CN116794139B - 一种基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速筛选具有塑料降解活性微生物的方法。更详细地公开了一种基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法。利用微生物对磁性复合材料外层包裹的塑料层的降解能力，调控复合材料中指示离子释放通量，再通过聚合物膜离子选择性电极对复合材料的响应信号、指示离子通量与微生物降解塑料之间关系，实现对降解塑料微生物的定性和/或定量检测降解效率；所述复合材料为经塑料包覆的磁性颗粒所形成。与传统筛选具有塑料降解活性微生物的方法相比，本发明在数小时内即可实现。本发明为塑料降解微生物的快速筛选提供了新思路。
Description
技术领域
本发明公开了一种快速筛选具有塑料降解活性微生物的方法。更详细地公开了一种基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法。
背景技术
塑料的年产量在3亿吨以上，塑料制品的大量生产与使用，以及对塑料废弃物的不合理处置和管理方式，使得环境中累积了大量的塑料垃圾。由于塑料具有化学性质稳定的特性，绝大多数塑料难以在短时间内被降解。传统的塑料处理方法主要是填埋、焚烧以及部分回收处理，而生物降解作为新兴的塑料处理方式，可以通过生物酶或者微生物降解塑料废弃物，具有绿色环保、成本低等特点，在解决塑料污染问题方面极具应用前景。
一些研究人员已从垃圾填埋场、土壤和海洋等环境中筛选分离出多种具有降解塑料能力的微生物。现有可用于评估微生物降解塑料能力的方法包括：通过观察塑料降解过程中塑料表面产生缺损情况的电子显微镜法、通过表征塑料降解前后塑料表面官能团变化的红外光谱法、通过测定塑料降解前后塑料聚合物分子量变化的色谱法、通过测定塑料降解前后质量变化的失重法等。然而，自然界中存在的微生物种类繁多，采用上述方法通常需要数天甚至数月的降解期，实验过程繁琐耗时。因此，如何快速筛选出对特定塑料具有高降解能力的微生物仍然是一个巨大挑战。
发明内容
针对目前快速筛选具有塑料降解活性的微生物的方法缺失，本发明的目的在于提供一种基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，利用微生物对磁性复合材料外层包裹的塑料层的降解能力，调控复合材料中指示离子释放通量，再通过聚合物膜离子选择性电极对复合材料的响应信号、指示离子通量与微生物降解塑料之间关系，实现对降解塑料微生物的定性和/或定量检测降解效率；所述复合材料为经塑料包覆的磁性颗粒所形成。
进一步的说，将复合材料与待检测样品共孵育，样品中若含有降解塑料微生物，其会对复合材料的塑料层进行降解，在复合物表面形成孔洞，通过磁性分离方法进行介质转换，酸性条件下，复合材料产生指示离子释放通量，引起聚合物膜离子选择性电极产生电位响应信号，实现对降解塑料微生物的定性和/或定量检测降解效率。
所述复合材料与待检测样品于无机盐培养基中，在25-35℃ 下共孵育1-12小时。
所述酸性条件为1-5 pH值的盐酸溶液。
所述复合材料具有三层结构，最内层为磁性基底Fe3O4颗粒，便于利用磁控分离方法实现介质转换；次外层为信号指示元件Ca3(PO4)2包覆层，用于介质转换后释放钙指示离子；最外层为识别元件塑料包覆层，用于识别可降解塑料的特定微生物。
所述塑料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯等。
一种所述方法筛选的降解微生物的应用，所述方法筛选的降解微生物在降解塑料中的应用。
本发明所述的快速筛选塑料降解微生物的方法原理在于，利用微生物对塑料层的降解作用调控指示离子（钙）释放通量，建立聚合物膜离子选择性电极电位信号、指示离子通量与微生物降解塑料效率之间的关系，实现对微生物降解塑料效率的快速分析。
