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CN116723867A - 肝脏特异性Wnt信号增强分子及其用途 - Google Patents

肝脏特异性Wnt信号增强分子及其用途 Download PDF

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CN116723867A
CN116723867A CN202180090777.XA CN202180090777A CN116723867A CN 116723867 A CN116723867 A CN 116723867A CN 202180090777 A CN202180090777 A CN 202180090777A CN 116723867 A CN116723867 A CN 116723867A
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CN
China
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liver
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sequence
polypeptide
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Pending
Application number
CN202180090777.XA
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English (en)
Inventor
李阳
张正健
兰德尔·J·布列斯基
伦纳德·普雷斯塔
托马斯·洛佩兹
陈晖�
海琳·巴里博
叶文琛
涂圣江
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Sirozen Opratine
Original Assignee
Sirozen Opratine
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Abstract

本公开内容提供了肝脏特异性Wnt信号增强分子，以及使用这些分子来增加肝脏组织中的Wnt信号传导并治疗肝脏疾病和病症的相关方法。

Description

肝脏特异性Wnt信号增强分子及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年11月16日提交的美国临时申请第63/114,457号，2021年4月30日提交的美国临时申请第63/182,106号和2021年9月24日提交的美国临时申请第63/248,157号的优先权，所述美国临时申请中的每一个出于所有目的以其整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表是以文本格式提供代替纸件副本，并且在此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是SRZN_019_03WO_ST25.txt。文本文件的大小是100KB，在2021年11月11日创建，并且经由EFS-Web以电子方式提交。
发明领域
本公开内容涉及肝脏特异性Wnt信号增强分子，例如融合蛋白，其包含结合E3泛素连接酶、ZNRF3或RNF43的结构域和肝脏特异性细胞表面受体结合结构域；以及使用肝脏特异性Wnt信号增强分子介导E3连接酶ZNRF3/RNF43的肝脏特异性内化或E3连接酶ZNRF3/RNF43的隔离(sequestration)，从而以肝脏特异性方式稳定Wnt受体并增强Wnt信号传导以及治疗和预防多种疾病和病症的相关方法。
发明背景
Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)配体及其信号在许多必需器官和组织(包括骨、肝脏、皮肤、胃、肠、肾脏、中枢神经系统、乳腺、口腔粘膜、味蕾、卵巢、耳蜗和许多其它组织)的发育、体内平衡和再生的控制中起关键作用(例如，由Clevers,Loh和Nusse,2014；346:1248012综述)。Wnt信号传导途径的调节具有治疗退行性疾病和组织损伤的潜力。为了实现该目标，需要开发以肝脏特异性或细胞类型特异性方式调节Wnt信号传导活性的策略以避免不希望的作用。调节作为治疗剂的Wnt信号传导的挑战之一是存在多个Wnt配体和Wnt受体，Frizzled 1-10(Fzd1-10)，许多组织表达多个和重叠的Fzds。规范的Wnt信号还涉及作为共受体的低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)或低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6(LRP6)，除了Fzds之外，它们还在各种组织中广泛表达。
R-脊椎蛋白1-4是放大Wnt信号的配体家族。每种R-脊椎蛋白通过受体复合物起作用，所述受体复合物在一端含有锌和环指3(ZNRF3)或环指蛋白43(RNF43)，以及在另一端含有富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)(例如，由Knight和Hankenson2014,Matrix Biology；37:157-161综述)。R-脊椎蛋白也可以通过另外的作用机制起作用。ZNRF3和RNF43是特异性靶向Wnt受体(Fzd1-10和LRP5或LRP6)用于降解的两种膜结合的E3连接酶。R-脊椎蛋白与ZNRF3/RNF43和LGR4-6的结合导致三元复合物的清除或隔离，其从Wnt受体中去除E3连接酶并稳定Wnt受体，导致增强的Wnt信号。每种R-脊椎蛋白含有两个弗林蛋白酶结构域(1和2)，其中弗林蛋白酶结构域1与ZNRF3/RNF43结合，以及弗林蛋白酶结构域2与LGR4-6结合。含有弗林蛋白酶结构域1和2的R-脊椎蛋白的片段足以放大Wnt信号。尽管R-脊椎蛋白作用依赖于Wnt信号，但由于LGR4-6和ZNRF3/RNF43在各种组织中广泛表达，R-脊椎蛋白的作用不是组织特异性的。
本领域清楚地需要用于治疗和预防特定疾病和病症的肝脏特异性Wnt信号增强分子。本发明通过提供用于以肝脏特异性方式增强Wnt活性的组合物和方法来解决这种需要。
发明内容
本发明涉及肝脏特异性Wnt信号增强分子及其例如在增加靶组织中的Wnt信号传导以及治疗将受益于增加的Wnt信号传导的疾病和病况中的用途。在特定的实施方案中，所述组织是肝脏。
在一个实施方案中，本发明提供了肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域特异性结合选自ZNRF3和RNF43的一种或多种跨膜E3泛素连接酶，所述第二结构域特异性结合肝脏特异性细胞表面分子，其中所述分子增加所述组织中的Wnt信号传导。在某些实施方案中，所述第二结构域特异性结合肝脏特异性细胞表面分子并增加肝脏或肝脏细胞中的Wnt信号传导。在各种实施方案中，所述第一结构域和所述第二结构域中的一个或两个是多肽、抗体、小分子、天然配体、非天然配体或其变体。
在Wnt信号增强分子的特定实施方案中，第一结构域包含第一多肽序列和/或第二结构域包含第二多肽序列。在特定的实施方案中，所述分子包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一多肽序列和第二多肽序列。
在某些实施方案中，第一多肽序列包含R-脊椎蛋白序列或其片段或变体。在特定的实施方案中，R-脊椎蛋白是R-脊椎蛋白-1、R-脊椎蛋白-2、R-脊椎蛋白-3或R-脊椎蛋白-4，例如人R-脊椎蛋白-1-4。在某些实施方案中，第一多肽序列包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1或其片段或变体。在特定的实施方案中，第一多肽序列是野生型R-脊椎蛋白衍生的序列或修饰的序列。此外，与相应的天然全长R-脊椎蛋白相比，第一多肽序列可以具有增加的、类似的或降低的与LGR4-6的结合。在一些实施方案中，R-脊椎蛋白或R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1与SEQ ID NO:29-32或47-50中存在的任何R-脊椎蛋白或R-脊椎蛋白弗林蛋白酶1结构域具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的同一性。在某些实施方案中，第一多肽是特异性结合ZNRF3和/或RNF43的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，第一多肽是抗体或其抗原结合片段，其包含：a)本文所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；和/或b)本文所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，或所述抗体的变体或其抗原结合片段，其包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体在所述CDR序列中包含少于8个氨基酸取代。在特定的实施方案中，第一多肽是抗体或其抗原结合片段，其包含纳米抗体、本文所示的VH或VL序列、或其片段或变体。
在某些实施方案中，第二多肽序列是多肽、抗体或其片段或变体、或配体或其片段或变体。在某些实施方案中，第二多肽是特异性结合ASGR1和/或ASGR2的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，第二多肽是抗体或其抗原结合片段，其包含：a)本文所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；和/或b)本文所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，或所述抗体的变体或其抗原结合片段，其包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体在所述CDR序列中包含少于8个氨基酸取代。在特定的实施方案中，第一多肽是抗体或其抗原结合片段，其包含纳米抗体、本文所示的VH或VL序列、或其片段或变体。
在本文公开的肝脏特异性Wnt信号增强分子的某些说明性实施方案中，所述组织是肝脏组织，以及所述细胞表面受体是去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)、去唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2)、转铁蛋白受体2(TfR2)或溶质载体家族10成员1(SLC10A1)。
在本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子的特定实施方案中，第一结构域和第二结构域通过接头部分连接。在某些实施方案中，接头部分是肽基接头序列。在特定的实施方案中，肽基接头序列包含选自甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸的一个或多个氨基酸。
在特定的实施方案中，本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子由单一多肽组成，例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白。在某些实施方案中，本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子包含两个或更多个多肽，如包含两个或更多个融合蛋白的二聚体或多聚体，每个包含第一结构域和第二结构域，其中所述两个或更多个多肽例如通过接头部分或经由两个或更多个多肽的每一个中的氨基酸残基之间的键，例如，半胱氨酸残基之间的分子间二硫键连接。在特定的实施方案中，本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子包含两个或更多个多肽序列。例如，肝脏特异性Wnt信号增强分子可以包含构成第一结构域或第二结构域的抗体重链和轻链(或其抗原结合片段)，其中另一个结构域(即，第二结构域或第一结构域)作为融合蛋白(例如，直接或通过肽接头)或经由接头部分与抗体重链或轻链连接。在特定的实施方案中，另一个结构域与重链的N-末端、重链的C-末端、轻链的N-末端或轻链的C-末端连接。这种结构在本文中可被称为附加的IgG支架或形式。
在相关的实施方案中，本公开内容提供了肝脏特异性Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)信号增强分子或其药学上可接受的盐，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域特异性结合选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶，所述第二结构域特异性结合去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)，其中：(a)所述第一结构域包含修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体；以及(b)所述第二结构域包含修饰的抗体或其抗原结合片段，其包含：CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；以及CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在某些实施方案中，R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体包含弗林蛋白酶结构域1序列和任选的野生型或突变的弗林蛋白酶结构域2序列或其片段或变体，其中与全长野生型R-脊椎蛋白多肽相比，R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体具有降低的与富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)的结合。在某些实施方案中，R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体在对应于人R-脊椎蛋白2的氨基酸105和109的位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是：(a)F105R、F105A或F105E；以及(b)F109A或F109E。在特定的实施方案中，两个氨基酸取代是：(a)F105R和F109A；(b)F105A和F109A；(c)F105E和F109A；或(d)F105E和F109E。在特定的实施方案中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的组合选自以下：(a)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)、QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；(b)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)、QGESLRSYYAS(SEQ IDNO:37)、YGKANRPS(SEQ ID NO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；或(c)分别为RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQ ID NO:42)、QHFWGTPFT(SEQ ID NO:43)、AYGIN(SEQ ID NO:44)、EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQ ID NO:46)。在某些实施方案中，所述第二结构域包含抗体轻链多肽和抗体重链多肽，并且其中所述第一结构域任选地经由接头部分与抗体重链多肽的N-末端融合。在特定的实施方案中，接头部分是肽基接头序列。在某些实施方案中，接头序列包含选自以下的一个或多个氨基酸：甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子包含两个抗体轻链多肽和两个融合多肽，其中每个融合多肽包含经由接头部分，任选地肽基接头序列与抗体重链多肽的N-末端融合的修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体，其中两个融合多肽彼此连接，以及两个抗体轻链多肽各自与融合多肽的不同重链多肽连接。在特定的实施方案中，所述分子包含：(i)所述两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、14、17、18、19、21、23、25或27中任一个的可变区序列具有至少95％同一性的可变区序列，或其可变区；和/或(ii)所述两个抗体重链多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、15、16、20、22、24、26、28、33或51中任一个的可变区序列具有至少95％同一性的可变区序列，或其可变区。在某些实施方案中，两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、14、15、16、20、22、24、26、28、33或51中的任一个具有至少95％同一性的序列，或其可变区。在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的序列，或其可变区。