CN116790665A - 一种基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法，本发明属于基因编辑技术领域。包括如下步骤：(1)合成编码Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种的化学修饰mRNA；(2)构建并合成包含gRNA和CRISPR序列的转座子载体；(3)将所述mRNA和包含gRNA的完整转座子载体转化猪原代皮肤成纤维细胞，获得单克隆目标细胞；(4)将所述单克隆目标细胞的细胞核插入去核卵母细胞中，得到重组细胞；(5)所述重组细胞移植到受体的输卵管中，培养得到病毒抵抗猪。本发明基于细胞重编程蛋白因子，延长有效基因编辑窗口，实现基因组多位点基因编辑，构建了一种病毒抵抗猪。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法。
背景技术
猪内源性病毒(PERV)为逆转录病毒，整合在猪基因组中，并有几十个到上百个病毒拷贝，虽然目前还没有感染人类的报道，但是其在体外可以感染人体细胞，在异种器官移植和免疫抑制剂的作用下可能会感染处于免疫抑制的器官受体，从异种移植安全性来说，完全去除猪内源性病毒十分必要。
目前有使用CRISPR系统对猪内源性病毒关键共性序列进行“瞬时”敲除和破坏而制备所谓“无猪内源性病毒基因编辑猪”，但是这个猪存在的重大技术漏洞就是：猪内源性病毒有其固有的宿主，所以这个“无猪内源性病毒基因编辑猪”会被猪内源性病毒再次感染，所以目前的“无猪内源性病毒基因编辑猪”仅仅是现有条件无法检测出猪内源性病毒活性而已。
与此同时，猪内源性病毒序列在猪基因组中有几十到上百个拷贝，上述报道的“无猪内源性病毒基因编辑猪”实际在基因组超过40位点进行基因编辑(敲除和破坏)，这样会诱导和加速猪体细胞的衰老而导致完全猪内源性病毒有效序列敲除及破坏和克隆猪制备的比例特别低。
有鉴于此，需要提供一种猪内源性病毒抵抗基因编辑猪的构建方法，甚至是针对多种病毒都有效的病毒抵抗基因编辑猪的构建方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种基于细胞重编程蛋白因子，通过维持和/或逆转猪体细胞衰老，从而延长猪体细胞有效基因编辑窗口，来实现猪体细胞基因组多位点基因编辑，从而构建了一种病毒抵抗猪。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成编码Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种的化学修饰mRNA；
(2)构建并合成包含gRNA和CRISPR序列的转座子载体；
(3)将所述mRNA和包含gRNA的完整转座子载体转化猪原代皮肤成纤维细胞，获得单克隆目标细胞；
(4)将所述单克隆目标细胞的细胞核插入去核卵母细胞中，得到重组细胞；
(5)所述重组细胞移植到受体的输卵管中，培养得到病毒抵抗猪。
优选的，所述Oct4的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sox2的mRNA序列如SEQ IDNO：2所示；所述Klf4的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Glis1的mRNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述Lin28的mRNA序列如SEQ ID NO：5所示。
优选的，所述转座子载体中包含嘌呤霉素抵抗基因和多西环素开关。
优选的，所述包含gRNA的完整转座子载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
优选的，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述病毒抵抗猪为抵抗猪内源性病毒、非洲猪瘟病毒或蓝耳病病毒的猪。
优选的，所述病毒抵抗猪为抵抗猪内源性病毒猪时，所述gRNA靶向猪内源性病毒序列的Pol序列。
本发明还提供了一种所述的构建方法得到的病毒抵抗猪作为器官移植材料的应用。
本发明提供了一种猪内源性病毒为逆转录病毒抵抗基因编辑猪的构建方法，该方法通过基于化学修饰mRNA编码和瞬时表达细胞重编程蛋白因子(Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种)，来维持和/或逆转猪体细胞衰老，从而延长猪体细胞有效基因编辑窗口，来实现猪体细胞对其基因组多位点基因编辑的耐受力。同时将完整的CRISPR系统序列含有针对猪内源性病毒有效序列的引导RNA(2个)和CRISPR蛋白，实现超过40个猪内源性病毒拷贝的彻底基因敲除和破坏的同时，因为该完整的CRISPR系统可以存在于猪的基因组中，可以持续地对猪内源性病毒进行破坏，从而实现对猪内源性病毒进行抵抗，同现有报道的“无猪内源性病毒基因编辑猪”相比高度有利。同时本发明的提供的方法还可以用于其他病毒的预防和抵抗，例如非洲猪瘟病毒，蓝耳病病毒。
附图说明
图1为实施例2构建的转座子载体图；
图2为实施例5中猪内源性病毒活性序列被CRISPR敲除的鉴定结果；
图3为实施例5中猪内源性病毒抵抗猪体细胞抵抗猪内源性病毒的鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
步骤一、特异的DNA模版的合成：5个重编程蛋白因子Oct4、Sox2、Klf4、Glis1、Lin28。
1、编码重编程蛋白因子的双链DNA
A：编码Oct4蛋白因子的双链DNA：gblock，直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下(1)+(2)+(3)+(4)：
(1)T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG。
(2)5’非翻译区序列：
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC。
