天然氨基酸的平均数，或表示为标记/蛋白质形式的摩尔比。DOL可通过本领域已知的任何方法由标记抗体的吸收光谱确定。
在某些实施方案中，如本文所述，本发明的免疫缀合物和放射性免疫缀合物使用点击化学反应来制备。例如，本发明的放射性免疫缀合物可使用被称为“点击放射性标记”的点击化学反应来制备。点击放射性标记使用点击化学反应配偶体，优选地叠氮化物和炔烃(例如，环辛炔或环辛炔衍生物)以在放射性络合物(结合到螯合剂的放射性金属离子)与抗体或其抗原结合片段之间形成共价三唑键联。抗体的点击放射性标记方法在例如名称为“Radiolabeling of Polypeptides”的国际专利申请PCT/US18/65913中有所描述，其相关描述以引用方式并入本文。在称为“一步直接放射性标记”的其他实施方案中，使用抗体或其抗原结合片段与螯合剂之间的点击化学反应来制备免疫缀合物；然后使免疫缀合物与放射性金属离子接触以形成放射性免疫缀合物。
根据一个实施方案，一种制备放射性免疫缀合物的方法包括使放射性金属离子结合到本发明的螯合剂上(例如，经由配位键合)。
“一步直接放射性标记”方法的实施方案可被描述为制备放射性免疫缀合物的方法，该方法包括：使免疫缀合物(即，多肽-螯合剂络合物)与放射性金属离子接触，从而形成放射性免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含本发明的螯合剂。根据特定实施方案，免疫缀合物已经由本发明的螯合剂与多肽之间的点击化学反应形成。根据特定实施方案，放射性免疫缀合物已在有金属条件下(例如，没有从反应混合物中去除或主动排除常见金属杂质的任何步骤)形成。这与某些常规方法相反，在这些常规方法中，必须在严格的无金属条件下对抗体进行放射性标记，以避免常见金属诸如铁、锌和铜的竞争性(非生产性)螯合，这给生产过程带来了重大挑战。
在一个特定实施方案中，制备本发明的放射性免疫缀合物的方法包括“一步直接放射性标记”方法，该方法包括：
(i)提供经修饰的多肽，该经修饰的多肽包含共价连接到第一点击反应配偶体(例如叠氮基基团)的多肽(例如抗体或其抗原结合片段)；
(ii)提供螯合剂络合物，该螯合剂络合物包含共价连接到第二点击反应配偶体(例如炔基基团或环炔基基团)的本发明的螯合剂；
(iii)使经修饰的多肽与螯合剂络合物在允许第一点击反应配偶体(例如叠氮基基团)与第二点击反应配偶体(例如炔基基团或环炔基基团)反应的条件下接触，从而形成多肽-螯合剂络合物(即免疫缀合物)；以及
(iv)使多肽-螯合剂络合物与放射性金属离子接触，从而制备放射性免疫缀合物(其中放射性免疫缀合物包含用放射性金属离子标记的多肽，例如，用经由配位键合结合到螯合剂的发射α的放射性金属离子标记的经修饰的抗体或其抗原结合片段)。
根据特定实施方案，步骤(iv)没有在无金属条件下进行。
在另选的实施方案中，制备放射性免疫缀合物的方法包括“点击放射性标记”方法，该方法包括：
(i)提供经修饰的抗体或其抗原结合片段，所述经修饰的抗体或其抗原结合片段包含共价连接到叠氮基基团的抗体或其抗原结合片段；
(ii)提供放射性络合物，所述放射性络合物包含经由配位键合结合到螯合剂的发射α的放射性金属离子，其中所述螯合剂共价连接到炔基基团或环炔基基团；以及
(iii)使经修饰的抗体或其抗原结合片段与放射性络合物在允许叠氮基基团与炔基基团或环炔基基团反应的条件下接触，从而制备放射性免疫缀合物。
用于进行点击化学反应的条件是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的用于进行点击化学反应的任何条件可用于本发明中。条件的示例包括但不限于在4至10的pH和20℃至70℃的温度下以1:1至1000:1的比率温育经修饰的多肽和放射性络合物。
上述点击放射性标记方法允许放射性金属离子在低或高pH和/或高温条件下螯合以使效率最大化，这可在没有使炔烃反应配偶体失活的风险的情况下实现。叠氮化物标记的抗体或其抗原结合片段与放射性络合物之间的有效螯合和有效SPAAC反应允许以高放射性化学收率产生放射性免疫缀合物，即使叠氮化物:抗体比率低。必须排除痕量金属的唯一步骤是放射性金属离子与螯合部分的螯合；抗体产生、纯化和缀合步骤不需要在无金属条件下进行。
本发明的螯合剂和放射性金属络合物也可用于产生位点特异性放射性标记多肽，例如抗体。本文所述的点击放射性标记方法通过利用已建立的方法将叠氮基团位点特异性地安装在抗体上来有利于放射性免疫缀合物的位点特异性产生(Li,X.等人，Preparationof well-defined antibody-drug conjugates through glycan remodeling andstrain-promoted azide-alkyne cycloadditions.Angew Chem Int Ed Engl,2014.53(28):p.7179-82；Xiao,H.等人,Genetic incorporation of multiple unnatural aminoacids into proteins in mammalian cells.Angew Chem Int Ed Engl,2013.52(52):p.14080-3)。以位点特异性方式将分子附接到蛋白质或抗体的方法是本领域中已知的，并且根据本公开，本领域技术人员已知的位点特异性标记抗体的任何方法可用于本发明中。适用于本发明中的位点特异性修饰抗体的方法的示例包括但不限于：掺入工程化半胱氨酸残基(例如，THIOMABTM)，使用非天然氨基酸或聚糖(例如，硒代半胱氨酸、p-AcPhe、甲酰甘氨酸生成酶(FGE、SMARTagTM)等)，以及酶促方法(例如，使用糖基转移酶、内切糖苷酶、微生物或细菌转谷氨酰胺酶(MTG或BTG)、转肽酶A等)。
在一些实施方案中，在产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物中使用的经修饰的抗体或其抗原结合片段通过如下方式获得：用对抗体的Fc糖基化位点中的核心GlcNac残基之间的β-1,4键具有特异性的细菌内切糖苷酶(诸如GlycINATOR(Genovis))修剪抗体或其抗原结合片段，这使最内的GlcNAc完整保留在Fc上，从而允许将叠氮基糖位点特异性掺入该位点处。然后，可在糖转移酶诸如GalT半乳糖基转移酶或GalNAc转移酶的存在下，使修剪的抗体或其抗原结合片段与叠氮化物标记的糖(诸如UDP-N-叠氮基乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAz)或UDP-6-叠氮基6-脱氧GalNAc)反应，从而获得经修饰的抗体或其抗原结合片段。
在其他实施方案中，用于在产生本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物中使用的经修饰的抗体或其抗原结合片段通过用酰胺酶使抗体或其抗原结合片段去糖基化来获得。然后，可使所得去糖基化抗体或其抗原结合片段与叠氮基胺(优选地3-叠氮基丙胺、6-叠氮基己胺、或任何叠氮基-连接基-胺或任何叠氮基-烷基/杂烷基-胺，诸如叠氮基-聚乙二醇(PEG)-胺，例如O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)四乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)五乙二醇、O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)三乙二醇等)反应，或在微生物转谷氨酰胺酶的存在下反应，从而获得经修饰的抗体或其抗原结合片段。
本文所述的任何放射性金属络合物均可用于产生本发明的放射性免疫缀合物。在特定实施方案中，放射性金属络合物具有式(I-m)、式(II-m)或式(III-m)的结构。在特定的实施方案中，放射性金属络合物具有选自由以下项组成的组的结构：
其中M为放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，更优选地锕-225(225Ac)，R11为环辛炔基或环辛炔基衍生物，诸如双环壬炔基(BCN)、二氟化环辛炔基(DIFO)、二苯并环辛炔基(DIBO)、酮基-DIBO、二芳基氮杂环辛炔酮基(BARAC)、二苯并氮杂环辛炔基(DIBAC、DBCO、ADIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔基(DIMAC)、二氟苯并环辛炔基(DIFBO)、单苯并环辛炔基(MOBO)和四甲氧基二苯并环辛炔基(TMDIBO)。
在一些实施方案中，根据本公开，使用本领域技术人员已知的用于抗体和多肽的化学或酶修饰的任何方法，将抗体或其抗原结合片段共价连接到叠氮基基团。在足以使叠氮基和炔基或环炔基基团发生点击化学反应的条件下，使叠氮基标记的抗体或其抗原结合片段与包含炔基或环炔基基团、优选地环辛炔基基团并且更优选地DBCO的本发明的螯合剂或放射性金属络合物反应，以形成1,2,3-三唑部分。
在特定实施方案中，本申请的放射性免疫缀合物包括但不限于：
其中“mAb”为抗体或抗原结合结构域(例如，KL2B30的Fab)；L1不存在或为连接基，优选地连接基；每个R12独立地为氢、CH3或CH2CH3，前提条件是至少一个R12为-CH3或-CH2CH3；并且M为发射α-的放射性核素，优选地225Ac。
本申请的放射性免疫缀合物的示例包括但不限于：
其中“mAb”优选地是指对hK2具有结合特异性的抗体或抗原结合结构域，诸如KL2B30的Fab，或本文中另外描述的。
在某些实施方案中，放射性免疫缀合物是独立地选自由以下项组成的组的任一种或多种结构：
其中：
M+为放射性金属离子，其中M+选自由以下项组成的组：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；以及
其中“mAb”优选地是指对hK2具有结合特异性的抗体或抗原结合结构域，诸如KL2B30的Fab，或本文中另外描述的。
在另一个实施方案中，放射性免疫缀合物是选自由以下项组成的组的任一种或多种：
其中“mAb”优选地是指对hK2具有结合特异性的抗体或抗原结合结构域，诸如KL2B30的Fab，或本文中另外描述的。
根据本公开，可使用本领域技术人员已知的方法分析通过本文所述的方法产生的放射性免疫缀合物。例如，LC/MS分析可用于测定螯合剂与标记的多肽(例如抗体或其抗原结合片段)的比率；分析性尺寸排阻色谱法可用于测定多肽和多肽缀合物(例如抗体和抗体缀合物)的低聚状态；放射性化学收率可通过瞬时薄层色谱法(例如iTLC-SG)测定，并且放射性化学纯度可通过尺寸排阻HPLC测定。
药物组合物及使用方法
在另一个总的方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含螯合剂、放射性金属络合物、本发明的免疫缀合物或放射性免疫缀合物以及药学上可接受的载体。该药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，该药物组合物包含本发明的放射性金属络合物以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，该药物组合物包含本发明的放射性免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于在药物制剂中使用的其它材料。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据特定实施方案，适用于基于抗体或基于放射性络合物的药物组合物中的任何药学上可接受的载体均可用于本发明中。
根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于胃肠外施用，例如静脉内、皮下、肌内或瘤内施用。
在其他一般方面，本发明涉及选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和治疗肿瘤性疾病或障碍的方法。本文所述的任何放射性络合物或放射性免疫缀合物及其药物组合物可用于本发明的方法中。
“瘤”是当细胞分裂超过它们应分裂的程度或当它们应死亡而不死亡时产生的异常组织块。瘤可为良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。瘤也被称为肿瘤。肿瘤性疾病或障碍是与瘤相关的疾病或障碍，诸如癌症。肿瘤性疾病或障碍的示例包括但不限于播散性癌症和实体瘤癌症。
根据一个实施方案，一种治疗有需要的受试者的前列腺癌(例如，转移性前列腺癌或转移性去势难治性前列腺癌)的方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的放射性免疫缀合物，其中该放射性免疫缀合物包含与对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域(诸如KL2B30 Fab)缀合的如本文所述的放射性金属络合物。
在本发明的一个实施方案中，一种选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法的方法包括向有需要的受试者施用本发明的放射性免疫缀合物或药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，一种治疗肿瘤性疾病或障碍的方法包括向有需要的受试者施用本发明的放射性免疫缀合物或药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，一种治疗有需要的受试者的癌症的方法包括向有需要的受试者施用本发明的放射性免疫缀合物或药物组合物。
放射性免疫缀合物将辐射直接携带到例如由抗原结合结构域靶向的细胞等。优选地，放射性免疫缀合物携带发射α的放射性金属离子，诸如225Ac。在靶向时，来自发射α的放射性金属离子的α粒子(例如225Ac及其子体)被递送至靶向细胞并对其产生细胞毒性作用，从而选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和/或治疗肿瘤性疾病或障碍。
本发明还设想了用于选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法以及用于治疗肿瘤性疾病或障碍的预靶向方法。根据预靶向方法，给予叠氮化物标记的抗体或其抗原结合片段，其结合到携带抗体的靶抗原的细胞，并且允许随时间推移从循环中清除或用清洗剂去除。随后，施用本发明的放射性络合物，优选地包含环辛炔或环辛炔衍生物(例如DBCO)的放射性络合物，并且使其与在靶位点处结合的叠氮化物标记的抗体发生SPAAC反应，而其余未结合的放射性络合物快速从循环中清除。该预靶向技术提供了一种增强放射性金属离子在受试者中靶位点处的定位的方法。
在其他实施方案中，将经修饰的多肽(例如叠氮化物标记的抗体或其抗原结合片段)和本发明的放射性络合物以相同组合物或不同组合物的形式施用于需要靶向放射疗法或肿瘤性疾病或障碍治疗的受试者。
在一些实施方案中，将治疗有效量的本发明放射性免疫缀合物或药物组合物施用于受试者以治疗受试者的肿瘤性疾病或障碍，诸如癌症。
在本发明的其他实施方案中，本发明的放射性免疫缀合物和药物组合物可与有效治疗肿瘤性疾病或障碍的其他药剂组合使用。
还提供了如本文所述的放射性免疫缀合物和药物组合物，该放射性免疫缀合物和药物组合物用于在选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和/或治疗肿瘤性疾病或障碍和/或诊断肿瘤性疾病或障碍中使用；以及如本文
所述的放射性免疫缀合物或药物组合物在制造用于选择性地靶向肿瘤性细胞以进行放射疗法和/或治疗肿瘤性疾病或障碍的药物中的用途。
实施例
本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
螯合剂和免疫缀合物的合成(实施例1至21)
用于本文所述螯合剂的实施方案的合成方法提供于例如WO2020/229974中，其以引用方式并入本文。附加的合成方法提供于PCT/IB2021/060350(其以引用方式并入本文)和下面实施例1至21中。
在实施例1至21中，列出了一些已经作为残余物分离出来的合成产物。本领域普通技术人员将理解，术语“残余物”不限制产物被分离时的物理状态，并且可包括例如固体、油状物、泡沫、胶状物、浆状物等。
用于本说明书，特别是方案和实施例中的缩写列于下表A：
表A：缩写
如本文所用，除非另外指明，否则术语“分离的形式”应意指该化合物以与和另一化合物的任何固体混合物、与溶剂系统或与生物环境分开的形式存在。在本发明的一个实施方案中，如本文所述的化合物中的任一种化合物都以分离的形式存在。
如本文所用，除非另外指明，否则术语“基本上纯的形式”应是指分离的化合物中杂质的摩尔百分数小于约5摩尔％，优选小于约2摩尔％，更优选小于约0.5摩尔％，最优选小于约0.1摩尔％。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物以基本上纯的形式存在。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“基本上不含相应盐形式”当用于描述式(I)的化合物时，应意指式(I)的分离碱基中的相应盐形式的摩尔百分数小于约5摩尔％，优选地小于约2摩尔％，更优选地小于约0.5摩尔％，最优选地小于约0.1摩尔％。在本发明的一个实施方案中，式(I)的化合物以基本上不含相应盐形式的形式存在。
实施例1
4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4, 10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸
(TOPA-[C-7]-苯基-羧酸)
方案1
步骤1：在氮气下，于-78℃向500mL三颈圆底烧瓶中的6-甲酰吡啶羧酸甲酯(4.00g，24.2mmol)、(4-(叔丁氧基羰基)苯基)硼酸(10.7g，48.5mmol)、PdCl2(0.21g，1.2mmol)、三(萘-1-基)膦(0.50g，1.2mmol)和碳酸钾(10.0g，72.7mmol)的混合物中一次性加入四氢呋喃(100mL)。将混合物用氮气吹扫，并在室温下搅拌30分钟，然后于65℃加热24小时。将反应混合物冷却至室温，通过Celite垫过滤，并将滤液浓缩至干。将粗产物通过硅胶色谱(0％-50％ EtOAc/石油醚)纯化，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为黄色油状物(2.5g，30％收率)。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯(2.50g，7.30mmol)、PPh3(3.43g，13.1mmol)、N-溴琥珀酰亚胺(2.13g，12.0mmol)和二氯甲烷(30mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应溶液加载到硅胶柱上并通过色谱(0％-30％ EtOAc/石油醚)，得到化合物6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.65g，56％收率)，为黄色油状物。
步骤3：在氮气气氛下，将搅拌子、6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.52g，3.69mmol)、6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.50g，3.69mmol)、Na2CO3(1.17g，11.1mmol)和乙腈(30mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并将所得异质混合物于90℃加热16小时。随后将反应混合物冷却至室温，通过celite垫过滤，并真空浓缩至干，得到粗产物。将粗产物通过硅胶色谱(0％-10％MeOH/二氯甲烷)纯化，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物(1.2g，44％收率)。
步骤4：将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.2g，1.6mmol)、TFA(0.62mL，8.1mmol)和DCM(20mL)于室温加入到100mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应混合物浓缩至干，并对所得粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19mm×150mm)5.0μm；流动相：0.1％ TFA水溶液/ACN；流速：15.0mL/分钟)，得到TOPA-[C-7]-苯基-羧酸(0.8g，72％)，为棕色油状物。LC-MS APCI：C35H44N4O10的计算值：680.31；实测值：m/z[M+H]+681.5。通过LC-MS测得的纯度：99.87％。通过HPLC测得的纯度：97.14％(在210nm处为97.01％，在254nm处为97.20％，在280nm处为97.21％；柱：Atlantis dC18(250mm×4.6mm)，5μm；流动相A：0.1％ TFA水溶液，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/分钟.％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.12-8.07(m,4H),8.00-7.98(m,2H),7.75-7.73(m,4H),6.10(s,1H),4.67(s,2H),3.96(s,3H),3.91(s,3H),3.82(s,8H),3.56(s,8H),3.52(s,8H).
