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CN116754678B - 一种血液中胰岛素样生长因子检测样本的处理及检测方法 - Google Patents

一种血液中胰岛素样生长因子检测样本的处理及检测方法

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CN116754678B
CN116754678B CN202310730020.3A CN202310730020A CN116754678B CN 116754678 B CN116754678 B CN 116754678B CN 202310730020 A CN202310730020 A CN 202310730020A CN 116754678 B CN116754678 B CN 116754678B
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Hangzhou Durbrain Medical Inspection Laboratory Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种血液中胰岛素样生长因子检测样本的处理及检测方法，样本处理采用0.6％SDS解离剂和沉淀剂对样本进行处理，并采用冰乙腈进一步清洗沉淀以清除SDS，减少SDS对仪器的损伤，采用确定好的色谱和质谱条件进行检测，利用标准曲线得出血液样本中胰岛素样生长因子的含量。本发明方法不需要经过SPE纯化，质谱检测仅需4.5min，对于大样本量的应用场景，极大地节约成本和检测时长。

Description

一种血液中胰岛素样生长因子检测样本的处理及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种血液中胰岛素样生长因子检测样本的处理及检测方法。
背景技术
胰岛素样生长因子(IGF-1)是由70个氨基酸组成的分子量约为7.6k Da的多肽类激素，在生长激素(GH)的刺激下，从肝脏中分泌出来，因此IGF-1常被用作GH激素的补充或替代检测物。在血液中，IGF-1通常与IGF结合蛋白(IGFBPs)结合，以复合体的形式存在。
传统的检测手段主要包括酶联免疫法，检测的灵敏度较低，也容易受到IGF-2等其他类似物的干扰。近年来随着临床质谱的快速发展，质谱法也快速地用于IGF-1的检测。但IGF-1分子量较大，且在血液中以蛋白复合物形式存在，给IGF-1的准确定量带来一定的检测难度。
综合分析目前已有IGF-1的检测方法有如下缺陷和不足：
1、酶联免疫法测定：该检测方法灵敏度较低，对于临床上矮小症儿童的临床诊断，不能准确定量。
2、胰蛋白酶酶切法检测：基于IGF-1分子量较大，需要对其进行酶切处理，最终进行多肽碎片的检测。该质谱测定方法耗费时间较长，一般需要过夜处理。同时，需要胰蛋白酶的处理，检测费用也随之增加。
3、添加解离剂进行完整蛋白检测法：因IGF-1以蛋白复合物的形式存在，需要添加解离剂，目前的解离剂主要包括十二烷基硫酸钠(SDS)、三氟乙醇(TFE)等。这些解离剂对质谱的干扰较大，且极易污染质谱仪，需要对前处理的样本进行SPE纯化处理以去除SDS等，实验的检测成本显著提升。
4、血清中添加IGF-2竞争解离得到完整IGF-1：该方法需要额外加入IGF-2，检测成本提升，且IGF-1的解离效果不好。
发明内容
针对背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种血液中胰岛素样生长因子的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：
本发明的第一方面在于提供一种血液中胰岛素样生长因子检测样本的处理方法，包括以下步骤：
S1、量取待测样本置于洁净的离心管a中，加入与待测样本等体积的0.6％SDS，充分混匀，将溶液离心至离心管底部，37℃孵育20-40min；
S2、加入离心管a内溶液2倍体积的由乙酸、乙腈、丙酮混合组成的沉淀剂，充分混匀，蛋白沉淀1-3min，4℃离心；
S3、吸取上清液置于洁净的离心管b中，加入4.2倍体积的冷乙腈，充分混匀，放置于-20℃冰箱进行蛋白沉淀；
S4、将蛋白沉淀的样本从-20℃冰箱取出4℃离心，去上清液；向沉淀中加入适量的冷乙腈，充分混匀，清洗沉淀和离心管管壁，4℃离心，去上清液，自然晾干；
S5、加入0.1％甲酸水溶液，涡旋震荡，充分溶解即得检测样本。
进一步地，所述沉淀剂按体积比乙酸：乙腈：丙酮＝1：4：15混合。
