CN116794123A - 一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器及其使用方法，其包括可折叠式的引流区、反应区以及吸附区。所述反应区的工作电极涂有PEDOT:PSS导电水凝胶材料，再通过PEG对其进行‑OH基团修饰，使其可以固定特异性生物识别分子。本发明检测装置可及时快速地对中和抗体浓度进行定量检测，可用于全血检测，可实现极低浓度的检测，灵敏度高，检测效果好。

Description

一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器及其使用方法

技术领域

本发明属于医疗检测领域，涉及一种及时的定量中和抗体电化学检测领域，尤其是涉及一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器及其使用方法。

背景技术

当人体接种了疫苗(如麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗和新冠疫苗)之后，可诱导体内免疫反应产生抗体，预防感染。免疫系统产生的抗体，大部分是通过与抗原结合，进而激发白细胞来吞噬抗原所在的外来物，并最终将其消灭。与普通抗体不同，中和抗体是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子(抗原)与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。因此，中和抗体是对抗病原微生物入侵的重要特异性防御。

因此，中和抗体浓度的定量检测对评估疫苗接种后的有效性和持久性具有十分重要的意义，尤其是面对突发疾病，疫苗效力研究还不是很完善的情况下(如新冠疫苗)。但现有的全血液检测现有手段方案难以实现中和抗体快速定量测试，因此需要开发一种小型化便携式的快速定量现场检测(POCT)设备，以便在疫苗接种后，通过基层医疗机构检测即可对疫苗保护能力做出客观判断，精准科学地指导后期疫苗接种，提高疾病防控效率，保障公共卫生安全。

电化学生物传感器通过固定在电极表面的特异性生物识别分子捕获溶液中的目标分析物，从而实现目标分子的定量分析。电化学检测方法由于其设备简单，操作便捷，检测快速且灵敏度高等特点，受到越来越多的关注。并在生化小分子，大分子蛋白，肿瘤标记物和致病菌等的检测中有着广泛应用。同时，电化学方法易与微流控芯片，纸基微电极等技术结合，实现微量体液的定量分析，满足POCT现场和实时检测的需求，因此在病原微生物感染和抗体检测中有着潜在的应用价值。但现有的用于抗体检测的电化学传感器制备工艺较复杂，无法实现大规模生产和应用，因此需要研究一款适用于产业化的电化学检测电极；其次，疫苗接种的初期和后期，体内的中和抗体浓度很低，如何提高传感器的灵敏度，以满足低浓度的测试需求，也是本项目发明中亟需解决的问题。

发明内容

为克服上述现有技术所存在的上述不足之处，本发明的第一个目的是提供一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器，既保留了传统竞争法检测抗体的现场快速检测优点，又通过PEDOT:PSS(聚(3,4-乙烯二氧噻吩)：聚(苯乙烯磺酸盐))水凝胶实现纸纤维导电化，实现了电化学检测技术的高灵敏度和宽范围测量，可以用来及时、定量的中和检测。

一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器，为一体成型的纸纤维基底检测片；所述纸纤维基底检测片包括三个功能区：引流区(1)、反应区(2)和吸附区(3)，且相邻功能区间设有折痕；

所述引流区(1)包括依次排列的滴液区(11)、冲洗区(12)、渗透区(13)和微流控通道(14)，所述滴液区(11)和冲洗区(12)之间、所述冲洗区(12)和渗透区(13)之间通过微流控通道(14)连通；