本发明所述的快速筛选塑料降解微生物的方法的具体过程在于，菌株与Fe3O4-Ca3(PO4)2@塑料（聚苯乙烯）磁性复合材料在无机盐培养基中共孵育数小时，利用菌株对聚苯乙烯塑料层的降解作用在材料表面形成孔洞或破损，通过磁性分离方法进行介质转换，利用酸性条件使磁性复合材料中的钙指示离子通量被释放，引起聚合物膜钙离子选择性电极产生电位响应信号。空白对照组为只含有Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料的无机盐培养基。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明提供可快速筛选具有塑料降解活性的微生物的方法，该方法利用微生物在适当的培养条件下培养时可将Fe3O4-Ca3(PO4)2@塑料（聚苯乙烯）磁性复合材料中的聚苯乙烯塑料包覆层降解，调控钙指示离子释放通量，在数小时内实现塑料降解微生物的快速筛选。本发明所提供的磁性复合材料中的塑料层，可根据实验条件合成不同的种类，进而实现降解不同种类塑料微生物的快速筛选。
附图说明
图1为本发明实施例提供的塑料降解微生物快速筛选方法的原理示意图。
图2为本发明实施例提供的Fe3O4、Fe3O4-Ca3(PO4)2、Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性材料的SEM表征图，其中A是Fe3O4，B是Fe3O4-Ca3(PO4)2，C是Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性材料。
图3为空白对照和已知降解聚苯乙烯塑料功能的蜡样芽孢杆菌属菌株与Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性材料共孵育12小时的电位响应变化图。
图4为功能未知菌株的SEM形貌表征图，其中A为TXN-1菌株，B为TXN-2菌株。
图5为空白对照和功能未知的菌株与Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性材料共孵育12小时的电位响应变化图，其中A为电位响应变化图，B为电位变化差值图。
图6为功能未知的TXN-1和TXN-2菌株与聚苯乙烯塑料薄膜共孵育7-14天的SEM变化图；其中A和B分别为与TXN-1菌株共培养7天、１４天的聚苯乙烯塑料薄膜样品的SEM表征图，插图分别为培养7天和14天的空白对照组的SEM表征图；C和D分别为与TXN-2菌株共培养7天、14天的聚苯乙烯塑料薄膜样品的SEM表征图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但实施例仅用于帮助说明本发明的技术特征，并不限定本发明的保护范围。
本发明通过合成的Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料用于快速筛选塑料降解微生物，其中，复合材料中聚苯乙烯塑料层作为识别元件，用于识别特定微生物；Ca3(PO4)2包覆层作为信号指示元件，用于介质转换后释放钙指示离子；Fe3O4微球作为磁性基底，便于利用磁性分离方法实现介质转换。本发明利用微生物对塑料层的降解作用调控指示离子释放通量，建立聚合物膜钙离子选择性电极信号、钙指示离子通量与微生物降解塑料效率之间的关系，实现具有塑料降解活性的微生物的快速筛选。空白对照组为只含有Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料的无机盐培养基（如图1所示）。
以本发明提供的方法快速筛选聚苯乙烯塑料降解微生物为例。
实施例1
Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料的合成
（1）Fe3O4磁性微球的合成
称取1.35 g FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇，而后加入3.6 g无水乙酸钠和1.0 g聚乙二醇。将混合溶液在室温下继续剧烈搅拌30 min后，转移至高压反应釜在200℃下反应8h。反应结束后，利用磁性分离方法分离得到黑色产物Fe3O4，使用无水乙醇和去离子水交替洗涤产物数次，置于60 ℃真空干燥箱中干燥6 h，备用。
（2）Fe3O4-Ca3(PO4)2磁性微球的合成：