本发明的第二方面提供了一种基于HPLC-MS/MS的血液中胰岛素样生长因子检测样本的检测方法，包括如下步骤：用IGF-1标准品和空白基质配制设计浓度梯度的标准曲线工作液，利用HPLC-MS/MS对标准曲线工作液进行检测，采用外标定量法，以标准曲线工作液的浓度为X轴，以标准曲线工作液的色谱峰面积为Y轴，建立标准工作曲线；将检测样本注入HPLC-MS/MS进行测定，检测得到的样本色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到检测样本中IGF-1浓度。
进一步地，所述空白基质为2％BSA溶液。
较佳地，所述检测的色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex Kinetex C8柱(50x2.1 mm，2.6μm，100A)；
流动相：A：0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸乙腈溶液；
流速：0.4mL/min；
柱温：55℃；
进样量：15μL
采用梯度洗脱方式，梯度洗脱方式如下：流动相A的体积分数+流动相B的体积分数＝100％；梯度洗脱时间4.5min停止，其中：
0.01-0.5min流动相A的体积分数为95％；
0.5-0.6min流动相A的体积分数由95％下降至80％；
0.6-2min流动相A的体积分数由80％下降至50％；
2-2.1min流动相A的体积分数由50％下降至0％；
2.1-3.1min流动相A的体积分数保持在0％；
3.1-3.2min流动相A的体积分数由0％上升降至95％；
3.2-4.5min流动相A的体积分数保持在95％。
进一步地，所述检测的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度：500℃；离子源雾化气：55psi；离子源加热辅助气：55psi；气帘气：40psi；碰撞气：Medium；扫描模式：MRM，MRM参数为：定量离子：IGF-1_8_y5；Q1(m/z)：956.950；Q3(m/z)：473.500；RT(min)：1.65；DP(V)：100；EP(V)：10；CE(V)：45；CXP(V)：15。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明基于测定人血清中的IGF-1浓度，利用变性剂SDS进行孵育解离IG F-1与其结合蛋白IGFBPs，以得到游离的IGF-1，采用0.6％SDS解离效果更加，质谱检测信号值更高。
(2)本发明方法中利用SDS解离血清中的IGF-1，代替了添加IGF-2的竞争法解离，显著节约检测成本。
(3)本发明方法中采用了与样本量4倍体积的沉淀剂进行蛋白质沉淀后，进一步利用冷乙腈进行两步清洗沉淀以去除SDS，无需使用SPE进行纯化处理，操作简便且节约检测成本，适用于临床样本IGF-1的检测，同时也减少对质谱仪的污染。
(4)质谱检测方法时长短，仅需4.5min，对于大样本量的应用场景，极大地节约检测时长。
附图说明
图1示出了本发明IGF-1质控样的离子流图。
图2示出了IGF-1的标准工作曲线图。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下列实施例中主要使用的仪器、试剂、耗材以及HPLC-MS/MS上机检测条件等如下：
仪器设备
Sciex 5500QT三重四级杆质谱仪(美国，Sciex公司)，包括岛津高效液相色谱系统(日本，Shimadzu Scientific公司)；
KQ-500E超声波清洗器(中国，昆山市超声仪器有限公司)；
1-14KS/3-18KS台式高速冷冻离心机(德国，Sigma)；
EVortex-Genie2涡旋混合器(美国，Scientific Industries Company)；
Cascada I超纯水制备系统(加拿大，颇尔富迪生物分析仪器(上海)有限公司)；
QUINTIX125D-1CN电子天平(德国，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；
MD200-2离心管氮吹浓缩装置(中国，杭州奥盛仪器有限公司)。
试剂和耗材
标准品：胰岛素样生长因子(IGF-1)100μg纯度97％，购自BBI LIFE SCIENCESCORPORATION公司；
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
色谱乙腈购自默克公司(德国)，色谱级甲酸、冰乙酸(上海麦克林生化科技有限公司)、丙酮(上海凌峰化学试剂有限公司)、牛血清白蛋白(Sigma)、十二烷基硫酸钠(SigmaAldrich，美国)；
1.5mL离心管(Axygen，德国)；
300μL 96孔板及密封垫购自Biosepur公司；
实验用到的血浆样本来自于杭州度安医学检验实验室有限公司送检的血清样本。
试剂前期准备
空白基质的配制(2％牛血清白蛋白)：2g BSA配制100mL超纯水中(根据样本量配置BSA的体积，剩余体积可存放在4℃冰箱一周)
