CN116763899A

CN116763899A - Htra1抑制剂在制备治疗胰腺炎-癌转化的药物中的应用

Info

Publication number: CN116763899A
Application number: CN202310874598.6A
Authority: CN
Inventors: 项红; 尚东; 董得时; 陶旭锋; 郭方悦; 吴昱
Original assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Dalian Medical University
Priority date: 2023-07-17
Filing date: 2023-07-17
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明公开了HTRA1抑制剂在制备治疗胰腺炎‑癌转化的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明通过药物数据库筛选HTRA1抑制剂，采用HTRA1抑制剂处理胰腺癌细胞系及小鼠胰腺炎‑癌转化体内模型，证明了HTRA1抑制剂Carfilzomib在体外能够抑制Panc1细胞的恶性表型；在体内可以抑制雨蛙素刺激的KC小鼠向胰腺导管腺癌转化，本发明为利用HTRA1抑制剂作为治疗胰腺炎‑癌转化的药物提供了依据。

Description

HTRA1抑制剂在制备治疗胰腺炎-癌转化的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及HTRA1抑制剂在制备治疗胰腺炎-癌转化的药物中的应用。

背景技术

胰腺癌(PC)是最致命的胃肠道恶性肿瘤之一，到2030年将成为癌症相关死亡率的第二大原因。胰腺导管腺癌(PDAC)主要起源于胰腺导管上皮和腺泡细胞，占所有PC病例的90％以上。大多数PDAC患者因早期无症状或不典型症状确诊时已属晚期，错失了最佳手术治疗时机。近年来PDAC的放化疗技术不断更新，但现有的临床治疗方案仅能延长患者几个月的生存期，该疾病5年生存率仍低于10％。因此，明确PDAC发病机制对于早期干预具有重要意义。PDAC患者的KRAS突变频率接近100％，且超过95％的癌前病变中存在KRAS突变。尽管KRAS突变是PDAC的重要驱动因素，但在缺乏持续环境应激的情况下，仅凭KRAS突变不足以促进肿瘤发生。胰腺炎是PDAC的独立危险因素之一。腺泡细胞在胰腺炎过程中发生腺泡-导管化生(ADM)，作为胰腺非典型增生的主要形式，ADM在KRAS突变的存在下表现出致癌潜力。因此，靶向阻断持续的炎症刺激对于有效预防KRAS突变诱导的PDAC至关重要。

高温需求因子A1(HTRA1)是人类HTRA丝氨酸蛋白酶家族中第一个被发现的成员。作为一种分泌性蛋白，HTRA1与细胞外基质的降解有关。除了作为肿瘤标志物和/或预后因子，HTRA1还通过调节肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和分化与肿瘤的发生发展密切相关。我们前期研究发现，HTRA1在胰腺炎及ADM过程中高表达。此外，HTRA1蛋白及mRNA水平在胰腺癌组织及细胞中显著上调，敲降HTRA1能够显著抑制体外胰腺癌细胞恶性表型，以及体内抑制胰腺炎-癌转化。因此，HTRA1是抑制胰腺炎诱导PDAC进展的关键靶点。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供了HTRA1抑制剂在制备治疗胰腺炎-癌转化的药物中的应用，本发明基于药物数据库(Drugbank)筛选HTRA1抑制剂，经体内外毒性及药效学评估，最终筛选出1种有效的抑制胰腺炎-癌转化的药物。

本发明目的是通过以下方式实现：

本发明提供HTRA1抑制剂在制备治疗胰腺炎-癌转化的药物中的应用。

基于上述技术方案，进一步地，所述HTRA1抑制剂包括Carfilzomib。

基于上述技术方案，进一步地，所述的药物包括有效量的HTRA1抑制剂和药学上可接受的盐/载体。

基于上述技术方案，进一步地，所述的药学上可接受的盐包括钠盐和钾盐。

基于上述技术方案，进一步地，所述的药学上可接受的载体包括填充剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、乳化剂和无毒副作用的载药载体。