将制备的Fe3O4磁性微球（0.1 g）在超声条件下均匀分散在100 mL去离子水中，加入1 mL CaCl2（1.0 M）溶液继续超声1 h。随后在机械搅拌下滴入2 mL PBS缓冲溶液（0.1M, pH = 7.4），继续搅拌4 h即得到Fe3O4-Ca3(PO4)2磁性微球。用去离子水洗涤产物数次，于4℃的条件下储存备用。
（3）Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料的合成
在合成之前，需要对苯乙烯溶液进行纯化，即向150 mL分液漏斗中加入20 mL苯乙烯溶液和15 mL 1.0 M NaOH溶液并充分混合，待静置分层后留上清液，以上过程重复三次，以除去苯乙烯溶液中的阻聚剂。然后加入30 mL去离子水再次洗涤上清液2次，以去除残留的NaOH。向250 mL三颈烧瓶中依次加入溶剂（20 mL去离子水和80 mL无水乙醇混合液）、纯化的苯乙烯单体（1 mL）、交联剂（0.1 mL，二乙烯苯）和乳化剂（0.3 g，聚乙烯吡咯烷酮），在氮气保护下加热至70 ℃反应1 h，而后加入3 mL引发剂（2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐水溶液，1.7 wt%）继续反应10 min，最后加入20 mL上述制备的Fe3O4-Ca3(PO4)2分散液，于70°C下继续反应48小时。利用磁性分离方法将得到的聚苯乙烯包覆Fe3O4-Ca3(PO4)2微球在去离子水中洗涤数次，以除去残留的反应物和游离的聚苯乙烯纳米颗粒，产物于60 ℃真空干燥箱中干燥6 h，备用。
按照上述方法，将聚苯乙烯替换为聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯等即可。获得不同种类塑料层包覆Fe3O4-Ca3(PO4)2的磁性复合材料，可以通过上述合成方法，改变相应的实验条件即可。
所述合成材料的扫描电子显微镜（SEM）表征如图2所示，对比未经修饰的Fe3O4微球（A），Ca3(PO4)2指示离子包覆层形成后（B），在Fe3O4微球表面可以观察到有形状不规则的碎片。继续聚合形成聚苯乙烯塑料包覆层后（C），微球表面形貌发生明显变化，且变得光滑，表明材料成功合成。
实施例2
利用上述实施例1获得复合材料进行降解塑料的验证
所使用的微生物富集培养基为2216E液体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）。用于评估微生物的塑料降解能力的无机盐培养基的组成（g/L）：0.92 g K2HPO4·3H2O，0.7 g KH2PO4，0.7 g MgSO4·7H2O，1.0 g NH4NO3，0.005 g NaCl，0.002 g FeSO4·7H2O，0.002 g ZnSO4·7H2O和0.001 g MnSO4使用前需在121 ℃灭菌锅中灭菌20分钟。
参见图1所示，将上述实施例1获得的复合材料与已知具有降解聚苯乙烯塑料能力的蜡样芽孢杆菌属菌株ATCC14579（Bacillus cereus CH6）共孵育一段时间，利用聚合物膜钙离子选择性电极对从磁性复合材料中释放至稀盐酸溶液中的钙离子浓度进行检测，以验证该方法的可行性。
同时，以实施例1获得的复合材料作为对照。
具体过程为，将处于生长对数期的Bacillus cereus CH6菌株以10%的接种量接种于含20 mL无菌无机盐培养基和Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料（2 mg/mL）中，并在33℃、90 rpm的摇床中进行培养。空白对照组为未接种细菌的20 mL无机盐培养基和Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料（2 mg/mL），其他实验条件均保持一致。在培养12小时后，采用磁控分离方法将Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料从无机盐培养基中分离，并用去离子水洗涤数次后重新分散于10 mL稀盐酸（pH = 3）溶液中，振荡5 min后再次分离出Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料，利用聚合物膜钙离子选择性电极对从磁性复合材料中释放至稀盐酸溶液中的钙离子浓度进行检测。上述实验一式三份进行。