在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:26具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在另一个相关的实施方案中，本公开内容提供了包含与SEQ ID NO:1-28、33或51中的任一个具有至少95％同一性的序列的多肽，或其可变区，任选地其中所述多肽包含以下CDR组之一：(a)SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)和DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)；(b)QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；(c)QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKANRPS(SEQ IDNO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；(d)RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQID NO:42)和QHFWGTPFT(SEQ ID NO:43)；or(e)AYGIN(SEQ ID NO:44)、EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQ ID NO:46)。在某些实施方案中，所述多肽是融合蛋白，所述融合蛋白包含经由接头部分，任选地肽基接头序列与抗体重链多肽的N-末端融合的修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体，其中所述R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体在对应于人R-脊椎蛋白2的氨基酸105和109的位置处包含两个氨基酸取代。在某些实施方案中，两个氨基酸取代是：(a)F105R、F105A或F105E；以及(b)F109A或F109E。在某些实施方案中，两个氨基酸取代是：(a)F105R和F109A；(b)F105A和F109A；(c)F105E和F109A；或(d)F105E和F109E。在某些实施方案中，抗体重链多肽包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列的组合：(a)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)；或(b)分别为RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQ ID NO:42)、QHFWGTPFT(SEQ ID NO:43)。在特定的实施方案中，所述多肽包含修饰的抗体轻链多肽，在某些实施方案中，所述修饰的抗体轻链多肽包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的组合：(a)分别为QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；(b)分别为QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKANRPS(SEQ ID NO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；或(c)分别为AYGIN(SEQ ID NO:44)、EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQ ID NO:46)。
在另一个相关的实施方案中，本公开内容提供了编码本文公开的任何多肽，如本文公开的抗体轻链多肽或融合多肽，或与SEQ ID NO:1-33或51中的任一个具有至少95％同一性的多肽，或其可变区的核酸序列。在特定的实施方案中，核酸序列是DNA或mRNA。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的核酸序列的载体。在某些实施方案中，载体是包含与核酸序列可操作地连接的启动子序列的表达载体。在某些实施方案中，载体是包含与核酸序列可操作地连接的启动子序列的病毒。
在相关的实施方案中，本公开内容提供了包含本文公开的载体的宿主细胞。在另一个相关的实施方案中，本公开内容提供了用于产生本文公开的抗体轻链多肽或融合多肽的方法，其包括在其中多肽由表达载体表达的条件下培养宿主细胞。在某些实施方案中，所述方法包括分离产生的融合多肽的步骤。
在相关的实施方案中，本公开内容提供了药物组合物，其包含：a)本文公开的分子、本文公开的核酸序列、本文公开的载体或本文公开的宿主细胞；以及b)药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含含有编码本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐的核酸序列的多核苷酸，以及药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。在特定的实施方案中，核酸序列包含DNA或mRNA，任选修饰的mRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含含有编码肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐的核酸序列的载体，以及药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。在特定的实施方案中，载体包含与核酸序列可操作地连接的启动子，其驱动肝脏特异性Wnt信号增强分子的表达。在某些实施方案中，载体是表达载体或病毒载体。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了用于增加肝脏组织中的Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)信号传导的方法，其包括使肝脏组织与以下接触：a)本文公开的Wnt信号增强分子；b)本文公开的核酸；c)本文公开的载体；d)本文公开的宿主细胞；或e)本文公开的药物组合物，其中所述分子结合肝脏组织并隔离肝脏组织中选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶或者增加肝脏组织中选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶的内吞作用。
在相关的实施方案中，本公开内容提供了用于治疗或预防有需要的对象中的肝脏疾病或肝脏病症的方法，其中所述肝脏疾病或肝脏病症与降低的Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)信号传导相关或者将受益于增加的Wnt信号传导，所述方法包括向所述对象施用有效量的：a)本文公开的分子；b)本文公开的核酸；c)本文公开的载体；d)本文公开的宿主细胞；或e)所公开的药物组合物。在特定的实施方案中，所述肝脏疾病或肝脏病症选自：各种原因的急性肝衰竭、药物诱导的急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)、肝性脑病、酒精性肝病、各种原因的慢性肝衰竭、代偿失调肝衰竭、晚期代偿性肝衰竭、肝硬化、各种原因的肝纤维化、门脉高压、各种原因的慢性肝功能不全、终末期肝病(ESLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(脂肪肝)、酒精性肝炎、急性酒精性肝炎(AAH)或重度酒精性肝炎、慢性酒精性肝炎、酒精性肝病(ALD)(也称为酒精相关的肝病(ARLD))、丙型肝炎病毒诱导的肝病(HCV)、乙型肝炎病毒诱导的肝病(HBV)、其它病毒性肝炎(例如甲型肝炎病毒诱导的肝病(HAV)和丁型肝炎病毒诱导的肝病(HDV))、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、有肝病症状的手术、肝损伤、静脉闭塞性疾病(VOD)、窦性阻塞综合征(SOS)、原发性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝移植、肝手术和移植中的“小体积”综合征、先天性肝脏疾病和病症、由于APAP(对乙酰氨基酚)过量导致的肝衰竭、对乙酰氨基酚诱导的肝损伤以及由遗传疾病、变性、衰老、药物或损伤引起的任何其它肝脏疾病或病症。
在某些实施方案中，所述肝脏疾病或肝脏病症选自急性酒精性肝炎、急性肝衰竭(包括但不限于由于对乙酰氨基酚(APAP)过量导致的急性肝衰竭(ALF))、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)、肝性脑病或肝硬化。在某些实施方案中，所述肝脏疾病是酒精性肝炎，例如急性酒精性肝炎或重度酒精性肝炎。在特定的实施方案中，将所述分子、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物经肠胃外、口服、肌内或局部施用至肝脏。在特定的实施方案中，所述对象是哺乳动物，任选地是人。
在相关的实施方案中，本公开内容提供了产生、培养或维持肝脏细胞、肝脏组织或肝脏类器官的方法，其包括使细胞、组织或类器官与以下接触：a)本文公开的分子；b)本文公开的核酸；c)本文公开的载体；d)本文公开的宿主细胞；或e)本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法用于维持离体肝脏组织的活力，其包括任选地通过用包含所述分子的组合物灌注离体肝脏组织而接触从供体获得的肝脏组织。在一些实施方案中，所述方法用于维持肝脏组织的活力，其包括使供体肝脏组织在体内与包含所述分子的组合物接触。在一些实施方案中，所述方法用于产生或维持肝脏类器官培养物，其包括任选地通过在包含所述分子的培养基中培养所述肝脏类器官培养物来接触所述肝脏类器官培养物。
在另一个实施方案中，本发明包括用于增加靶组织中Wnt信号传导的方法，其包括使所述靶组织与本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子接触，其中所述第二结构域特异性结合所述靶组织上的细胞特异性表面分子，并且其中所述肝脏特异性Wnt信号增强分子结合所述靶组织并隔离靶组织中选自ZNRF3和RNF43的一种或多种跨膜E3泛素连接酶或者增加靶组织中选自ZNRF3和RNF43的一种或多种跨膜E3泛素连接酶的内吞作用。
在特定的实施方案中，靶组织或细胞与包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列的多核苷酸，或包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列的载体，例如表达载体或病毒载体接触。
在另一个相关的实施方案中，本发明包括用于治疗或预防有需要的对象中的疾病或病况的方法，其中所述疾病或病况与降低的Wnt信号传导相关或者将受益于增加的Wnt信号传导，所述方法包括向所述对象提供有效量的药物组合物，所述药物组合物包含单独的或与Wnt、Norrin或Wnt活化/模拟分子组合的肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐。在特定的实施方案中，使用药物组合物进行所述方法，所述药物组合物包含含有编码肝脏特异性Wnt信号增强分子(例如，DNA或mRNA)的核酸序列的多核苷酸或包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列的载体(例如，表达载体或病毒载体)。
在本文所述的任何治疗方法的特定实施方案中，所述疾病或病症是选自以下的组织的肝脏疾病或病症：各种原因的急性肝衰竭、药物诱导的急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)、肝性脑病、酒精性肝病、各种原因的慢性肝衰竭、代偿失调肝衰竭、晚期代偿性肝衰竭、肝硬化、各种原因的肝纤维化、门脉高压、各种原因的慢性肝功能不全、终末期肝病(ESLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(脂肪肝)、酒精性肝炎、急性酒精性肝炎(AAH)、慢性酒精性肝炎、酒精性肝病(ALD)(也称为酒精相关的肝病(ARLD))、丙型肝炎病毒诱导的肝病(HCV)、乙型肝炎病毒诱导的肝病(HBV)、其它病毒性肝炎(例如甲型肝炎病毒诱导的肝病(HAV)和丁型肝炎病毒诱导的肝病(HDV))、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、有肝病症状的手术、肝损伤、静脉闭塞性疾病(VOD)、窦性阻塞综合征(SOS)、原发性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝移植、肝手术和移植中的“小体积”综合征、先天性肝脏疾病和病症、由于APAP(对乙酰氨基酚)过量导致的肝衰竭、以及由遗传疾病、变性、衰老、药物或损伤引起的任何其它肝脏疾病或病症。在某些实施方案中，所述肝脏疾病是酒精性肝炎，例如急性酒精性肝炎或重度酒精性肝炎。在本文所述的任何治疗或预防方法的特定实施方案中，所述药物组合物经全身、肠胃外、口服、肌内、局部或外用提供。在特定的实施方案中，所述对象是哺乳动物，任选地是人。
在特定的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或轻链可变区或者重链或轻链，其包含与本文公开的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1-28、33或51)或其片段或变体(例如序列的可变结构域)具有至少90％同一性的氨基酸序列。
附图的简要说明
在所附权利要求中具体阐述了本公开内容的特征。通过参考以下详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用了本发明的原理的说明性实施方案。
图1显示了初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子的轻链可变结构域序列和融合多肽重链可变结构域-RSPO2序列。CDR用下划线标出，并且脱酰胺或异构化风险用粗体标出。针对每个位置显示了为消除风险而进行的各种氨基酸置换。
图2提供了初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子在CDR H2的D62位具有各种氨基酸取代的变体的SEC图谱。
图3提供了初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子在CDR L1的D25位具有各种氨基酸取代的变体的SEC图谱。
图4提供了初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子在CDRL2的N51位具有各种氨基酸取代的变体的SEC图谱。
图5提供了初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子在CDR L3的N88位具有各种氨基酸取代的变体的SEC图谱。
图6显示了在非还原(左图面)或还原(右图面)条件下，与初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子相比，包含所示点突变的Wnt信号传导增强分子的表达和折叠的SDS-PAGE凝胶分析。
图7显示了与初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子相比，包含所示点突变的组合的Wnt信号传导增强分子的表达和折叠的SDS-PAGE凝胶分析(左图面：泳道1＝标志物，泳道2-8分别＝EESY、EEAL、EEAE、EEAH、EEAT、EEAY、EEAR，非还原的，以及泳道9-15分别＝EESY、EEAL、EEAE、EEAH、EEAT、EEAY、EEAR，还原的；右图面：泳道1＝标志物，泳道2-9＝EESN、EEAN、EESL、EESE、EESH、EEST、EESR、EESK)。
图8是总结与初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子(野生型)相比包含所示点突变的组合的Wnt信号传导增强分子的指定测定结果的表。
图9是总结与初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子(野生型)相比包含所示点突变的组合的Wnt信号传导增强分子的ASGR1结合测定结果的表。
图10提供了显示在Huh-7(左图面)和Hek-203(右图面)细胞中包含所示点突变的组合的Wnt信号传导增强分子的STF测定结果的图。
图11提供了显示用媒介物或所示Wnt信号传导增强分子处理的动物中Axin2/ActB表达的图。数据用(左图面)或没有(右图面)每天用力莫敌处理的受伤动物的值表示。
图12是显示从用抗bgal、抗GFP-mutRSPO、EEST-EE Wnt信号传导增强分子(1R34-EEST-EE)或Rspo2(每个组织从左到右)处理的动物分离的各种组织中Axin2表达增加的图。
图13提供了显示在用αGFP-IgG、αASGR1-RSPO2-EEST-EE或αASGR1-RSPO2-EEST-RAWnt信号传导增强分子(从左到右)处理指定时间的动物中所示Wnt靶基因在肝脏中表达增加的图。
图14A显示了在所示时间点在用αGFP-IgG、αASGR1-RSPO2-EEST-EE或αASGR1-RSPO2-EEST-RA(从左到右)处理的动物的肝脏中增殖标志物Ki67的表达增加。
图14B显示了在用所示剂量的αASGR1-RSPO2-EEST-EE或对照处理的动物的肝脏中增殖标志物Ki67的表达增加。
图15提供了在小鼠中以3、10、30、100mg/kg静脉内(IV)或以10或30mg/kg腹膜内(i.p.)施用EEST-EE Wnt信号增强分子后的药代动力学特征。
图16是慢性硫代乙酰胺诱导的小鼠肝脏纤维化模型和测试的各种Wnt信号增强分子的图。
图17A-17C显示了在施用所示量的Wnt信号增强分子EEST-EE或EEST-RA后的INR(图17A)、Axin2(图17B)和CYP2e1mRNA(图17C)。
图18显示了在存在或不存在TAA的情况下，用对照(抗bgal)、EEST-EE或Rspo2处理的动物的肝脏中Ki67的表达。
图19显示了在施用所示量的Wnt信号增强分子、EEST-EE或EEST-RA后的INR(左)、Axin2(中)和CYP2e1 mRNA(右)。
图20显示了在存在或不存在CCl4的情况下，用对照(抗bgal)、EEAT-EE(αASGR1-RSPO2-EEAT-EE或1R34-EEAT/EE)或Rspo2处理的动物的肝脏中Ki67的表达。