(3)Oct4开放阅读框序列：
ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGTGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCTGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACTGA
(4)3’非翻译区序列：
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTC CCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTB：编码Sox2蛋白因子的双链DNA：
编码Sox2蛋白因子的双链DNA：gblock，直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下(1)+(2)+(3)+(4)：
(1)T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG。
(2)5’非翻译区序列：
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC。
(3)Sox2开放阅读框序列：
ATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAACTTCGGGGGGCGGCGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCCGGCGGCAACCAGAAAAACAGCCCGGACCGCGTCAAGCGGCCCATGAATGCCTTCATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGCAAGATGGCCCAAGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCCTGGGCGCCGAGTGGAAACTTTTGTCGGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCTAAGCGGCTGCGAGCGCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAGACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACGCTGCCCGGCGGGCTGCTGGCCCCCGGCGGCAATAGCATGGCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTGGGCGCGGGCGTGAACCAGCGCATGGACAGTTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGACCAGCTGGGCTACCCGCAGCACCCGGGCCTCAATGCGCACGGCGCAGCGCAGATGCAGCCCATGCACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCCATGACCAGCTCGCAGACCTACATGAACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTACTCGCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCTCTTGGCTCCATGGGTTCGGTGGTCAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCTGTGGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAGGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTATCTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAACCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACATGTCCCAGCACTACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCTCACACATGTGA
(4)3’非翻译区序列：
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTC CCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTC：编码Klf4蛋白因子的双链DNA：
编码Klf4蛋白因子的双链DNA：gblock，直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下(1)+(2)+(3)+(4)：
(1)T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG。
(2)5’非翻译区序列：
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC。
(3)Klf4开放阅读框序列：
ATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATCTTTCTCCACGTTCGCGTCTGGCCCGGCGGGAAGGGAGAAGACACTGCGTCAAGCAGGTGCCCCGAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCCCACATGAAGCGACTTCCCCCAGTGCTTCCCGGCCGCCCCTATGACCTGGCGGCGGCGACCGTGGCCACAGACCTGGAGAGCGGCGGAGCCGGTGCGGCTTGCGGCGGTAGCAACCTGGCGCCCCTACCTCGGAGAGAGACCGAGGAGTTCAACGATCTCCTGGACCTGGACTTTATTCTCTCCAATTCGCTGACCCATCCTCCGGAGTCAGTGGCCGCCACCGTGTCCTCGTCAGCGTCAGCCTCCTCTTCGTCGTCGCCGTCGAGCAGCGGCCCTGCCAGCGCGCCCTCCACCTGCAGCTTCACCTATCCGATCCGGGCCGGGAACGACCCGGGCGTGGCGCCGGGCGGCACGGGCGGAGGCCTCCTCTATGGCAGGGAGTCCGCTCCCCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGACATCAACGACGTGAGCCCCTCGGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCAGAATTGGACCCGGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGCGTCGCTGAGCGCCCCTGGCAGCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGCGTCAGCAAAGGCAGCCCTGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAACGGCGGGCCGCCGCGCACGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCGGTCTCTTCGTGCACCCACTTGGGCGCTGGACCCCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGGCTGCACACGACTTCCCCCTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTCTTGAGGAAGTGCTGAGCAGCAGGGACTGTCACCCTGCCCTGCCGCTTCCTCCCGGCTTCCATCCCCACCCGGGGCCCAATTACCCATCCTTCCTGCCCGATCAGATGCAGCCGCAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCAGAGGAGCCCAAGCCAAAGAGGGGAAGACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACCGCCACCCACACTTGTGATTACGCGGGCTGCGGCAAAACCTACACAAAGAGTTCCCATCTCAAGGCACACCTGCGAACCCACACAGGTGAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGACGGCTGTGGATGGAAATTCGCCCGCTCAGATGAACTGACCAGGCACTACCGTAAACACACGGGGCACCGCCCGTTCCAGTGCCAAAAATGCGACCGAGCATTTTCCAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCATTTTTAA
(4)3’非翻译区序列：
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTC CCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTD：编码Glis1蛋白因子的双链DNA：
编码Glis1蛋白因子的双链DNA：gblock，直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下(1)+(2)+(3)+(4)：
(1)T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG。
(2)5’非翻译区序列：
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC。
(3)Glis1开放阅读框序列：
ATGGCAGAGGCCCGCACATCCCTGTCTGCCCACTGTCGGGGCCCGCTGGCCACTGGCCTGCACCCAGACCTGGACCTCCCGGGCCGAAGCCTCGCCACCCCTGCGCCTTCCTGCTACCTTCTGGGCAGCGAACCCAGCTCTGGCCTGGGCCTCCAGCCCGAGACCCACCTCCCCGAGGGCAGCCTGAAGCGGTGCTGTGTCTTGGGCCTACCCCCCACCTCCCCAGCCTCCTCCTCACCCTGTGCCTCCTCCGACGTCACCTCCATCATCCGCTCCTCCCAGACGTCTCTGGTCACCTGTGTAAATGGACTCCGGAGCCCCCCTCTGACGGGAGATCTGGGGGGCCCTTCCAAGCGGGCCCGGCCTGGCCCTGCATCGACGGACAGCCATGAGGGCAGCTTGCAACTTGAAGCCTGCCGGAAGGCGAGCTTCCTGAAGCAGGAACCCGCGGATGAGTTTTCAGAGCTCTTTGGGCCTCACCAGCAGGGCCTGCCGCCCCCCTATCCCCTGTCTCAGTTGCCGCCTGGCCCAAGCCTTGGAGGCCTGGGGCTGGGCCTGGCAGGCAGGGTGGTGGCCGGGCGGCAGGCGTGCCGCTGGGTGGACTGCTGTGCAGCCTATGAGCAGCAGGAGGAGCTGGTGCGGCACATCGAGAAGAGCCACATCGACCAGCGCAAGGGCGAGGACTTCACCTGCTTCTGGGCTGGCTGCGTGCGCCGCTACAAGCCCTTCAACGCCCGCTACAAGCTGCTCATCCACATGCGAGTGCACTCGGGCGAGAAGCCCAACAAGTGCATGTTTGAAGGCTGCAGCAAGGCCTTCTCACGGCTGGAGAACCTCAAGATCCACCTGAGGAGCCACACGGGCGAGAAGCCGTACCTGTGCCAGCACCCGGGTTGCCAGAAGGCCTTCAGCAACTCCAGCGACCGCGCCAAGCACCAGCGCACCCACCTAGACACGAAGCCGTACGCCTGTCAGATCCCTGGCTGCTCCAAGCGCTACACAGACCCCAGCTCCCTCCGCAAGCACGTCAAGGCCCATTCAGCCAAAGAGCAGCAGGTGCGTAAGAAGCTGCATGCGGGCCCTGACACCGAGGCCGACGTCCTGACCGAGTGTCTGGTCCTGCAGCAGCTCCACACGTCCACACAGCTGGCTGCCAGCGACGGCAAGGGTGGCTGTGGCCTGGGCCAGGAGCTGCTCCCAGGTGTGTATCCTGGCTCCATCACCCCCCATAACGGACTTGCATCGGGCCTCCTGCCCCCAGCGCACGACGTACCTTCCAGGCACCACCCGCTGGATGCCACCACCAGTTCCCACCACCATCTGTCCCCTCTGCCCATGGCTGAGAGCACCCGGGATGGGTTGGGGCCCGGCCTCCTCTCACCAATAGTCAGCCCCCTGAAGGGGCTGGGGCCACCGCCGCTGCCCCCATCCTCTCAGAGCCATTCTCCGGGGGGCCAGCCCTTCCCCACACTCCCCAGCAAGCCGTCCTACCCACCCTTCCAGAGCCCTCCACCCCCGCCTCTGCCCAGCCCACAAGGTTACCAGGGCAGTTTCCACTCCATCCAGAGTTGCTTCCCCTATGGCGACTGCTACCGGATGGCTGAACCAGCAGCCGGTGGGGACGGACTGGTCGGGGAGACCCACGGTTTCAACCCCCTGCGGCCCAATGGCTACCACAGCCTCAGCACGCCCTTGCCTGCCACAGGCTATGAGGCCCTGGCTGAGGCCTCATGCCCCACAGCGCTGCCACAGCAGCCATCTGAAGATGTGGTGTCCAGCGGCCCCGAGGACTGTGGCTTCTTCCCCAATGGAGCCTTTGACCACTGCCTGGGCCACATCCCCTCCATCTACACAGACACCTAAG
(4)3’非翻译区序列：
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTC CCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTE：编码Lin28蛋白因子的双链DNA：
编码Lin28蛋白因子的双链DNA：gblock,直接订购于美国IDT公司，该DNA序列信息如下(1)+(2)+(3)+(4)：
(1)T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG。
(2)5’非翻译区序列：
AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC。
(3)Lin28开放阅读框序列：
ATGGGCTCCGTGTCCAACCAGCAGTTTGCAGGTGGCTGCGCCAAGGCGGCAGAAGAGGCGCCCGAGGAGGCGCCGGAGGACGCGGCCCGGGCGGCGGACGAGCCTCAGCTGCTGCACGGTGCGGGCATCTGTAAGTGGTTCAACGTGCGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCCATGACCGCCCGCGCCGGGGTCGCGCTCGACCCCCCAGTGGATGTCTTTGTGCACCAGAGTAAGCTGCACATGGAAGGGTTCCGGAGCTTGAAGGAGGGTGAGGCAGTGGAGTTCACCTTTAAGAAGTCAGCCAAGGGTCTGGAATCCATCCGTGTCACCGGACCTGGTGGAGTATTCTGTATTGGGAGTGAGAGGCGGCCAAAAGGAAAGAGCATGCAGAAGCGCAGATCAAAAGGAGACAGGTGCTACAACTGTGGAGGTCTAGATCATCATGCCAAGGAATGCAAGCTGCCACCCCAGCCCAAGAAGTGCCACTTCTGCCAGAGCATCAGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGCTGAAGGCCCAGCAGGGCCCTAGTGCACAGGGAAAGCCAACCTACTTTCGAGAGGAAGAAGAAGAAATCCACAGCCCTACCCTGCTCCCGGAGGCACAGAATTGA
(4)3’非翻译区序列：
GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTC CCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGT
2、通过PCR添加mRNA的poly-(a)尾巴DNA模版：
按照表1制备PCR预混液(总体积为200μl，八个反应各25μl)。
表1.PCR预混液的组成
加尾引物-F1：5′-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3′。
加尾-F2-T120：
5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-5′。
3、使用表2的条件展开PCR：
表2PCR条件
| 循环次数 | 变性 | 退火 | 扩展 |
| 1 | 95℃,2–3min | - | - |
| 2-31 | 98℃,20s | 60℃,15s | 72℃,60s |
| 32 | 72℃,3min | - | - |