测试结果如图3所示，与空白对照组相比，接种有Bacillus cereus CH6菌株的Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料中产生的电位信号更大，说明Bacillus cereusCH6菌株可以通过降解磁性复合材料的聚苯乙烯塑料层，使钙指示离子释放至溶液中引起电极电位变化。这一结果验证了基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法的可行性。
实施例3
基于聚合物膜电极传感技术评估微生物降解塑料的能力：
取中国台湾西南部海底冷泉液沉积物，通过聚合物膜电极传感技术评估其降解聚苯乙烯塑料的能力。
获取过程：将海底冷泉液沉积物上清液（22°06′55.457′′-26.831′′N，119°17′07.302′′-10.153′′E，深度约1100米）与无菌聚苯乙烯塑料薄膜在含有少量营养物质的无机盐培养基中33°C富集培养30天。然后将附着在聚苯乙烯塑料薄膜表面的微生物进行分离纯化，不断进行传代培养，实现菌种的大量富集。最后通过16 S rRNA基因测序技术对分离纯化后的菌种进行鉴定。
选择两种功能未知的肠杆菌属菌株，分别命名为TXN-1和TXN-2，并通过SEM观察所使用功能未知的TXN-1和TXN-2菌株的形态。TXN-1菌株（图4A）呈杆状，菌体细长、直或略弯，菌体周围未观察到菌丝；TXN-2菌株（图4B）形态与TXN-1菌株相似，呈杆状，菌体细长、直或略弯，但不同之处在于，菌体表面携带有菌丝（黑色箭头指示处）。
将两种功能未知的TXN-1和TXN-2菌株分别接种于2216E液体培养基中，并置于33℃摇床中培养过夜，次日重新接种于新的2216E液体培养基中继续培养3-5小时至生长对数期。
取上述实施例1制备的Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料（2 mg/mL）分别加入到已接种10%处于生长对数期的TXN-1和TXN-2菌株的无机盐培养基中，在33 ℃、90 rpm的摇床中培养12小时。空白对照组为未接种细菌的无机盐培养基和Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料，并保持其他实验条件一致。在培养12小时后，采用磁控分离方法将Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料从无机盐培养基中分离，并用去离子水洗涤数次后重新分散于10 mL稀盐酸（pH = 3）溶液中，振荡5 min后再次分离出Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料。
而后进一步，利用聚合物膜钙离子选择性电极对上述从磁性复合材料中释放至稀盐酸溶液中的钙离子浓度进行检测，上述实验一式三份进行。
所述聚合物膜钙离子选择性电极的制备过程：分别称取8.28 mg的离子载体ETH129，7.92 mg的离子交换剂四（3，5-二（三氟甲基）苯基）硼酸钠，229.32 mg的增塑剂邻-硝基苯辛醚，114.48 mg的膜基体聚氯乙烯于干燥透明的玻璃瓶中，加入3.6 mL四氢呋喃溶液后充分搅拌2小时使其充分溶解。室温下倒入直径为3.6 cm的玻璃环中，恒温恒湿箱中过夜，待四氢呋喃完全挥发，得到厚度约为200 μm的透明且具有弹性的钙离子选择性敏感膜。将所述钙离子选择性敏感膜用打孔器切割成直径约为6.0 mm的小圆片，并用四氢呋喃粘在聚氯乙烯管的末端，得到聚合物膜钙离子选择性电极。恒温恒湿箱中放置约2小时至四氢呋喃挥发完全，并向电极腔体中注入10-3M CaCl2作为内充液，置于10-3M CaCl2溶液中活化过夜后使用。
利用微生物对塑料的降解作用调控Fe3O4-Ca3(PO4)2@聚苯乙烯磁性复合材料中指示离子的释放通量，并将这种指示离子释放通量调节方法与聚合物膜离子选择性电极相结合，实现对微生物降解塑料效率的快速检测。结果如图5所示，与TXN-2菌株共同培养12小时后的磁性复合材料中释放的钙离子浓度引起明显的电极电位信号，表明其对聚苯乙烯塑料层的降解能力较强；与TXN-1菌株共同培养后的磁性复合材料中释放的钙离子浓度引起的电极电位信号最小，表明其对聚苯乙烯塑料层的降解能力最弱。