解离剂的配置(0.6％十二烷基硫酸钠)：0.6g SDS配制100mL超纯水中(根据样本量配置SDS的体积，剩余体积可存放在4℃冰箱)；
沉淀剂的配制(5％乙酸20％乙腈75％丙酮，V：V：V)：用移液枪准确移取冰乙酸，准确加入量取好的乙腈及丙酮中，充分混匀，备用；
冷乙腈：100％乙腈放入-20℃冰箱，备用。
实施例1
一、检测条件
(1)色谱条件
色谱柱：Phenomenex Kinetex C8柱(50x2.1 mm，2.6μm，100A)
流动相：A：0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸乙腈溶液
流速：0.4mL/min
柱温：55℃
进样量：15μL
采用梯度洗脱方式，洗脱梯度设置如表1所示；
表1IGF-1液相洗脱梯度
Time(min) A(％) B(％)
0.01 95 5
0.5 95 5
0.6 80 20
2.0 50 50
2.1 0 100
3.1 0 100
3.2 95 5
4.5
(2)质谱条件
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度(TEM)：500℃；离子源雾化气(GS1)：55psi；离子源加热辅助气(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：40psi；碰撞气(CAD)：Medium；扫描模式：MRM；MRM参数条件如表2所示。
表2MRM定量检测子离子参数
定量离子 Q1(m/z) Q3(m/z) RT(min) DP(V) EP(V) CE(V) CXP(V)
IGF-1_8_y5 956.950 473.500 1.65 100 10 45 15
上述表格中，IGF-1_8_y5为IGF-1检测样本定量离子；Q1为母离子；Q3为子离子；RT为保留时间；DP为去簇电压；EP为射入电压，CE为碰撞电压；CXP为碰撞室射出电压。
IGF-1的离子流图如图1所示。
二、IGF-1标准曲线
(1)空白基质配制：称量2g牛血清白蛋白，加入100mL超纯水进行溶解混匀，得到2％BSA溶液作为空白基质。
(2)IGF-1母液配制：取纯度为97％的IGF-1标准品100μg，加入97μL水进行溶解，得到IGF-1母液1μg/μL，分装后贮存于-80℃冰箱。
(3)IGF-1标准曲线工作液配制：将IGF-1母液稀释200倍即可得到R0溶液，R0溶液的浓度为5000ng/mL；继续将R0稀释5倍得W0溶液，W0溶液的浓度为1000ng/mL。用空白基质稀释W0溶液配制得到名称为W1-W8的8种不同浓度的标准曲线工作液，标准曲线工作液浓度及配制如表3所示：
表3 IGF-1标准曲线工作溶液浓度
标准曲线工作液名称 浓度(ng/mL) 移取W0体积(μL) 2％BSA(μL)
W1 750 600 200
W2 500 400 400
W3 250 200 600
W4 100 80 720
W5 50 40 760
W6 25 20 780
W7 10 8 792
W8 5 4 796
三、样本处理
S1、采用1.5mL的离心管来进行样品的制备，用移液枪精密量取人血清100μL置于洁净离心管中，加入100μL的解离剂，充分混匀，将溶液离心致离心管底部，37℃孵育30min；
S2、再加入400μL沉淀剂(5％乙酸20％乙腈75％丙酮，V：V：V)，充分混匀，蛋白沉淀2min，4℃条件13000g离心10min(离心机提前预冷)；
S3、吸取上清液350μL置新的2mL离心管中，加入1.5mL提前预冷的乙腈，充分混匀，-20℃冰箱放置1小时进行蛋白沉淀；
S4、将蛋白沉淀的样本从-20℃拿出4℃条件13000g离心10min(离心机提前预冷)弃去上清液；向沉淀中加入500μL的冷乙腈，充分混匀，进行清洗沉淀和离心管管壁，4℃条件13000g离心10min，弃去上清液，自然晾干(尽量避免吸出沉淀)；
S5、用300μL 0.1％甲酸水溶液，涡旋震荡，充分溶解即得检测样本。
四、HPLC-MS/MS检测
处理好的检测样品在HPLC-MS/MS上机检测，每次上样量为15μL，色谱及质谱参数设置如前文所述。
实施例2、3
其他实验条件同实施例1，区别仅在于色谱柱分别选择：Phenomenex Kinetex C18柱(100x2.1 mm，2.6μm)；Phenomenex Kinetex C8柱(50x2.1 mm，2.6μm)。采用相同样本a分别进行两次平行实验，检测结果如下表4所示。
表4色谱柱结果比较
结果显示：通过平行实验，均显示C8柱较C18柱峰面积响应明显增强。
实施例4、5、6、7
其他实验条件同实施例1，区别仅在于解离剂分别用150uL 50％TFE；150uL 100％TFE；100uL 0.6％SDS；100uL 0.3％SDS。采用相同样本b分别进行实验，检测结果如下表5所示。