4、通过凝胶电泳检查PCR产物的质量。
5、切胶回收PCR产物(QIAquickPCRpurification kit,Qiagen,cat.no.28106)：将尾模板的最终浓度调整为100ng/μl，作为体外转录合成mRNA模版。
Oct4的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；Sox2的mRNA序列如SEQ ID NO：2所示；Klf4的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；Glis1的mRNA序列如SEQ ID NO：4所示；Lin28的mRNA序列如SEQ ID NO：5所示。
步骤二、体外转录合成mRNA
1、按照表3、表4组装mRNA帽结构和核苷酸混合物：
帽子结构3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G RNAcap analog(New England Biolabs,cat.no.S1411S),-Methylcytidine-5′-triphosphate(Me-CTP；Trilink,cat.no.N1014)，Pseudouridine-5’-triphosphate(Pseudo-UTP；Trilink,cat.no.N1019)，其他组分均来自MEGAscriptT7试剂盒(Ambion,cat.no.AM1334)。
表3mRNA帽结构
2、按照表4组装mRNA体外转录体系：
表4mRNA体外转录体系
3、将反应置于PCR仪器在37℃孵5h。
4、向每个样品中添加2μl Turbo DNase(来自MEGAscript T7试剂盒,Ambion,cat.no.AM1334)。
5、轻轻混合并在37℃下孵育15min。
6、使用MEGAclear试剂盒(Ambion,cat.no.AM1908)，纯化经过DNase处理的反应；用总共100μl的洗脱缓冲液洗脱修饰的mRNA(50μl的洗脱缓冲液洗脱两次)。
7、使用磷酸酶(Antarctic phosphatase(New England Biolabs,cat.no.M0289S)处理纯化的修饰mRNA。
8、向每个样品(～100μl)中，添加11μl 10×磷酸酶缓冲液，然后添加2ul磷酸酶；轻轻混合样品并在37℃下孵育0.5～1h。
9、洗脱后，在NanoDrop分光光度计中测量修饰的mRNA的浓度。预期的总产量应为～50μg(30～70μg范围；一次40μl IVT反应的100μl洗脱体积为300～700ng/μl)。通过添加洗脱缓冲液或TE缓冲液(pH 7.0)，将浓度调节至100ng/μl。
实施例2
构建并合成包含2个gRNA和CRISPR序列的转座子载体。
2个gRNA为：
gRNA1：ggtaccctcctccagtacgtgg(SEQ ID NO：7)；
gRNA2：ggtcatccacgtactggaggagg(SEQ ID NO：8)。
设计好的转座子载体序列如SEQ ID NO：6所示。
合成方法为：
(1)先将设计好的载体分成三段PB-1、PB-2、PB-3(委托基因合成公司IDT公司合成)，用于Gibson组装。
(2)根据合成片段2μg计算各片段的pmol值：pmols按ng值X1000/片段长度(bp)X660公式算出。
配置0.08pmol/μL的溶液，各片段加入TE buffer量为：
PB-1＝19.25μL、PB-2＝19.25μL、PB-3＝19.25μL。
(3)实验步骤
a将GeneArtTMGibsonHiFi MasterMix在冰上解冻后，先涡旋混匀；
b在冰上预冷的0.2ml离心管中按下表5配置反应液：
表5Gibson组装反应液
按上述表中组分配置反应体系后，置于50℃恒温水浴锅中孵育15min至反应结束，得到组装好的转座子载体，如图1所示，转座子载体含有针对猪内源性病毒活性序列Pol的2个gRNA、Cas9蛋白和嘌呤霉素抵抗基因、多西环素开关。将反应产物置于冰上进行转化实验(若不用存放于-20℃)。
实施例3
Gibson高保真反应产物(实施例2制备)转化感受态细胞并保存。
(1)将水浴锅预热至42℃，SOC medium预热至37℃，Amp抗性平板(含有50μg/mL的氨苄青霉素)在37℃预热30min，在冰上解冻TOP10Chemically Competent E.coli cells感受态细胞；
(2)用无核酸酶ddH2O4：1稀释Gibson高保真反应产物(12μL无核酸酶水和3μLGibson高保真反应产物)，涡旋混匀后瞬时离心，在冰上保存；
(3)加入2μL稀释液到感受态细胞中，轻轻吹打混匀，(转化控制实验：遵循转化实验流程，将2.5μLpUC19质粒转入TOP10 Chemically Competent E.coli cells感受态中，检验转化效率)将转化混合物在冰上孵育25min；
(4)在42℃下对转化混合物进行热冲击30s，期间不摇晃，然后立即转移到冰上孵育2min；
(5)然后在转化混合物中加入室温SOC培养基250μL，盖紧管盖，37℃下200rpm摇晃复苏1h；
(6)复苏后，6000rpm离心3min，去除200μL上清液；剩余约100μL混合液均匀涂布于预热的Amp抗性平板上。将每次转化的100μL涂在预热的选择性培养板上。(对于阳性对照，将100μL体积的转化反应接种到含有100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL卡那霉素的LB平板上。)
(7)平板在37℃下过夜培养；
(8)第二天，挑选单个菌落，保种。
将待测的单菌落划线保种后，进行菌落PCR以验证质粒是否成功组装，并是否成功转入大肠杆菌细胞。PCR体系如下：
表6PCR反应体系
| 反应组分 | 用量(μl) | 终浓度 |
| Green Taq mix(2×) | 6 | 1× |
| M13-F,10μM | 0.5 | 0.42μM |
| M13-R,10μM | 0.5 | 0.42μM |