将上述使用的功能未知菌株通过传统SEM方法评估其降解塑料的能力
TXN-1和TXN-2菌株分别接种于2216E液体培养基中并置于33 ℃摇床中培养过夜，次日重新接种于新的2216E液体培养基中继续培养3 - 5小时至生长对数期。将处于生长对数期的两种菌株（TXN-1、TXN-2）再次以10%的接种量接种于含20 mL灭菌无机盐培养基和灭菌聚苯乙烯塑料薄膜样品的50 mL无菌锥形瓶内，并放置于33 ℃的恒温恒湿箱中培养。作为对照，未接种的无机盐培养基和聚苯乙烯塑料薄膜样品保持其他条件一致，进行培养。在培养7天和14天后取出聚苯乙烯塑料薄膜样品，利用超声清洗去除其表面形成的微生物膜，在SEM下观察聚苯乙烯塑料的降解情况。上述实验一式三份进行。
上述实验条件下，与TXN-1、TXN-2在无机盐培养基中培养7天和14天后聚苯乙烯塑料薄膜样品的降解情况通过SEM进行观察，结果如图6所示。其中A为与TXN-1菌株共培养7天的聚苯乙烯塑料薄膜样品的SEM表征图，B为与TXN-1菌株共培养１４天的聚苯乙烯塑料薄膜样品的SEM表征图，插图为培养7天和14天的空白对照组的SEM表征图；C和D分别为与TXN-2菌株共培养7天、14天的聚苯乙烯塑料薄膜样品的SEM表征图。同空白对照组相比，在无机盐培养基中没有任何碳源的情况下，经不同细菌降解后的聚苯乙烯塑料薄膜样品表面均出现了不同程度的褶皱、沟壑和坑洞，根据表面形貌变化程度，可得出不同细菌对聚苯乙烯塑料薄膜的降解能力为：TXN-2＞TXN-1。这一结果与采用聚合物膜电极传感技术得到的结果一致。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能够理解和使用本发明。熟悉本领域的技术人员显然可以对这些实施例进行各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，其特征在于，利用微生物对磁性复合材料外层包裹的塑料层的降解能力，调控复合材料中指示离子释放通量，再通过聚合物膜离子选择性电极对复合材料的响应信号、指示离子通量与微生物降解塑料之间关系，实现对降解塑料微生物降解效果的定性和/或定量检测；所述复合材料为经塑料包覆的磁性颗粒所形成。
2.按权利要求1所述的基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，其特征在于，将复合材料与待检测样品共孵育，样品中若含有降解塑料微生物，其会对复合材料的塑料层进行降解，在复合物表面形成孔洞，通过磁性分离方法进行介质转换，酸性条件下，复合材料产生指示离子释放通量，引起聚合物膜离子选择性电极产生电位响应信号，实现对降解塑料微生物降解效果的定性和/或定量检测。
3.按权利要求1或2所述的基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，其特征在于，所述复合材料与待检测样品于无机盐培养基中，在25-35 ℃下共孵育1-12小时。
4.按权利要求2所述的基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，其特征在于，所述酸性条件为1-5 pH值的盐酸溶液。
5.按权利要求1或2所述的基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，其特征在于，所述复合材料具有三层结构，最内层为磁性基底Fe3O4颗粒，便于利用磁控分离方法实现介质转换；次外层为信号指示元件Ca3(PO4)2包覆层，用于介质转换后释放钙指示离子；最外层为识别元件塑料包覆层，用于识别可降解塑料的特定微生物。
6.按权利要求5所述的基于聚合物膜电极传感技术快速筛选塑料降解微生物的方法，其特征在于，所述塑料为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或聚氯乙烯。
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