实施例2
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基 甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案2
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.40g，0.60mmol)、(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.60mmol)、三乙胺(0.18g，0.76mmol)、HATU(0.33g，0.90mmol)和DCM(4.0mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应物用水(10mL)处理并用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％ NaHCO3水溶液(10mL)、盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g)。
步骤2：于0℃将搅拌子、6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g，0.20mmol)、MeOH(1.8mL)和HCl的甲醇(4M，1.0mL，4.0mmol)溶液加入到10mL单颈圆底烧瓶中，然后升温至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.15g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.12mmol)、三乙胺(37mg，0.37mmol)、无水DCM(2mL)和二硫化碳(14mg，0.18mmol)加入到压力小瓶中。于90℃对小瓶进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将小瓶冷却至室温，将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，然后依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到6-((4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(100mg)，其不经纯化直接使用。
步骤4：将搅拌子、6-((4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.12mmol)和HCl水溶液(6N，0.4mL，2.34mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，得到油状物，将该油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)纯化，得到6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(5.0mg)。LC-MS APCI：C40H52N6O11S的计算值：824.34；实测值：m/z[M+H]+824.8。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.22-8.20(m,2H),8.14-8.05(m,2H),7.94(d,J＝8.00Hz,2H),7.79(d,J＝8.00Hz,2H),7.73 -7.67(m,2H),6.16(s,1H),4.77(s,2H),3.93-4.00(m,8H),3.59-3.70(m,27H),3.47-3.44(m,2H).
实施例3
6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4, 10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
以及
实施例4
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1, 4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案3
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.12g，0.18mmol)、(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯
(38mg，0.18mmol)、三乙胺(54mg，0.54mmol)、HATU(0.10g，0.27mmol)和DCM(4.0mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。然后将反应混合物升至室温并搅拌过夜。然后将反应物用水(10mL)处理并用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％ NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。将该油状物经由硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(70mg)，为粘性油状物。
步骤2：于0℃将搅拌子、6-((4-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(70mg，0.080mmol)、MeOH(1.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.4mL，1.6mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，随后使其升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(30mg)，其不经纯化直接使用。
步骤3：于室温将搅拌子、6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(30mg，0.038mmol)、LiOH水溶液(1.1mL，0.1N，0.11mmol)和MeOH(1.0mL)加入到8mL反应小瓶中，并搅拌过夜。然后将反应混合物用乙酸处理直至pH约为6.5，随后于室温真空浓缩至干。对所得产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/分钟)，得到实施例3：6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(10mg)。LC-MS APCI：C39H54N6O9的计算值：750.40；实测值：m/z[M+H]+751.3。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.22(d,J＝1.60Hz,2H),8.21-8.06(m,2H),7.92(d,J＝8.40Hz,2H),7.80(d,J＝8.40Hz,2H),7.75-7.69(m,2H),6.20(s,1H),4.70(s,2H),4.02-3.92(m,8H),3.76-3.62(m,14H),3.51-3.32(m,4H),2.93(t,J＝8.00Hz,2H),1.67-1.64(m,4H),1.46-1.45(m,4H)。
步骤4：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-((6-氨基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.13mmol)、三乙胺(39mg，0.38mmol)、无水DCM(2mL)和二硫化碳(15mg，0.19mmol)加入到压力小瓶中。于90℃对小瓶进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将小瓶冷却至室温，并将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到6-((4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.1g)，其不经纯化直接使用。
步骤5：将搅拌子、6-((4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.10g，0.12mmol)和HCl水溶液(6N，0.4mL，2.4mmol)加入到10mL圆底烧瓶中，然后于50℃搅拌3小时。然后将该反应混合物冷却至室温，并真空浓缩至干，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，3.5μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：2.0mL/分钟)纯化，得到实施例4：6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((6-异硫氰基己基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(15mg)。LC-MS APCI：C40H52N6O9S的计算值：792.35；实测值：m/z[M+H]+792.8。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.23-8.20(m,2H),8.15-8.06(m,2H),7.92(d,J＝8.40Hz,2H),7.79(d,J＝8.40Hz,2H),7.74-7.68(m,2H),6.17(s,1H),4.77(s,2H),4.01-3.93(m,8H),3.75-3.56(m,16H),3.42-3.33(m,5H),1.74-1.64(m,4H),1.50-1.44(m,4H).
实施例5
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)甲基)- 1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案4
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.25g，0.37mmol)、4-(2-氨基乙基)苯胺(60mg，0.37mmol)、TEA(0.11g，0.15mL，1.1mmol)、HATU(0.21g，0.55mmol)和DCM(5mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将反应混合物于室温搅拌过夜，然后用水(10mL)处理，用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％ NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到产物，将该产物通过硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((4-氨基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g)。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-((4-氨基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g，0.15mmol)、TEA(45mg，65μL，0.45mmol)、DCM(3mL)和CS2(17mg，0.23mmol)加入到10mL微波压力小瓶中。于90℃对该反应混合物进行微波辐射(150W功率)并持续30分钟。然后将该反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩至干，得到6-((4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：将搅拌子、6-((4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.12g，0.14mmol)和HCl水溶液(0.50mL，6N，2.8mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，并对粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)，得到6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-((4-异硫氰基苯乙基)氨基甲酰基)苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(30mg)。LC-MSAPCI：C42H48N5O10S的计算值：812.32；实测值：m/z[M+H]+812.9。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.22(d,J＝0.80Hz,2H),8.06-8.21(m,2H),7.85(d,J＝8.40Hz,2H),7.68-7.78(m,4H),7.31(d,J＝8.40Hz,2H),7.21(d,J＝2.00Hz,2H),6.18(s,1H),4.77(s,2H),3.70-4.00(m,7H),3.60-3.67(m,16H),3.44-3.49(m,2H),2.90-3.10(m,3H).
实施例6
(S)-6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮 杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案5
步骤1：于0℃将搅拌子、1(6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯)(0.10g，0.15mmol)、MeOH(0.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.6mL，4.0mmol)加入到25mL单颈圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((2-氨基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(55mg)，其不经纯化用于下一步骤。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((2-氨基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(50mg，0.10mmol)、三乙胺(24mg，0.24mmol)、DCM(2mL)和二硫化碳(12mg，0.16mmol)加入到微波小瓶中。于90℃对小瓶进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将小瓶冷却至室温，并将该反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，浓缩至干，并进行硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)，得到6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯，为黄色固体(20mg)。
步骤3：将搅拌子、6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(20mg，0.030mmol)和HCl水溶液(6N，0.1mL，0.6mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于室温搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩至干，对所得残余物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19mm×150mm)5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)，得到(S)-6,6'-((2-(((2-异硫氰基乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(6mg)。LC-MS APCI：C30H41N5O8S2的计算值：663.24；实测值：m/z[M+H]+664.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.78(s,1H),8.10(s,4H),7.78(d,J＝6.00Hz,2H),4.69(s,4H),3.96-3.52(m,23H),2.85(t,J＝6.40Hz,2H),2.70(t,J＝8.00Hz,2H).
实施例7
(S)-6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮 杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案6
步骤1：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)、MeOH(0.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.6mL，4.0mmol)加入到25mL单颈圆底烧瓶中，升至室温并搅拌2小时。然后真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(70mg)，其不经纯化直接使用。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(70mg，0.10mmol)、三乙胺(20mg，0.20mmol)、无水DCM(2mL)和二硫化碳(15mg，0.20mmol)加入到微波小瓶中。于90℃对反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。将小瓶升至室温，将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，过滤并浓缩至干，得到残余物。对残余物进行硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)，得到6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(30mg)，为黄色固体。
步骤3：于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(30mg，0.040mmol)和HCl水溶液(6N，0.2mL，0.8mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩至干，并将浓缩物通过HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/分钟)纯化，得到(S)-6,6'-((2-(((5-异硫氰基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(12mg)。LC-MS APCI：C33H47N5O8S2的计算值：705.29；实测值：m/z[M+H]+706.2。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ13.40(s,1H),9.90(s,1H),8.17-8.09(m,4H),7.78(d,J＝6.80Hz,2H),4.70(s,4H),3.93-3.17(m,27H),2.68-2.67(m,2H),1.64-1.60(m,2H),1.53-1.49(m,2H),1.40-1.38(m,2H)..
实施例8
(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10, 13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案7
方案7a
方案7a，步骤1a：在氮气氛下，将搅拌子、(4-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.5g，22mmol)、1-溴-2-(2-溴乙氧基)乙烷(5.0g，22mmol)、K2CO3(4.6g，43mmol)和ACN(45mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并在氮气氛下将所得反应混合物于80℃加热16小时。将反应混合物冷却至室温，通过过滤，真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0％-20％ EtOAc/石油醚)纯化，得到产物(4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g)。
步骤2a：在氮气气氛下，将搅拌子、(4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(2.0g，5.6mmol)、硫基乙酸(0.42g，5.6mmol)、K2CO3(1.5g，11mmol)和ACN(50mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中。将反应混合物于80℃搅拌2小时，然后冷却至室温，通过过滤并真空浓缩至干。浓缩物使用中性氧化铝色谱(0％-50％ EtOAc/石油醚)纯化，得到S-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(1.8g)。
步骤3a：在氮气下，将搅拌子、S-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(1.8g，5.1mmol)、乙醇(20mL)和一水合肼
(0.24g，0.24mL，7.6mmol)加入到250mL单颈圆底烧瓶中，并于80℃搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至室温并真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物经由硅胶色谱(5％-10％ EtOAc/石油醚)纯化，得到(4-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.5g)，为无色油状物。
方案7，步骤1：在氮气气氛下，于0℃将由(4-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.40g，1.0mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(0.060g，60％矿物油溶液，1.5mmol)的DMF(3.0mL)悬浮液的50mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，就将反应混合物升温至室温并搅拌15分钟。将混合物再次冷却至0℃，并滴加由6,6'-((2-(((甲磺酰基)氧基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.5g，0.7mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液。一旦添加完成，就将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌1.5小时。然后将反应物用饱和NH4Cl(0.2mL)缓慢处理，然后浓缩至干，得到油状物。将油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到6,6'-((2-(((2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g)，为棕色油状物。
步骤2：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g，0.16mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.80mL，3.2mmol)加入到25mL单颈圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌3小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)、三乙胺(46mg，0.46mmol)、无水DCM(3mL)和二硫化碳(17mg，0.22mmol)加入到压力小瓶中。于90℃对该反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。将该反应混合物冷却至室温，并用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1MHCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩至干，得到6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化直接使用。
步骤4：将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)和HCl水溶液(6N，0.51mL，3.1mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，并将浓缩物经由制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(40mg，37％)。LC-MS APCI：C38H49N5O10S2的计算值：799.29；实测值：m/z[M+H]+799.9。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.23-8.20(m,2H),8.15-8.09(m,2H),7.74-7.71(m,2H),7.19(d,J＝8.80Hz,2H),6.92(d,J＝9.20Hz,2H),4.81(s,2H),4.77(s,2H),4.09-4.11(m,4H),3.92-3.95(m,6H),3.79(t,J＝4.00Hz,3H),3.66-3.71(m,16H),2.70-2.76(m,4H).
实施例9
(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲 基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
方案8
方案8a
方案8a，步骤1a：将搅拌子、(4-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(3.5g，17mmol)、1,2-双(2-溴乙氧基)乙烷(4.6g，17mmol)、K2CO3(4.6g，33mmol)和ACN(40mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，然后在氮气气氛下于80℃搅拌48小时。将反应混合物冷却至室温，通过过滤，真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物经由硅胶色谱(0％-10％MeOH/DCM)纯化，得到(4-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.0g)，为棕色油状物。
步骤2a：在氮气气氛下，将搅拌子、(4-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(4.0g，9.9mmol)、硫基乙酸(0.75g，9.9mmol)、K2CO3(2.7g，20mmol)和ACN(50mL)加入到250mL三颈圆底烧瓶中，并在氮气气氛下将反应混合物于60℃加热2小时。将反应混合物冷却至室温，通过过滤，真空浓缩至干，并将浓缩物通过氧化铝色谱(0％-50％ EtOAc/石油醚)纯化，得到S-(2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(3.0g)，为棕色油状物。
步骤3a：在氮气下将搅拌子、S-(2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基乙酸酯(3.0g，7.5mmol)、乙醇(50mL)和肼一水合物(0.36g，0.36mL，11mmol)加入到250mL单颈圆底烧瓶中，并于80℃搅拌1小时。将反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，并且将浓缩物通过硅胶色谱(5％-10％ EtOAc/石油醚)纯化，得到(4-(2-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g)，为无色油状物。
方案7，步骤1：在氮气气氛下，于0℃将由(4-(2-(2-(2-巯基乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.40g，1.0mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(0.060g，60％矿物油溶液，1.5mmol)的DMF(3.0mL)悬浮液的50mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物升至室温并连续搅拌15分钟。将混合物再次冷却至0℃，并在10分钟内滴加由6,6'-((2-(((甲磺酰基)氧基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.5g，0.7mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌1.5小时。然后将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(0.2mL)缓慢处理，浓缩至干，得到油状物。将油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19mm×150mm)5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g，21％)，为棕色油状物。
步骤2：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15mg，0.16mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇(4M，0.80mL，3.2mmol)溶液加入到25mL单颈圆底烧瓶中。使反应混合物升温至室温，
并搅拌3小时。真空除去挥发物，得到产物6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化用于下一步骤。
步骤3：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-氨基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.14mmol)、三乙胺(44mg，0.43mmol)的无水DCM(5mL)溶液和二硫化碳(17mg，0.22mmol)加入到微波小瓶中。于90℃对该反应混合物进行30分钟的微波辐射(150W功率)。然后将该反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷(10mL)稀释，依次用水(5mL)、1M HCl(5mL)和水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩至干，得到6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g)，其不经纯化用于下一步骤。
步骤4：将搅拌子、6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12mg，0.14mmol)和HCl水溶液(6N，0.50mL，2.8mmol)加入到10mL单颈圆底烧瓶中，并于50℃搅拌3小时。将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩至干，得到残余物，将该残余物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm 5.0μm；流动相：0.1％TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到(S)-6,6'-((2-(((2-(2-(2-(4-异硫氰基苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(50mg)。LC-MS APCI：C40H53N5O11S2的计算值：843.32；实测值：m/z[M+H]+843.9。1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.24-8.21(m,2H),8.21-8.11(m,2H),7.74(d,J＝7.60Hz,2H),7.23-7.20(m,2H),6.97-6.95(m,2H),4.84-4.79(m,5H),4.14-4.12(m,4H),3.97-3.94(m,6H),3.83-3.59(m,23H),2.75-2.67(m,4H).