所述反应区(2)包括微流控电化学电极、导电带(24)和信号输出接口(25)，所述微流控电化学电极包括参比电极(21)、对电极(22)和工作电极(23)；所述参比电极(21)为圆弧状结构，所述对电极(22)为圆弧状结构，且所述参比电极(21)与所述对电极(22)构成一个外圆环；所述工作电极(23)为圆形片状结构，位于所述参比电极(21)与所述对电极(22)的圆环内；所述参比电极(21)、对电极(22)构成的外圆环与所述工作电极(23)间留有间隙；所述导电带(24)包括第一导电带、第二导电带和第三导电带；所述信号输出接口包括第一信号输出接口、第二信号输出接口和第三信号输出接口；所述第一导电带的一端与所述参比电极(21)连接，另一端与所述第一信号输出接口连接；所述第二导电带的一端与所述对电极(22)连接，另一端与所述第二信号输出接口连接；所述第三导电带的一端与所述工作电极(23)连接，另一端与所述第三信号输出接口连接；其中所述工作电极(23)固定有抗原探针；所述抗原探针采用-OH基团修饰的PEDOT:PSS水凝胶固定有能与抗原蛋白特异性结合的生物识别分子构成；

由-OH基团修饰的PEDOT:PSS水凝胶和所述工作电极(23)内纸纤维形成导电三维网络；

所述吸附区(3)包括一体成型的吸附区域(31)和扩展区域(32)；

根据折痕进行折叠后，所述渗透区(13)、微流控电化学电极和吸附区域(31)呈上下对齐设置，且所述滴液区(11)、冲洗区(12)、扩展区域(32)均与微流控电化学电极错开；所述微流控电化学电极的上表面与所述渗透区(13)的下表面接触。

作为优选，所述滴液区(11)、冲洗区(12)和渗透区(13)均为圆形结构。

作为优选，所述微流控通道(14)采用长条形结构。

作为优选，所述吸附区域(31)采用圆形结构，所述扩展区域(32)采用长条形结构。

作为优选，所述引流区(1)中非滴液区(11)、冲洗区(12)、渗透区(13)、微流控通道(14)所在区域采用纸纤维，且上下表面铺设蜡层；所述反应区(2)中非微流控电化学电极所在区域采用纸纤维，且上下表面铺设蜡层；所述吸附区(3)中非吸附区域和扩展区域所在区域采用纸纤维基底，且上下表面铺设蜡层。

作为优选，所述纸纤维基底检测片采用孔径为2～6μm、厚度为700～1200μm的纸纤维。

作为优选，所述纸纤维基底检测片采用丝网印刷工艺。

作为优选，所述参比电极(21)、对电极(22)构成的外圆环上开有窗口，所述第三导电带穿过所述窗口与所述工作电极(23)连接。

本发明的第二个目的是提供上述适用于全血液的中和抗体电化学传感器的使用方法，采用如下技术方案：

步骤S1：电化学传感器的折叠

将电化学传感器沿着折痕进行折叠，使得所述渗透区(13)、微流控电化学电极和吸附区域(31)呈上下对齐，且所述滴液区(11)、冲洗区(12)、扩展区域(32)均与微流控电化学电极错开；

步骤S2：滴加待测血液样品

将血液样品与抗原蛋白溶液混合，预反应一段时间后滴加至所述滴液区(11)，由于纤维孔径的限制，混合液中的血细胞停留在滴液区(11)，其余部分在纸纤维的毛细作用下，经过微流控通道(14)依次被吸附至所述冲洗区(12)和渗透区(13)，最终进入所述反应区(2)，在微流控电化学电极上孵育一段时间，使混合液中未与中和抗体结合的抗原蛋白与工作电极中的抗原探针充分结合；抗原蛋白可与血液中的中和抗体结合，也可与固定于反应区工作电极(23)内的抗原探针结合。因此，当血液中存在中和抗体时，抗原蛋白在预反应阶段将于血液中的中和抗体结合，剩余的抗原蛋白在孵育阶段将与反应区工作电极(23)内的抗原探针结合。血液中的中和抗体浓度越低，能与抗原探针结合的抗原蛋白就越多；相反，血液中的中和抗体浓度越高，剩余的抗原蛋白就越少，因此能与工作电极(23)内的抗原探针结合的抗原蛋白就越少。