基于上述技术方案，进一步地，所述的药物被制备成药学上允许的剂型，所述的剂型包括片剂、颗粒剂、口服液体制剂、滴剂、注射制剂和胶囊制剂。

基于上述技术方案，进一步地，所述的药物以单剂量药物形式制备。

基于上述技术方案，进一步地，所述的单剂量药物包含1-1000mg HTRA1抑制剂。

基于上述技术方案，进一步地，所述的药物能够减少胰腺肿瘤数量和大小、减少胰腺中高级别PanIN病变、改善胰腺组织中胶原沉积。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

本发明采用HTRA1抑制剂处理胰腺癌细胞系及小鼠胰腺炎-癌转化体内模型，证明了HTRA1抑制剂Carfilzomib在体外能够抑制Panc1细胞的恶性表型；在体内，可以抑制雨蛙素刺激的KC小鼠向胰腺导管腺癌转化，本发明为利用HTRA1抑制剂作为治疗胰腺炎-癌转化的药物提供了依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为HTRA1的三维结构(a)以及筛选获得的4种化合物(b)。

图2为Pipecuronium bromide(a)、Carfilzomib(b)、Succinycholine chloride(c)、Choline chloride(d)的细胞毒性实验结果。

图3为HTRA1抑制剂Carfilzomib的体外药效实验结果，其中，(a)：细胞周期，(b)：细胞凋亡，(c)：肿瘤粘附，(d)：肿瘤迁移，(e)：肿瘤侵袭。

图4为HTRA1抑制剂Carfilzomib的体内药效实验结果，其中，(a)：胰腺组织外观，(b)：HE染色，(c)：阿尔新蓝染色，(d)：天狼星红染色。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

实施例1

HTRA1抑制剂的筛选：

HTRA1的结构从RCSB PDB数据库中下载，PDB ID为3NZI2。MOE v2015.1001中的Dock模块用于基于受体的虚拟筛选(SBVS)。HTRA1蛋白被定义为受体，从Drugbank中选取约2800个获批药物分子作为虚拟筛选库，在HTRA1的残基附近选择受体结合位点，最终选择评分排名前10且适合注射给药的4种化合物(Pipecuronium bromide、Carfilzomib、Succinycholine chloride、Choline chloride)，HTRA1的三维结构以及筛选获得的4种化合物的结构如图1所示。

实施例2

毒性实验：

取对数期生长的Panc1细胞以每孔1×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，设置空白对照组、对照组以及药物组，每组6个复孔，空白对照组为DMEM培养基，对照组以DMEM培养基孵育细胞，药物组分别以含终浓度为10、1、0.1、0.01、0.001μM的化合物1-4的DMEM孵育细胞，孵育细胞24h后，在每孔中加入10μL CCK8溶液，继续培养2h，在450nm处测量各孔的吸光度，筛选出对Panc1细胞有毒性的HTRA1抑制剂。

细胞存活率＝(药物组-空白对照组)/(对照组-空白对照组)×100％

细胞毒性实验结果如图2所示，发现4种抑制剂(Pipecuronium bromide、Carfilzomib、succinycholine chloride、choline chloride)中仅Carfilzomib在≥0.01μM时对Panc1细胞有毒性。

实施例3

药效实验：

1.体外药效验证

1.1细胞凋亡

采用最小的有毒剂量处理细胞24h，接着用0.25％胰蛋白酶消化Panc1细胞，PBS溶液洗涤2次。然后用5μL Annexin V-FITC+5μL PI染色，室温避光孵育15min。使用流式细胞仪分析凋亡结果。

1.2细胞粘附

采用最小的有毒剂量处理Panc1细胞24h，用含0.5mg/mL的Matrigel基质的无血清培养基包被96孔板预处理2h。对照组与药物组细胞浓度调整为5×10⁵/mL，接种100μL/孔至96孔板，孵育3h后，使用CCK8检测贴壁细胞的数量。

1.3细胞周期

采用最小的有毒剂量处理Panc1细胞24h，收集Panc1细胞，用PBS洗涤一次，在75％乙醇中固定，4℃过夜。分析前，再次用PBS洗涤细胞，然后加入10μL DNase A与25μL PI，在37℃避光孵育30min。使用流式细胞仪进行分析。

1.4细胞迁移

培养Panc1细胞，使其在6孔板中的密度到达95％-100％。采用最大无毒剂量处理细胞，用200μL吸管头在每孔细胞留下一个划痕。在划痕后0、24和48h，使用相差显微镜对细胞迁移情况进行拍摄。为细胞迁移的重复成像创造一个参考点，在细胞划痕之前，在孔外的板底部做了一个标记。通过这种方法，可以在所有采样时间内对同一区域进行拍摄。