实施例10
6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡 啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案9
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.40g，0.60mmol)、(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.15g，0.60mmol)、三乙胺(0.18g，0.76mmol)、HATU(0.33g，0.90mmol)和DCM(4.0mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将混合物于室温搅拌过夜，用水(10mL)稀释，用二氯甲烷(10mL×3)萃取。合并的萃取物用10％ NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g)。
步骤2：于0℃将搅拌子、6-((4-((2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.18g，0.20mmol)、MeOH(1.8mL)和HCl的甲醇(4M，1.0mL，4.0mmol)溶液加入到10mL单颈圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.15g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：于室温将搅拌子、6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(0.1g，0.1mmol)、LiOH水溶液(3mL，0.1N，0.3mmol)和MeOH(1.0mL)加入到8mL反应小瓶中并搅拌过夜。用乙酸将反应混合物调节至pH约6.5，然后于室温真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C1819mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到6-((4-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酰基)苯基)(16-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(40mg)。LC-MS APCI：C39H54N6O11的计算值：782.39；实测值：m/z[M+H]+783.0。
实施例11
6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并 [b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸
以及
实施例12
N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢- 4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲 基))吡啶二羧酸
方案10
步骤1：于0℃将搅拌子、环戊-3-烯-1-羧酸甲酯(25.0g，198mmol)、THF(600mL)、甲醇(12.6g，16.0mL，397mmol)和硼氢化锂(198mL，2.0M的THF溶液，397mmol)加入到3000mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物于70℃搅拌6小时。然后将反应混合物冷却至室温，用冰水(250mL)缓慢处理，进一步冷却至0℃，用1.5N HCl(pH约2)调节至pH约2，然后用DCM(1000mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(50％-80％ EtOAc/石油醚)纯化，得到环戊-3-烯-1-基甲醇(13.8g)。
步骤2：在氮气气氛下，于0℃将由环戊-3-烯-1-基甲醇(13.7g，139mmol)和DMF(50mL)组成的溶液在30分钟内滴加到含有氢化钠(6.69g，60％矿物油溶液，167mmol)的DMF(50mL)悬浮液的1000mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将该反应混合物缓慢升温至室温并继续搅拌30分钟。然后将混合物再次冷却至0℃，并用由苄基溴(19.8g，167mmol)和DMF(50mL)组成的溶液在15分钟内逐滴处理。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温，然后搅拌16小时。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)缓慢处理，然后用乙酸乙酯(1000mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(500mL×3)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物。将浓缩物通过硅胶色谱(0％-20％ EtOAc/石油醚)纯化，得到((环戊-3-烯-1-基甲氧基)甲基)苯(21.0g)。
步骤3：于0℃将搅拌子、NMO(38.0g，50重量％H2O溶液，158mmol)、THF(180mL)和四氧化锇(16.2g，3.21mL，2.5重量％叔丁醇溶液，0.158mmol)加入到1000mL三颈圆底烧瓶中。将反应混合物升至室温，搅拌10分钟再冷却至0℃。一旦冷却，就用((环戊-3-烯-1-基甲氧基)甲基)苯(20.0g，158mmol)和THF(180mL)的溶液在15分钟内逐滴处理混合物。将反应物升至室温并搅拌16小时，然后用饱和NaHCO3水溶液(100mL)缓慢处理，并用DCM萃取(1000mL×3)。将合并的萃取物用水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0％-20％ EtOAc/石油醚)纯化，得到4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二醇的异构体混合物，为无色油状物。异构体通过SFC(仪器：PIC 100；柱：ChiralpakOXH(250×30)mm，5μm；流动相：CO2:0.5％异丙胺的IPA溶液(60:40)；总流速:70g/min；背压：100巴；波长：220nm；循环时间：8.0min)分离，得到4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二醇的顺式-1,2异构体：第1洗脱异构体(10g)和第2洗脱异构体(5g)两者。
步骤4：在氮气气氛下，于0℃将由4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二醇的第1洗脱异构体(10.0g，45.0mmol)和DMF(60mL)组成的溶液在1小时内滴加到含有氢化钠(8.62g，60％矿物油溶液，225mmol)的DMF(60mL)悬浮液的250mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将该反应混合物升至室温并搅拌30分钟。然后将混合物再次冷却至0℃，并用由2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(47.0g，225mmol)和DMF(60mL)组成的溶液在15分钟内逐滴处理。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温并搅拌2小时。然后将混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)缓慢处理，然后用乙酸乙酯(500mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物，将该油状物通过硅胶色谱(0％-30％EtOAc/石油醚)纯化，得到2,2'-((((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(四氢-2H-吡喃)(21.0g)。
步骤5：将搅拌子、2,2'-((((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(四氢-2H-吡喃)(29.0g，61.0mmol)、MeOH(200mL)和HCl的1,4-二噁烷溶液(4M，3.0mL，12.0mmol)加入到1000mL三颈圆底烧瓶中，然后加热回流1小时。然后将烧瓶冷却至室温，真空除去挥发物，得到2,2'-((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)(20.0g)作为残余物，其不经纯化直接使用。
步骤6：在氮气气氛下将搅拌子、2,2'-((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)(20.0g)(20.0g，64.4mmol)、DCM(200mL)和三乙胺(32.6mL，322mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，并将所得混合物冷却至10℃。然后将混合物用分批加入的pTsCl(36.9g，193mmol)处理，接着升至室温。一旦添加完成，将反应混合物搅拌16小时，在此期间形成沉淀。然后将混合物用DCM(500mL)稀释，用冷HCl水溶液(1M，500mL×3)和冰冷水(500mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到残余物，将该残余物通过硅胶色谱(0％-30％ EtOAc/石油醚)纯化，得到((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)双(4-甲基苯磺酸酯)(26.0g)。
步骤7：在氮气气氛下将搅拌子、N,N'-((乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(4-甲基苯磺酰胺)(21.0g，42.0mmol)、Cs2CO3(41.3g，126mmol)和无水DMF(250mL)加入到2000mL三颈圆底烧瓶中，并将所得异质混合物于室温搅拌1.5小时。然后用由((4-((苄氧基)甲基)环戊烷-1,2-二基)双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)双(4-甲基苯磺酸酯)(26.0g，42.0mmol)和DMF(250mL)组成的溶液经2小时的时间逐滴处理该混合物。继续搅拌20小时，然后将混合物真空浓缩至干，得到糊状固体。将糊状物悬浮于DCM(1000mL)中，搅拌30分钟，并通过真空过滤进行过滤。将过滤物真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过硅胶色谱(0％-40％ EtOAc/石油醚)纯化，得到18-((苄氧基)甲基)-4,13-二对甲苯磺酰基十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷(24g)。
步骤8：在氮气气氛下将HBr(50％，112mL，695mmol)的HOAc溶液加入到含有搅拌子和18-((苄氧基)甲基)-4,13-二对甲苯磺酰基十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷(24.0g，32.8mmol)的500mL圆底烧瓶中。将混合物于室温搅拌直至均匀，然后用苯酚(16.3g，174mmol)处理。然后将该反应混合物于60℃加热6小时，之后冷却至室温并真空浓缩至干，得到浓缩物。将浓缩物通过反相柱色谱(柱：RevelriesC18-330g；流动相A：0.1％ TFA水溶液，流动相B：乙腈；流速：60mL/min)纯化，得到(十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-18-基)乙酸甲酯(8.0g)。
步骤9：在氮气气氛下将搅拌子、(十四氢-2H,11H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-18-基)乙酸甲酯(8.0g，21mmol)、6-(氯代甲基)吡啶羧酸甲酯(12.2g，53.2mmol)、Na2CO3(11.1g，106mmol)和乙腈(100mL)加入500mL三颈圆底烧瓶中，并在氮气气氛下，于90℃将所得异质混合物加热16小时。然后将所得混合物冷却至室温，通过垫过滤，并将滤液真空浓缩至干，得到浓缩物。对浓缩物进行硅胶色谱(0％-10％MeOH/DCM)，得到6,6'-((18-(乙酰氧基甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(5.0g)。
步骤10：在氮气气氛下将搅拌子、6,6'-((18-(乙酰氧基甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(5.0g，7.4mmol)、K2CO3(0.10g，0.74mmol)和甲醇(50mL)加入250mL圆底烧瓶中，并将所得混合物于室温搅拌10分钟。然后将混合物真空浓缩至干，并且将所得残余物通过硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6,6'-((18-(羟甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(3.0g)。
步骤11：在氮气气氛下将搅拌子、6,6'-((18-(羟甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(2.0g，3.1mmol)、DCM(20mL)和三乙胺(1.2g，9.5mmol)加入到100mL三颈圆底烧瓶中，并将所得混合物冷却至10℃。将混合物用MsCl(0.48g，6.3mmol)分批处理，并且一旦添加完成，将反应容器升至室温并且搅拌30分钟，在此期间形成沉淀。然后将异质混合物用DCM(50mL)稀释，用冷HCl水溶液(1M，50mL×3)和冰冷水(50mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到胶状固体。胶状固体通过中性氧化铝柱色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6,6'-((18-(((甲磺酰基)氧基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(1.5g)。
步骤12：在氮气气氛下，于0℃将由6,6'-((18-(((甲磺酰基)氧基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(0.69g，3.2mmol)和DMF(5mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(162mg，60％矿物油溶液，4.22mmol)的DMF(0.5mL)悬浮液的25mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物升至室温并搅拌15分钟。然后将反应混合物再次冷却至0℃，并用由2-(2-巯基乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯(1.50g，2.11mmol)和DMF(3mL)组成的溶液在5分钟内逐滴处理。一旦添加完成，就使反应混合物缓慢升温至室温然后搅拌1小时。然后将反应物用饱和NH4Cl溶液缓慢处理，随后用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150m)5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)纯化，得到环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(0.2g)。
步骤13：于0℃将搅拌棒、环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸酯(0.20g，0.24mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇(4M，1.2mL，4.8mmol)溶液加入到25mL单颈圆底烧瓶中，并将所得混合物升至室温，搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(150mg)，其不经纯化直接使用。
步骤14：于室温将搅拌棒、6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(40mg，0.054mmol)、LiOH水溶液(1.6mL，0.1N，0.16mmol)和MeOH(0.5mL)加入到8mL反应小瓶中，并将所得混合物搅拌过夜。将反应混合物的pH用乙酸调节至pH约6.5，然后于室温真空浓缩至干，将所得浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGEC18 19mm×150mm 5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到实施例11：6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(23mg)。LC-MS APCI：C34H51N5O9S的计算值：705.34；实测值：m/z[M+H]+706.4。
步骤15：在氮气气氛下，于0℃将搅拌棒、6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(70mg，0.95mmol)、11,12-二脱氢-γ-氧代二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-丁酸(29mg，0.95mmol)、三乙胺(29mg，0.76mmol)、HATU(54mg，0.14mmol)和DCM(0.5mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将所得混合物升至室温并搅拌过夜。将反应混合物用水(10mL)稀释并用二氯甲烷(10mL×3)萃取。将合并的萃取物用10％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。油状物通过硅胶色谱(0％-10％MeOH/DCM)纯化，得到N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(10mg)。
步骤16：于室温将搅拌棒、N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(10mg，0.01mmol)、LiOH水溶液(0.3mL，0.1N，0.03mmol)和甲醇(0.25mL)加入到8mL反应小瓶中，并将所得混合物搅拌过夜。将反应混合物用乙酸调节至pH约6.5，于室温真空浓缩至干，将所得浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19mm×150mm)5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到
实施例12：N-酰基-DBCO标记的6,6'-((18-(((2-(2-氨基乙氧基)乙基)硫基)甲基)十四氢-4H,13H,17H-环戊并[b][1,4,10,13]四氧杂[7,16]二氮杂环十八烷-4,13-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(3mg)。LC-MS APCI：C53H64N6O11S的计算值：992.44；实测值m/z[M-H]-：991.4。
实施例13
6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-8-异硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二 氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案11
步骤1：向在氮气的惰性气氛下吹扫并维持的500mL三颈圆底烧瓶中加入8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酸(20.0g，77.1mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液、N,O-二甲基羟胺(7.0g，115mmol)、二异丙基乙胺(29.90g，231mmol)。这之后在0℃下，边搅拌边加入HATU(43.9g，115mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时。然后通过添加200mL的水猝灭反应物。用二氯甲烷(100mL×2)萃取所得溶液。将合并的有机层依次用HCl(1M)(300mL×2)、NH4CO3水溶液(400mL×3)和盐水(400mL)洗涤。经无水Na2SO4干燥后，浓缩，得到(8-(甲氧基(甲基)氨基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(15.4g，66％收率)，为浅黄色油状物。
步骤2：向在氮气的惰性气氛下吹扫并维持的500mL三颈圆底烧瓶中加入2,6-二溴吡啶(23.0g，927mmol)的THF(400mL)溶液。将其冷却至-78℃，并快速滴加n-BuLi(60.4mL，927mmol)。搅拌10分钟后，于-78℃搅拌下滴加加入(8-(甲氧基(甲基)氨基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(14.0g，463.5mmol)的THF(40mL)溶液。将所得溶液于室温搅拌30分钟。通过添加500mL的水猝灭反应物。将所得溶液用乙酸乙酯(200mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(400mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩得到粗产物。经硅胶色谱(0％-10％乙酸乙酯/石油醚)得到(8-(6-溴吡啶-2-基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(11.8g，50％收率)，为淡黄色固体。
步骤3：向在氮气的惰性气氛下维持的1L高压反应器中加入(8-(6-溴吡啶-2-基)-8-氧代辛基)氨基甲酸叔丁酯(11.5g，28.8mmol，1.0当量)的MeOH(500mL)溶液，随后加入Pd(dppf)Cl2(2.1g，2.88mmol)、TEA(8.7g，86.4mmol)。然后引入CO(20atm)。将所得溶液于100℃搅拌16小时。将反应溶液过滤并直接用于下一步骤。
步骤4：将从上面得到的MeOH溶液冷却至0℃并加入NaBH4(1.08g，28.8mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时。然后将反应物通过加入500mL NH4CO3水溶液猝灭，并用乙酸乙酯(300mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(600mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-羟基辛基)吡啶羧酸甲酯(10g)，为棕色油状物。
步骤5：向在氮气的惰性气氛下吹扫并维持的250mL三颈圆底烧瓶中加入6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-羟基辛基)吡啶羧酸甲酯(10g)的DCM(100mL)溶液。冷却至0℃后，加入TEA(7.9g，78.9mmol)和甲磺酰氯(3.6g，31.5mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时。将混合物真空浓缩。加入MeCN(100mL)并真空浓缩。将粗产物6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-((甲磺酰基)氧基)辛基)吡啶羧酸甲酯直接用于下一步骤。
步骤6：向上述粗产物6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-((甲磺酰基)氧基)辛基)吡啶羧酸甲酯的ACN(100mL)溶液中加入NaI(4.3g，28.9mmol)。将所得溶液于80℃搅拌1小时。将混合物过滤并浓缩。粗产物通过快速制备型HPLC纯化：柱C18；流动相，30分钟内H2O/ACN＝50％/50％至H2O/ACN＝20％/80％；得到4g 6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-碘辛基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤7：向6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-碘辛基)吡啶羧酸甲酯(3.0g，6.12mmol)的DCM(200mL)溶液中加入6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(3.0g，7.34mmol)、二异丙基乙胺(3.9g，30.61mmol)。将所得溶液于80℃搅拌16小时。浓缩反应物。粗产物通过快速制备型HPLC纯化：柱C18；流动相，A：H2O(0.05％ TFA)，B：CAN；20分钟内20％ B至40％ B。得到1.9g 6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤8：于0℃向搅拌的6-(8-((叔丁氧基羰基)氨基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯(1.7g，2.19mmol，在LCMS上77％)的DCM(8.5mL)溶液中滴加HCl/二噁烷。将所得溶液于室温搅拌1小时。通过分批加入NH4CO3水溶液(20mL×3)猝灭反应物。用二氯甲烷(100mL×2)萃取所得溶液。将合并的有机层用盐水(400mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到1.3g 6-(8-氨基-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤9：在N2下，向6-(8-氨基-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)辛基)吡啶羧酸甲酯(1.0g，1.48mmol)的DCM(17mL)溶液中加入1,1'-硫代羰基双(吡啶-2(1H)-酮)(0.38g，1.63mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1h。浓缩，得到1.6g 6-((16-(1-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-8-硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤10：向6-((16-(1-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-8-硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.40g，1.42mmol)的ACN(4mL)溶液中加入HCl(6M)(7mL)。将所得溶液于50℃在油浴中搅拌5小时。用10mL H2O稀释。粗产物通过快速制备型HPLC纯化：柱，C18；流动相，A：H2O(0.05％ TFA)，B：ACN，20分钟内20％ B至36％ B；检测器UV@210nm。浓缩产物级分以除去ACN。用NaHCO3水溶液将水溶液调节至pH 7～8。再次在快速制备型HPLC上纯化：柱，C18；流动相，A：H2O，B：ACN，20分钟内95％ B至100％ B。将产物溶液浓缩以除去CAN，然后冻干。得到190mg 6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-8-硫氰基辛基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸，为棕色固体。1H NMR(300MHz,D2O)δ7.91(s,4H),7.54(s,2H),4.52(d,J＝17.9Hz,3H),3.77(d,J＝9.3Hz,8H),3.56-3.41(m,18H),2.11(s,2H),1.51(s,2H),1.17(s,7H),0.97(s,1H).MS(ES,m/z):688.3(M+H+).