步骤S3：PBS冲洗液冲洗

滴加PBS冲洗液至所述冲洗区(12)，在纸纤维的毛细作用下，PBS冲洗液经过微流控通道(14)依次被吸附至所述冲洗区(12)和渗透区(13)，进入所述反应区(2)对所述微流控电化学电极进行清洗，除去干扰物质，然后进入所述吸附区(3)；清洗过程中，血液中无法与抗原探针结合的部分随着清洗液进入吸附区(3)，只有与抗原探针结合的抗原蛋白留在工作电极内部。由于能与抗原探针结合的抗原蛋白的量与血液中的中和抗体浓度呈反比，因此产生的电化学信号反映了中和抗体的浓度。

步骤S4：电信号结果输出

将输出接口(25)连接至外部电路并施加相应的控制信号，微流控电化学电极产生相应的输出电信号，通过导电带(24)传输至所述输出接口(25)，所述输出接口(25)通过外部电路将输出电信号输出至配备有LED屏幕的信号显示器上，计算输出电信号与中和抗体浓度的对应关系与数值。

在本发明中，引流区(1)具有血细胞分离的功能。引流区(1)纸纤维的孔径约为2～6μm，而血细胞的直径约为6～10μm，因此当血液与抗原蛋白溶液的混合液被滴加至滴液区(11)时，较大的血细胞将无法通过孔径较小的纤维孔，基本被留在滴液区，从而减小了血细胞对传感器信号的影响。冲洗区(12)位于滴液区(11)和渗透区(13)之间，滴加PBS冲洗液时，不会将位于滴液区(11)的血细胞冲至渗透区(13)。

反应区(2)的工作电极(23)表面通过PEDOT:PSS水凝胶进行修饰后，PEDOT:PSS水凝胶在纸纤维表面包裹形成导电层，并利用纸纤维形成三维导电网络，极大地增加工作电极(23)的有效面积，使其可以固定更多的识别分子(包括抗体，酶，DNA等特异性识别分子)，提高目标分子的识别效率，从而提高传感器的灵敏度，降低传感器的检测限，使其可以检测超低浓度的目标分子。

吸附区(3)的存在使PBS冲洗液在经过工作电极(23)后还可以向下渗透，从而对电极进行冲洗，被工作电极(23)中识别分子捕获的目标分子不会被冲洗掉，而待测血液样品中其他的干扰物质由于没有被捕获，在PBS冲洗液的冲洗下会随之被吸附至吸附区(3)。通过控制滴加的待测血液样品和PBS冲洗液的量，可将反应区(2)中的干扰物全部冲洗至吸附区(3)。

本公开提供的适用于全血液的中和抗体电化学传感器，具有以下有益效果：

(1)混合液中的抗原蛋白可与电极内部的抗原探针进行与中和抗体的竞争反应，改变电极的信号。中和抗体的浓度越高，能与工作电极中抗原探针结合的抗原蛋白越少，传感器的信号越小，因此可对血清中的中和抗体浓度进行定量分析。

(2)采用PEDOT:PSS水凝胶对纸纤维工作电极表面进行修饰，形成了导电三维网络，将蛋白固定于导电纤维表面，不仅大大提高了蛋白的固定量，而且降低了蛋白的空间位阻，提高了传感器的灵敏度和最低检测限。

(3)纸基微流控可以实现液体在电极沟道内的横向和纵向可控流通，不仅可以精确控制整个测试过程所需要的溶液用量，而且分层结构的微流控通道可以方便地实现后续的电极清洗和消除干扰的过程。

(4)本发明采用折叠结构，微流控通道和电化学电极可通过丝网印刷工艺在滤纸上一次成型，可以通过丝网印刷工艺批量加工完成，大大降低了工艺难度和制作成本，满足大规模生产加工的要求。