1.5细胞侵袭

细胞侵袭使用8μm孔径的transwell孔板进行检测。采用最大无毒剂量处理Panc1细胞24h后，将细胞(5×10⁴个)重悬在100μL无血清培养基中加入transwell上室，将800μL含10％胎牛血清的培养基加入transwell下室；24h后，用10％甲醇固定浸润细胞，并用0.1％结晶紫染色。显微镜下拍摄图像，对入侵细胞进行计数。每个transwell上室中加入400μL 33％醋酸洗脱结晶紫。将洗脱液转移到96孔板上，使用酶标仪在590nm处读取吸光值。

2.体内药效验证

将8只KC小鼠按照随机数字表法随机分成2组，每组4只：KC组与KC+药物组，小鼠每周一、三、五，每天四次腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)，KC+药物组每周二尾静脉注射HTRA1抑制剂Carfilzomib，5mg/kg/week；KC组注射生理盐水作为对照。

实验小鼠于开始造模后五周经异氟烷麻醉留取样本，小鼠取仰卧位将头部与四肢分别固定于鼠板上，垫高背部以充分暴露腹主动脉。常规消毒术区，沿腹正中线开腹，取完整胰腺拍照、称重后固定于4％多聚甲醛溶液中，用于组织病理学观察。

组织检测方法如下：

2.1苏木精-伊红染色(Hematoxylin&Eosin,HE)

取出4％多聚甲醛固定的胰腺组织，包埋入石蜡，切成约5μm的组织薄片并固定于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。将石蜡切片依次浸入二甲苯、95％、85％、75％乙醇。切片经HE染色后于光镜下进行组织病理学观察。

2.2阿尔新蓝染色(Alcian blue)

胰腺组织石蜡切片常规脱蜡、水合，石蜡切片经过阿利新蓝染色液染色15min，核固红染液染色3min，再依次浸入无水乙醇，二甲苯透明后，滴加中性树胶封片，于光镜下进行观察。

2.3天狼星红染色(Sirius red)

胰腺组织石蜡切片常规脱蜡、水合，天狼星红染色液滴染30min，再依次浸入无水乙醇，二甲苯透明后，滴加中性树胶封片。于光镜下进行观察。

体外药效实验的结果如图3所示，同对照组相比，HTRA1抑制剂Carfilzomib能够显著降低Panc1细胞处于G0/G1期的百分率，增加细胞处于G2/M期的百分率，这些结果表明HTRA1抑制剂Carfilzomib可以将Panc1细胞的细胞周期阻滞在G2/M期阻(图3a)。同时，HTRA1抑制剂Carfilzomib能够促进Panc1细胞凋亡，抑制其粘附(图3b-c)，HTRA1抑制剂Carfilzomib处理的Panc1细胞的迁移和侵袭能力均明显低于对照组(图3d-e)。

体内药效实验的结果如图4所示，KC小鼠胰腺外观观察显示，HTRA1抑制剂Carfilzomib治疗后肿瘤大小明显减小(图4a)，HE染色和阿尔新蓝染色显示，与未治疗的KC小鼠相比，HTRA1抑制剂Carfilzomib干预后KC小鼠胰腺中高级别PanIN病变明显减少(图4b-c)，此外，天狼星红染色观察到HTRA1抑制剂Carfilzomib干预能够明显减少KC小鼠胰腺组织中的胶原沉积(图4d)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.HTRA1抑制剂在制备治疗胰腺炎-癌转化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述HTRA1抑制剂包括Carfilzomib。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物包括有效量的HTRA1抑制剂和药学上可接受的盐/载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的盐包括钠盐和钾盐。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的载体包括填充剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、乳化剂和无毒副作用的载药载体。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物被制备成药学上允许的剂型，所述的剂型包括片剂、颗粒剂、口服液体制剂、滴剂、注射制剂和胶囊制剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物以单剂量药物形式制备。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的单剂量药物包含1-1000mg HTRA1抑制剂。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物能够减少胰腺肿瘤数量和大小、减少胰腺中高级别PanIN病变、改善胰腺组织中胶原沉积。