CN116784280B - 一种tfrc人源化小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TFRC人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法：(1)构建表达人源化TFRC基因的打靶载体；(2)设计并获得针对小鼠TFRC基因的sgRNA；(3)将打靶载体、sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；(4)F0小鼠与背景鼠配繁获得F1小鼠，筛选出TFRC人源化小鼠模型。本发明构建的TFRC人源化小鼠在肿瘤学、免疫学等领域具有应用价值。

Description

一种TFRC人源化小鼠模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及动物基因工程领域，具体涉及一种TFRC人源化小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

随着CRISPR/Cas9技术的日渐成熟，其应用也越来越广泛，其中最重要的一方面应用就是利用CRISPR/Cas9构建转基因模式动物(主要为基因编辑小鼠)，从而为临床前提供动物层面治疗的基础研究。

人类疾病的发病机制研究以及筛选有效的治疗药物均需要进行大量临床前试验。由于直接利用人细胞及组织进行临床前相关研究受到伦理方面的限制，动物模型就成为人类生物学研究的替代选择。小鼠体积小，易维持与操作，繁殖周期短，与人在基因组和生理学等特征方面相似，并且已经有相应成熟的基因修饰技术，因此成为广泛应用的哺乳动物模式生物系统。目前相当多的疾病有望基于CRISPR/Cas9技术，经过基因编辑动物实验验证，继而应用于人类临床治疗。

TFRC转铁蛋白受体(又称CD71)是一种跨膜蛋白，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。红细胞在分化的终末阶段，红细胞上调转铁蛋白受体(TFRC)基因的表达，以增加铁的同化和血红素的产生。TFRC与细胞表面的转铁蛋白(TF)相互作用形成复合物，通过网格蛋白介导的内吞作用被内化。一旦铁在成熟的内体中释放出来，不含铁的TF-TFRC复合物就会循环到细胞表面，以进行下一轮的铁吸收。TFRC在增殖活跃的细胞中高表达，尤其是肿瘤细胞中，铁的摄取、储存、运输和调节的途径都受到了干扰，肿瘤患者常出现贫血，表明铁代谢与肿瘤细胞生存息息相关。有研究表明，利用抗TFRC单抗可以有效抑制血液系统恶性肿瘤细胞的增殖。另外，由于铁代谢对于机体的生命活动起到很重要的作用，缺乏TFRC会表现出红细胞发育受损及铁代谢异常。因此开发一种TFRC Cas9-KI小鼠模型能够用于评价与TFRC基因相关的各类研究。

在药物研发过程中，小鼠实验模型发挥的重要作用是不可替代的。但是由于种族差异性，小鼠实验筛选的TFRC抑制剂药效可能与人类药效存在差异性。因此，构建TFRC人源化的小鼠模型在筛选评价TFRC靶点药物方面具有较高的应用价值。目前暂未见TFRC人源化小鼠模型构建方法及其在靶点药物应用方面的相关文献报道。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明的第一方面提供一种TFRC人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

(1)构建表达人源化TFRC基因的打靶载体，用于人源化TFRC基因的插入；

(2)设计针对小鼠TFRC基因翻译起始位点的sgRNA，利用体外转录技术获得上述sgRNA；

(3)将步骤(1)构建的打靶载体、步骤(2)获得的sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；

(4)F0小鼠与背景鼠进行繁殖获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出TFRC人源化小鼠模型。

优选的，所述步骤(1)中包括下述步骤：根据人源TFRC的结构及功能，在鼠源TFRC翻译起始密码子(ATG)之后插入人源的TFRC基因及TFRC的3’UTR-polyA，选取的人源TFRC基因氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源TFRC基因氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述步骤(1)中包括下述步骤：选取人源TFRC基因的91-760Aa，利用同源重组的技术替换小鼠TFRC基因的91-763Aa，选取的人源TFRC基因序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述步骤(1)中构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述步骤(2)中sgRNA的基因序列为(a)SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、(b)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8或者(c)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

更优选的，所述步骤(2)中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

优选的，所述步骤(3)中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为BALB/c。

优选的，所述步骤(3)中F0小鼠基因型鉴定使用的5’端鉴定引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，3’端鉴定引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

优选的，所述步骤(3)中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应体系如下：

优选的，所述步骤(3)中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应条件如下：

本发明的第二方面提供上述构建方法得到的小鼠在研究TFRC基因相关功能和作用机制中的应用。

优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。

本发明的第三方面提供上述构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与TFRC基因相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。