附图说明

图1为本发明适用于全血液的中和抗体电化学传感器的折叠结构示意图；

图2为本发明中经修饰后的工作电极内部结构放大示意图；

图3为本发明的传感器未折叠前的结构示意图；

图4为本发明的传感器折叠后的液体流向示意图。

图中标记：引流区1，反应区2，吸附区3，滴液区11，冲洗区12，渗透区13，微流控通道14，参比电极21，对电极22，工作电极23，导电带24，信号输出接口25，吸附区域31，扩展区域32，血液样本与抗原蛋白混合液4，PBS冲洗液5，抗原探针6。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

如图1所示，适用于全血液的中和抗体电化学传感器，包括引流区1，反应区2和吸附区3。引流区1用于滴加血液样本和抗原蛋白RBD(新冠病毒表面刺突糖蛋白S的受体结合域)溶液，并使其充分混匀，流向反应区，将血液和抗原蛋白RBD混合溶液样本滴加于滴液区11后，由于所使用的纸纤维基底孔径为2～6μm，小于血细胞的直径，因此较大的血细胞将被留在滴液区11处，无法继续前进，除去了血细胞的血清在纸纤维毛细作用的引导下，经由微流控通道14，穿过装置的渗透区13快速到达电极的反应区2。

反应区2包括丝网印刷工艺制备的微流控纸基电化学电极，导电带24和信号输出接口25；微流控纸基电化学电极包括参比电极21，对电极22和工作电极23，用于电化学信号的产生与测量；导电带24和信号输出接口25用于电信号的传输和转接。对电极22，导电带24和信号输出接口25均由碳浆材料在纸纤维基底表面经丝网印刷制备而成，参比电极21由银氯化银材料在纸纤维基底表面经丝网印刷制备而成，工作电极23由PEDOT:PSS溶液浇筑在纸纤维基底表面而成。PEDOT:PSS溶液均匀扩散于纸纤维表面，通过自组装的方式形成PEDOT:PSS水凝胶多孔导电层，从而实现纸纤维内部的有效电子传输和物质扩散。为了将特异性抗原探针ACE-2(血管紧张素转化酶2)固定于工作电极23内部，可使用聚乙二醇(PEG)对PEDOT:PSS进行-OH基团修饰，使其可用于后期的氨基化和蛋白固定。PEG具有良好的亲水性，每个PEG主链都可以牢固地结合水分子，通过醚氧连接每条链并形成紧密的水合层，从而在物理上阻止蛋白吸附，提高电极的抗干扰能力。通过连接PEG在导电纤维表面连接了-OH基团后，可利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与-OH基团反应，在导电纤维表面修饰上可与蛋白结合的氨基，然后通过蛋白表面的羧基与电极表面的氨基的缩合反应，将抗原探针ACE-2固定于电极表面，形成抗原蛋白RBD捕获位点。图2为本发明中经修饰后的工作电极内部结构放大示意图，发明中的工作电极利用纸纤维本身的三维结构，经PEDOT:PSS修饰后形成导电三维网络，将抗原探针6(ACE-2)固定于导电纤维表面，不仅大大提高了蛋白的固定量，而且降低了蛋白的空间位阻，在血清流经电极工作区时即可高效抓取抗体，提高了传感器的灵敏度和最低检测限。

本发明采用竞争法实现血液中中和抗体的检测：待测血液样本首先与抗原蛋白RBD溶液混合进行预反应，如果血液中存在中和抗体，则抗原蛋白RBD将与血液中的中和抗体结合，从而降低了混合液中游离的抗原蛋白RBD浓度。当除去了血细胞的血清和抗原蛋白RBD的混合液经过引流区1，到达反应区2时，血清中未被中和抗体结合的游离抗原蛋白RBD可被固定于工作电极内部的识别分子抗原探针6(ACE-2)捕获，并产生相应的电化学信号。同时由于能与抗原探针6(ACE-2)结合的抗原蛋白RBD的量与血液中的中和抗体浓度呈反比，因此产生的电化学信号反映了中和抗体的浓度。电化学电极产生的电信号经导电带24和输出接口25与外部电路相连接，传输到可视化设备上进行计算显示，便于观察。