表5解离剂结果比较
结果显示：TFE的解离效果较差，且对质谱仪也有一定的影响；解离剂0.6％SDS峰面积较其他解离剂更高。
实施例8～13
其他实验条件同实施例1，区别仅在于沉淀剂分别为：400uL 5％乙酸95％已腈；400uL 5％乙酸20％乙腈75％丙酮；400uL 100％乙腈；400uL 25％乙腈75％丙酮；600uL5％乙酸95％乙腈；600uL 5％乙酸20％乙腈75％丙酮。采用相同样本c分别进行实验，检测结果如下表6所示。
表6沉淀剂结果比较
结果显示：采用样本量4倍体积的沉淀剂进行沉淀，沉淀剂体系5％乙酸20％乙腈75％丙酮，样本峰面积最高。
结果：
将实施例1中对配制得到的W1-W8的8个已知IGF-1浓度的标准曲线工作液进行检测，色谱及质谱参数设置如前文所述，采用外标定量法，以标准曲线工作液的浓度为X轴，以标准曲线工作液的色谱峰面积为Y轴，建立标准曲线，得到相应的标准曲线方程为：y＝102.36796x-40.91264(R＝0.99948)，标准曲线图如图2所示。
对实施例1中处理好的检测样品在HPLC-MS/MS上机检测，每次上样量为15μL，最终结果如下表7所示：
表7样本检测结果
样本 样本峰面积 IGF-1浓度(ng/ml)
血清 1.17E+04 114.447
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种基于HPLC-MS/MS的血液中胰岛素样生长因子的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：用IGF-1标准品和空白基质配制设计浓度梯度的标准曲线工作液，利用HPLC-MS/MS对标准曲线工作液进行检测，采用外标定量法，以标准曲线工作液的浓度为X轴，以标准曲线工作液的色谱峰面积为Y轴，建立标准工作曲线；将检测样本注入HPLC-MS/MS进行测定，检测得到的样本色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到检测样本中IGF-1浓度；
所述检测样本的处理方法，包括以下步骤：
S1、量取待测样本置于洁净的离心管a中，加入与待测样本等体积的0.6% SDS，充分混匀，将溶液离心至离心管底部，37℃孵育20-40min；
S2、加入离心管a内溶液2倍体积的由乙酸、乙腈、丙酮混合组成的沉淀剂，充分混匀，蛋白沉淀1-3min，4℃离心；
S3、吸取上清液置于洁净的离心管b中，加入上清液4.2倍体积的冷乙腈，充分混匀，放置于-20℃冰箱进行蛋白沉淀；
S4、将蛋白沉淀的样本从-20℃冰箱取出4℃离心，去上清液；向沉淀中加入适量的冷乙腈，充分混匀，清洗沉淀和离心管管壁，4℃离心，去上清液，自然晾干；
S5、加入0.1%甲酸水溶液，涡旋震荡，充分溶解即得检测样本；
所述沉淀剂按体积比乙酸：乙腈：丙酮=1：4：15混合；
所述检测的色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex Kinetex C8柱，50 x2.1 mm，2.6 μm，100 A；
流动相：A：0.1% 甲酸水溶液；B：0.1% 甲酸 乙腈溶液；
流速：0.4 mL/min；
柱温：55℃；
进样量：15 µL
采用梯度洗脱方式，梯度洗脱方式如下：流动相A的体积分数+流动相B的体积分数=100%；梯度洗脱时间4.5min停止，其中：
0.01-0.5 min流动相A的体积分数为95%；
0.5-0.6 min流动相A的体积分数由95%下降至80%；
0.6-2 min流动相A的体积分数由80%下降至50%；
2-2.1 min流动相A的体积分数由50%下降至0；
2.1-3.1 min流动相A的体积分数保持在0；
3.1-3.2 min流动相A的体积分数由0上升降至95%；
3.2-4.5 min流动相A的体积分数保持在95%。
2.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS的血液中胰岛素样生长因子的检测方法，其特征在于：所述空白基质为2% BSA溶液。
3.根据权利要求1所述的一种基于HPLC-MS/MS的血液中胰岛素样生长因子的检测方法，其特征在于：所述检测的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500 V；离子源温度：500 ℃；离子源雾化气：55 psi；离子源加热辅助气：55 psi；气帘气：40 psi；碰撞气：Medium；扫描模式：MRM，MRM参数为：定量离子：IGF-1_8_y5；Q1：956.950 m/z；Q3：473.500 m/z；RT：1.65 min；DP：100V；EP：10V；CE：45V；CXP：15V。
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