实施例14
6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,4, 10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸
方案12
步骤1：在氮气气氛下，于0℃向2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-油酸(10.00g，37.98mmol)和二异丙基乙胺(14.73g，113.94mmol)的二氯甲烷(100mL)搅拌溶液中滴加[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(15.16g，39.88mmol)、N,O-二甲基羟胺(5.55g，56.97mmol)。将所得混合物于室温搅拌1小时后，将其倒入饱和NH4Cl(水溶液)中。将所得混合物用二氯甲烷(100mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：含0.05％ TFA的H2O，B：ACN；20分钟内梯度20％ B至40％B；检测器：UV@210nm。得到(3-甲基-4-氧代-2,6,9-三氧杂-3-氮杂十一烷-11-基)氨基甲酸叔丁酯(9.90g，85％收率)，为淡黄色油状物。
步骤2：在氮气气氛下，于-78℃向500ml三颈圆底烧瓶中的2,6-二溴-吡啶(13.3g，56.1mmol)的THF(260mL)溶液中滴加n-BuLi(28.0mL，56.1mmol)。将溶液于-78℃搅拌10分钟。将(3-甲基-4-氧代-2,6,9-三氧杂-3-氮杂十一烷-11-基)氨基甲酸叔丁酯(7.0g，28.0mmol)的THF(30mL)溶液于-78℃滴加到反应溶液中，并将混合物于室温搅拌30分钟。通过加入0℃的水/冰(200mL)猝灭反应物。将水层用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。将合并的萃取物经Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相，流动相A：含0.05％ TFA的H2O，B：ACN；20分钟内梯度38％ B至58％ B；检测器：UV@210nm。得到(2-(2-(2-(6-溴吡啶-2-基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.6g，50％收率)，为黄色固体。MS(ES,m/z):425,427(M+Na+).
步骤3：向250mL高压反应器中加入(2-(2-(2-(6-溴吡啶-2-基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.0g，18.1mmol)、三乙胺(5.5g，54.3mmol)、Pd(dppf)Cl2(1.3g，1.8mmol)和MeOH(40mL)。将反应溶液抽空并用N2回填。然后引入CO(10atm)。将所得溶液于100℃搅拌过夜。过滤反应混合物并将滤液浓缩至干。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：含0.05％ TFA的H2O，B：ACN；20分钟内梯度38％ B至58％B；检测器：UV@210nm。得到6-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-酰基)吡啶羧酸甲酯(2.4g，63％收率)，为棕色油状物。MS(ES,m/z):405(M+Na+).
步骤4：在N2气氛下，于0℃向6-(2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-酰基)吡啶羧酸甲酯(2.30g，6.01mmol)的MeOH(46mL)溶液中加入NaBH4(0.23g，6.01mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时并通过加入50mL饱和NH4HCO3(水溶液)猝灭。将所得溶液用乙酸乙酯(30mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(60mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。得到2.2g粗产物6-(13-羟基-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤5：在0℃、N2气氛下，向6-(13-羟基-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(2.2g，5.72mmol)的二氯甲烷(22mL)溶液中加入三乙胺(1.74g，17.16mmol)和MsCl(0.79g，6.86mmol)。将所得溶液于室温搅拌1小时，用H2O(22mL)猝灭。将所得混合物用二氯甲烷(20mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。得到2.2g粗产物6-(2,2-二甲基-13-((甲磺酰基)氧基)-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物。
步骤6：在N2气氛下，向6-(2,2-二甲基-13-((甲磺酰基)氧基)-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(2.2g，4.75mmol)的ACN(22mL)溶液中加入NaI(0.78g，5.23mmol)。将所得溶液于80℃搅拌1小时。将混合物过滤并浓缩。粗产物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：H2O，B：ACN；30分钟内梯度50％ B至80％ B；检测器：UV@210nm。得到6-(13-碘-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(1.2g)，为棕色油状物。MS(ES,m/z):517(M+Na+),495(M+H+).
步骤7：在氮气气氛下，于80℃将6-(13-碘-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)吡啶羧酸甲酯(840mg，1.69mmol)和6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(839mg，2.03mmol)的ACN(16.8mL)溶液搅拌过夜。过滤冷却的反应混合物，并将滤液减压浓缩。粗产物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：H2O，B：ACN；20分钟内梯度40％ B至60％ B；检测器：UV@210nm。得到6-((16-(13-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(450mg)，为棕色油状物。MS(ES,m/z):700(M+Na+),678(M+H+)。
步骤8：于0℃向6-((16-(13-(6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)-2,2-二甲基-4-氧代-3,8,11-三氧杂-5-氮杂十三烷-13-基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(450mg，579mmol)的二氯甲烷(2.5mL)溶液中加入HCl/二噁烷(2.5ml，4M)。将所得溶液于室温搅拌20分钟。通过添加饱和Na2CO3(水溶液)猝灭反应物。将水层用DCM:IPA(5:1)(30mL×2)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到粗产物6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(330mg)。将粗产物直接用于下一步骤。
步骤9：在氮气气氛下，于室温将6-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(300mg，0.44mmol)和1-(2-氧代吡啶-1-硫代羰基)吡啶-2-酮(113.08mg，0.48mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液搅拌1小时。将所得混合物减压浓缩，得到粗产物6-(2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(380mg)。将粗产物直接用于下一步骤。
步骤10：在氮气气氛下，于50℃将6-(2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)-1-(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)乙基)吡啶羧酸甲酯(380mg，0.52mmol)和HCl(1.9mL，6M)的二氯甲烷(1.9mL)溶液搅拌3小时。将所得混合物减压浓缩，用饱和NaHCO3(水溶液)碱化至pH 6-7。残余物通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：含0.05％ TFA的H2O，B：ACN，20分钟内梯度20％ B至36％ B；检测器：UV@210nm。然后，将产物级分真空浓缩以除去MeCN。将溶液再次通过色谱纯化：柱，C18；流动相A：H2O，B：ACN，20分钟内梯度95％ B至100％ B。浓缩溶液以除去大部分MeCN，冻干水溶液，得到6-((16-(1-(6-羧基吡啶-2-基)-2-(2-(2-异硫氰基乙氧基)乙氧基)乙基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(130mg)，为棕色固体。1H NMR(300MHz,D2O)8.03-7.84(m,2H),7.57(dd,J＝22.3,7.4Hz,1H),5.00(s,0H),4.59(s,1H),4.20(dd,J＝23.4,9.5Hz,1H),3.82(d,J＝15.4Hz,4H),3.70-3.58(m,6H),3.58-3.49(m,6H).MS(ES,m/z):692.3(M+H+)。
实施例15
6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基) 氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲 基))吡啶二羧酸
方案13
步骤1：在氮气气氛下，于0℃将由(5-巯基戊基)氨基甲酸叔丁酯(0.30g，1.0mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在5分钟内滴加到含有氢化钠(0.07g，60％矿物油溶液，2mmol)的DMF(3.0mL)悬浮液的50mL三颈圆底烧瓶中。一旦添加完成，将反应混合物升至室温并继续搅拌15分钟。将反应混合物再次冷却至0℃，并用由6,6'-((2-(((甲磺酰基)氧基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.6g，0.9mmol)和DMF(3.0mL)组成的溶液在10分钟内逐滴处理。一旦添加完成，将反应混合物缓慢升温至室温并持续搅拌1.5小时。然后将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(1.0mL)小心地处理，浓缩至干，得到油状物。对油状物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％ TFA的水/乙腈溶液；流速：15.0mL/min)，得到6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.25g)。
步骤2：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.25g，0.32mmol)、MeOH(1.0mL)和HCl的甲醇溶液(4M，1.5mL，6.3mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，随后将其升至室温并将混合物搅拌3小时。然后真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.21g)，其不经纯化直接使用。
步骤3：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.15g，0.22mmol)、((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基4-硝基苯基碳酸酯(68mg，0.22mmol)、三乙胺(66mg，0.65mmol)以及DCM(2mL)和DMF(0.1mL)的混合物加入到25mL三颈圆底烧瓶中。将所得混合物逐渐温热至室温并搅拌过夜。然后将混合物浓缩至干，得到6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(0.1g)，其不经纯化直接使用。
步骤4：将搅拌棒、6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸二甲酯(0.10g，0.12mmol)、LiOH水溶液(3.5mL，0.1N，0.35mmol)和MeOH(0.5mL)加入到8mL反应小瓶中，并将所得混合物于室温搅拌过夜。然后用乙酸将反应混合物处理直至pH约6.5，随后于室温真空浓缩至干，得到油状物，将该油状物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm，5.0μm；流动相：0.1％甲酸的H2O溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到6,6'-(((S)-2-(((5-(((((1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲氧基)羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))吡啶二羧酸(42mg)。
实施例16
N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂- 7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸
方案14
步骤1：于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-((叔丁氧基羰基)氨基)戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(0.12g，0.15mmol)、MeOH(0.5mL)和HCl的甲醇溶液(4M，0.75mL，3.0mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，然后升至室温并搅拌2小时。真空除去挥发物，得到6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(70mg)，其不经纯化直接使用。
步骤2：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(50mg，0.070mmol)、11,12-二脱氢-γ-氧代二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-丁酸(20mg，0.070mmol)、三乙胺(21mg，0.21mmol)、HATU(38mg，0.10mmol)和DCM(0.5mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中，随后升至室温并搅拌过夜。将反应混合物用水(10mL)处理并用二氯甲烷(10mL×3)萃取，然后用10％ NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤合并的萃取物，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到油状物。该油状物通过硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(16mg)。
步骤3：将搅拌子、N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸二甲酯(16mg，0.016mmol)、LiOH水溶液(0.49mL，0.1N，0.049mmol)和MeOH(0.25mL)加入到8mL反应小瓶中，并将混合物于室温搅拌过夜。然后用乙酸将反应混合物处理直至pH约6.5，并于室温真空浓缩至干，得到浓缩物，将该浓缩物通过制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18 19mm×150mm5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)纯化，得到N-酰基-DBCO标记的6,6'-((2-(((5-氨基戊基)硫基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基)双(亚甲基))(S)-吡啶二羧酸(5mg)，为灰白色固体。LC-MS APCI：C51H62N6O10S的计算值：950.42；实测值m/z[M+H]+951.4。1H NMR(400MHz,D2O):δ7.81-7.75(m,4H),7.52-7.17(m,10H),4.97-4.90(m,1H),4.80(s,4H),4.14(s,3H),3.77-3.46(m,16H),3.10(s,7H),2.83-2.80(m,2H),2.55-2.53(m,2H),2.42-2.38(m,3H),2.11-2.08(m,3H),1.39-1.35(m,2H),1.20-1.10(m,4H).
实施例17
N-酰基-DBCO标记的6-((4-((6-氨基乙基)氨基甲酰基)苯基)16-((6-羧基吡啶- 2-基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(TOPA-[C7]-苯亚 氨基-DBCO)
方案15
步骤1：在氮气下，于-78℃向500mL三颈圆底烧瓶中的6-甲酰吡啶羧酸甲酯(4.00g，24.2mmol)、(4-(叔丁氧基羰基)苯基)硼酸(10.7g，48.5mmol)、PdCl2(0.21g，1.2mmol)、三(萘-1-基)膦(0.50g，1.2mmol)和碳酸钾(10.0g，72.7mmol)的混合物中一次性加入四氢呋喃(100mL)。将混合物用氮气吹扫，并于室温搅拌30分钟，然后于65℃加热24小时。将反应混合物冷却至室温，通过垫过滤，并将滤液浓缩至干。对粗产物进行硅胶色谱(0％-50％ EtOAc/石油醚)，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为黄色油状物(2.5g，30％)。
步骤2：在氮气气氛下，于室温将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯(2.50g，7.30mmol)、PPh3(3.43g，13.1mmol)、N-溴琥珀酰亚胺(2.13g，12.0mmol)和DCM(30mL)放入250mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应溶液上样到硅胶柱上并使用0％-30％乙酸乙酯/石油醚纯化，得到化合物6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.65g，56％)，为黄色油状物。
步骤3：在氮气气氛下，将搅拌子、6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.52g，3.69mmol)、6-(溴(4-(叔丁氧基羰基)苯基)甲基)吡啶羧酸酯(1.50g，3.69mmol)、Na2CO3(1.17g，11.1mmol)和乙腈(30mL)加入250mL三颈圆底烧瓶中，将所得异质混合物在氮气气氛下，于90℃加热16小时。随后将反应物料冷却至室温，通过垫过滤，并真空浓缩至干，得到粗产物。对粗产物进行硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)纯化，得到6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯，为棕色油状物(1.2g，44％收率)。
步骤4：将搅拌子、6-((4-(叔丁氧基羰基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(1.2g，1.6mmol)、TFA(0.62mL，8.1mmol)和DCM(20mL)于室温加入到100mL三颈圆底烧瓶中并搅拌1小时。将反应混合物浓缩至干，并对所得粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19mm×150mm)5.0μm；流动相：0.1％ TFA水溶液/ACN；流速：15.0mL/min)，得到4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.8g，72％)，为棕色油状物。LC-MS APCI：C35H44N4O10的计算值：680.31；实测值：m/z[M+H]+681.5。通过LC-MS测得的纯度：99.87％。通过HPLC测得的纯度：97.14％(在210nm处为97.01％，在254nm处为97.20％，在280nm处为97.21％；柱：Atlantis dC18(250mm×4.6mm)，5μm；流动相A：0.1％ TFA水溶液，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/分钟.％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.12-8.07(m,4H),8.00-7.98(m,2H),7.75-7.73(m,4H),6.10(s,1H),4.67(s,2H),3.96(s,3H),3.91(s,3H),3.82(s,8H),3.56(s,8H),3.52(s,8H).