吸附区3由吸附区域31和扩展区域32组成，用于承载反应后的物质。当血清与抗原蛋白RBD的混合液到达电极反应区2进行孵化反应结束后，可通过在冲洗区12滴加适量的PBS溶液对电极进行冲洗。冲洗过程中，只有与抗原探针6(ACE-2)结合的抗原蛋白BRD能继续停留在工作电极内部，血清中的其他物质，如干扰蛋白和其他小分子物质，将随着反应结束后PBS溶液的冲洗下继续到达吸附区域31，并在毛细作用下，到达末端的扩展区域32。电极的清洗过程可除去干扰物质对电极信号的影响，提高电极的抗干扰性。

如图3所示为传感器折叠之前的结构，本发明中所述的传感器采用折叠结构，微流控通道和电化学电极可通过丝网印刷工艺在滤纸上一次成型，无需繁琐的加工步骤，大大降低了工艺难度和制作成本，满足大规模生产加工的要求。纸基电极通过丝网印刷工艺批量加工完成之后，可按照相应的功能区通过裁剪、折叠的方法制备出三维微流控沟道，实现液体在电极沟道内的横向和纵向可控流通，完成微流控反应过程中的液体滴加，反应孵育和废液吸附等功能。折叠过程中需注意功能区的上下层对应关系，以保证液体的正确流向。

经折叠后的液体流向示意图如图4所示，血液样本与抗原蛋白(RBD)混合液4首先滴加于滴液区11，在滴液区与血细胞分离后，血清与抗原蛋白RBD的混合液沿着箭头所指的方向，流经微流控通道14和渗透区13，到达反应区2的上部，并在毛细作用下进一步从上至下流入电化学电极区域。通过控制所滴加的溶液的量，可以使孵化过程中液体刚好到达电化学电极区域，而不会到达吸附区域。孵化反应完成后，将PBS冲洗液5滴加于冲洗区12，同样地，在毛细作用下，液体继续沿着纸基微流控通道前进，冲洗液以及反应液从上至下到达吸附区3的吸附区域31，并沿着箭头所指的方向到达扩展区域32。通过控制所滴加的冲洗液的量和吸附区域的大小，可以保证将工作电极内部的干扰物质完全冲洗干净。因此产生的电化学信号只来自于与抗原探针6(ACE-2)结合的抗原蛋白BRD，而与血液中的其他物质无关。本发明通过微流控通道与测试电极的巧妙设计，使整个微流控过程无需外加动力，结构简单，操作便捷。纸基微流控通道不仅可以精确控制整个测试过程所需要的溶液用量，实现微量样品的定量分析，而且吸附区3的存在使得减小反应残留物的感染，方便地实现后续的电极清洗和消除干扰的过程。

在附图和以上描述中详细说明和描述了本发明，但是这些说明和描述应视作说明性或示例性而不是限制性的。本发明不限于所公开的实施例。通过研究附图、说明书和后附权利要求书来实践所主张的发明，本领域技术人员可以理解和实现所公开的实施例的其他变化。

Claims (9)

1.一种适用于全血液的中和抗体电化学传感器，其特征在于，为一体成型的纸纤维基底检测片；所述纸纤维基底检测片包括三个功能区：引流区(1)、反应区(2)和吸附区(3)，且相邻功能区间设有折痕；

所述引流区(1)包括依次排列的滴液区(11)、冲洗区(12)、渗透区(13)和微流控通道(14)，所述滴液区(11)和冲洗区(12)之间、所述冲洗区(12)和渗透区(13)之间通过微流控通道(14)连通；