图21是显示增殖标志物Ki67在用对照或αASGR1-RSPO2-EEST-EE处理的动物的肝脏中表达的图。
图22是显示增殖标志物Ki67在用对照或αASGR1-RSPO2-EEST-EE处理的动物的小肠中表达的图。
图23是显示在用CCl4处理后用对照(抗GFP)、Rspo2或αASGR1-RSPO2-EEAT-EE处理的动物的纤维化区域的图。
图24是显示在用媒介物、EEST-RA、EEST-EE、8M24-EASE-RA或8M24-EASE-EE处理后ALP表达的图。
图25提供了8M24抗体重链和轻链及其各种人源化形式的可变结构域的序列。
图26A提供了8M24抗体的VH和VL结构域的序列。CDR加下划线，以及被修饰的氨基酸以粗体示出。
图26B显示了在8M24 CDR的每个所示位置进行的各种氨基酸取代。
图27是显示包含在N57处所示点突变的8M24 Wnt信号增强子分子的STF测定结果的图。
图28是总结包含点突变的所示组合的各种8M24 Wnt信号传导增强分子的特征的表。
图29提供了显示用不同剂量的初始8M24-RA Wnt信号增强分子或EEST-EE IgG2形式的Wnt信号增强分子(1R34-EEST/EE IgG2)处理的动物中Axin2、Ccnd和Ki67表达的图。
图30提供了显示用不同剂量的8M24-EASE-RA Wnt信号增强分子或EEST-EE IgG2形式的Wnt信号增强分子(1R34-EEST/EE IgG2)处理的动物中Axin2、Ccnd和Ki67表达的图。
图31提供了EEST-RA(1R34-EEST/RA)、EEST-EE(1R34-EEST/EE)、8M24-EASE-RA或8M24-EASE-EE Wnt信号增强分子在小鼠中的药代动力学特征。
图32显示了终止时肝脏与体重的百分比。统计分析：单向ANOVA(GraphPadPrism)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，误差条：具有SEM的平均值。
图33A-B显示了在测试物品给药开始后第7天和第14天的血清ALP(图33A)和白蛋白(图33B)。
图34显示了通过qPCR测量的Axin2、Ccnd1和Mki67基因的肝脏RNA的表达分析。
图35显示了在CCl4处理后用SZN-043.v2、RSPO2、抗GFP处理的小鼠的肝脏切片或来自仅用橄榄油注射的小鼠的对照切片的免疫荧光染色。用增殖标志物抗Ki67核抗原(绿色)、肝细胞特异性标志物染色，用DAPI(蓝色)染色抗HNF4α(红色)DNA。
图36A-B显示了通过天狼猩红(Picro-Sirius red)染色(图36A)随后使用图像J定量(图36B)测量的纤维化面积百分比。
图37A显示了HuASGR1-CBD:8M24复合物的总体结构。HuASGR1-CBD的分子表面显示为浅灰色透明表面。8M24的重链和轻链分别以深黑色和浅黑色的色调着色。三种结构钙离子显示为深色球体。
图37B显示了HuASGR1-CBD:8M24界面的近视图，标记重链的CDR环H1、H2、H3，轻链的L1、L2和L3的位置。
图38显示了所有四种人R-脊椎蛋白(Rspo1(SEQ ID NO:47)；Rspo2(SEQ ID NO:48)；Rspo3(SEQ ID NO:49)；和Rspo4(SEQ ID NO:50)的比对，其中弗林蛋白酶结构域1(Fu1)和2(Fu2)分别以浅和深阴影着色。Fu1结构域通常对应于：SEQ ID NO:47的约氨基酸残基38-94；SEQ ID NO:48的约氨基酸残基37-93；SEQ ID NO:49的约氨基酸残基39-95；以及SEQ ID NO:50的约氨基酸残基32-88。Fu2结构域通常对应于：SEQ ID NO:47的约氨基酸残基97-144；SEQ ID NO:48的约氨基酸残基96-143；SEQ ID NO:49的约氨基酸残基98-144；以及SEQ ID NO:50的约氨基酸残基91-137。
图39A-C显示了与初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子(NG或“野生型”)相比，包含所示点突变的组合的各种Wnt信号增强分子的结合。图39A是显示来自图39B和39C中的数据的动力学fir参数的表。使用ForteBIO数据分析软件中的二价分析物模型拟合数据。图39B-39C提供了来自使用Octet Red96e，使用在链霉亲和素传感器上捕获的生物素化ASGR1测试结合的各种Wnt信号增强分子的连续稀释液的数据。
图40A-40D显示了Huh-7(图40A和40C)和Hek-293(图40B和40D)细胞中突变的各种组合的STF活性。
图41显示了具有所示氨基酸取代组合的构建体的稳定性。
图42显示了具有所示氨基酸取代组合的构建体的STF活性。
图43提供了显示在所示时间用αGFP-IgG、Nac或αASGR1-RSPO2-EEAT-EE Wnt信号传导增强分子(从左到右)处理的未损伤动物的肝脏或APAP损伤的动物的肝脏中所示Wnt靶基因和细胞色素P450(CYP)代谢酶的表达水平的图。
图44提供了显示在对乙酰氨基酚诱导的肝脏损伤后用所示试剂处理的肝脏的肝细胞中Ki67和HNF4a表达的显微照片。
图45提供了显示在对乙酰氨基酚诱导的肝脏损伤后用所示试剂处理的肝脏的肝细胞中Ki67和CYP2F2表达的显微照片。
图46提供了显示如所示处理的肝脏的组织学的显微照片。显示了抗GFP或Nac处理后的坏死区域。
图47提供了显示在所示时间用αGFP-IgG、Nac或αASGR1-RSPO2-EEAT-EE Wnt信号传导增强分子(从左至右)处理的未损伤动物的肝脏或APAP-损伤的肝脏中ALT、AAST、ALP和AMMN水平的图。
图48是1R34-EEST-EE在慢性酗酒诱导的肝脏损伤的动物模型中对肝脏功能和组织修复的影响的研究图。
图49提供了显示在处理后第0天、第3天或第7天所示Wnt靶基因的表达的图。在第0天，从左到右的柱条对应于配对喂养(pair fed)和EtOH，在第3天以及在第3天和第7天，从左到右的柱条对应于用抗GFP或1R43-EEST-EE处理。
图50提供了显示在处理后第0天、第3天或第7天所示肝增殖标志物的表达的图。在第0天，从左到右的柱条对应于配对喂养和EtOH，在第3天以及在第3天和第7天，从左到右的柱条对应于用抗GFP或1R43-EEST-EE处理。
图51提供了显示Ki67或HNF4A的免疫荧光染色的显微照片。
图52提供了显示在处理后第0天、第3天或第7天所示分子的表达的图。在第0天，从左到右的柱条对应于配对喂养和EtOH，在第3天以及在第3天和第7天，从左到右的柱条对应于用抗GFP或1R43-EEST-EE处理。
图53是显示在处理后第0天、第3天或第7天Lect2和血管生成素的表达的图。在第0天，从左到右的柱条对应于配对喂养和EtOH，在第3天以及在第3天和第7天，从左到右的柱条对应于用抗GFP或1R43-EEST-EE处理。
图54提供了显示在处理后第0天、第3天或第7天炎性标志物、白细胞介素IL1b和IL6的表达的图。在第0天，从左到右的柱条对应于配对喂养和EtOH，在第3天以及在第3天和第7天，从左到右的柱条对应于用抗GFP或1R43-EEST-EE处理。
发明详述
本公开内容提供了肝脏特异性Wnt信号增强分子，其中在某些实施方案中，所述分子：1)选择性地结合肝脏特异性细胞表面受体；2)介导ZNRF3/RNF43在靶向肝脏组织或细胞中的内化或隔离；和/或3)以肝脏特异性方式增强Wnt信号传导。在某些实施方案中，分子是融合蛋白。在某些实施方案中，分子是具有另外附加结合结构域的抗体。还提供了使用本文公开的任何分子和组合物来增强(即增加)肝脏组织或肝脏细胞中的Wnt信号传导，例如用于治疗或预防肝脏疾病或病症的药物组合物和方法。本发明的这些和其它目的、优点和特征对于本领域技术人员来说在阅读如下面更全面描述的组合物和方法的细节后将变得显而易见。
定义
本文所用的“载体”是指包含多核苷酸或与多核苷酸缔合并可用于介导多核苷酸递送至细胞的大分子或大分子的缔合。示例性的载体包括，例如，质粒、病毒载体、脂质体和其它基因递送媒介物。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。本文所用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有说明或需要，本文所述的本发明的作为多核苷酸的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
多核苷酸或多肽(目的序列)与另一种多核苷酸或多肽(参考序列)具有一定百分比的“序列同一性”，意味着当比对时，碱基或氨基酸的百分比在比较两个序列时是相同的。如本领域所理解的，序列同一性是指当序列在比较窗口(例如，每个序列的指定区域)上进行最大对应性比对时获得的同一性百分比，其可以通过本文所述的任何算法使用默认参数来计算，当应用于类似序列时，预期默认参数在大多数情况下产生相同的比对。除非另有说明，否则在参考序列的全长上计算同一性。因此，如果当目的序列与参考序列比对时，目的序列中至少x％(向下取整)的残基被比对为与参考序列中的相应残基精确匹配，则目的序列与参考序列“共有至少x％同一性”。可以在目的序列和/或参考序列中引入缺口，以使比较窗口上的对应性最大化。
序列相似性(即，同一性)可以以多种不同的方式确定。为了确定序列同一性，可以使用方法和计算机程序对序列进行比对，包括通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得，例如，通过全球网在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/BLAST公开获得的BLAST(例如，BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410以及Altschul等人(1997)Nucleic acids Res.25:3389-3402中)，如BLASTP或BLASTN。例如，可以通过使用用于blast两个序列的独立可执行BLAST引擎程序(b12seq)来确定序列同一性，该程序可以使用默认参数从NCBI ftp站点检索(Tatusova和Madden,FEMS MicrobiolLett.1999,174,247-250)。另一种比对算法是FASTA，其可从Madison,Wis.,USA(OxfordMolecular Group,Inc完全拥有的子公司)的遗传学计算组(Genetics Computing Group,GCG)包获得。其它用于比对的技术描述在Methods in Enzymology,vol.266:ComputerMethods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.Doolittle,AcademicPress,Inc.,a division of Harcourt Brace&Co.,San Diego,Calif.,USA中。特别感兴趣的是允许序列中存在缺口的比对程序。Smith-Waterman是一种类型的允许序列比对中存在缺口的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。感兴趣的是使用Smith和Waterman的局部同源算法(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))来确定序列同一性的BestFit程序。空位生成罚分的范围通常为1至5，通常为2至4，并且在许多实施方案中，将是3。空位延伸罚分的范围通常为约0.01至0.20，并且在许多情况下将为0.10。该程序具有由输入的要比较的序列确定的默认参数。序列同一性可以使用程序确定的默认参数来确定。该程序也可从来自Madison,Wis.,USA的遗传学计算组(GCG)包获得。另一个目的程序是FastDB算法。FastDB描述在Current Methods in SequenceComparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,SelectedMethods and Applications,pp.127-149,1988,Alan R.Liss,Inc中。基于以下参数通过FastDB计算序列同一性百分比：错配罚分：1.00；空位罚分：1.00；空位大小罚分：0.33；以及连接罚分：30.0。另一个目的程序是来自uniprot.org的CLUSTAL，并且可以在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/获得。除非有相反地指示，否则使用BLAST算法(例如，bl2seq)和默认参数来确定序列同一性。
应用于多核苷酸的“重组”意指该多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合，以及导致与自然界中发现的多核苷酸不同的构建体的其它方法的产物。
“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能调节，包括多核苷酸的复制(replication)、倍增(duplication)、转录、剪接、翻译或降解。调节可影响该过程的频率、速度或特异性，并且在性质上可以是增强的或抑制的。本领域已知的控制元件包括，例如，转录调节序列如启动子和增强子。启动子是能够在某些条件下结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(3’方向)的编码区转录的DNA区域。
“可操作地连接的(operatively linked)”或“可操作地连接的(operablylinked)”是指遗传元件的并置，其中所述元件处于允许它们以预期方式操作的关系。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接至编码区。在启动子和编码区之间可能存在插入残基，只要保持这种功能关系即可。
“表达载体”是包含编码目的基因产物的区域，并且用于在预期的靶细胞中实现基因产物表达的载体。表达载体还包含可操作地连接到编码区以促进基因产物在靶标中表达的控制元件。控制元件和它们可操作地连接用于表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是本领域已知的和可获得的，或者可以容易地由本领域可获得的组分构建。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。该术语还涵盖已被修饰例如以包括二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记组分缀合的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“抗体”意指分离的或重组的结合剂，其包含特异性结合抗原表位的必需可变区序列。因此，抗体是任何形式的抗体或其片段，其表现出所需的生物活性，例如结合特异性靶抗原。因此，它在最广泛的意义上使用并且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，包括但不限于scFv、Fab和Fab2，只要它们表现出所需的生物活性即可。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体(例如，Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单一的抗原结合位点和残留的“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
所谓“包含”意指所述要素例如在组合物、方法、试剂盒等中是必需的，但是在权利要求的范围内可以包括其它要素以形成例如组合物、方法、试剂盒等。例如，“包含”编码与启动子可操作地连接的治疗性多肽的基因的表达盒是可以包括除基因和启动子之外的其它元件，例如聚腺苷酸化序列、增强子元件、其它基因、接头结构域等的表达盒。
所谓“基本上由……组成”意指将所述的例如组合物、方法、试剂盒等的范围限制于不会实质上影响例如组合物、方法、试剂盒等的基本和新颖特征的指定材料或步骤。例如，基本上由编码与启动子和聚腺苷酸化序列可操作地连接的治疗性多肽的基因组成的表达盒可以包含另外的序列，例如接头序列，只要它们不会实质上影响基因的转录或翻译。作为另一个实例，基本上由所述序列组成的变体或突变体、多肽片段具有所述序列的氨基酸序列加上或减去基于其衍生自的全长天然多肽的所述序列的边界处的约10个氨基酸残基，例如少于所述边界氨基酸残基10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基或者多于所述边界氨基酸残基1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基。
所谓“由……组成”意指排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分的组合物、方法或试剂盒。例如，由所述序列组成的多肽或多肽结构域仅包含所述序列。
本文所用的“表达载体”涵盖如本文讨论的或本领域已知的载体，例如质粒、微环、病毒载体、脂质体等，其包含编码目的基因产物的多核苷酸，并用于在预期的靶细胞中实现基因产物的表达。表达载体还包含可操作地连接到编码区以促进基因产物在靶标中表达的控制元件。控制元件(例如启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等)与它们可操作地连接用于表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”。许多这样的控制元件在本领域中是已知的和可获得的，或者可以容易地由本领域中可获得的组件构成。
本文所用的“启动子”涵盖指导RNA聚合酶结合从而促进RNA合成的DNA序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白或多肽表达可以是普遍存在的，意味着在广泛的细胞、组织和物种或细胞类型特异性、肝脏特异性或物种特异性中具有强活性。启动子可以是“组成型的”，意味着持续活性的或“诱导型的”，意味着启动子可以通过存在或不存在生物或非生物因子而被激活或失活。本发明的核酸构建体或载体还包括增强子序列，其可以与启动子序列邻接或不邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达，并且可以位于天然基因的5’或3’区域。