步骤5：在氮气气氛下，于0℃将搅拌子、4-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)苯甲酸(0.25g，0.37mmol)、DBCO(0.10g，0.37mmol)、三乙胺(0.16mL，1.1mmol)、HBTU(0.21g，0.55mmol)和DCM(10mL)加入到25mL三颈圆底烧瓶中并于室温搅拌16小时。反应物用水(20mL)猝灭，并用DCM(3×20mL)萃取。将合并的萃取物用10％ NaHCO3水溶液(20mL)、盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到粗产物，为油状物。对粗产物进行硅胶色谱(0％-10％ MeOH/DCM)，得到TOPA二甲酯-[C7]-苯基-DBCO(0.12g，35％)，为无色粘性油状物。
步骤6：于室温将搅拌子、TOPA二甲酯-[C7]-苯基-DBCO(0.1g，0.1mmol)、LiOH.H2O水溶液(3mL，0.1N，0.3mmol)和THF/MeOH/H2O(4:1:1v/v/v，2mL)加入到8mL反应小瓶中，并搅拌2小时。将反应混合物用HCl水溶液(1N)中和至PH约为6.5。将反应混合物于室温真空浓缩至干，对所得粗产物进行制备型HPLC(柱：XBRIDGE C18(19mm×150mm)5.0μm；流动相：10mM乙酸铵水溶液/ACN；流速：15.0mL/分钟)，得到TOPA-[C7]-苯基-DBCO(20mg，21％)，为灰白色固体。LC-MS APCI：C51H54N6O10的计算值：910.39；实测值：m/z[M-H]+909.3。通过LC-MS测得的纯度：92.47％。通过HPLC测得的纯度：90.68％(在210nm处为88.04％，在254nm处为90.43％，并且在280nm处为93.56％；柱：XBRIDGE C8(50×4.6mm)，3.5μm；流动相A：10mM碳酸氢铵水溶液，流动相B：乙腈；流速：1.0mL/分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.84-7.82(m,4H),7.60-7.29(m,12H),7.13-7.10(m,2H),5.12-5.02(m,2H),3.97(s,2H),3.59-3.44(m,20H),2.85(s,4H),2.73-2.68(m,6H).
实施例18
TOPA-[C7]-苯亚氨基-DBCO-三唑-PSMB-127抗体缀合物
步骤1.mAb的叠氮化物修饰和点击反应：于37℃用100x摩尔过量的3-叠氮基丙胺和微生物转谷氨酰胺酶(MTG；活化TI)对PSMB127进行位点选择性修饰。通过Agilent G224仪器上的完整质量ESI-TOF LC-MS监测mAb的重链上两个叠氮化物的添加。除去过量的3-叠氮基丙胺和MTG，并使用1mL GE Healthcare MabSelect柱纯化叠氮化物修饰的mAb(叠氮基-mAb)。将叠氮基-mAb使用100mM柠檬酸钠(pH 3.0)从树脂上洗脱，随后使用7K脱盐柱交换到20mM Hepes、100mM NaCl(pH7.5)中。使10x摩尔过量的TOPA-[C7]-苯基-DBCO与位点特异性叠氮化物-PSMB127(DOL＝2)在37℃在不振荡的情况下反应1小时。通过完整质谱监测DBCO-叠氮化物点击反应的完成。通过在7K脱盐柱上将缀合物脱盐到20mMHepes、100mM NaCl(pH 7.5)中，然后使用30K MWCO Amicon浓缩装置通过以3800×g旋转在20mM Hepes、100mM NaCl(pH 7.5)中进行三个连续的15x稀释和浓缩步骤来去除过量的游离螯合剂。这提供了最终位点特异性TOPA-[C7]-苯基-DBCO-PSMB127缀合物，其中CAR＝2。通过在Tosoh TSKgel G3000SWxl 7.8mm×30cm，5u柱上使用以下条件的分析性尺寸排阻色谱法确认最终缀合物为单体；柱温：室温；将柱用DPBS缓冲液(1x，不含钙和镁)洗脱；流速：0.7mL/min；18分钟运行；进样容量：18μL。
步骤2.螯合：在纯水中制备下列金属盐的储备溶液：
将金属溶液加入到在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)中的5x摩尔过量的TOPA-[C7]-苯基-DBCO-PSMB127(6.8μM抗体，34μM金属离子)中，并于37℃温育2小时。通过用柱脱盐，随后在50K MWCO Amicon浓缩器(EMD)中进行两个10x稀释和浓缩循环来除去过量金属。通过完整和简化质量的LC-MS评估螯合。
步骤3.稳定性测定：为了测定螯合物的稳定性，进行DTPA测试。将50μL样品(6.3μM抗体)与50μL 10mM DTPA pH 6.5混合，并于37℃温育过夜。通过完整和简化质量的LC-MS评估螯合。LC-MS在连接到Agilent G6224 MS-TOF质谱仪的Agilent 1260 HPLC系统上进行。LC在Agilent RP-mAb C4柱(2.1mm×50mm，3.5微米)上以1mL/分钟的流速运行，其中流动相为0.1％甲酸的水溶液(A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(Sigma-Aldrich，目录号34688)(B)，并且梯度为20％ B(0至2分钟)、20％-60％ B(2分钟至3分钟)、60％-80％ B(3分钟至5.5分钟)。仪器以正电喷雾电离模式操作，并从m/z 600至6000扫描。使用最大熵算法对质荷比谱进行解卷积，并且通过解卷积质量的峰高估计相关物质的相对量。仪器设置包括：毛细管电压3500V；碎裂电压175V；撇渣器电压65V；气体温度325C；干燥气体流速5.0L/min；喷雾器压力30psig；采集模式范围100-7000，扫描速率0.42。
对于铈和钕样品，观察到相对于TOPA-[C7]-苯基-DBCO-PSMB127的MW变化。与铈一起温育的缀合物的完整质量显示MW增加139(20％，按峰面积计)或276(77％)。Da对应于1或2个铈离子的添加。在DTPA测试后，质量保持相似，具有相似的丰度(对于+138物质和+274物质为30％和67％)。
实施例19
6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-异硫氰基苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16- 二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸(H2bp18c6-苄基-苯基)(TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸 酯和钠盐形式
化合物2以与现有文献方法类似的方式制备，参见J.Org.Chem；1987，52，5172。
化合物3以与现有文献方法类似的方式制备，参见Chemistry-a EuropeanJournal；2015，21，10179。
化合物4的制备：
在N2气氛下，于15℃-20℃将1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷(494g，1.88mol，2.5当量)、NaCl(44.1g，0.75mol，1.0当量)、H2O(140mL，相对于化合物3为1体积)和乙腈(2.1L，15体积)装入10L反应器中，加热至65℃。于65℃在1小时内向所得混合物中滴加化合物3(140g，0.75mol)的乙腈(280ml，2体积)溶液。于65℃将溶液老化0.5小时。混合物的LCMS分析显示反应已完成。将混合物冷却至室温并真空浓缩。向混合物中加入丙酮(700ml，5体积)并将悬浮液再搅拌1小时。将混合物过滤(过滤的固体是未反应的化合物2)。将滤液真空浓缩，然后溶解于DCM(1.4L，10体积)中。将有机相用水(3×750mL)洗涤，并将有机相用Na2SO4干燥，然后真空浓缩，得到化合物4，212g(63％收率，测定：85％w/w)。LCMS:(ES,m/z):412.15[M+H]+ 1H-NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.98-7.87(m,2H),7.81(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),3.87(s,3H),3.81(s,2H),3.61-3.38(m,16H),2.77(dt,J＝19.0,5.2Hz,8H).
化合物7的制备：
在N2气氛下，于15℃-20℃将6-甲酰吡啶羧酸甲酯5(250g，1.0当量)、(4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)硼酸6(538g，1.5当量)和脱气的THF(6.5L，相对于5为26体积)加入10L反应器中。然后加入PdCl2(14.0g，0.05当量)、三(萘-1-基)-磷烷(31g，0.05当量)和K2CO3(650g，3.1当量)。将所得溶液于20°搅拌0.5小时。然后将混合物加热至65℃并老化17小时。LCMS的分析显示该反应已完成。将所得溶液于室温冷却并用冰水(2.5L，10体积)和乙酸乙酯(5L，20体积)稀释。搅拌混合物，然后通过Celite垫过滤。使溶液分离，并弃去含水下层。用水(2×1.5L，12体积)洗涤有机相。分离各层，并将有机层经Na2SO4干燥，真空浓缩。将所得残余物用庚烷(1.25L，5体积)处理并将所得悬浮液搅拌0.5小时。过滤混合物，用正庚烷(500ml，2体积)洗涤滤饼，得到530g(98％收率，LCAP纯度：90％)期望产物7，为黄色固体，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。LCMS:(ES,m/z):381.10[M+Na]+ 1H-NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.27(s,1H),8.03-7.85(m,2H),7.79(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H),6.13(d,J＝4.0Hz,1H),5.72(d,J＝3.9Hz,1H),3.87(s,3H),1.46(s,9H).
化合物8的制备；
在氮气气氛下，于15℃-20℃将6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)(羟基)甲基)吡啶羧酸甲酯7(310g，1.0当量)、三乙胺(219g，2.5当量)和DCM(6.2L，相对于7为20体积)装入10L反应器中，并将溶液冷却至0℃。在30分钟内滴加甲磺酰氯(99.2g，1.0当量)，保持温度为℃。除去冷却浴，使温度达到环境温度，然后在该温度下老化1小时。将溶液在10℃-15℃真空浓缩，然后将残余物溶于乙腈(438ml，2体积)中。将所得溶液真空浓缩，得到518g(粗制)期望产物8。将该粗产物不经进一步纯化直接用于下一步骤。
化合物9的制备：
在氮气气氛下，于室温将6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)-((甲磺酰基)氧基)甲基)吡啶羧酸甲酯8(212g，1.0当量，通过Q-NMR测得纯度为85％)、Na2CO3(137.6g，3.0当量)和乙腈(3.56L，相对于8为20体积)装入10L反应器中，然后将混合物加热至65℃并老化1小时。于65℃在0.5小时内滴加6-((1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯4(377.8g，2.0当量)的乙腈(3L，10体积)溶液。将混合物在该温度下老化直至HPLC分析显示该反应完成。将所得溶液于室温冷却，然后过滤，滤饼用MeOH(2×1体积)洗涤。将滤液真空浓缩并将所得残余物溶于EA(700mL)中，然后加入硅胶(800g，型号：ZCX-2，100目-200目，2.11w/w)。真空浓缩混合物，同时保持温度低于35℃。将硅胶(9.6kg，型号：ZCX-2，100目-200目，26.3w/w)装入柱中，随后装入所制备的含有吸附的粗产物9的干燥硅胶。用乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷(3:3:1)/甲醇:二氯甲烷(1:1)洗脱柱(梯度为100:0至90:10，每4L±0.5L收集样品)。通过TLC(乙酸乙酯:石油醚:二氯甲烷:甲醇＝4:4:1:1)分析级分。合并含产物的级分并浓缩，得到260g化合物9，为黄色固体(HPLC：94％，QNMR：92％)。得到另外70g化合物9，为黄色油状物(HPLC；75％，QNMR：60％)。LCMS(ES,m/z):752.30[M+H]+实测值m/z 1H-NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ7.53-7.32(m,3H),7.28-7.18(m,3H),6.86(d,J＝8.4Hz,2H),6.76(d,J＝8.4Hz,2H),6.09(s,1H),4.63(s,1H),3.48(s,3H),3.44(bs,5H),3.17-2.92(m,16H),2.38(dq,J＝25.0,7.2,6.8Hz,8H),0.97(s,9H)。
化合物10的制备：
在氮气气氛下，于15℃-20℃将化合物9(260g，QNMR：92％，1.0当量)、N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA，6.0当量)和乙腈(4L，15体积)加入到10L反应容器中。将混合物于20℃搅拌40分钟。在0.5小时内滴加TMSOTf(212.9g，3.0当量)的乙腈(1.3L，5体积)溶液，内部温度维持在15℃-20℃之间。将溶液于15℃-20℃老化1小时。当过程分析(样品制备0.1mL体系+0.9mL ACN+一滴二异丙基乙胺)显示起始材料完全转化时，将混合物用二异丙基乙胺(617g，15.0当量)猝灭，温度维持在5℃-10℃之间。将混合物于5℃-10℃搅拌20分钟，然后加入饱和NH4Cl水溶液(2.6L，10体积)，温度维持在5℃-10℃之间。将混合物于该温度再老化30分钟。收集水相(含有固体)并用2-MeTHF(520ml，2体积)萃取。合并有机相并用KF(KF：9.18％)检查水含量，然后用无水Na2SO4(500g，10.0当量)干燥。过滤除去固体，滤饼用乙腈(2×520ml，2体积)洗涤。然后用无水Na2SO4(500g，10.0当量)干燥滤液。过滤后，用乙腈(2×520ml，2体积)洗涤滤饼，并用KF(KF：8.15％)检查水含量。将10的乙腈/2-MeTHF流直接用于下一步骤。(产物在LCMS条件下不稳定)。
化合物14(游离酸)的制备
在氮气气氛下，于室温将6-((4-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)(16-((6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸甲酯(6.0g，1.0当量)、BSA(9.7g，6.0当量)和MeCN(120mL，相对于9为20体积)加入到500mL反应器中。于室温在30分钟内滴加TMSOTf(5.4g，2.3当量)的MeCN(120mL，20体积)溶液。将混合物于室温老化过夜。混合物的分析(样品制备0.1mL体系+0.9mL ACN+一滴二异丙基乙胺)显示反应已经完成。将混合物用二异丙基乙胺(15.4g，15.0当量)猝灭，温度维持在0℃-5℃之间。将混合物于0℃-5℃搅拌5分钟，然后滴加饱和NH4Cl水溶液(60mL，10体积)，温度维持在0℃-5℃之间。通过萃取除去水相，收集有机相并直接用于下一步骤。将有机相装入500mL三颈圆底烧瓶中，于室温将LiOH(1.15g，6.0当量)的水(60mL，10V)溶液加入到该溶液中。将溶液于该温度搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示没有完全转化。加入另一部分LiOH(576mg，3.0当量)并将溶液于室温再搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示反应已经完成。然后加入TCDI(5.6g，3.9当量)并将溶液于室温搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示没有完全转化。加入另一部分TCDI(2.8g，2.0当量)并将溶液于室温再搅拌1小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示反应已经完成。通过反相Combi-Flash分离反应溶液。方法：柱C18，A溶液H2O(含有0.01％甲酸)，B溶液ACN。40分钟内5％至35％，流速(100mL/min)，产物在20分钟-25分钟。收集溶液。将该溶液浓缩以除去ACN并再次通过反相Combi-Flash分离。方法：柱C18，A溶液H2O，B溶液ACN。流速：5％10分钟，5％至35％5分钟，95％10分钟，流速(100mL/分钟)，产物在13分钟-25分钟。收集溶液。将溶液在<20℃下真空浓缩并通过冷冻干燥进行干燥。这得到2.5g(3步收率为47％)化合物14，为黄色固体。化合物14(6-((16-((6-羧基吡啶-2-基)(4-异硫氰基苯基)甲基)-1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7-基)甲基)吡啶羧酸)需要储存在-80℃。LCMS:(ES,m/z):666.3[M+H]+ 1H-NMR:(400MHz,D2O,ppm):7.94-7.84(m,4H),7.56-7.40(m,4H),7.16-7.14(m,2H),5.83(s,1H),4.56(s,2H),3.80-3.75(m,8H),3.60-3.49(m,14H),3.36-3.33(m,2H).
制备化合物11(钠盐)：
将制备的化合物10在ACN和2-MeTHF中的溶液加入到10L四颈反应器中，并将溶液冷却至5℃-10℃。加入粉末状NaOH(56.9g，4.5当量)，温度维持在5℃-10℃之间。将溶液于15℃-20℃搅拌0.5小时。混合物的分析(样品制备，0.1mL体系+0.9mL乙腈)显示没有转化。于5℃-10℃加入另外的粉末状NaOH(25.3g，2.0当量)。将溶液于15℃-20℃再老化0.5小时。分析第二次IPC并显示50％的转化率。于5℃-10℃加入最终量的粉末状NaOH(25.3g，2.0当量)。将混合物于15℃-20℃再搅拌0.5小时。分析显示起始材料10完全转化。过滤混合物，并用乙腈(2×520ml，2体积)洗涤滤饼。将最终溶液(约7.5L，28.8体积)浓缩至1-2体积，温度维持在15℃-20℃之间。然后将残余物用乙腈(2L，7.7体积)处理，并用KF(KF：5.7％)检查水含量。过滤混合物，并用ACN(2×520ml，2体积)洗涤滤饼。然后将溶液于15℃-20℃真空浓缩至1V-2V。再次用KF(KF：5.5％)检查水含量。用乙腈(390ml，1.5体积)稀释该溶液，并在0.5小时内将其滴加到MTBE(2.6L，10体积)中，温度维持在15℃-20℃之间。倾出溶剂，留下粘稠的油状物，将其再溶解于乙腈(520ml，2体积)中并加入到MTBE(2.6L，10体积)中。该过程再重复四次。得到粘稠的油状物，将其最终溶解于乙腈(520ml，2体积)中并干燥，然后于15℃-20℃减压浓缩。然后于15℃-20℃用油泵蒸发除去残余溶剂。干燥后，得到335g化合物11，为浅黄色固体(QNMR：70％，两步总收率87％)。LCMS(ES,m/z):624.3[M-TfONa-2Na+3H]+ 1H-NMR(300MHz,甲醇-d4,ppm):δ7.97(dd,J＝7.8,2.1Hz,2H),7.84(t,J＝7.7Hz,1H),7.75(t,J＝7.8Hz,1H),7.36(dd,J＝7.8,1.1Hz,1H),7.23(d,J＝7.7Hz,1H),7.11(d,J＝8.5Hz,2H),6.72(d,J＝8.5Hz,2H),3.96(s,1H),3.83-3.36(m,18H),3.03-2.62(m,6H),2.55(d,J＝14.3Hz,2H).