所述反应区(2)包括微流控电化学电极、导电带(24)和信号输出接口(25)，所述微流控电化学电极包括参比电极(21)、对电极(22)和工作电极(23)；所述参比电极(21)为圆弧状结构，所述对电极(22)为圆弧状结构，且所述参比电极(21)与所述对电极(22)构成一个外圆环；所述工作电极(23)为圆形片状结构，位于所述参比电极(21)与所述对电极(22)的圆环内；所述参比电极(21)、对电极(22)构成的外圆环与所述工作电极(23)间留有间隙；所述导电带(24)包括第一导电带、第二导电带和第三导电带；所述信号输出接口包括第一信号输出接口、第二信号输出接口和第三信号输出接口；所述第一导电带的一端与所述参比电极(21)连接，另一端与所述第一信号输出接口连接；所述第二导电带的一端与所述对电极(22)连接，另一端与所述第二信号输出接口连接；所述第三导电带的一端与所述工作电极(23)连接，另一端与所述第三信号输出接口连接；其中所述工作电极(23)固定有抗原探针；所述抗原探针采用-OH基团修饰的PEDOT:PSS水凝胶固定有能与抗原蛋白特异性结合的生物识别分子构成；

-OH基团修饰的PEDOT:PSS水凝胶和所述工作电极(23)内纸纤维形成导电三维网络；

所述吸附区(3)包括一体成型的吸附区域(31)和扩展区域(32)；

根据折痕进行折叠后，所述渗透区(13)、微流控电化学电极和吸附区域(31)呈上下对齐设置，且所述滴液区(11)、冲洗区(12)、扩展区域(32)均与微流控电化学电极错开；所述微流控电化学电极的上表面与所述渗透区(13)的下表面接触。

2.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述滴液区(11)、冲洗区(12)和渗透区(13)均为圆形结构。

3.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述微流控通道(14)采用长条形结构。

4.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述吸附区域(31)采用圆形结构，所述扩展区域(32)采用长条形结构。

5.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述引流区(1)中非滴液区(11)、冲洗区(12)、渗透区(13)、微流控通道(14)所在区域的上下表面铺设蜡层；所述反应区(2)中非微流控电化学电极所在区域的上下表面铺设蜡层；所述吸附区(3)中非吸附区域和扩展区域所在区域的上下表面铺设蜡层。

6.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述纸纤维基底检测片采用孔径为2～6μm、厚度为700～1200μm的纸纤维。

7.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述纸纤维基底检测片采用丝网印刷工艺制作。

8.根据权利要求1所述传感器，其特征在于所述参比电极(21)、对电极(22)构成的外圆环上开有窗口，所述第三导电带穿过所述窗口与所述工作电极(23)连接。

9.权利要求1-8任一项所述适用于全血液的中和抗体电化学传感器的使用方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

步骤S1：电化学传感器的折叠

将电化学传感器沿着折痕进行折叠，使得所述渗透区(13)、微流控电化学电极和吸附区域(31)呈上下对齐，且所述滴液区(11)、冲洗区(12)、扩展区域(32)均与微流控电化学电极错开；

步骤S2：滴加待测血液样品

将血液样品与抗原蛋白溶液混合，预反应一段时间后滴加至所述滴液区(11)，由于纤维孔径的限制，混合液中的血细胞停留在滴液区(11)，其余部分在纸纤维的毛细作用下，经过微流控通道(14)依次被吸附至所述冲洗区(12)和渗透区(13)，最终进入所述反应区(2)，在微流控电化学电极上孵育一段时间，使混合液中未与中和抗体结合的抗原蛋白与工作电极中的抗原探针充分结合；

步骤S3：PBS冲洗液冲洗

滴加PBS冲洗液至所述冲洗区(12)，在纸纤维的毛细作用下，PBS冲洗液经过微流控通道(14)依次被吸附至所述冲洗区(12)和渗透区(13)，进入所述反应区(2)对所述微流控电化学电极进行清洗，除去干扰物质，然后进入所述吸附区(3)；

步骤S4：电信号结果输出

将输出接口(25)连接至外部电路并施加相应的控制信号，微流控电化学电极产生输出电信号，通过导电带(24)传输至所述输出接口(25)，所述输出接口(25)通过外部电路将输出电信号输出至配备有LED屏幕的信号显示器上，计算输出电信号与中和抗体浓度的对应关系与数值。