本文所用的术语“天然的”或“野生型”是指存在于野生型细胞、组织、器官或有机体中的核苷酸序列，例如基因或基因产物，例如RNA或蛋白质。本文所用的术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列，例如天然多核苷酸或多肽序列的突变体，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％的序列同一性。换句话说，变体包含相对于参考多核苷酸序列(例如，天然多核苷酸或多肽序列)的至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。例如，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有50％或更多、60％或更多或者70％或更多序列同一性的多核苷酸，例如与全长天然多核苷酸序列具有75％或80％或更多，如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％同一性的多核苷酸。作为另一个实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更多序列同一性的多肽，例如与全长天然多肽序列具有75％或80％或更多，如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％同一性的多肽。变体还可以包括参考序列(例如天然序列)的变体片段，其与参考序列(例如天然序列)的片段共有70％或更多的序列同一性，如与天然序列具有75％或80％或更多，如85％、90％或95％或更多，例如98％或99％同一性的同一性。
如本文所用，术语“生物活性”和“生物活性的”是指归因于细胞中特定生物元素的活性。例如，R-脊椎蛋白或其片段或变体的“生物活性”是指增强Wnt信号的能力。作为另一个实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或变体进行其天然功能例如结合、酶活性等的能力。作为第三个实例，基因调控元件，例如启动子、增强子、Kozak序列等的生物活性是指调控元件或其功能片段或变体分别调节，即促进、增强或激活其可操作地连接的基因表达的翻译的能力。
本文所用的术语“施用”或“引入”或“提供”是指将组合物递送至细胞，对象的细胞、组织和/或器官或对象。这种施用或引入可以在体内、体外或离体进行。
本文所用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果可以在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的，例如降低疾病或其症状在对象中发生的可能性；和/或可以在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用方面是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物中疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，即部分或完全阻止其发展；或(b)缓解疾病，即引起疾病的消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。其中治疗稳定或减轻患者不希望的临床症状的正在进行的疾病的治疗是特别令人感兴趣的。这种治疗理想地在受影响组织中功能完全丧失之前进行。在疾病的症状性阶段期间，并且在一些情况下在疾病的症状性阶段后，希望施用主题疗法。
术语“个体”、“宿主”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人和非人灵长类动物，包括猿和人；哺乳动物运动动物(例如马)；哺乳动物农场动物(例如绵羊、山羊等)；哺乳动物宠物(狗、猫等)和啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
下面描述了本发明的各种组合物和方法。尽管本文举例说明了特定的组合物和方法，但应理解，许多替代性组合物和方法中的任一种都是适用的，并且适合用于实施本发明。还应当理解，本发明的表达构建体和方法的评价可以使用本领域的程序标准进行。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用细胞生物学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们在本领域技术人员的范围内。这样的技术在文献中有充分的解释，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第二版(Sambrook等人,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait编,1984)；"Animal CellCulture"(R.I.Freshney编,1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Handbook of Experimental Immunology"(D.M.Weir&C.C.Blackwell编)；"Gene TransferVectors for Mammalian Cells"(J.M.Miller&M.P.Calos编,1987)；"Current Protocolsin Molecular Biology"(F.M.Ausubel等人编,1987)；"PCR:The Polymerase ChainReaction",(Mullis等人编,1994)；以及"Current Protocols in Immunology"(J.E.Coligan等人编,1991)，其各自明确地通过引用并入本文中。
下面参考用于说明的示例应用来描述本发明的几个方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，本发明可以在没有一个或多个具体细节的情况下或利用其它方法来实施。本发明不受所示的动作或事件的顺序的限制，因为一些动作可以以不同的顺序发生和/或与其它动作或事件同时发生。此外，并非所有示出的动作或事件都是实现根据本发明的方法所必需的。
本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明。如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。此外，就在详细描述和/或权利要求书中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包括。
术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，“约”可意指给定值的高达20％、高达10％、高达5％或高达1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在数值的数量级内，例如在5倍内或2倍内。当在申请和权利要求中描述特定值时，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意指在该特定值的可接受的误差范围内。
本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。应当理解，本公开内容在存在矛盾的程度上取代了并入的出版物的任何公开内容。
还应注意的是，权利要求书可被草拟为排除任何可选的要素。因此，该陈述旨在用作使用诸如“单独”、“仅”等与权利要求要素的引用有关的排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。
除非另有说明，否则本文所用的所有术语具有与本领域技术人员所理解的相同的含义，并且本发明的实践将采用微生物学和重组DNA技术的常规技术，其在本领域技术人员的知识范围内。
序列
下表(表A)是代表性序列和相关序列标识符编号的列表。CDR以普通字体加下划线。对于每个重链和轻链序列，CDR连续地是CDR1、CDR2和CDR3。接头序列以粗体示出，Rspo2序列以斜体示出。因此，可以基于所提供的序列容易地确定重链和轻链序列及其可变结构域。重链恒定结构域是灰色阴影。在特定的实施方案中，所述序列是存在于所示肝脏特异性Wnt信号增强分子内的多肽序列。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含例如以抗体形式的重链融合蛋白序列中的两个和轻链序列中的两个，其中两个重链融合蛋白序列彼此结合，并且两个轻链序列中的每一个与不同的重链融合蛋白序列结合。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含例如抗体形式的两个重链融合蛋白序列和两个轻链序列，所述两个重链融合蛋白序列包含存在于任何这些序列中的CDR，所述两个轻链序列存在于任何这些序列中，其中两个重链融合蛋白序列彼此结合，并且两个轻链序列中的每一个与不同的重链融合蛋白序列结合。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含例如抗体形式的两个重链融合蛋白序列和两个轻链序列，每个重链融合蛋白序列包含存在于任何这些序列中的CDR，每个轻链序列包含存在于任何这些序列中的CDR，其中两个重链融合蛋白序列彼此结合，并且两个轻链序列中的每一个与不同的重链融合蛋白序列结合。在特定的实施方案中，两个重链融合蛋白序列中的每一个和/或两个轻链序列中的每一个与任何公开的序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性，并且在特定的实施方案中，氨基酸修饰，例如插入、缺失或取代，不存在于CDR中。在特定的实施方案中，氨基酸修饰不发生在(a)F105R、F105A或F105E；和/或(b)F109A或F109E中的任一个处。
表A.代表性肝脏特异性Wnt信号增强分子1R34-DDNN/RA、8M24-v1、1R34-EEST/EE、1R34-EEST/RA、1R34-EEAT/EE、8M24人源化1、8M24人源化2、8M24-EASE-RA、8M24-EASE-EE、1R34-DDNN/RA的序列，其包括抗体形式的所示轻链序列中的两个和所示重链融合序列中的两个，例如双向对称的双特异性分子：(a)其包含与2个Rspo2结构域融合的IgG或由其组成，其中(i)一个(1)Rspo2结构域与IgG的每个重链融合，(ii)IgG的每个臂结合肝脏特异性细胞表面受体结合结构域(例如，ASGR1)；以及(b)其中这样的IgG臂的结合激活下游信号传导。
在特定的实施方案中，序列是存在于所示的肝脏特异性Wnt信号增强分子内的多肽序列，其包含表A所示的任何多肽中的一种或多种或其变体，或其任何组合。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含例如抗体形式的重链融合蛋白序列中的两个和轻链序列中的两个，其中两个重链融合蛋白序列彼此结合，并且两个轻链序列中的每一个与不同的重链融合蛋白序列结合。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含例如抗体形式的两个重链融合蛋白序列和两个轻链序列，所述两个重链融合蛋白序列包含存在于任何这些序列中的CDR，所述两个轻链序列存在于任何这些序列中，其中两个重链融合蛋白序列彼此结合，并且两个轻链序列中的每一个与不同的重链融合蛋白序列结合。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含例如抗体形式的两个重链融合蛋白序列和两个轻链序列，每个重链融合蛋白序列包含存在于任何这些序列中的CDR，每个轻链序列包含存在于任何这些序列中的CDR，其中两个重链融合蛋白序列彼此结合，并且两个轻链序列中的每一个与不同的重链融合蛋白序列结合。在特定的实施方案中，两个重链融合蛋白序列中的每一个和/或两个轻链序列中的每一个是所公开的序列中的任一个的变体，并且与所公开的序列中的任一个具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性，并且在特定的实施方案中，任何氨基酸修饰，例如插入、缺失或取代不存在于CDR内。在特定的实施方案中，氨基酸修饰不发生在(a)F105R、F105A或F105E；和/或(b)F109A或F109E中的任一个处。在特定的实施方案中，重链的变体包含N297G。在特定的实施方案中，变体中存在的RPOS2序列包含F105R和F109A取代。在特定的实施方案中，变体中存在的RPOS2序列包含F105E和F109E取代。在特定的实施方案中，所述分子包含任何以下构建体的与亲本或野生型相比的氨基酸取代：EEST/EE、EEST/RA、EEAT/EE、EESN/RA、EEAN/RA、8M24-EAASE-0RA或8M24-EASE-EE。
肝脏特异性Wnt信号增强分子
在某些方面，本公开内容提供了能够以肝脏特异性方式增强Wnt活性的肝脏特异性Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子是双功能分子，其包含结合一种或多种ZNRF3和/或RNF43连接酶的第一结构域以及结合肝脏组织和/或肝脏细胞的第二结构域。第一结构域和第二结构域中的每一个可以是能够分别结合连接酶复合物或靶组织或细胞的任何部分。例如，第一结构域和第二结构域中的每一个可以是但不限于选自以下的部分：多肽(例如，抗体或其抗原结合片段或不同于抗体的肽或多肽)、小分子和天然配体或其变体、片段或衍生物。在某些实施方案中，天然配体是多肽、小分子、离子、氨基酸、脂质或糖分子。第一结构域和第二结构域可以是彼此相同类型的部分，或者它们可以是不同类型的部分。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子结合肝脏特异性细胞表面受体。在特定的实施方案中，例如，与阴性对照相比，肝脏特异性Wnt信号增强分子在肝脏组织或肝脏细胞中增加或增强Wnt信号至少50％、至少两倍、至少三倍、至少五倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍或至少五十倍。
肝脏特异性Wnt信号增强分子可以具有不同的形式。在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子是融合蛋白，其包含结合ZNRF3/RNF43的第一多肽序列以及结合肝脏组织或肝脏细胞的第二多肽序列。在某些实施方案中，两个多肽序列可以直接融合或经由接头融合。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含两个或更多个多肽，如包含两个或更多个融合蛋白的二聚体或多聚体，每个融合蛋白包含第一结构域和第二结构域，其中两个或更多个多肽例如通过接头部分或经由所述两个或更多个多肽的每一个中的氨基酸残基之间的键，例如半胱氨酸残基之间的分子间二硫键连接。
在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子是包含构成第一结构域或第二结构域的抗体重链和轻链(或其抗原结合片段)的抗体，其中另一个结构域(即，第二结构域或第一结构域)作为融合蛋白或经由接头部分与抗体重链或轻链连接。在特定的实施方案中，另一个结构域与重链的N-末端、重链的C-末端、轻链的N-末端或轻链的C-末端连接。这种结构在本文中可被称为附加的IgG支架。例如，肝脏特异性Wnt信号增强分子可以是结合肝脏特异性细胞表面受体的抗体，其中结合ZNRF3/RNF43的结合结构域与结合组织或细胞特异性受体的抗体的重链或轻链融合或者附加至结合组织或细胞特异性受体的抗体的重链或轻链。在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子是结合ASGR1或ASGR2的抗体或其抗原结合片段，其中结合ZNRF3/RNF43的结合结构域融合或附加到抗体或其抗原结合片段的重链或轻链。在特定的实施方案中，结合ZNRF3/RNF43的结合结构域衍生自Rspo多肽，并且在一些实施方案中，其包含Fu1和Fu2结构域，其中Fu1和Fu2结构域任选地包含一个或多个氨基酸修饰，包括本文公开的那些中的任一个，例如F105R、F105E、F109A或F109E。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含结合ZNRF3/RNF43的第一结构域(“作用模块”)和例如，以高亲和力结合肝脏特异性受体的第二结构域(“靶向模块”)。在某些实施方案中，两个结构域中的每一个在增强Wnt信号本身方面具有显著降低的活性或无活性。然而，当肝脏特异性Wnt信号增强分子与表达肝脏特异性受体的肝脏组织或细胞结合时，E3连接酶ZNRF3/RNF43被募集到具有肝脏特异性受体的三元复合物中，导致它们被隔离，和/或经由受体介导的内吞作用从细胞表面清除。最终结果是以肝脏特异性方式增强Wnt信号。
在某些实施方案中，作用模块是ZNRF3/RNF43 E3连接酶的结合剂，并且其可以基于R-脊椎蛋白设计，所述R-脊椎蛋白例如R-脊椎蛋白-1-4，包括但不限于人R-脊椎蛋白-1-4。在某些实施方案中，作用模块是R-脊椎蛋白，例如野生型R-脊椎蛋白-1-4，任选地人R-脊椎蛋白-1-4或其变体或片段。在特定的实施方案中，它是与相应的野生型R-脊椎蛋白-1-4序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的任何R-脊椎蛋白-1-4的变体。在某些实施方案中，作用模块包含结合ZNRF3/RNF43的R-脊椎蛋白，例如，R-脊椎蛋白1-4中的任一种的弗林蛋白酶结构域1或者由其组成。也可以使用弗林蛋白酶结构域1的延伸形式(包括但不限于不再与LGR4-6结合或具有降低的与LGR4-6的结合的具有突变的弗林蛋白酶结构域2的那些)或工程化抗体或任何其它衍生物或任何工程化多肽，其不同于能够特异性结合ZNRF3/RNF43的抗体。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的一个或多个弗林蛋白酶结构域1。在某些实施方案中，其不包含R-脊椎蛋白的弗林蛋白酶结构域2，或者其包含R-脊椎蛋白的修饰的或变体弗林蛋白酶结构域2，例如，与野生型弗林蛋白酶结构域2相比具有降低的活性的弗林蛋白酶结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的弗林蛋白酶结构域1但不包含弗林蛋白酶结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含两个或更多个弗林蛋白酶结构域1或者弗林蛋白酶结构域1的多聚体。作用结构域可以包含R-脊椎蛋白的一个或多个野生型弗林蛋白酶结构域1。在特定的实施方案中，作用模块包含与野生型弗林蛋白酶结构域1相比具有增加的活性，例如与ZNRF3/RNF43结合的R-脊椎蛋白的修饰的或变体弗林蛋白酶结构域1。与ZNRF3/RNF43结合增加的变体可以例如通过筛选包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1的变体的噬菌体或酵母展示文库来鉴定。还可以通过筛选来鉴定与R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1不相关但与ZNRF3/RNF43结合的肽或多肽。作用模块还可以包含另外的部分或多肽序列，例如另外的氨基酸残基，以稳定作用模块或其中存在的肝脏特异性Wnt信号增强分子的结构。