制备化合物12(TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐)：
在氮气气氛下，于15℃-20℃将TCDI(68.7g，1.4当量)和乙腈(2.6L，8体积)加入到10L反应器中。在30分钟内滴加化合物11(330g，Na+盐，QNMR：70％，1.0当量)的乙腈(660mL，2体积)溶液，温度维持在15℃-20℃之间。将混合物于15℃-20℃老化0.5小时。混合物的分析(样品制备：30μL体系+300μL ACN+一滴水)显示反应已经完成。用KF(KF：0.19％)检查水含量。将该体系干燥并于15℃-20℃减压浓缩。将所得残余物溶解于乙腈(945ml，2.9体积)中并用KF(KF：0.34％)测量水含量。于15℃-20℃经40分钟将乙酸异丙酯(660ml，2体积)加入到溶液中。没有观察到成核现象，并且于15℃-20℃经40分钟缓慢滴加另外的乙酸异丙酯(6.6L，18体积)，导致产物12沉淀，通过过滤收集产物，为浅黄色固体。将固体溶解于乙腈(330ml，1体积)中，并于15℃-20℃经40分钟缓慢滴加IPAc(6.6L，20体积)。过滤混合物，得到230g产物，为浅黄色固体(LCAP：80.99％，QNMR：59％，10％IPAc)。将湿滤饼于15℃-20℃真空干燥2小时，得到224g粗产物12，为浅黄色固体(LCAP：80.9％，QNMR：60.4％，约6％IPAc)。将粗产物12再溶解于乙腈(330ml，1体积)中，并于15℃-20℃经40分钟缓慢滴加乙酸异丙酯(412ml，1.25体积)。过滤所得混合物，并收集12(30.5g，HPLC＝60.9％，测定：25.5％)。用15℃-20℃经40分钟加入的乙酸异丙酯(6.6L，20体积)稀释母液。过滤混合物，干燥滤饼，得到173.5g粗产物12，为浅黄色固体(LCAP：85.4％，QNMR：66％，3.9％IPAc，RRT1.19＝3.9％)。将190g粗产物12溶解于760mL乙腈:乙酸异丙酯(2:1)中，并使混合物通过硅胶柱(380g，2x)。用乙腈:乙酸异丙酯(2:1，5.7L)冲洗二氧化硅，然后用12L乙腈冲洗(非常少的产物)。浓缩含产物的级分，得到118g产物12，为浅黄色固体(LCAP：95％)。然后用MeCN/H2O(12L，10:1)冲洗二氧化硅垫。真空除去溶剂，得到另外的60g粗产物12，为浅黄色固体，将其溶解于乙腈(1.5L)中，搅拌30分钟，然后过滤。然后浓缩母液，得到24g粗产物12，为淡黄色固体(LCAP＝92％)。将如上制备的粗产物12(118g)和粗产物12(24g)溶解于乙腈(330ml，1体积)中，并于15℃-20℃在40分钟内滴加乙酸异丙酯(6.6L，20体积)。然后过滤混合物，得到133g产物12，为合适纯度的浅黄色固体(LCAP：95％，QNMR：60.8％，7.8％ IPAc)。注意，化合物12需要储存在-20℃。LCMS:(ES,m/z):666.61[M-TfONa-2Na+3H]+ 1H-NMR:(400MHz,甲醇-d4,ppm):δ8.00(ddd,J＝13.8,7.7,1.0Hz,2H),7.84(dt,J＝20.4,7.7Hz,2H),7.58-7.49(m,2H),7.40(dd,J＝7.6,1.0Hz,1H),7.36-7.28(m,2H),7.28-7.20(m,1H),4.96(hept,J＝6.3Hz,1H),3.96-3.88(m,1H),3.83(d,J＝15.1Hz,1H),3.70-3.52(m,11H),3.55-3.39(m,4H),3.07-2.73(m,6H),2.62(dt,J＝15.1,3.6Hz,2H).
实施例20
TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物
(在上述TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物中，结构未显示与苯基硫脲部分连接的h11b6的赖氨酸残基。)
mAb的TOPA-[C7]-苯基硫脲修饰：
将h11b6 mAb(10.2mg/ml)在10mM乙酸钠(pH 5.2)缓冲液中稀释至1mg/ml。在即将缀合之前，用碳酸氢钠缓冲液(VWR 144-55-8)将pH调节至pH 9。用pH试纸确认pH。然后，将10x摩尔过量的二钠盐TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐(溶解于水中的50mM储备液)加入到h11b6mAb，并且将抗体和TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐的混合物于室温不振摇培养大约1小时。在G224仪器上通过完整质量ESI-TOF LC-MS监测TOPA-[C7]-苯基异硫氰酸酯钠盐的添加，直至CAR值为1.5-2.0。然后立即通过加入1M Tris pH 8.5(TeknovaT1085)至100mM的最终浓度来猝灭混合物。通过使用7K脱盐柱将反应物脱盐到10mM乙酸钠(pH 5.2)中来除去过量的游离螯合剂。为了确认不存在过量螯合剂，使用50,000MWCO Amicon浓缩器设备进行了3轮样品稀释至15ml，然后浓缩至1ml。然后将样品浓缩至其用于放射性标记的最终浓度。通过在Tosoh TSKgel G3000SWxl 7.8mm×30cm，5u柱上使用以下条件的分析性尺寸排阻色谱法确认最终缀合物为单体；柱温：室温；柱用0.2M磷酸钠pH 6.8洗脱；流速：0.8mL/min；18Min运行；注射体积：18μL。
实施例21
Ac-225标记的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物
(在上述Ac-225标记的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6抗体缀合物中，结构未显示与苯基硫脲部分连接的h11b6的赖氨酸残基。)
(i)在3M NaOAc缓冲液中用Ac-225标记TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(3M H2O溶液，60μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，15μL)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(1.13mg/mL的10mM NaOAc溶液，pH＝5.5，441μL，0.5mg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA(pH 5-6)显影。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描示出99.7％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
在PD10柱上纯化：
通过使5mL×3的NaOAc缓冲液(25mM NaOAc，0.04％ PS-20，pH 5.5)通过柱并弃去洗涤液，在NaOAc缓冲溶液中调节PD-10树脂。将整个标记反应混合物施加到柱的贮存器上，并将洗脱液收集于预先编号的塑料管中。用0.2mL×3NaOAc缓冲液(25mM NaOAc，0.04％PS-20，pH 5.5)洗涤反应小瓶，并将洗涤液移取到PD-10柱的贮存器中并收集洗脱液。每管含有约1mL洗脱液。继续向PD-10柱的贮存器中施加NaOAc缓冲液(25mM NaOAc，0.04％ PS-20，pH 5.5)直至达到10mL的总洗脱体积。收集的级分的放射性化学纯度通过iTLC检查：将10μL每种收集的级分点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。纯级分应当在iTLC-SG的溶剂前沿没有放射性信号。
纯化的225Ac-TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6的DTPA测试：
将PD-10柱后收集的10μL级分#3与15μL 10mM DTPA溶液(pH 6.5)混合，并温育30分钟。将10μL混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显影并干燥过夜。将其在BioscanAR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在iTLC-SG的溶剂前沿没有观察到放射性信号，表明级分#3中不存在游离的Ac-225。
纯化的225Ac-TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6的HPLC分析：
通过HPLC分析在PD-10柱后收集的级分#3。HPLC方法：Tosoh TSKgel G3000SWxl7.8mm×30cm，5μm柱；柱温：室温；将柱用DPBS缓冲液(X1，不含钙和镁)洗脱；流速：0.7mL/min；20min运行；进样量：40μL。HPLC后，以30秒或1分钟的时间间隔收集级分。将收集的HPLC级分在室温处放置过夜。在γ计数器中对每个收集的级分中的放射性进行计数。HPLC放射迹线由每个HPLC级分中的放射性构建。HPLC放射迹线显示出对应于HPLC UV迹线上的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6峰的放射性峰。
(ii)在1.5MNaOAc缓冲液中用Ac-225标记更高浓度的TOPA-[C7]-苯基硫脲- h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(含有0.04％PS-20的1.5M H2O溶液，63μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，10μL)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(9.36mg/mL的10mMNaOAc溶液，pH＝5.2，0.04％PS-20，36μL，337μg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
然后将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描示出99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
(iii)在1M NaOAc缓冲液中用Ac-225标记更高浓度的TOPA-[C7]-苯基硫脲- h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(含有0.04％PS-20的1.0M H2O溶液，63μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，10μL)和TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(9.36mg/mL的10mMNaOAc溶液，pH＝5.2，0.04％PS-20，36μL，337μg)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.5。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
然后将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描示出99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
在含0.4％tween-20的25mM NaOAc(pH5.5)中用Ac-225标记更高浓度的TOPA- [C7]-苯基硫脲-h11B6：
向塑料小瓶中的NaOAc溶液(含有0.04％PS-20的25mM H2O溶液，pH 5.5，10μL)中依次加入Ac-225(10mCi/mL的0.1N HCl溶液，5μL)、TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6(10.4mg/mL的10mM NaOAc溶液，pH＝5.2，16μL，166μg)和NaOH(0.1M，5μL)。混合后，通过pH试纸测得pH为约6.0。将小瓶于37℃静置2小时。
标记反应混合物的iTLC：
然后将0.5μL标记反应混合物上样到iTLC-SG上，将其用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.9％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6结合了Ac-225。
标记反应混合物的DTPA测试：
还于37℃将0.5μL标记反应混合物与10mM DTPA(pH＝6.5，15μL)混合。30分钟后，将10μL混合物点样在iTLC-SG上并用10mM EDTA显色。将干燥的iTLC-SG在室温处放置过夜，然后将其在Bioscan AR-2000放射性TLC扫描仪上扫描。在本文所述的洗脱条件下，TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合的Ac-225留在原点，并且任何游离的Ac-225将随溶剂迁移到溶剂前沿。iTLC的扫描显示99.8％的TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6螯合了Ac-225。
用Ac-225标记TOPA-[C7]-苯基硫脲-h11B6的反应条件
实施例22—抗KLK2抗体的生成
使用转基因小鼠 和转基因大鼠 表达人免疫球蛋白基 因座来生成抗体
含有嵌合人/大鼠IgH基因座(包含22个人VH，全部的人D和JH片段以天然构型连接至大鼠CH基因座)连同完全人IgL基因座(连接至Jκ-Cκ的12个Vκ和连接至Jλ-Cλ的16个Vλ)(参见例如，Osborn等人，J Immunol，2013，190(4):1481-90)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以生成具有完全人可变区的高亲和力嵌合人/大鼠IgG单克隆抗体。国际公布WO14/093908中描述了的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰。
小鼠生成具有与人CH1和CL结构域连接的人可变结构域、嵌合人/小鼠铰链区和小鼠Fc区的抗体。Ablexisκ小鼠和λ小鼠品系通过如下所示其重链中的哪些重链是人或小鼠来区分。由κ小鼠产生的抗体缺乏源自小鼠VH、DH和JH外显子以及小鼠Vκ、Jκ和Cκ外显子的序列。内源性小鼠Igλ在κ小鼠中有活性。在该品系中人Igκ链占原初组库的大约90％-95％，并且小鼠Igλ链占原初组库的大约5％-10％。由λ小鼠产生的抗体缺乏源自小鼠VH、DH和JH外显子以及小鼠Vλ、Jλ和Cλ外显子的序列。内源性小鼠Igκ在λ小鼠中有活性。人Igλ链占原初组库的大约40％，并且小鼠Igκ链占原初组库的大约60％。国际公布WO11/123708中描述了的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰。
将小鼠和大鼠用可溶性全长KLK2蛋白质(人激肽释放酶-26-His蛋白质，具有氨基酸序列VPLIEGRIVGGWECEKHSQPWQVAVYSHGWAHCGGVLVHPQWVLTAAHCLKKNSQVWLGRHNLFEPEDTGQRVPVSHSFPHPLYNMSLLKHQSLRPDEDSSHDLMLLRLSEPAKITDVVKVLGLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLRPRSLQCVSLHYSEKVTEFMLCAGLWTGGKDTCGGDSGGPLVCNGVLQGITSWGPEPCALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANPHHHHHH(SEQ ID NO:454))免疫。
从淋巴结中提取Ablexis小鼠和OniRat大鼠的淋巴细胞并按队列进行融合。合并细胞并针对CD138表达进行分选。使用可溶性hK2抗原以高通量微型化MSD格式进行杂交瘤筛选。将大约>300份样品鉴定为hK2结合剂。通过Biacore 8K SPR，通过单循环动力学方法测量>300份抗hKLK2上清液样品与人KLK2蛋白质的结合。另外，还测试了上清液样品与人KLK3蛋白质的结合。并行地，还通过流式细胞术测试上清液与表达KLK2的细胞系VCap和阴性细胞系DU145的结合。如上所述，在VH-VL和VL/VH取向和热稳定性测试中，将所选细胞结合剂转向到scFv转化。由Ablexis小鼠免疫活动产生KL2B413、KL2B30、KL2B53和KL2B242。由OmniRat免疫活动产生KL2B467和KL2B494。
通过上述各种免疫和人源化活动生成的抗体以fab格式、mAb格式、VH-接头-VL取向的scFv格式或VL-接头-VH取向的scFv格式表达，并且如下所述进一步分析。使用上述SEQID NO:7的接头序列缀合VH/VL区。
实施例23.抗KLK2抗体的结构表征
本文提供了在胞内测定中显示出最高性能的抗体可变结构域和scFv抗体片段的序列。可变结构域以Fab格式、VH-接头-VL取向的scFv格式或VL-接头-VH取向的scFv格式表达。
可变结构域VH、VL和CDR
表3示出了所选抗hK2抗体的VH和VL氨基酸序列。表4示出了所选抗hK2选择抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3。表5示出了所选抗hK2抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3。表6示出了所选抗hK2抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3。表7示出了抗hK2的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3。表8汇总了所选hK2抗体的可变结构域序列和SEQ ID NO。表9示出了VH和VL区的蛋白质和DNA SEQ ID NO。
表3：所选抗hK2抗体的VH和VL氨基酸序列。
表4：所选抗KLK2抗体的Kabat HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
表5：所选抗hK2抗体的Kabat LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
表6：所选抗hK2抗体的AbM HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。
表7：所选抗hK2抗体的AbM LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
表8：选定抗hK2抗体的可变结构域的氨基酸序列和SEQ ID NO汇总
表9：选定hK2抗体的VH和VL结构域的蛋白质和DNA序列的SEQ ID NO。
SEQ ID NO:225(m11B6 VH cDNA)
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCTGGACCCGGACTTGTTAAACCAAGTCAGTCTCTGTCCCTGACCTGTACCGTCACCGGCAACAGCATCACAAGCGATTACGCATGGAACTGGATCAGGCAGTTCCCTGGAAATCGACTCGAATGGATGGGCTACATTTCATACTCCGGTTCAACCACTTACTCTCCATCCTTGAAATCTAGGTTCAGCATCACCCGTGATACCTCAAAGAACCAATTTTTTCTGCAACTGAATAGCGTAACTCCAGAGGACACAGCCACATATTTCTGCGCCACTGGGTATTACTATGGCTCAGGTTTCTGGGGTCAGGGCACTCTCGTCACCGTCAGCAGC
SEQ ID NO:226(hu11B6 VH cDNA)
CAGGTCCAACTGCAAGAGAGCGGACCGGGCCTGGTAAAGCCATCCGA
CACATTGTCCCTGACGTGTGCGGTAAGTGGAAACTCTATCACTAGCGA
CTATGCGTGGAATTGGATAAGACAACCGCCGGGCAAGGGGCTGGAAT
GGATAGGATATATCAGCTATTCCGGTTCTACGACATACAATCCTTCCC
TGAAAAGCAGAGTCACTATGTCACGCGACACGTCCAAGAATCAGTTC
TCATTGAAATTGTCATCCGTAACGGCCGTTGACACTGCGGTTTATTAT
TGCGCAACCGGATATTACTACGGCTCTGGTTTTTGGGGACAGGGAACA
CTTGTTACTGTTAGTTCASEQ ID:NO 227(HCF3-LCD6 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGCGA
CACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCAACAGCATCACCAGCG
ACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCAGTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGATCGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAG
CCTGAAGAGCCGCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGT
TCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTGTACT
ACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCTGGGGCCAGGGC
ACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:228(HCG5-LCB7 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCAGGCCTGGTGAAGCCAAGCGA
CACCCTGAGCCTGACCTGCGCCGTGAGCGGCAACAGCATCACCAGCG
ACTACGCCTGGAACTGGATCCGCCAGTTCCCAGGCAAGGGCCTGGAG
TGGATGGGCTACATCAGCTACAGCGGCAGCACCACCTACAACCCAAG
CCTGAAGAGCCGCGTCACCATCAGCCGCGACACCAGCAAGAACCAGT
TCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCCCTGTGGACACCGCCGTGTACT
ACTGCGCCACCGGCTACTACTACGGCAGCGGCTTCTGGGGCCAGGGC
ACCCTGGTGACCGTGAGCAGC
SEQ ID NO:229(KL2B357、KL2B360 VH cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCA
GACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGA
CTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGGGCCTTGAGTG
GATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCT
GAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTG
TGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACT
GGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:230(KL2B358 VH cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCA
GACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGA
CTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCACCTGGCAAGGGCCTTGAGT
GGATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCC
TGAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCT
CCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACT
GTGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACAC
TGGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:231(KL2B359 VH cDNA)
CAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGACCAGGCCTGGTCAAGCCCTCTCA
GACCCTGTCTCTGACCTGTACCGTGTCCGGCAACTCCATCACCTCTGA
CTACGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTCCCTGGCAAGCGCCTTGAGTG
GATCGGCTACATCTCCTACTCCGGTTCCACCACCTACAACCCCAGCCT
GAAGTCCCGGGTCACCATCTCCCGCGACACCTCCAAGAACCAGTTCTC
CCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCTGCTGATACCGCCGTGTACTACTG
TGCCACCGGCTACTACTACGGCTCCGGCTTTTGGGGACAGGGCACACT
GGTTACCGTGTCTAGT
SEQ ID NO:232(KL2B413 VH cDNA)
GAGGTGCAACTTGTGGAGAGCGGCGGAGGTCTGGTCCAACCCGGAGG
AAGTCTCCGTCTCTCCTGTGCTGCTAGTGGCTTCACTTTCAGCTCATAT
TGGATGACATGGGTGAGACAAGCCCCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGT
AGCTAACATTAAACAGGACGGCTCCGAACGGTACTATGTTGATTCTGT
GAAGGGACGGTTCACTATATCCAGGGATAATGCAAAAAATTCACTCT
ATCTTCAAATGAACTCACTCAGAGCAGAGGACACTGCCGTGTATTATT
GCGCCAGGGATCAAAATTATGACATACTGACCGGTCATTATGGAATG
GATGTTTGGGGCCAGGGAACAACCGTTACCGTCTCAAGT
SEQ ID NO:233(KL2B30 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGA
GACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTA
CTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGA
TTGGATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCA
AGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCC
CTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGT
GCGGGGACTACGATTTTTGGAGTGGTTACCCCCAACTTCTACTACGGT
ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:234(KL2B53 VH cDNA)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTAT
GACATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGT
GGCAATTATTTCATATGATGGAAGTAAAAAAGACTATACAGACTCCG
TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG
TATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGTTGAGGACTCGGCTGTGTATTCC
TGTGCGAGAGAAAGTGGCTGGTCCCACTACTACTATTACGGTATGGAC
GTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:235(KL2B242 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGA
GACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTA
CTATTGGAGCTGGCTCCGGCAGCCCGCCGGGTCGGGACTGGAGTGGA
TTGGGCGTTTATATGTCAGTGGGTTCACCAACTACAACCCCTCCCTCA
AGAGTCGAGTCACCTTGTCACTAGACCCGTCCAGGAACCAGTTGTCCC
TGAAACTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTATATTATTGTG
CGGGAGATAGTGGGAACTACTGGGGTTGGTTCGACCCCTGGGGCCAG
GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:236(KL2B467 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTTACTAT
GGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGT
GGCATTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGT
GAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT
ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTAC
TGTGCCCACCTCCCTTATAGTGGGAGCTACTGGGCCTTTGACTACTGG
GGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:263(KL2B494 VH cDNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTCATTAT
GCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGT
CTCAACTATTGGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGT
GAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT
ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTAC
TGTGCGAAACCTCATATTGTAATGGTGACTGCTCTTCTCTACGACGGT
ATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:237(m11B6 VL cDNA)
GACATTGTGCTGACACAGAGTCCAGCATCCTTGGCAGTATCTTTGGGG
CAGCGGGCAACAATTTCATGCCGTGCATCTGAAAGTGTGGAGTATTTT
GGAACTTCTCTTATGCACTGGTATCGCCAGAAGCCTGGGCAGCCTCCC
AAACTCCTTATATATGCCGCTTCCAACGTGGAGTCCGGAGTACCAGCA
CGCTTTTCCGGCTCTGGGTCCGGCACAGACTTTTCCCTCAATATCCAA
CCTGTTGAAGAAGACGATTTTTCCATGTATTTTTGCCAACAGACACGC
AAGGTTCCATATACATTCGGCGGCGGCACTAAACTTGAGATCAAASEQ ID NO:238(hu11B6 VLcDNA)
GACATAGTCTTGACTCAGAGCCCGGATTCCCTTGCTGTGTCTCTGGGA
GAACGAGCTACGATCAACTGCAAGGCAAGTGAATCCGTAGAATACTT
CGGGACATCATTGATGCATTGGTATCAACAGAAACCGGGGCAACCGC
CCAAATTGCTGATATATGCGGCTAGTAATAGAGAATCAGGAGTACCG
GATAGGTTTAGTGGTTCAGGATCAGGTACAGATTTCACCCTGACAATA
AGTAGCTTGCAAGCCGAAGACGTAGCAGTGTATTACTGCCAACAAAC
CCGAAAGGTGCCATATACGTTTGGACAGGGTACAAAGTTGGAAATCA
AA
SEQ ID NO:239(HCF3-LCD6 VL cDNA)
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGG
CGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACT
TCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCA
CCAAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCC
AGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCA
TCCAGAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCTCCGTGTACTTCTGCCAGCAG
ACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGAT
CAAG
SEQ ID NO:240(HCG5-LCB7 VL cDNA)
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGG
CGAGCGCGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCGAGAGCGTGGAGTACT
TCGGCACCAGCCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCA
CCAAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGCAACCGCGAGAGCGGCGTGCC
AGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCA
TCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAG
ACCCGCAAGGTGCCATACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGAT
CAAG
SEQ ID NO:241(KL2B357 VL cDNA)
GACATCGTGCTGACCCAGTCTCCAGACTCTCTGGCTGTGTCTCTGGGC
GAGAGAGCCACCATCAACTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTT
CGGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCC
TAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTGGAATCTGGCGTGCCCGA
TAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAG
CTCTCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTTCTGTCAGCAGACCCG
GAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAGSEQ ID NO:242(KL2B358、KL2B359、KL2B360 VL cDNA)
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCACACTGTCACTGTCTCCAGGC
GAGAGAGCCACCCTCTCTTGTAGAGCCTCCGAGTCCGTGGAATACTTC
GGCACCTCTCTGATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCT
AGACTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACGTCGAATCTGGCATCCCCGCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACAGACTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGGAACCCGAGGATTTCGCTGTGTACTTTTGCCAGCAGACCCGGAAGGTGCCCTACACATTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:243(KL2B413 VL cDNA)
GAAATCGTACTGACCCAGTCCCCTTCTTTCTTGAGTGCATCAGTTGGGGATAGAGTGACCATTACTTGTAGAGCATCTCAAGGTATTTCTTCATACTTGTCTTGGTATCAACAAAAACCTGGCAAGGCACCCAAACTCTTGATCTACGCCACCTCTACATTGCAAAGTGGGGTTCCTTCTAGGTTTTCAGGCTCCGGCTCTGGTACCGAGTTCACCCTCACTATAAGCAGTCTCCAACCTGAAGATTTCGCTACTTATTATTGTCAGCAGCTTAATTCTTATCCCCGAACCTTTGGTCAAGGAACTAAGGTCGAGATCAAA
SEQ ID NO:244(KL2B30 VL cDNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTTCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
SEQ ID NO:245(KL2B53 VL cDNA)
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCACTCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAAGTATAACAGTGCCCCGTACACTTTTGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
SEQ ID NO:246(KL2B242 VL cDNA)
TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGAGAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATCAATTGGGGGAAAATTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATCAAGATAGTAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTCTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAACAGTATTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:247(KL2B467 VL cDNA)
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCCGGGCAGACGGCCAGTATTACCTGTGGGGGAGACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATAATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGACCACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATCCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
SEQ ID:271(KLK2B494_VL DNA)
TCTTCTGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
Fab-Fc和scFv
hK2特异性VH/VL区经工程化为VH-CH1-铰链CH2-CH3和VL-CL，并且表达为IgG2或IgG4，或经工程化为VH-接头-VL或VL-接头-VH取向的scFv。scFv中使用的接头是如上所述的SEQ ID NO:7的接头。使用scFv生成如实例7中所述的双特异性抗体或生成如实例11中所述的CAR。
表10示出了mAb格式的所选抗hK2抗体的HC氨基酸序列。表11示出了mAb格式的所选抗hK2抗体的LC氨基酸序列。表12汇总了mAb格式的所选抗hK2抗体的HC和LC DNA SEQ IDNO。表13示出了VH-接头-VL或VL-接头-VH取向的所选scFv的氨基酸序列。
表10：mAb形式的选定抗hK2抗体的HC(VH-CH1-铰链CH2-CH3)的氨基酸序列。
表11：mAb(Fab-Fc)格式的所选抗hK2抗体的LC(VL-CL)的氨基酸序列。
表12：所选hK2抗体的HC和LC的cDNA序列的SEQ ID NO
表13：VH-接头-VL(HL)或VL-接头-VH(LH)格式的所选抗hK2scFv抗体的可变结构 域的氨基酸序列。
实施例24.抗hK2抗体的生物物理学表征
抗hK2抗体的亲和力和热稳定性。
通过表面等离子体共振(SPR)测量选定hK2抗体对可溶性hK2的亲和力。SPR是一种无标签技术，用于通过测量复合物形成和解离时的质量变化来研究两个结合配偶体之间的相互作用的强度。在涂覆有抗Fc抗体的传感器芯片上捕获抗体，接着以各种浓度和指定的缔合和解离时间注射可溶性hK2。解离后，用适当的溶液再生表面以准备进行下一相互作用。通过将传感器图拟合到1:1Langmuir模型来提取动力学信息(结合速率和解离速率常数)。将结合亲和力(KD)报告为速率常数比率(koff/kon)。所选hK2抗体的KD值列于表14中。
使用自动Prometheus仪器，通过差示扫描荧光测定法(NanoDSF)测定热稳定性。使用NanoDSF测量浓度为0.5mg/mL的磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中的分子的Tm。通过将样品从384孔样品板装载到24孔毛细管中来进行测量。对每个样品执行重复运行。热扫描范围为20℃至95℃，速率为1.0℃/分钟。在330nm和350nm的发射波长下监测固有色氨酸和酪氨酸荧光，并且将F350nm/F330nm比率相对于温度绘图以生成拆解曲线。测量的Tm值列于表14中。
表14：所选分子的KD和Tm
分子 KD(nM) Tm(℃)
KL2B413(scFv-LH-Fc) 34.3 67
KL2B359(scFv-LH-Fc) 0.7-1 67
KL2B30(Fab) 0.460 >70
KL2B242(Fab) 0.040 >70
KL2B53(Fab) 0.080 >70
KL2B467(Fab) 0.078 >70
KL2B494(Fab) 0.053 >70
由Ablexis免疫活动生成的KL2B413 scFv具有如通过Nano DSF测量的为67℃的热稳定性(Tm)以及对人hK2为约34nM的结合亲和力(KD)。将获得的用于再人源化活动的且已经保持与鼠11B6相似的结合亲和力的克隆KL2B359转化为scFv-Fc和CAR-T以进行另外的分析。KL2B359 scFv显示出为67℃的Tm以及对hK2为约0.7nM至1nM的结合亲和力(KD)。KL2B30、KL2B242、KL2B53、KL2B467和KL2B494 Fab显示出低于0.5nM的结合亲和力以及高于70℃的Tm值。
表位定位
通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)确定选定的抗hK2抗体和抗hK2/CD3双特异性抗体的表位和互补位。人KLK2抗原用于表位和互补位定位实验。
简言之，将纯化的KLK2抗原在有和无抗hK2抗体或抗hK2/CD3双特异性抗体的情况下在氧化氘标记缓冲液中温育。在不同时间点通过添加8M尿素、1M TCEP(pH 3.0)淬灭氢-氘交换(HDX)混合物。在室温下使淬灭的样品通过用缓冲液A(1％乙腈、0.1％ FA的H2O溶液)平衡的600μL/min的固定胃蛋白酶/FPXIII柱。将胃蛋白酶片段装载到具有缓冲液A的600μL/min的反相阱柱上并且脱盐1分钟(600μL缓冲液A)。将脱盐片段通过C18柱在20分钟内以8％至35％缓冲液B(95％乙腈、5％ H2O、0.0025％ TFA)的线性梯度，以100μL/min分离，并且通过质谱法分析。使用LTQTMOrbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo FisherScientific)进行质谱分析，其中毛细管温度为275℃、分辨率150,000且质量范围(m/z)300-1,800。使用BioPharma Finder 3.0(Thermo Fisher Scientific)在HDX实验之前进行非氘化样品的肽鉴定。使用HDExaminer 2.5版(Sierra Analytics,Modesto,CA)从HDX实验的MS原始数据文件中提取质心值。
将hK2抗体即hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413和KL2B53与可溶性hK2蛋白质一起温育产生氢交换和整体保护的不同模式。将保护的区段定位到hK2抗原的序列上以可视化结合表位。将KL2B494、KL2B467和KL2B30结合到以下残基的共同序列：(i)残基174-178(SEQ ID NO:111，KVTEF)(例如，KL2B494、KL2B467和KL2B30结合SEQ ID NO:111的残基中的至少三个残基，即174-176处的KVT残基)；和(ii)残基230-234(SEQ ID NO:112，HYRKW)(例如，KL2B494、KL2B467和KL2B30结合SEQ ID NO:112的残基中的至少三个残基，即230-232处的HYR残基)。KL2B413还结合SEQ ID NO:111的所有残基和SEQ ID NO:112的KW残基。本发明的实施方案提供了包含结合hK2的抗原结合结构域的分离的蛋白质，其中所述抗原结合结构域结合具有SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112的序列的表位内的hK2；例如，所述抗原结合结构域结合到SEQ ID NO:111的所有残基、或至少四个残基、或至少三个残基，并且结合到SEQ ID NO:112的所有残基、或至少四个残基、或至少三个残基。
KL2B53示出不同的保护模式，并且结合到由残基27-32(Seq ID NO:113，SHGWAH)、60-75(SEQ ID NO:114，RHNLFEPEDTGQRVP)和138-147(SEQ ID NO:115，GWGSIEPEE)组成的序列。
根据一个实施方案，分离的抗hK2/抗CD3蛋白质(例如，hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B30、KL2B413或KL2B53)包含与hK2的不连续表位特异性结合的hk2特异性抗原结合结构域(即，其残基在序列中放置较远的表位)，该不连续表位包含选自由SEQ ID NO:111、112、113、114和115组成的组的一个或多个氨基酸序列。