| ddH2O | 4 | - |
| Colony DNA Templates | 1 | - |
表7PCR反应程序
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(1×TAE缓冲液)，目标片段符合预计，选择条带大小相符合的单菌落，接种到LB液体培养基中富集后提取质粒，送测序公司测序，测序结果符合预期，参加转座子完整序列。
实施例4
同时将实施例1构建的5条mRNA和实施例2构建的Piggybac转座子载体(含PERV特异gRNA2个)用电穿孔法(Neon转染)导入猪原代皮肤成纤维细胞，嘌呤霉素选择4天，多西环素诱导一周后，通过PCR扩增Pol序列。
正链引物：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACTGCCCCAAGGGT TCAA(如SEQ ID NO：9所示)；
负链引物：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCTCCTGCAAATC TGGGCC(如SEQ ID NO：10所示)。
通过测序确定PERV抵抗挑选单克隆目标细胞。
通过用0.1％(w/v)透明质酸酶处理培养的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)，处理后COC中没有卵丘细胞，而包含第一极体，小心去掉其细胞核。将上述构建的单克隆目标细胞作为供体细胞插入去核卵母细胞的卵细胞质中，得到重组细胞。将重组细胞施加200V/mm的单个直流脉冲融合20微秒，使用融合介质(0.25mol/LD-山梨醇、0.05mmol/L Mg(C2H3O2)2、20mg/mL BSA和0.5mmol/L HEPES)。然后将重组细胞在PZM-3培养液中培养45min，然后用150V/mm的单脉冲激活100毫秒，激活介质为0.25mol/LD-山梨醇、0.01mmol/L Ca(C2H3O2)2、0.05mmol/L Mg(C2H3O2)2和0.1mg/mL BSA。
重组细胞在添加了5μg/mL细胞松弛素BPZM-3培养液中，置于38.5℃、5％CO2、5％O2和90％N2的培养箱(APM-30D，ASTEC，日本)中继续培养和发育，直至胚胎移植。胚胎移植时是通过手术转移到代孕猪的输卵管中。
实施例5
待产出猪内源性病毒抵抗猪后，取猪肾脏、脾脏和皮肤样本，测定猪内源性病毒活性序列Pol序列的敲除情况和对猪内源性病毒的抵抗能力。具体如下：
(1)猪内源性病毒活性序列CRISPR敲除后的鉴定方法：采用PCR扩增三个样本的pol基因并通过IlluminaNext对其进行了测序，使用PE250进行二代测序，获取数据。然后我们将两个重叠的reads结合起来，使用PEAR及BLAT映射到参考区域，映射后，我们将读出该段序列在CRISPR基因编辑后的乱码(即外源基因的随机插入和本身序列的缺失)，结果见图2。
从图2中可以看出，猪内源性病毒抵抗猪基因组内的内源性病毒活性序列已经通过敲除而被破坏。
(2)抵抗猪内源性病毒的鉴定：取内源性病毒抵抗猪的成纤维细胞，和内源性病毒单纯敲除猪的成纤维细胞(仅瞬时转染CRISPR+2条gRNA)，同猪PK细胞(含有猪内源性病毒)进行非直接接触共培养100天，取第30天和第100天为检测时间点，检测二者被PK细胞猪内源性病毒感染的情况。结果如图3所示。
从图3中可以看出，内源性病毒单纯敲除猪的成纤维细胞同含有猪内源性病毒的PK细胞共培养会被该病毒感染，而且随着培养的时间病毒拷贝数增加，而本发明构建的内源性病毒抵抗猪的成纤维细胞，在共培养的100天后仍然保持内源性病毒拷贝数为零。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于基因编辑的病毒抵抗猪的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成编码Oct4、Sox2、Klf4、Glis1和Lin28中的一种或几种的化学修饰mRNA；
(2)构建并合成包含gRNA和CRISPR序列的转座子载体；
(3)将所述mRNA和包含gRNA的完整转座子载体转化猪原代皮肤成纤维细胞，获得单克隆目标细胞；
(4)将所述单克隆目标细胞的细胞核插入去核卵母细胞中，得到重组细胞；
(5)所述重组细胞移植到受体的输卵管中，培养得到病毒抵抗猪。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Oct4的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Sox2的mRNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Klf4的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Glis1的mRNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述Lin28的mRNA序列如SEQ ID NO：5所示。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述转座子载体中包含嘌呤霉素抵抗基因和多西环素开关。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述转座子载体的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述病毒抵抗猪为抵抗猪内源性病毒、非洲猪瘟病毒或蓝耳病病毒的猪。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述病毒抵抗猪为抵抗猪内源性病毒猪时，所述gRNA靶向猪内源性病毒序列的Pol序列。
8.一种权利要求1～7任一项所述的构建方法得到的病毒抵抗猪作为器官移植材料的应用。
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