R-脊椎蛋白能够放大Wnt信号。R-脊椎蛋白的最小功能单元由两个弗林蛋白酶结构域组成，弗林蛋白酶结构域1与ZNRF3/RNF43 E3连接酶结合以及弗林蛋白酶结构域2与LGR4-6结合，将R-脊椎蛋白、LGR和E3连接酶的三元复合物结合在一起。这导致整个复合物的内化和ZNRF3/RNF43移除远离它们的破坏靶标。单独的弗林蛋白酶结构域1没有完全的功能，但它能够与ZNRF3和RNF43结合。
本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子的作用模块可以是但不限于能够结合ZNRF3/RNF43连接酶的任何功能部分，例如多肽或有机化学品。在特定的实施方案中，单独的或与靶向模块一起的作用模块，例如包含R-脊椎蛋白的弗林结构域1的多肽，在非靶组织中基本上是无活性的，以便使潜在的脱靶效应最小化。在肝脏特异性Wnt信号增强分子的上下文中，将作用模块融合至或结合至靶向模块，并且当肝脏特异性Wnt信号增强分子与表达肝脏特异性受体的靶组织结合时，E3连接酶ZNRF3/RNF43被募集至具有肝脏特异性受体的三元复合物，导致它们在细胞表面上被重新定位，被隔离和/或从细胞表面清除。
在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白多肽(例如，R-脊椎蛋白1-4中的任一种)的片段或变体或其功能片段或变体。在特定的实施方案中，作用模块包含野生型R-脊椎蛋白的片段，而在其它实施方案中，作用模块包含含有一个或多个氨基酸修饰的R-脊椎蛋白的片段。R-脊椎蛋白可以是本领域已知的任何R-脊椎蛋白或其同源物，包括来自任何动物物种的R-脊椎蛋白，包括但不限于哺乳动物物种，如人R-脊椎蛋白。已经鉴定和描述了R-脊椎蛋白，并且它们的多肽和编码多核苷酸序列是本领域已知的和可获得的。在特定的实施方案中，R-脊椎蛋白多肽是人R-脊椎蛋白或在其它脊椎动物或非脊椎动物中发现的同系物，例如小鼠R-脊椎蛋白。在图38和SEQ ID NO:47-50中分别提供了人R-脊椎蛋白1、人R-脊椎蛋白2、人R-脊椎蛋白3和人R-脊椎蛋白4及其弗林蛋白酶结构域1的氨基酸序列。它们的同源物和变体可从一般数据库搜索获得，如https://www.dot.ncbi.dot.nlm.dot.nih.dot.gov/protein/。本发明包括(但不限于)作用模块，该作用模块包含这些或其它R-脊椎蛋白中的任一种的片段和变体或者由其组成。在各种实施方案中，与野生型R-脊椎蛋白多肽相比，任何R-脊椎蛋白多肽及其片段的变体包含一个或多个氨基酸修饰，例如缺失、添加或取代。修饰可以存在于R-脊椎蛋白变体或其片段的任何区域，包括但不限于弗林蛋白酶结构域1和/或弗林蛋白酶结构域2。应理解，弗林蛋白酶结构域1或弗林蛋白酶结构域2外的氨基酸修饰可改变所得变体，使得与野生型R-脊椎蛋白或其片段相比，所得变体具有降低的LGR4-6结合活性。
在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白序列，例如全长或野生型R-脊椎蛋白-1、-2、-3或-4，任选地人R-脊椎蛋白-1、-2、-3或-4，或其变体或片段，或者由其组成。在特定的实施方案中，它是与相应的野生型R-脊椎蛋白-1-4序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的任何R-脊椎蛋白-1-4的变体。在某些实施方案中，作用模块包含含有一个或多个氨基酸修饰的全长R-脊椎蛋白(例如，R-脊椎蛋白-1-4中的任一种)或者由其组成，所述氨基酸修饰包括但不限于本文公开的那些中的任一种。在某些实施方案中，作用模块包含野生型或修饰的R-脊椎蛋白(例如，R-脊椎蛋白-1-4中的任一种)的片段或者由其组成。在特定的实施方案中，所述片段能够结合ZNRF3和/或RNF43。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的弗林蛋白酶结构域1、或R-脊椎蛋白的片段或变体。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白(例如R-脊椎蛋白-1-4)的一种或多种(例如一种、两种或三种或更多种)弗林蛋白酶结构域1，或其与R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的变体，或者由其组成。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶1结构域或其变体或片段和R-脊椎蛋白弗林蛋白酶2结构域或其变体或片段。在某些实施方案中，作用模块包含结合ZNRF3/RNF43的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，作用模块特异性地结合ZNRF3或RNF43。
在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白，例如，人R-脊椎蛋白1或人R-脊椎蛋白2或其变体的一个或多个弗林蛋白酶结构域1。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的一个或多个弗林蛋白酶结构域1，但它不包含R-脊椎蛋白的弗林蛋白酶结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白的一个或多个弗林蛋白酶结构域1，并且其包含R-脊椎蛋白的修饰的或变体弗林蛋白酶结构域2，例如，与野生型弗林蛋白酶结构域2相比具有降低的活性的弗林蛋白酶结构域2。在某些实施方案中，作用模块包含具有R-脊椎蛋白的修饰的或变体弗林蛋白酶结构域2，例如，与野生型弗林蛋白酶结构域2相比具有降低的活性的弗林蛋白酶结构域2的R-脊椎蛋白。在某些实施方案中，作用模块包含两个或更多个弗林蛋白酶结构域1或其变体或弗林蛋白酶结构域1的多聚体或其变体。在某些实施方案中，作用模块包含变体R-脊椎蛋白弗林蛋白酶1结构域，其包含例如在对应于人R-脊椎蛋白2的K58、H76、S77、R86和/或N91的氨基酸残基处的一个或多个点突变。在某些实施方案中，作用模块包含变体R-脊椎蛋白弗林蛋白酶2结构域，其包含例如在对应于人R-脊椎蛋白2的F105、F109和/或K121的氨基酸残基处的一个或多个点突变。在特定的实施方案中，作用模块包含与野生型弗林蛋白酶结构域1相比具有增加的活性，例如与ZNRF3/RNF43结合的R-脊椎蛋白的修饰的或变体弗林蛋白酶结构域1。作用模块还可以包含另外的部分或多肽序列，例如另外的氨基酸残基，以稳定作用模块或其中存在的肝脏特异性Wnt信号增强分子的结构。在某些实施方案中，作用模块包含与R-脊椎蛋白没有明显/强序列同源性但与ZNRF3/RNF43的结合亲和力可比得上或高于R-脊椎蛋白与ZNRF3/RNF43的结合亲和力的肽或多肽。
在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白多肽(例如，人R-脊椎蛋白)的弗林蛋白酶结构域1或其功能片段或变体和R-脊椎蛋白多肽(例如，人R-脊椎蛋白)的修饰的或变体弗林蛋白酶结构域2，其中与相应的野生型弗林蛋白酶结构域2相比，修饰的弗林蛋白酶结构域2对LGR4-6具有降低的结合亲和力。在某些实施方案中，弗林蛋白酶结构域2包含例如在对应于人R-脊椎蛋白2的F105和/或F109的氨基酸残基处的一个或多个点突变。本领域技术人员可以通过将它们的氨基酸序列与人R-脊椎蛋白2进行比较来容易地确定其它R-脊椎蛋白多肽中的相应氨基酸残基。在某些实施方案中，作用模块包含弗林蛋白酶结构域1或其变体和弗林蛋白酶结构域2或其变体，其中弗林蛋白酶结构域1和/或弗林蛋白酶结构域2包含一个或多个点突变。作用模块内的一个或多个点突变(与相应的野生型R-脊椎蛋白序列相比)可以发生在弗林蛋白酶结构域1和/或弗林蛋白酶结构域2内的任何氨基酸残基上，包括但不限于例如氨基酸残基K58、H76、S77、R86、N91、F105、F109或K121和可以被修饰以降低对LGR4-6的结合亲和力的其它残基。已经鉴定了对于其功能活性重要的人R-脊椎蛋白1的弗林蛋白酶结构域1和弗林蛋白酶结构域2的区域，包括保守的亲水性残基S48、N51、R66、R70和Q71，以及对于结合E3连接酶重要的保守程度较低的疏水性残基L46、L54、I62和L64。此外，在人R-脊椎蛋白1弗林蛋白酶结构域1中，氨基酸残基K59、S78、D85、R87、N88和N92与LGR5形成亲水性相互作用表面，并且FSHNF氨基酸序列已经被鉴定为对于疏水性表面重要的环。在特定的实施方案中，包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1和/或弗林蛋白酶结构域2的作用模块可以在任何这些区域、表面或氨基酸残基内包含一个或多个突变。
在特定的实施方案中，包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1和/或弗林蛋白酶结构域2的作用模块可以包含这些区域、表面或氨基酸残基以外的一个或多个突变或其它替代，其通过影响结合表面的结构和/或稳定性而间接损害LGR4-6结合。
在某些实施方案中，包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1和/或弗林蛋白酶结构域2的作用模块可以包含在任何氨基酸残基处的一个或多个突变，包括但不限于所附实施例中描绘的那些中的任一个。在特定的实施方案中，作用模块包含修饰的弗林蛋白酶结构域2，其包含在氨基酸残基F105和/或F109处的氨基酸取代。在特定的实施方案中，作用模块包含弗林蛋白酶1结构域和修饰的弗林蛋白酶结构域2，其包含在氨基酸残基F105和/或F109处的氨基酸取代。在特定的实施方案中，作用模块包含修饰的弗林蛋白酶1结构域和修饰的弗林蛋白酶2结构域，其中在某些实施方案中，修饰的弗林蛋白酶1结构域包含在氨基酸R65、R69和/或Q70处的一个或多个氨基酸修饰，并且修饰的弗林蛋白酶结构域包含在氨基酸F105和/或F109处的一个或多个氨基酸修饰。在某些实施方案中，修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体在对应于人R-脊椎蛋白2的氨基酸F105和F109的位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，两个氨基酸取代包括：(a)F105R、F105A或F105E；以及(b)F109A或F109E。在特定的实施方案中，两个氨基酸取代是：(a)F105R和F109A；(b)F105A和F109A；(c)F105E和F109A；或(d)F105E和F109E。在某些实施方案中，修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体与SEQ ID NO:29-32中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在某些实施方案中，修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体与SEQ ID NO：29-32中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且包含氨基酸取代的以下组合之一：(a)F105R和F109A；(b)F105A和F109A；(c)F105E和F109A；或(d)F105E和F109E。在特定的实施方案中，例如在全长R-脊椎蛋白的上下文中，修饰的弗林蛋白酶结构域2对LGR4-6的结合亲和力小于80％、小于50％、小于20％或小于10％的相应野生型弗林蛋白酶结构域2的结合。
在某些实施方案中，作用模块包含R-脊椎蛋白多肽(例如，人R-脊椎蛋白)的弗林蛋白酶结构域1或其功能片段或变体和R-脊椎蛋白多肽(例如，人R-脊椎蛋白)的未修饰的弗林蛋白酶结构域2。尽管在某些实施方案中，与相应的野生型弗林蛋白酶结构域2相比对LGR4-6具有降低的结合亲和力的修饰的弗林蛋白酶结构域2更希望增加组织靶向的特异性，但在特定的实施方案中，与靶向模块组合的未修饰的弗林蛋白酶结构域2与没有靶向模块的野生型R-脊椎蛋白相比具有改善的组织靶向，并且在某些环境中具有实用性。
在某些实施方案中，作用模块包含例如来自R-脊椎蛋白-1、-2、-3、-4，任选地人R-脊椎蛋白-1、-2、-3或-4中任一种的野生型或修饰的R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1。在特定的实施方案中，作用模块包含例如来自R-脊椎蛋白-1、-2、-3、-4，任选地人R-脊椎蛋白-1、-2、-3或-4中任一种的R-脊椎蛋白弗林蛋白酶1结构域和野生型或修饰的R-脊椎蛋白弗林蛋白酶2结构域。在特定的实施方案中，作用模块包含例如来自R-脊椎蛋白-1、-2、-3、-4，任选地人R-脊椎蛋白-1、-2、-3或-4中任一种的第一R-脊椎蛋白弗林蛋白酶1结构域和第二野生型或修饰的R-脊椎蛋白弗林蛋白酶1结构域。在特定的实施方案中，例如在全长R-脊椎蛋白的上下文中，修饰的弗林蛋白酶结构域2对LGR4-6的结合亲和力与相应的野生型弗林蛋白酶结构域2的结合相当，或者对LGR4-6的结合亲和力小于80％、小于50％、小于20％或小于10％的相应野生型弗林蛋白酶结构域2结合的结合亲和力。
在某些实施方案中，作用模块包含特异性结合ZNRF3和/或RNF43的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，作用模块包含抗体或其抗原结合片段，其结合人RNF43(hRNF43,NCBI参考序列XP_011523257.1，残基44-198)或人ZNRF3(hZNRF3，NCBI参考序列NP_001193927.1，残基56-219)。在特定的实施方案中，作用模块是抗体或其抗原结合片段，其包含纳米抗体、VH或VL序列或其片段或变体。
在某些实施方案中，靶向模块特异性结合肝脏特异性表面分子，例如肝脏特异性表面受体，并且可以是例如天然配体、抗体或合成化学品。在特定的实施方案中，肝脏特异性表面分子优先在肝脏器官、肝脏组织和/或肝脏细胞上表达。在特定的实施方案中，与一种或多种其它非靶向器官、组织或细胞类型相比，肝脏特异性表面分子在肝脏组织或肝脏细胞上具有增加或增强的表达。在某些实施方案中，与一种或多种其它器官、组织或细胞类型相比，肝脏特异性表面分子优先分别在肝脏器官、肝脏组织或肝脏细胞的表面上表达。例如，在特定的实施方案中，如果细胞表面受体在肝脏器官、组织或细胞中的水平表达分别比其在一个或多个、五个或更多个所有其它器官、组织或细胞或者所有其它器官、组织或细胞的平均值中的表达高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍，则细胞表面受体被认为是肝脏特异性的或肝脏特异性的细胞表面分子。在某些实施方案中，肝脏特异性的或肝脏特异性的细胞表面分子是细胞表面受体，例如包含位于细胞表面膜内的区域和靶向模块可结合的细胞外区域的多肽受体。在各种实施方案中，本文所述的方法可通过特异性靶向仅在肝脏组织或包括肝脏组织的组织子集上表达的细胞表面分子，或者通过特异性靶向与所有、大多数或大量数目的其他组织相比在肝脏组织上具有较高表达水平的细胞表面分子，例如，在肝脏组织上的表达高于至少两个、至少五个、至少十个或至少二十个其它组织来实施。
肝脏特异性细胞表面受体是本领域已知的。肝脏特异性表面受体的实例包括但不限于ASGR1、ASGR2、TFR2和SLC10A1。用于肝脏递送的另外受体描述于例如Yan等人，TumorBiology,2015；36:55-67。
在某些实施方案中，靶向模块包含特异性结合ASGR1和/或ASGR2的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，靶向模块包含抗体或其抗原结合片段，其包含：a)本文所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；和/或b)本文所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；或所述抗体或其抗原结合片段的变体，其包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体包含在所述CDR序列中的少于8个氨基酸取代(例如，少于7个、少于6个、少于5个、少于4个、少于3个或少于2个)。在某些实施方案中，靶向模块包含含有SEQ ID NO:34、35和36的CDR的抗体重链可变结构域以及含有SEQ ID NO:37、38和39的CDR的抗体轻链可变结构域。在某些实施方案中，靶向模块包含含有SEQ ID NO:34、35和36的CDR的抗体重链可变结构域以及含有SEQ ID NO:37、40和39的CDR的抗体轻链可变结构域。在某些实施方案中，靶向模块包含含有SEQ IDNO:41、42和43的CDR的抗体轻链可变结构域以及含有SEQ ID NO:44、45和46的CDR的抗体重链可变结构域。