基于来自HDExaminer残基突变的氘摄取的显著差异，鉴定抗hK2抗体hu11B6、KL2B494、KL2B467、KL2B413和抗hK2/CD3双特异性抗体KLCB113和KLCB80的互补位。KL2BB494包含三个互补位区，其中两个互补位区位于KL2B494重链可变结构域(GFTFSH(SEQID NO:455)和TAVYYCAKPHIVMVTAL(SEQ ID NO:456))中，并且单个互补位区位于轻链可变结构域(YDDSDRPSGIPER(SEQ ID NO:457))内。KL2B467包含三个互补位区，其中两个互补位区位于KL2B467重链可变结构域(FTFSY(SEQ ID NO:458)和GSYWAFDY(SEQ ID NO:459))中，并且单个互补位区位于轻链可变结构域(DNSD(SEQ ID NO:460))内。Hu11B6包含位于重链(GNSITSDYA(SEQ ID NO:461))中的单个表位区。KL2B413包含位于重链可变结构域(GFTF(SEQ ID NO:462)和ARDQNYDIL(SEQ ID NO:463))中的两个互补位区。双特异性KLCB80的KL2B30包含位于重链(包含氨基酸残基TIF和VTPNF(SEQ ID NO:464))中的互补位区和位于轻链(YAASTLQSG(SEQ ID NO:465))中的互补位区。双特异性KLCB113的KL2B53包含位于重链(包含氨基酸残基ESGWSHY(SEQ ID NO:466))中的单个互补位区。
实施例25-MMAF与KL2B30 Fab的缀合
通过将KL2B30 Fab(鉴定为KL2B997)与MMAF缀合来制备本发明的免疫缀合物。缀合经由随机缀合和位点特异性缀合进行；此类方法描述于例如WO2020/229974中。如本文所述，KL2B997(KL2B30的Fab)包含分别为SEQ ID NO:170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；并且KL2B997包含SEQ ID NO:162的VH和SEQ ID NO:163的VL。
在图1中，术语“DAR”为“药物与抗体比率”，其是指与抗体部分(即KL2B997)附接的药物分子(即MMAF)的数目。每个抗体部分结合的药物分子数或标记度是本领域常用的参数，并且被命名为“药物-抗体比”的“DAR”。
为了评估KL2B30 Fab与不同缀合变体的靶细胞结合，使用VCaP细胞作为hK2-阳性靶细胞并且使用DU145细胞作为hK2-阴性细胞。包括KL2B30亲本抗体(包含分别为SEQ IDNO:210和SEQ ID NO:221的重链和轻链)和hu11B6(抗-hK2抗体，在本文中也称为h11B6，包含分别为SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:215的重链和轻链)作为阳性对照。在美国专利10,100,125中描述了h11B6抗体，该专利以引用方式并入本文。将抗人F(ab')2片段特异性第二检测抗体用于检测基于Fab的结合。将测试抗体与靶细胞在4℃温育60分钟，并通过二次染色检测。通过基于二抗结合信号的流式细胞术定量细胞结合，并对活细胞进行门控。结果指示使用所有三种测试方法的阳性和剂量依赖性细胞结合，该方法包括未缀合的KL2B997、KL2B997的随机缀合和KL2B997的位点特异性缀合(在图1中描述为KL2B997*、KL2B997 NHS和KL2B997 SORT)。示出KL2B30 Fab特异性结合到hK2阳性VCaP细胞，而不结合到hK2阴性DU145细胞。如图1所示，结果示出KL2B30 Fab与表达hK2的VCaP细胞结合，并且当与MMAF缀合时可内化并触发基于内化的细胞杀伤。
经由随机缀合和位点特异性缀合制备上述免疫缀合物。对于位点特异性缀合，将2mg/mL的2.1mgs h11B6的1x dPBS(Thermo Fisher 14190144)溶液用5μl的Rapid PNGaseF(NEB#P0711S)于37℃去糖基化过夜。细菌转谷氨酰胺酶(bTG；来自Ajinomoto的Activa TI)连同1000x摩尔过量的氨基-PEG4-(PEG3-叠氮化物)2支链底物(CP-2051Conju-Probe LLC)一起添加至30重量/体积％，并在室温下温育过夜。将叠氮化物修饰的mAb在配备有1mlMabselect柱(GE 11003493)的AKTA Avant仪器上纯化，并用10mL Zeba脱盐柱(ThermoFisher)交换到1x dPBS中。添加10x摩尔过量的DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAF(Levena生物制药)，并通过LC-MS监测反应直至达到药物:抗体比率为4。最终的h11B6-vcMMAF ADC在Zeba脱盐柱上纯化，之后用Amicon浓缩器浓缩和渗滤。
对于随机缀合，首先使KL2B30与NHS-PEG4-叠氮化物(Thermo Fisher目录号26130)反应。向1.5mg的1mg/ml KL2B30的1x dPBS溶液中添加30ul的1M pH 9碳酸氢钠(BDH#144-55-8)，并且然后立即添加7x摩尔比的NHS-PEG4-叠氮化物。反应通过质谱监测直至标记程度达到2-2.5，然后通过添加Tris pH 8.5(Teknova T1085)至终浓度为100mM来淬灭。除去未反应的NHS-PEG4-叠氮化物后，添加10x摩尔过量的DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAF，并在37℃下温育1小时。最终的ADC(DAR＝2.7)用10ml Zeba脱盐柱纯化，然后用Amicon浓缩器浓缩和渗滤。
KL2B997位点特异性ADC(抗体-药物缀合物)经由分选酶标签通过缀合制备。将1mg的1mg/mlKL2B997与酿脓链球菌分选酶A酶(2μM)[参见Chen等人，PNAS2011:11399]和过量的Gly3-vcMMAF(Levena生物制药)在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2缓冲液中一起温育。将反应在37℃温育1小时。缀合物在AKTA Avant仪器上在1mL HisTrap柱(Cytiva17524701)上纯化。ADC在24ml Superdex 75 10/300(Cytiva29148721)上在1x dPBS中进一步纯化以除去任何聚集体或残余底物。
KL2B997随机缀合的ADC通过添加NHS-PEG4-叠氮化物，之后如上所述与DBCO-vCMMAF反应来制备。
实施例26-TOPA-KL2B1251 Fab
下文提供了将KL2B30 Fab(鉴定为KL2B1251)与TOPA缀合的方法。
TOPA-KL2B1251的制备。
将随机TOPA修饰的Fab:KL2B1251Fab在无菌1xdPBS中稀释至1mg/ml。用碳酸氢钠缓冲液pH 9(VWR 144-55-8)将mAb的pH调节至9.0。然后，添加8x摩尔过量的TOPA(TOPA-苯基-NCS(中间体)；溶于DMSO中的50mM原液)，并在不振荡的情况下在室温下将合并物温育大约1小时。在G224仪器上通过完整质量ESI-TOF LC-MS监测TOPA的添加，直至CAR值介于1.5-2.0之间。然后通过添加1M Tris pH 8.5(Teknova T1085)至100mM的最终浓度来淬灭合并物。通过连续几轮脱盐并在55ml HiPrep 26/10脱盐柱(17508701-Cytiva)上一次洗脱15ml缀合物合并物来除去过量的游离螯合剂。平衡并洗脱全部在1xdPBS中进行。然后将样品浓缩至2ml。为了确认不存在过量螯合剂，使用50,000MWCO Amicon浓缩器设备进行了3轮样品稀释至15ml，然后浓缩至1ml。通过在Tosoh TSKgel G3000SWxl7.8mm×30cm，5u柱上使用以下条件的分析性尺寸排阻色谱法确认最终缀合物为单体；柱温：室温；柱用0.2M磷酸钠pH 6.8洗脱；流速：0.8mL/min；18Min运行；注射体积：18μL。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是为了进行示意性的说明，并且可在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施方案进行修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖符合本发明实质和范围的修改，如所附权利要求书中定义的。

Claims (41)

1.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含：与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域缀合的治疗部分。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为细胞毒性剂。
3.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为显像剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分包含放射性金属。
5.根据权利要求4所述的免疫缀合物，其中所述放射性金属选自由以下项组成的组：225Ac、177Lu、32p、47Sc、67Cu、77As、89Sr、90Y、99Tc、105Rh、109Pd、111Ag、131I、149Tb、152Tb、155Tb、153Sm、159Gd、165Dy、166Ho、169Er、186Re、188Re、194Ir、198Au、199Au、211At、212pb、212Bi、213Bi、223Ra、255Fm、227Th、177Lu、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr和111In。
6.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为包含225Ac的细胞毒性剂。
7.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为包含111In的显像剂。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分包含放射性金属络合物，其中所述放射性金属络合物包含与螯合剂结合的放射性金属，并且其中所述螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域缀合。
9.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂为1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、S-2-(4-异硫氰基苄基)-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十二烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)、3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五碳-1(15)，11，13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰基苄基)-3，6，9-三乙酸(PCTA)、5-S-(4-氨基苄基)-1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷-4，7，10-三(乙酸)(DO3A)或它们的衍生物。
10.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂为DOTA。
11.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
12.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述放射性金属络合物为式(I-m)、或式(II-m)、或式(III-m)的放射性金属络合物，
其中所述式(I-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
其中：
M为所述放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，并且更优选地锕-225(225Ac)；
环A和环B各自独立地为6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中环A和环B各自任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自由以下项组成的组：卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和X；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；前提条件是所述放射性金属络合物包含至少一个X，并且当X存在于环A或环B上时，L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢；
其中所述式(II-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
其中：
M为所述放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，并且更优选地锕-225(225Ac)；
A1为N或CR1或不存在；
A2为N或CR2；
A3为N或CR3；
A4为N或CR4；
A5为N或CR5；
A6为N或CR6或不存在；
A7为N或CR7；
A8为N或CR8；
A9为N或CR9；
A10为N或CR10；
前提条件是A1、A2、A3、A4和A5中不超过三者为N，并且A6、A7、A8、A9和A10中不超过三者为N；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地选自由以下项组成的组：氢、卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和-X，
或者，另选地，任两个直接相邻的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10与它们所附接的原子合在一起以形成五元或六元取代或未取代的碳环或含氮环；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；
前提条件是所述放射性金属络合物包含至少一个X，并且当R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10中任一者为X时，则L1为连接基，或R12和R14-R17中至少一者不是氢；
其中所述式(III-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
其中：
M为所述放射性金属离子，优选地发射α的放射性金属离子，并且更优选地锕-225(225Ac)；
每个A11独立地为O、S、NMe或NH；
Z1和Z2各自独立地为-(C(R12)2)m-或-(CH2)n-C(R12)(X)-(CH2)n-；
每个X独立地为-L1-R11；
每个n独立地为0、1、2、3、4或5；
每个m独立地为1、2、3、4或5；
每个p独立地为0或1；
L1不存在或为连接基；
R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域；
每个R12独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基；
每个R13独立地为氢或烷基；
R14、R15、R16和R17各自独立地为氢、烷基或X，
或另选地R14和R15和/或R16和R17与它们所附接的碳原子合在一起以形成任选地被X取代的5元或6元环烷基环；并且
每个R18独立地选自由以下项组成的组：氢、卤代基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、杂环基、杂芳基、-OR13、-SR13、-(CH2)pCOOR13、-OC(O)R13、-N(R13)2、-CON(R13)2、-NO2、-CN-OC(O)N(R13)2和-X，
前提条件是所述放射性金属络合物包含至少一个X，并且R18为X时，则L1为连接基，或R12和R14-R17中的至少一者不为氢。
13.根据权利要求8所述的免疫缀合物，其中所述放射性金属络合物为式(IV-m)、或式(V-m)、或式(VI-m)的放射性金属络合物，
其中所述式(IV-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为优选地选自由以下项组成的组的放射性金属：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
R1为氢并且R2为-L1-R4；
另选地，R1为-L1-R4并且R2为氢；
R3为氢；
另选地，R2和R3与它们所附接的碳原子合在一起以形成5元或6元环烷基，其中所述5元或6元环烷基任选地被-L1-R4取代；
L1不存在或为连接基；
R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域；
其中所述式(V-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为优选地选自由以下项组成的组的放射性金属：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；
R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域；
其中所述式(VI-m)的放射性金属络合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
M+为优选地选自由以下项组成的组的放射性金属：锕-225(225Ac)、镭-223(233Ra)、铋-213(213Bi)、铅-212(212Pb(II)和/或212Pb(IV))、铽-149(149Tb)、铽-152(152Tb)、铽-155(155Tb)、镄-255(255Fm)、钍-227(227Th)、钍-226(226Th4+)、砹-211(211At)、铈-134(134Ce)、钕-144(144Nd)、镧-132(132La)、镧-135(135La)和铀-230(230U)；
L1不存在或为连接基；并且
R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域。
14.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为澳瑞他汀衍生物。
15.根据权利要求14所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为MMAE(一甲基澳瑞他汀E)。
16.根据权利要求14所述的免疫缀合物，其中所述治疗部分为MMAF(一甲基澳瑞他汀F)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的免疫缀合物，其中所述结合hK2的抗原结合结构域为scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab′)2、Fd、dAb或VHH。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的免疫缀合物，其中对hK2具有结合特异性的抗原结合结构域为Fab。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域包含分别为SEQ ID NO：170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的免疫缀合物，其中所述结合hK2的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：162的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO：163的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的免疫缀合物，其中所述结合hK2的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：162的VH和SEQ ID NO：163的VL。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域为Fab，所述Fab包含：
a.分别为SEQ ID NO：170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或
b.SEQ ID NO：162的VH和SEQ ID NO：163的VL。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物为短半衰期免疫缀合物。
24.一种治疗受试者的表达hK2的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物。
25.一种减少受试者中表达hK2的肿瘤细胞的量的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物并持续足以减少表达hK2的肿瘤细胞的量的时间。
26.一种治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述前列腺癌为复发性、难治性、恶性或去势难治性前列腺癌、或它们的任何组合。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述前列腺癌为转移性去势难治性前列腺癌。
29.一种检测受试者的前列腺癌的存在的方法，所述方法包括向疑似患有前列腺癌的受试者施用根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物，并且使所述缀合物所结合的生物结构可视化，从而检测前列腺癌的存在。
30.一种制备根据权利要求1至23中任一项所述的免疫缀合物的方法，所述方法包括：将所述治疗部分与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域缀合。
31.一种制备放射性免疫缀合物的方法，所述方法包括将放射性金属与螯合剂结合，所述螯合剂与对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域缀合。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述螯合剂为DOTA。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述螯合剂为H2bp18c6或H2bp18c6衍生物。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述螯合剂选自由以下项组成的组：如本文所述的式(I)、式(II)和式(III)的螯合剂，其中R11包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的所述抗原结合结构域。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述螯合剂选自由以下项组成的组：如本文所述的式(IV)、式(V)和式(VI)的螯合剂，其中R4包含对激肽释放酶相关肽酶2(hK2)具有结合特异性的抗原结合结构域。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述结合hK2的抗原结合结构域为scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab′)2、Fd、dAb或VHH。
37.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述结合hK2的抗原结合结构域为Fab。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含分别为SEQ ID NO：170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述结合hK2的抗原结合结构域包含与SEQ ID NO：162的VH有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VH和与SEQ ID NO：163的VL有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％)同一性的VL。
40.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述结合hK2的抗原结合结构域包含SEQ ID NO：162的VH和SEQ ID NO：163的VL。
41.根据权利要求31至37中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域为Fab，所述Fab包含：
a.分别为SEQ ID NO：170、171、172、173、174和175的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；和/或
b.SEQ ID NO：162的VH和SEQ ID NO：163的VL。
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