本发明的有益效果：

本发明的动物模型设计了切割鼠源TFRC基因的sgRNA，同时设计包含人源TFRC基因、TFRC基因的3’UTR和polyA的Donor，将sgRNA、Donor和Cas9混样，注射到BALB/cJGpt背景小鼠的受精卵中，进行同源重组，获得阳性F0，F0小鼠与BALB/cJGpt小鼠配种获得稳定的遗传阳性F1小鼠模型。本发明构建的动物模型与ES打靶小鼠模型相比，具有高效、快捷、简便、成本便宜等特点，节省了时间及成本。

附图说明

图1是TFRC-KI F0小鼠5’端和3’端基因鉴定结果电泳图；

图2是TFRC-KI F1小鼠5’端和3’端基因鉴定结果电泳图；

图3是BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠骨髓中人源TFRC表达的流式细胞图；

图4是BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠中外周血B细胞和T细胞中比例的流式细胞图；

图5是BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠中外周血NK细胞和巨噬细胞中比例的流式细胞图；

图6是BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠中外周血树突细胞和嗜中性粒细胞中比例的流式细胞图；

图7是BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠中外周血单核细胞和嗜酸性粒细胞中比例的流式细胞图。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

试验例1、TFRC人源化小鼠模型的建立

本发明使用CRISPR/Cas9技术在BALB/c背景的小鼠上用人源TFRC基因替换鼠源TFRC基因，从而构建可以表达人源TFRC的小鼠模型，具体方法如下：

1、确定人源片段替换区域及插入的人源序列

根据TFRC基因的结构及功能，在鼠源TFRC翻译起始密码子(ATG)之后插入人源的TFRC基因及TFRC的3’UTR-polyA，插入片段长度约5.5kb。选取的人源TFRC基因的氨基酸序列(Aa：91-760)为SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源TFRC基因的氨基酸序列(Aa：91-763)为SEQ ID No.2所示。

GVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(SEQ IDNo.1)

RVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF(SEQID No.2)

2、注射获得阳性鼠

1)确定人源片段替换区域及插入的人源序列

根据人源TFRC蛋白胞外功能域及人鼠同源性比较，人源TFRC基因的91-760Aa替换小鼠TFRC基因的91-763Aa，选取的人源TFRC基因替换的序列为SEQ ID No.3所示。