如本文所用，如果与一种或多种其它细胞或组织类型或者任何其它细胞或组织类型相比，肝脏细胞或肝脏组织上存在更大量的分子，则细胞表面分子被认为是肝脏特异性的。在某些实施方案中，与一种或多种其它细胞或组织类型或者任何其它细胞或组织类型中的量相比，更大量是至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。例如，在特定的实施方案中，如果细胞表面受体在靶器官、组织或细胞中的水平表达分别比其在一个或多个、五个或更多个所有其它器官、组织或细胞或者所有其它器官、组织或细胞的平均值中的表达高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍，则细胞表面受体被认为是肝脏特异性的或肝脏特异性的细胞表面分子。在某些实施方案中，肝脏特异性的或细胞特异性的细胞表面分子是细胞表面受体，例如包含位于细胞表面膜内的区域和靶向模块可结合的细胞外区域的多肽受体。
在特定的实施方案中，靶向模块结合肝脏特异性表面分子。与各肝脏特异性表面分子结合的靶向模块可以是但不限于抗体或其抗原结合片段、肽、组织或细胞特异性受体的天然配体或它们的衍生物和合成小分子等。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子结合特定的肝脏细胞类型，例如与靶组织相关的特定细胞类型。例如，在肝脏组织中，靶向模块可以结合肝细胞、肝细胞的前体和干细胞、胆道细胞和/或内皮或其它血管细胞。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)由ASGR1和ASGR2组成(例如由Stockert,Morell和Ashwell,1991,Targeted Diagnostics and Therapy4:41-64综述)。该受体是一种跨膜蛋白，其通过介导具有暴露的末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白的内吞作用和溶酶体降解而在血清糖蛋白体内平衡中起关键作用。因此，AGPR的天然和合成配体包括但不限于半乳糖基化胆碱酯酶，半乳糖(Gal)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，含有GalNAc的分子如GalNAc终止糖蛋白和含有单糖、寡糖或多糖的分子或纳米颗粒(例如，由D’Souza和Devarajan 2015,Journal of Controlled Release,203:126-139综述)。
在各种实施方案中，肝脏特异性表面分子是肝脏特异性细胞表面受体。对于肝脏，这些包括但不限于ASGR1和ASGR2。在特定的实施方案中，靶向模块结合人ASGR1(hASGR1；NCBI参考序列NP_001662.1，残基62-291)、人ASGR2(hASGR2；NCBI参考序列NP_550436.1，残基66-292)，猕猴ASGR1(cynoASGR1，序列ID XP_005582755.1，残基62-291)或猕猴ASGR2(cynoASGR2)。
在某些实施方案中，靶向模块包含抗体或其抗原结合片段，其包含本文所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；和/或本文所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；或所述抗体或其抗原结合片段的变体，其包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体包含在所述CDR序列中少于8个氨基酸取代。在特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区、轻链可变区、纳米抗体或scFv序列，其包含与本文公开的序列(例如SEQ ID NO:1-24或29中的任一个公开的序列)具有至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，靶向模块包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、15、16、20、22、24、26、28、33或51中任一个所示的可变重链结构域具有至少90％或至少95％同一性的可变重链区。在特定的实施方案中，靶向模块包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、14、17、18、19、21、23、25或27中任一个所示的可变轻链结构域具有至少90％或至少95％同一性的可变轻链区。在特定的实施方案中，靶向模块包含与SEQ ID NO:2、6、8、10、12、22、26、33或51中任一个所示的重链具有至少90％或至少95％同一性的重链。在特定的实施方案中，靶向模块包含与SEQ ID NO:1、5、7、9、11、21或25中任一个所示的轻链具有至少90％或至少95％同一性的轻链。在特定的实施方案中，轻链和/或重链的恒定区是IgG1或IgG2。
在某些实施方案中，Wnt信号增强分子包含融合蛋白，例如包含与作用结构域融合的靶向结构域的抗体重链或轻链的融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白的两个区域(例如，靶向结构域区域和作用结构域)经由接头部分融合。在某些实施方案中，接头由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。在特定的实施方案中，接头在长度上包含1个至多达约40个氨基酸残基、1个至多达约20个氨基酸残基或1个至约10个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头中的氨基酸残基选自二十个标准的氨基酸，以及在某些实施方案中，选自半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和/或丝氨酸。在某些实施方案中，接头包含一个或多个非天然氨基酸。在一些实施方案中，肽基接头由空间不受阻的大多数氨基酸组成，如通过肽键连接的甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。某些接头包括聚甘氨酸、聚丝氨酸和聚丙氨酸或任何这些的组合。一些示例性肽基接头是聚(Gly)1-8，特别是(Gly)3、(Gly)4(SEQ ID NO:55)、(Gly)5(SEQ ID NO:56)和(Gly)7(SEQ ID NO:57)，以及聚(Gly)4Ser(SEQ ID NO:58)、聚(Gly-Ala)2-4和聚(Ala)1-8。肽基接头的其它具体实例包括(Gly)5Lys(SEQ ID NO:59)和(Gly)5LysArg(SEQ ID NO:60)。为了解释上述命名法，例如，(Gly)3Lys(Gly)4意指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:61)。Gly和Ala的其它组合也是有用的。另外，肽基连接基还可以包含非肽基区段，如式--CH2--CH2--CH2--CH2--CH2--CH2--的6碳脂族分子。肽基接头可被改变以形成如本文所述的衍生物。在特定的实施方案中，接头是在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、20、22、24、26或28中任一个中鉴定的那些中的任一个。
示例性的非肽基接头包括，例如，烷基接头，如--NH--(CH2)s--C(O)--，其中s＝2-20。这些烷基接头还可以被任何非空间阻碍基团取代，如低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。本发明的物质组合物的非肽部分，如非肽基接头或非肽半衰期延长部分可以通过常规的有机化学反应合成。可用于连接结合结构域的化学基团包括氨基甲酸酯；酰胺(胺加羧酸)；酯(醇加羧酸)、硫醚(卤代烷加巯基；马来酰亚胺加巯基)、席夫碱(胺加醛)、脲(胺加异氰酸酯)、硫脲(胺加异硫氰酸酯)、磺酰胺(胺加磺酰氯)、二硫化物；腙、脂质等，如本领域已知的。
结构域之间的连接可以包含间隔基，例如烷基间隔基，其可以是直链或支链的，通常是直链的，并且可以包括一个或多个不饱和键；通常具有1至约300个碳原子；更通常约1-25个碳原子；并且可以是约3至12个碳原子。这种类型的间隔基还可以包含杂原子或官能团，包括胺、醚、磷酸二酯等。感兴趣的具体结构包括：(CH2CH2O)n，其中n为1至约12；(CH2CH2NH)n，其中n为1至约12；[(CH2)n(C＝O)NH(CH2)m]z，其中n和m为1至约6，并且z为1至约10；[(CH2)nOPO3(CH2)m]z，其中n和m为1至约6，并且z为1至约10。这种接头可以包括聚乙二醇，其可以是直链或支链的。
在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐包含特异性结合选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶的第一结构域以及特异性结合去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)和/或去唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2)的第二结构域，其中：(a)所述第一结构域包含Rspo序列或其片段或变体；和/或(b)所述第二结构域包含抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)本文所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；和/或(ii)本文所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，或所述抗体或其抗原结合片段的变体，其包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体包含在所述CDR序列中少于8个氨基酸取代。在特定的实施方案中，其包含与SEQ ID NO:1-29中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的多肽。在特定的实施方案中，多肽包含在SEQ ID NO:1-46或51的任一个中鉴定的CDR序列或本文公开的任何其它序列。
“特异性结合”特定细胞表面多肽或受体或者“对特定细胞表面多肽或受体具有特异性的”作用模块或靶向模块，例如抗体或其抗原结合片段，是结合该特定多肽或受体而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的模块。在一些实施方案中，当在约4℃、25℃、37℃或42℃的温度下测量时，本公开内容的作用模块和靶向模块分别特异性结合ZNRF3/RNF43或肝脏特异性细胞表面分子(例如受体)，解离常数(Kd)等于或低于1000nM、等于或低于100nM、等于或低于10nM、等于或低于1nM，等于或低于0.5nM、等于或低于0.1nM、等于或低于0.01nM、等于或低于0.005nM、等于或低于0.001nM或者等于或低于0.0005nM。粘合剂(例如抗体)的亲和力可以使用常规技术，例如，由Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949)描述的那些，ELISA测定，生物层干涉(BLI)测定和表面等离子体共振(SPR)测定容易地确定。抗体与其抗原、细胞或组织的结合特性通常可以使用免疫检测方法来确定和评估，所述免疫检测方法包括例如基于免疫荧光的测定，如免疫组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS)。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子的作用模块和/或靶向模块是多肽，而在其它实施方案中，肝脏特异性Wnt信号传导分子的作用模块和/或靶向模块是小的有机分子。在某些实施方案中，作用模块和靶向模块都是多肽，例如抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子的作用模块和靶向模块彼此共价结合。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强融合分子的作用模块和靶向模块彼此非共价结合。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子的作用模块和靶向模块存在于同一融合蛋白内。在其它实施方案中，作用模块存在于进一步包含第一结合结构域的第一多肽中，并且靶向模块存在于进一步包含第二结合结构域的第二多肽中，其中第一和第二结合结构域彼此结合。在一些实施方案中，第一和第二结合结构域是相同的或其变体，诸如，例如Fc多肽。在一些实施方案中，第一和第二结合结构域彼此不同。在特定的实施方案中，本发明包括本文所述的任何靶向模块或作用模块的片段或变体(包括参考分子的功能片段或变体)的用途。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子(例如，融合蛋白)具有选自以下的式：R1-L-R2和R2-L-R1，其中R1是结合ZNRF3/RNF43的作用模块，R2是结合肝脏特异性细胞表面受体的靶向模块，并且L是接头，并且其中L可以不存在或存在。R1和R2中的每一个可以分别是本文所述的各种作用模块和靶向模块中的任一个。R1和R2中的每一个可以是能够分别与一种或多种E3连接酶(ZNRF3或RNF43)或靶组织或细胞结合的任何部分。例如，R1和R2中的每一个可以是但不限于选自以下的部分：多肽(例如，抗体或其抗原结合片段或不同于抗体的肽或多肽)，小分子和天然配体或其变体、片段或衍生物。在某些实施方案中，天然配体是多肽、小分子、离子、氨基酸、脂质或糖分子。作用模块和靶向模块(即R1和R2)可以是彼此相同类型的部分，或者它们可以是不同类型的部分。在特定的实施方案中，R2是抗体或其抗原结合片段，并且在某些实施方案中，R2包含Fc蛋白或其类似物。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含单个分子(例如多肽)，而在其它实施方案中，Wnt信号增强融合分子包含彼此结合的两个或更多个分子(例如多肽)，例如彼此非共价结合。例如，在一个实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强融合物包含分别具有式R3-L1和R4-L2的两个分子，其中R3是作用模块，R4是靶向模块，并且其中L1和L2基团彼此结合，例如以形成二聚体。在各种实施方案中，L1和L2基团彼此相同或彼此不同。L1或L2基团的一个实例是Fc序列，例如鼠Fc2b或人Fc1，其各自是本领域已知的。R3和R4中的每一个可以分别是本文所述的各种作用模块和靶向模块中的任一个。R3和R4中的每一个可以是能够分别与一种或多种E3连接酶(ZNRF3和/或RNF43)或靶组织或细胞结合的任何部分。
在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含结合一种或多种E3连接酶(ZNRF3和/或RNF43)的抗体或其结合片段，其中抗体重链和/或抗体轻链包含结合靶组织或细胞的附加结合结构域。
在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含结合靶组织或细胞的抗体或其一个或多个结合片段，其中抗体重链和/或抗体轻链包含结合一种或多种E3连接酶(ZNRF3和/或RNF43)的附加结合结构域。附加的结合结构域可以直接融合到抗体的N-末端或C-末端，例如作为重链或轻链融合蛋白，或者它可以经由接头部分附加到重链或轻链，例如附加到重链或轻链的N-末端、C-末端或内部氨基酸。在某些实施方案中，抗体是IgG，例如IgG1或IgG2。在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含四个多肽，其包括两个抗体轻链和两个抗体重链，其中一个或多个抗体重链和/或抗体轻链还包含结合一种或多种E3连接酶(ZNRF3和/或RNF43)的附加结合结构域，如本文公开的Rspo2变体。在特定的实施方案中，附加的结合结构域经由接头(如本文公开的任一种)与抗体重链和/或轻链(或其结合片段)中的一个或两个连接。在某些实施方案中，两个抗体重链经由一个或多个二硫键连接，并且每个抗体轻链经由一个或多个二硫键与不同的抗体重链连接。在特定的实施方案中，抗体样Wnt信号增强分子中的每个轻链是相同的。在特定的实施方案中，抗体样Wnt信号增强分子中的每个重链是相同的。在特定的实施方案中，抗体样Wnt信号增强分子中的每个轻链是不同的。在特定的实施方案中，抗体样Wnt信号增强分子中的每个重链是不同的。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含两个不同的轻链和/或两个不同的重链，它们各自结合不同的肝脏特异性细胞表面分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含两个不同的轻链和/或两个不同的重链，它们各自结合不同的E3连接酶。在各种实施方案中，结合结构域附加至重链或轻链，在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含特异性结合肝脏特异性细胞表面分子(例如ASGR1或ASGR2)的抗体的两个抗体轻链和两个抗体重链，其中结合一种或多种E3连接酶(ZNRF3和/或RNF43)的结合结构域附加至两个抗体重链的N-末端。在特定的实施方案中，结合一种或多种E3连接酶的结合结构域是Rspo或其片段或变体。在某些实施方案中，Rspo与SEQ ID NO:29-32或SEQ ID NO:47-50中的任一个或其片段具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含表A中公开的两种重链融合蛋白和两种轻链融合蛋白，例如，肝脏特异性Wnt信号增强分子是1R34-DDNN/RA、8M24-v1、1R34-EEST/EE、1R34-EEST/RA、1R34-EEAT/EE、8M24人源化1、8M24人源化2、8M24-EASE-RA、8M24-EASE-EE或1R34-DDNN/RA。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子或其药学上可接受的盐包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域特异性结合选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶，所述第二结构域特异性结合去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)，其中：
(a)所述第一结构域包含修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体；以及
(b)所述第二结构域包含修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段包含：CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；以及CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。
在特定的实施方案中，所述第二结构域包含两个修饰的抗体轻链和两个修饰的抗体重链，其中所述第一结构域附加到每个抗体重链的N-末端。因此，在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含衍生自与ASGR1结合的抗体的两个修饰的抗体轻链和两个融合蛋白，每个融合蛋白包含衍生自与ASGR1结合的抗体的修饰的抗体重链和任选地经由接头部分与其N-末端融合的R-脊椎蛋白多肽(或其片段)。在特定的实施方案中，R-脊椎蛋白多肽是修饰的R-脊椎蛋白多肽，例如修饰的Rspo-2多肽，与野生型人Rspo-2相比，其包含一个或多个氨基酸修饰。
在某些实施方案中，修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体在对应于人R-脊椎蛋白2的氨基酸F105和F109的位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，两个氨基酸取代包含：(a)F105R、F105A或F105E；以及(b)F109A或F109E。在特定的实施方案中，两个氨基酸取代是：(a)F105R和F109A；(b)F105A和F109A；(c)F105E和F109A；或(d)F105E和F109E。在某些实施方案中，修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体与以下中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
在特定的实施方案中，衍生自与ASGR1结合的抗体的修饰的抗体重链经由接头部分(包括本文公开的那些中的任一个)与修饰的R-脊椎蛋白多肽融合。在特定的实施方案中，接头部分是包含或具有以下序列的肽基接头：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:62)。
在特定的实施方案中，修饰的重链可变区包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、14、15、16、20、22、24、26、28、33或51中的任一个具有至少90％或至少95％同一性的序列。在特定的实施方案中，修饰的轻链可变区包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、14、17、18、19、21、23、25或27中的任一个具有至少90％或至少95％同一性的序列。在特定的实施方案中，氨基酸修饰，例如插入、缺失或取代，不存在于CDR中。在特定的实施方案中，氨基酸修饰不发生在(a)F105R、F105A或F105E；和/或(b)F109A或F109E中的任一个处。
在特定的实施方案中，修饰的重链包含与SEQ ID NO:2、6、8、10、12、22、26或33中的任一个具有至少90％或至少95％同一性的序列，或其包含重链序列或重链可变结构域序列的片段(例如，不存在RSPO2和接头序列)。在特定的实施方案中，修饰的轻链包含与SEQID NO:1、5、7、9、11、21或25中的任一个具有至少90％或至少95％同一性的序列。在特定的实施方案中，氨基酸修饰，例如插入、缺失或取代，不存在于CDR中。在特定的实施方案中，氨基酸修饰不发生在(a)F105R、F105A或F105E；和/或(b)F109A或F109E中的任一个处。在特定的实施方案中，重链的变体包含N297G。在特定的实施方案中，变体中存在的RPOS2序列包含F105R和F109A取代。在特定的实施方案中，变体中存在的RPOS2序列包含F105E和F109E取代。在特定的实施方案中，与亲本或野生型相比，所述分子包含任何以下构建体的氨基酸取代：EEST/EE、EEST/RA、EEAT/EE、EESN/RA、EEAN/RA、8M24-EAASE-RA或8M24-EASE-EE。
在特定的实施方案中，两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、14、15、16、20、22、24、26、28、33或51中的任一个具有至少95％同一性的序列。
在某些实施方案中，修饰的重链和修饰的轻链序列衍生自包含以下重链和轻链序列的抗ASGR1抗体或者与以下重链和轻链序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性(CDR加下划线示出)：
轻链：
重链：
在特定的实施方案中，轻链包含在选自D25、N51和N88(上文粗体所示)的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代。在特定的实施方案中，所有三个位置都被取代。在某些实施方案中，D25被E取代。在某些实施方案中，N51被S或A取代。在某些实施方案中，N88被T取代。在一个实施方案中，D25被E取代，N51被S取代，以及N88被T(EST)取代。在一个实施方案中，D25被E取代，N51被A取代，以及N88被T(EAT)取代。在特定的实施方案中，本文公开的任何Wnt信号增强分子包含与SEQ ID NO:1的可变结构域具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变结构域，任选地还包含在选自D25、N51和N88的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代，包括上文公开的任何取代。
在特定的实施方案中，重链包含在D62(上文粗体所示)处的氨基酸取代。在某些实施方案中，D62被E(E)取代。在特定的实施方案中，本文公开的任何Wnt信号增强分子包含与SEQ ID NO:33的可变结构域具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的重链可变结构域，任选地还包含在D62处的氨基酸取代，包括上文公开的任何取代。
在特定的实施方案中，分子的修饰的抗体部分(或其可变结构域)包含以下氨基酸取代的组合：(a)在重链中，D62被E取代；以及(b)在轻链中，D25被E取代，N51被S取代，以及N88被T(EEST)取代。在特定的实施方案中，分子的修饰的抗体部分(或其可变结构域)包含以下氨基酸取代基的组合：(a)在重链中，D62被E取代；以及(b)在轻链中，D25被E取代，N51被A取代，以及N88被T(EEAT)取代。
因此，在某些实施方案中，分子的修饰的抗ASGR1抗体部分包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的以下组合中的任一种：
(a)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)、QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；或
(b)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)、QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKANRPS(SEQ ID NO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)。
在某些实施方案中，分子的修饰的抗ASGR1抗体部分包含VH和VL结构域，其包含在亲本序列的背景下CDR的这些组合中的任一种，或者与VH或VL结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的变体。在特定的实施方案中，本文公开的任何变体在其CDR序列中不包含任何另外的氨基酸修饰(除本文所述的那些以外)。
在特定的实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:1、5、7、9、11、21、25中的任一个具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在特定的实施方案中，两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、14、15、16、20、22、24、26、28、33或51中的任一个具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在某些实施方案中，修饰的重链和修饰的轻链序列衍生自包含以下重链和轻链序列的8M24抗ASGR1抗体或与以下重链和轻链序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性(CDR加划线示出)：
轻链：
重链：
在特定的实施方案中，轻链包含在氨基酸位置D56(上文粗体所示)处的氨基酸取代。在某些实施方案中，D56被E、S或A取代。在特定的实施方案中，D56被E(E)取代。在特定的实施方案中，本文公开的任何Wnt信号增强分子包含与SEQ ID NO:5的可变结构域具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变结构域，任选地还包含在D56处的氨基酸取代，包括上文公开的任何取代。
在特定的实施方案中，重链包含在选自N31、N57或D102(上文粗体所示)的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代。在特定的实施方案中，所有三个位置都被取代。在某些实施方案中，N31被A或Q取代。在某些实施方案中，N57被S、A或N取代。在某些实施方案中，D102被E、S或A取代。在一个实施方案中，N31被A取代，N57被S取代，以及D102被E(ASE)取代。在特定的实施方案中，N31被A取代，N57被S取代，D102被E取代，以及D110未被取代(ASED)。在特定的实施方案中，本文公开的任何Wnt信号增强分子包含与SEQ ID NO:20、22或51中的任一个的可变结构域具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的重链可变结构域，任选地还包含在选自N31、N57或D102的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代，包括上文公开的任何取代。
在特定的实施方案中，分子的修饰的抗体部分包含以下氨基酸取代的组合：(a)在轻链中，D56被E取代；以及(b)在重链中，N31被A取代，N57被S取代，D102被E取代，以及D110未被取代(EASE)。
因此，在某些实施方案中，分子的修饰的抗ASGR1抗体部分包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的以下组合：
(c)分别为RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQ ID NO:42)、QHFWGTPFT(SEQ ID NO:43)、AYGIN(SEQ ID NO:44),EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQ ID NO:46)。
在某些实施方案中，分子的修饰的抗ASGR1抗体部分包含VH和VL结构域，其包含在亲本序列的背景下CDR的这些组合中的任一种，或者与VH或VL结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的变体。在特定的实施方案中，变体在其CDR序列中不包含任何另外的氨基酸修饰(除本文所述的那些以外)。
在某些实施方案中，两个抗体轻链多肽或其可变结构域包含与SEQ ID NO:3、5、14、17、18、19、21或25中的任一个具有至少90％或至少95％同一性的序列，或其可变区。在某些实施方案中，两个融合多肽或抗体重链多肽或其可变结构域各自包含与SEQ ID NO:4、6、13、15、16、20、22或26中的任一个具有至少90％或至少95％同一性的序列，或其可变区。在特定的实施方案中，两个抗体轻链多肽各自包含与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及两个融合多肽各自包含与SEQ ID NO:26具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
在某些实施方案中，轻链多肽包含序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAAINLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPFTFGQGTKLEIK(SEQID NO:25)，其中所述CDR序列加下划线；以及在某些实施方案中，重链融合多肽包含序列：
其中Rspo2结构域以斜体示出，接头以粗体示出，以及CDR序列加下划线。在相关的实施方案中，用E和E代替以粗体显示的R和A。
应理解，Wnt信号增强分子可以包含作用模块和靶向模块的各种组合。因此，任何变体抗ASGR1抗体序列(或其片段)可以与各种其它作用模块(包括但不限于本文公开的任一种)组合。
本公开内容还提供了包含本文公开的任何轻链或融合多肽的多肽和包含与本文公开的任何轻链或融合多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列的多肽以及其功能或结合片段，例如VH或VL结构域。本领域技术人员可以基于在序列表中提供的信息，并通过将这些序列与本文公开的其它序列进行比较而容易地确定本文公开的任何多肽的轻链区。
在某些实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子(例如，融合蛋白)增加与融合蛋白接触的肝脏组织或肝脏细胞中的Wnt信号传导。在特定的实施方案中，肝脏组织或肝脏细胞中的Wnt信号传导增加至少50％、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少十倍。
肝脏特异性Wnt信号增强分子可以通过本领域已知和可获得的有机合成和分子生物学的标准方法产生。例如，肝脏特异性Wnt信号增强融合蛋白可以通过将靶向模块(例如，结合ASGR1或ASGR2的抗体或其抗原结合片段)与作用模块(例如，单独的人R-脊椎蛋白2弗林蛋白酶结构域1，对应于氨基酸残基N37-R95；或者人R-脊椎蛋白2弗林蛋白酶结构域1，随后是弗林蛋白酶结构域2，其中弗林蛋白酶结构域2与LGR蛋白的相互作用被点突变，例如F105A和F109A，单独或组合消除或损害)融合而产生。在某些实施方案中，靶向模块和作用模块通过接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)与位于肝脏特异性Wnt信号增强分子的N-末端的任一结构域融合。在某些实施方案中，靶向模块和作用模块通过蛋白质接头(例如白蛋白)融合。将靶向模块与作用模块“融合”的另外方式包括但不限于，例如，“knob-in-hole”或亮氨酸拉链介导的二聚化。可以对编码靶向模块、作用模块(和任选的接头)的DNA序列进行基因工程改造以编码所需的融合蛋白。
对于肝脏特异性Wnt信号增强分子及其结构域(例如融合分子、抗体重链和轻链)，可以使用标准分子克隆技术将编码融合蛋白不同部分的DNA序列插入细菌或真核表达载体，并在适当的宿主细胞中表达。使用蛋白质科学中的标准技术，如亲和力、离子交换和尺寸排阻色谱法，可以将表达的蛋白质纯化至均一。本公开内容还包括本文所述的任何多肽作用模块、靶向模块和融合蛋白的功能片段和变体，包括与本文所述的作用模块、靶向模块或融合蛋白具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％多肽序列同一性的变体。与本文公开的任何序列相比，这样的变体可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个氨基酸缺失、插入或取代。在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强融合蛋白的功能片段和变体与它们所来源的肝脏特异性Wnt信号增强融合蛋白相比具有至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多的Wnt信号增强活性。在某些实施方案中，多肽作用模块的功能片段和变体与它们所来源的作用模块相比(当在整个肝脏特异性Wnt信号增强分子的上下文中测量时)具有至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多的Wnt信号增强活性。在某些实施方案中，靶向模块的功能片段和变体与它们所来源的靶向模块相比具有至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或更多的结合活性。