GGGGTAGAACCAAAAACTGAGTGTGAGAGACTGGCAGGAACCGAGTCTCCAGTGAGGGAGGAGCCAGGAGAGGACTTCCCTGCAGCACGTCGCTTATATTGGGATGACCTGAAGAGAAAGTTGTCGGAGAAACTGGACAGCACAGACTTCACCGGCACCATCAAGCTGCTGAATGAAAATTCATATGTCCCTCGTGAGGCTGGATCTCAAAAAGATGAAAATCTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATTTCGTGAATTTAAACTCAGCAAAGTCTGGCGTGATCAACATTTTGTTAAGATTCAGGTCAAAGACAGCGCTCAAAACTCGGTGATCATAGTTGATAAGAACGGTAGACTTGTTTACCTGGTGGAGAATCCTGGGGGTTATGTGGCGTATAGTAAGGCTGCAACAGTTACTGGTAAACTGGTCCATGCTAATTTTGGTACTAAAAAAGATTTTGAGGATTTATACACTCCTGTGAATGGATCTATAGTGATTGTCAGAGCAGGGAAAATCACCTTTGCAGAAAAGGTTGCAAATGCTGAAAGCTTAAATGCAATTGGTGTGTTGATATACATGGACCAGACTAAATTTCCCATTGTTAACGCAGAACTTTCATTCTTTGGACATGCTCATCTGGGGACAGGTGACCCTTACACACCTGGATTCCCTTCCTTCAATCACACTCAGTTTCCACCATCTCGGTCATCAGGATTGCCTAATATACCTGTCCAGACAATCTCCAGAGCTGCTGCAGAAAAGCTGTTTGGGAATATGGAAGGAGACTGTCCCTCTGACTGGAAAACAGACTCTACATGTAGGATGGTAACCTCAGAAAGCAAGAATGTGAAGCTCACTGTGAGCAATGTGCTGAAAGAGATAAAAATTCTTAACATCTTTGGAGTTATTAAAGGCTTTGTAGAACCAGATCACTATGTTGTAGTTGGGGCCCAGAGAGATGCATGGGGCCCTGGAGCTGCAAAATCCGGTGTAGGCACAGCTCTCCTATTGAAACTTGCCCAGATGTTCTCAGATATGGTCTTAAAAGATGGGTTTCAGCCCAGCAGAAGCATTATCTTTGCCAGTTGGAGTGCTGGAGACTTTGGATCGGTTGGTGCCACTGAATGGCTAGAGGGATACCTTTCGTCCCTGCATTTAAAGGCTTTCACTTATATTAATCTGGATAAAGCGGTTCTTGGTACCAGCAACTTCAAGGTTTCTGCCAGCCCACTGTTGTATACGCTTATTGAGAAAACAATGCAAAATGTGAAGCATCCGGTTACTGGGCAATTTCTATATCAGGACAGCAACTGGGCCAGCAAAGTTGAGAAACTCACTTTAGACAATGCTGCTTTCCCTTTCCTTGCATATTCTGGAATCCCAGCAGTTTCTTTCTGTTTTTGCGAGGACACAGATTATCCTTATTTGGGTACCACCATGGACACCTATAAGGAACTGATTGAGAGGATTCCTGAGTTGAACAAAGTGGCACGAGCAGCTGCAGAGGTCGCTGGTCAGTTCGTGATTAAACTAACCCATGATGTTGAATTGAACCTGGACTATGAGAGGTACAACAGCCAACTGCTTTCATTTGTGAGGGATCTGAACCAATACAGAGCAGACATAAAGGAAATGGGCCTGAGTTTACAGTGGCTGTATTCTGCTCGTGGAGACTTCTTCCGTGCTACTTCCAGACTAACAACAGATTTCGGGAATGCTGAGAAAACAGACAGATTTGTCATGAAGAAACTCAATGATCGTGTCATGAGAGTGGAGTATCACTTCCTCTCTCCCTACGTATCTCCAAAAGAGTCTCCTTTCCGACATGTCTTCTGGGGCTCCGGCTCTCACACGCTGCCAGCTTTACTGGAGAACTTGAAACTGCGTAAACAAAATAACGGTGCTTTTAATGAAACGCTGTTCAGAAACCAGTTGGCTCTAGCTACTTGGACTATTCAGGGAGCTGCAAATGCCCTCTCTGGTGACGTTTGGGACATTGACAATGAGTTTTAA(SEQ ID No.3)

2)人源化打靶载体构建

将人源的TFRC基因的91-760Aa的编码序列、鼠的1-90Aa的编码序列及人源TFRC基因的3’UTR构建成融合CDS，并构建成打靶载体，利用同源重组的技术在鼠源TFRC基因的起始位置插入，构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示(KI片段用斜体表示)。

3)sgRNA的构建

(1)合成sgRNA上下游引物，引物纯化方式为PAGE；

(2)sgRNA上下游引物分别稀释至100umol/μl，以1:1的配比混匀，室温自行缓慢退火；

(3)退火形成的双链与Puc57-sgRNA-NEO-Amp(Bsa I)连接1h，转化，涂布Amp+平板；

(4)挑取单克隆，进行PCR鉴定；

(5)PCR阳性的单克隆进一步测序确认，测序引物为pUC57-T7-F；

(6)以测序正确的克隆为模板，然后用引物PCR扩增sgRNA转录的DNA产物；

(7)以sgRNA转录的DNA产物为模板，转录sgRNA并进一步纯化。

4)TFRC人源化小鼠制备的sgRNA筛选

设计并合成了3组sgRNA(Tfrc-S1+Tfrc-S2、Tfrc-S3+Tfrc-S4和Tfrc-S5+Tfrc-S6，具体序列信息见表1)，sgRNA识别位点位于小鼠TFRC基因的起始密码子处。然后将每对sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，分别注射到0.5天的受精卵中，进行培养至囊胚后，通过对小鼠TFRC基因的KO阳性率进行鉴定，以此对sgRNA切割活性进行验证。

sgRNA切割实验鉴定方法：将收集的囊胚进行PCR扩增，PCR的方案如表3-4所示，将扩增的条带进行二代测序，结果与WT条带进行对比，统计发生突变的概率(鉴定的方案如表2所示)。

表1 sgRNA信息及切割效率

5)TFRC人源化小鼠模型建立

将筛选得到的sgRNA(Tfrc-S1+Tfrc-S2)设计并构建携带人源序列的ssDNAdonor，将ssDNAdonor及Cas9/sgRNA系统注射至0.5d的小鼠受精卵中，移植至0.5d假孕雌鼠体内，等小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠(F0)。

6)人源化F0小鼠基因型鉴定

对获得的F0小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用表2所示的两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，PCR反应条件和反应程序如表3和表4所示。引物mTFRC-5tF1/hTFRC-5tR1分别位于5’端同源臂外及ssDNAdonor的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组5’端进行了有效插入；BGH-pA-tF1/mTFRC-3tR1分别位于ssDNAdonor的人源片段内及3’端同源臂外，如该对引物扩增产生PCR引物，说明目标donor在小鼠基因组3’端进行了有效插入。

表2 F0鉴定引物

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

本试验例共注射获得F0小鼠49只，采用上述鉴定方案检测阳性F0小鼠。如图1的PCR电泳结果所示(WT为BALB/cJGpt基因组DNA(阴性对照)；N为negative空白对照(无模板的对照)；M为DNAMarker：TRANS2K PLUS II条带：8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，26#、49#号小鼠TFRC基因5’及3’端鉴定均为阳性，测序无突变，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性小鼠，可尝试进行繁育。

阳性F0小鼠与背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定，F1代小鼠基因鉴定结果见图2所示(①为5’端，②为3’端，③为野生型)，58#、60#、64#小鼠人源TFRC基因5’及3’端鉴定均为阳性，表明获得的小鼠为正确进行基因重组的杂合阳性小鼠。F1小鼠大量扩繁后进行互配，获得纯合子小鼠。

试验例2、BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠中hTFRC表达检测

1、试验方法

流式细胞术实验检测BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合阳性小鼠的骨髓中TFRC蛋白的表达。此外，收集BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合阳性小鼠的外周血，使用流式细胞仪检测检测BALB/c小鼠及BALB/c-hTFRC F1杂合小鼠外周血中T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等免疫细胞的分群。

2、试验结果

如图3所示，杂合BALB/c-hTFRC小鼠检测到人源TFRC表达。此外，野生型和杂合BALB/c-hTFRC小鼠的外周血免疫细胞分群实验结果显示，人源化小鼠的各类免疫细胞亚群比例和野生型小鼠一致(图4-7)，说明小鼠表达人源化TFRC蛋白对于小鼠的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞等免疫细胞亚群的发育没有影响。

上述试验结果表明，本发明通过将小鼠TFRC基因进行人源化基因的替换，成功构建得到BALB/c-hTFRC小鼠模型，预示着该模型在肿瘤学、免疫学等领域的研究中具有广阔的应用前景。

尽管已经对本方法实施步骤进行详细说明，但是对于本领域的技术人员来讲，依然可以在本发明范围内对方法中部分参数及整体方案进行修改。因此，凡在本发明精神和原则范围之内做的更改、替换、调整等行为均应在该发明所涵盖范围内。

Claims (9)

1.一种TFRC人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

（1）构建表达人源化TFRC基因的打靶载体，用于人源化TFRC基因的插入；

（2）设计针对小鼠TFRC基因翻译起始位点的sgRNA，利用体外转录技术获得上述sgRNA；

（3）将步骤（1）构建的打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；

（4）F0小鼠与背景鼠进行繁殖获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出TFRC人源化小鼠模型；

所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源TFRC的结构及功能，在鼠源TFRC翻译起始密码子（ATG）之后插入人源的TFRC基因及TFRC的3’UTR-polyA，选取的人源TFRC基因氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源TFRC基因氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源TFRC基因的91-760Aa，利用同源重组的技术替换小鼠TFRC基因的91-763Aa，选取的人源TFRC基因序列如SEQ ID No.3所示。

3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示。

4. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为（a）SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、（b）SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8或者（c）SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为BALB/c。

7. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的5’端鉴定引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，3’端鉴定引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

8.权利要求1-7任一项所述的TFRC人源化小鼠模型的构建方法得到的小鼠在研究TFRC基因相关功能和作用机制中的应用。

9.权利要求1-7任一项所述的TFRC人源化小鼠模型的构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与TFRC基因相关疾病的药物中的应用。