本公开内容还包括编码一种或多种肝脏特异性Wnt信号增强分子或其组分，例如本文所述的蛋白质、融合蛋白或其变体的多核苷酸或核酸序列，包含这些多核苷酸的载体(包括表达载体)以及包含这些载体的细胞。在某些实施方案中，多核苷酸或核酸序列是DNA或RNA。在特定的实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)。在某些实施方案中，RNA是包含一种或多种修饰的核苷的修饰的mRNA。包含一种或多种修饰的核苷的修饰的mRNA已经被描述为具有优于未修饰的mRNA的优点，包括增加稳定性、更高的表达水平和降低的免疫原性。根据本发明可以使用的修饰的mRNA的非限制性实例描述于例如PCT专利申请公开号WO2011/130624、WO2012/138453、WO2013052523、WO2013151666、WO2013/071047、WO2013/078199、WO2012045075、WO2014081507、WO2014093924、WO2014164253、美国专利号:US 8,278,036(描述了包含假尿苷的修饰的mRNA)、US 8,691,966(描述了包含假尿苷和/或N1-甲基假尿苷的修饰的mRNA)、US 8,835,108(描述了包含5-甲基胞苷的修饰的mRNA)、US 8,748,089(描述了包含假尿苷或1-甲基假尿苷的修饰的mRNA)。在特定的实施方案中，与未修饰的A、G、U或C核糖核苷相比，编码肝脏特异性Wnt信号增强多肽的修饰的mRNA序列包含至少一个修饰。在特定的实施方案中，至少一种修饰的核苷包括N1-甲基假尿苷和/或5-甲基胞苷。在特定的实施方案中，修饰的mRNA包含5’末端帽序列，随后是编码肝脏特异性Wnt信号增强多肽的序列，随后是3’加尾序列，如polyA或polyA-G序列。
在特定的实施方案中，多核苷酸是载体，例如表达载体，并且表达载体包含编码本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强融合分子(例如融合蛋白或者附加抗体的一条或两条链)的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与启动子序列，例如驱动多核苷酸在细胞中表达的启动子序列可操作地连接。在某些实施方案中，载体是病毒载体，例如包含多核苷酸的病毒，所述多核苷酸包含表达盒，所述表达盒包含与编码肝脏特异性Wnt信号增强多肽的DNA或RNA序列可操作地连接的启动子。在特定的实施方案中，表达盒包含5’和/或3’细胞或病毒UTR或其衍生物。
本公开内容还包括本文所述的多核苷酸的功能片段和变体，其包括与本文所述的多核苷酸具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％多核苷酸序列同一性的变体。与本文公开的任何序列相比，这样的变体可以包含一个或多个核苷酸或核苷修饰，例如一个或多个核苷酸缺失、插入或取代。在特定的实施方案中，本文所述的多核苷酸是密码子优化的，例如以增强所编码的多肽在宿主细胞中的表达。在特定的实施方案中，多核苷酸变体包含一个或多个修饰的核苷酸或核苷。
本公开内容还包括包含多核苷酸或载体的细胞，所述多核苷酸或载体编码本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子，例如融合蛋白或其部分或结构域。在某些实施方案中，细胞是宿主细胞，诸如例如HEK293细胞，其可用于产生肝脏特异性Wnt信号增强融合蛋白。在制备主题组合物中，可以使用任何宿主细胞，包括但不限于例如哺乳动物细胞(例如293细胞)、昆虫细胞(例如SF9细胞)、微生物和酵母。在某些实施方案中，细胞对于用本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强多肽治疗的对象来说是异源的或自体的。在特定的实施方案中，从对象获得细胞，并用本文所述的病毒载体转导。在特定的实施方案中，将转导的细胞递送至对象进行治疗。
本公开内容还包括药物组合物，其包含一种或多种肝脏特异性Wnt信号增强分子(例如融合蛋白或基于抗体的构建体)，或者包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子或其部分的序列的一种或多种多核苷酸或载体。
Wnt信号传导可以使用本领域已知和可获得的技术和测定来测量。在某些实施方案中，使用对应于靶组织或细胞类型的细胞系确定Wnt信号传导的增加。在特定的实施方案中，细胞系含有在Wnt信号响应启动子控制下的带有标志物基因(例如，荧光素酶基因)的报告质粒。可以通过添加单独的弗林蛋白酶结构域1(或与弗林蛋白酶结构域2一起，具有F105A和/或F109A点突变)作为阴性对照或功能性R-脊椎蛋白(全长或弗林蛋白酶结构域1和2)作为阳性对照来测定细胞响应于Wnt3a、Wnt3a条件培养基、Wnt3a的重组来源或Wnt模拟激动剂的增强的报告活性。响应于肝脏特异性Wnt信号增强分子的报告活性也可以通过使报告细胞系与组织特异性Wnt信号增强分子接触来测定。阴性对照对于报告活性可以是基本上、显著或完全阴性的，以及肝脏特异性Wnt信号增强分子和阳性对照应显示随着报告活性的增加Wnt信号传导应答的增加。另外的对照可以包括单独的抗ASGR1抗体(阴性)，其中使用抗GFP抗体代替抗ASGR1抗体的融合蛋白(阴性)和完整的弗林蛋白酶结构域1-弗林蛋白酶结构域2蛋白(阳性)。肝脏特异性Wnt信号增强分子的组织特异性可以通过类似地测量在除靶向的那些以外的细胞类型或组织中响应于用肝脏特异性Wnt信号增强分子的处理的报告活性来确定。在某些实施方案中，与非靶向组织相比，报告活性在由肝脏特异性Wnt信号增强分子结合的靶组织中较高，例如高至少50％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强多肽包含作用模块和靶向模块的任何组合，包括本文所述的任何作用模块和靶向模块的任何组合。在特定的实施方案中，它们通过接头，例如白蛋白(例如人血清白蛋白)、肽基接头或非肽基接头连接，其中靶向模块和作用模块在接头，例如Fc或白蛋白、肽基接头或非肽基接头的N-和C-末端。
肝脏特异性Wnt信号增强分子也可与本领域已知的诸如聚乙二醇(PEG)、Fc、白蛋白等的部分连接以增强体内稳定性。
肝脏特异性Wnt信号增强分子的一个实例是包含作用模块和靶向模块的Wnt信号增强多肽，所述作用模块包含具有降低的增强Wnt信号传导能力的R-脊椎蛋白(例如，人R-脊椎蛋白2)的变体或片段，所述靶向模块特异性结合ASGR1、ASGR2、TFR2或SLC10A1，其中所述组织特异性Wnt信号增强多肽增加肝脏组织中的Wnt信号传导并且可用于治疗肝脏组织的疾病或病况。
肝脏特异性Wnt信号增强分子的示例性非限制性实例包括所附实施例和序列中所述的那些。在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子包含本文公开的两个或更多个多肽序列，例如，以附加的IgG或抗体形式。本文公开的多肽包括但不限于包含与本文所示的任何序列及其片段和变体具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽或者由其组成。在特定的实施方案中，多肽包含在本文所示的任何序列中存在的作用模块或靶向模块，及其片段和变体。在某些实施方案中，多肽具有作为作用模块和/或靶向模块的活性。
本文公开的多核苷酸的示例性非限制性实例包括编码本文所述的任何多肽、变体和片段(包括上文所述的那些)的任何多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸编码具有作为功能结构域和/或靶向模块的活性的多肽。
药物组合物
还公开了包含本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子或抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。
在其它实施方案中，还公开了包含多核苷酸以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述多核苷酸包含编码本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子或抗体或其抗原结合片段的核酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸是DNA或mRNA，例如修饰的mRNA。在特定的实施方案中，多核苷酸是修饰的mRNA，其还包含5’帽序列和/或3’加尾序列，例如polyA尾。在其它实施方案中，多核苷酸是包含与编码序列可操作地连接的启动子的表达盒。
在其它实施方案中，还公开了包含表达载体(例如病毒载体)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述表达载体包含含有编码本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子或抗体或其抗原结合片段的核酸序列的多核苷酸。
本发明还考虑了包含细胞以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述细胞包含含有多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸包含与编码本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子或抗体或其抗原结合片段的核酸可操作地连接的启动子。在特定的实施方案中，细胞是从待治疗的对象获得的异源细胞或自体细胞。在特定的实施方案中，细胞是干细胞，例如脂肪衍生的干细胞或造血干细胞。
主题分子可以与药学上可接受的载体、稀释剂和试剂组合，用于制备通常安全、无毒且合乎需要的制剂，并且包括哺乳动物(例如人或灵长类)使用可接受的赋形剂。这种赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下，可以是气态的。这种载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。补充的活性化合物也可掺入制剂中。用于制剂的溶液或悬浮液可以包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如吐温20，以防止聚集；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节pH。在特定的实施方案中，药物组合物是无菌的。
药物组合物还可以包含无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些情况下，组合物是无菌的，并且应该是流体，达到容易注射的程度。在某些实施方案中，其在制造和储存条件下是稳定的，并且被保存以抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖；多元醇，如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现内部组合物的延长吸收。
无菌溶液可以通过将肝脏特异性Wnt信号增强分子以所需量掺入适当溶剂中，如果需要，随后过滤灭菌来制备，所述适当的溶剂具有上文所列组分中的一种或组合。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分+任何另外的所需成分的粉末。
在一个实施方案中，药物组合物用载体制备，所述载体将保护融合蛋白免于从体内快速清除，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料也可以在商业上获得。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。
为了易于施用和剂量的均匀性，将药物组合物配制成剂量单位形式可能是有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有与所需的药物载体缔合的经计算可产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果以及在配制用于治疗个体的这种活性化合物的领域中固有的限制决定和直接取决于它们。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中，例如注射器，例如预填充的注射器。
本发明的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或任何其它化合物，其在施用至包含人的动物时能够(直接或间接)提供生物活性的肝脏特异性Wnt信号增强分子。
本发明包括本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予其不希望的毒理效应的盐。多种药学上可接受的盐是本领域已知的，并且描述于例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,第17版,AlfonsoR.Gennaro(编),Mark Publishing Company,Easton,PA,USA,1985(及其较新的版本)；“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”,第3版,James Swarbrick(编),Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA,2007以及J.Pharm.Sci.66:2(1977)。另外，对于合适盐的综述，参见“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,andUse”,Stahl和Wermuth(Wiley-VCH,2002)。
药学上可接受的碱加成盐与金属或胺，如碱金属和碱土金属或有机胺形成。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括N-N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见，例如，Berge等人,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharma Sci.,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与足够量的所需碱以常规方式接触以产生盐来制备。游离酸形式可通过使盐形式与酸接触以及以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式在某些物理性质如在极性溶剂中的溶解度方面与它们各自的盐形式有些不同，但是对于本发明的目的，盐与它们各自的游离酸是等同的。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂混合的治疗有效量的本文所述的肝脏特异性Wnt信号增强分子，所述药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲液、防腐剂和其它蛋白质。示例性的氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露糖醇、右旋糖酐、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液(Ringer's and Hank's solutions)、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，该制剂在4℃下稳定至少6个月。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其它缓冲液，如Good等人(1966)Biochemistry 5:467描述的那些。缓冲液的pH范围可以是6.5至7.75，优选7至7.5，以及最优选7.2至7.4。
用于增加Wnt活性或Wnt受体细胞表面表达的方法
关于融合蛋白在本文中例示的肝脏特异性Wnt信号增强分子可用于增加肝脏组织或肝脏细胞中的Wnt信号传导。在特定的实施方案中，Wnt信号传导是规范的Wnt信号传导。因此，在一些方面，本发明提供了用于增加或增强肝脏组织或肝脏细胞中的Wnt信号传导的方法，其包括使肝脏组织或细胞与有效量的本文公开的肝脏特异性Wnt信号增强分子接触，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以组织或细胞特异性的方式结合靶组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在一些实施方案中，接触发生在体外、离体或体内，例如，将对象肝脏特异性Wnt信号增强分子施用或提供给对象。在特定的实施方案中，细胞是培养的细胞，并且接触发生在体外。
在相关方面，本发明提供了用于增加肝脏组织或细胞中的Wnt信号传导的方法，其包括使靶组织或细胞与有效量的一种或多种多核苷酸接触，所述多核苷酸包含编码本文公开的肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以组织或细胞特异性方式结合靶组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，多核苷酸是DNA或mRNA，例如修饰的mRNA。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2EASE-RA。在某些实施方案中，多核苷酸是修饰的mRNA，其还包含5’帽序列和/或3’加尾序列，例如polyA尾。在其它实施方案中，多核苷酸是包含与编码序列可操作地连接的启动子的表达盒。
在相关方面，本发明提供了用于增加肝脏组织或细胞中的Wnt信号传递的方法，其包括使靶组织或细胞与有效量的一种或多种载体接触，所述载体包含编码本发明的肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以肝脏特异性方式结合肝脏组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在某些实施方案中，载体是表达载体，并且可以包含与核酸序列可操作地连接的启动子。在特定的实施方案中，载体是病毒载体。
在相关方面，本发明提供了用于增加肝脏组织或细胞中的Wnt信号传导的方法，其包括使靶组织与有效量的细胞接触，所述细胞包含编码本发明的肝脏特异性Wnt信号增强分子的一个或多个核酸序列，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以肝脏特异性方式结合肝脏组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在特定的实施方案中，细胞是从待治疗的对象获得的异源细胞或自体细胞。在某些实施方案中，用包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的表达盒的载体转导细胞。在特定的实施方案中，细胞是干细胞，例如脂肪衍生的干细胞或造血干细胞。
本文所述的用于增加Wnt信号传导的任何方法也可用于增加靶细胞(例如肝脏组织细胞)表面上卷曲(Frizzled,Fz)受体的数目。在某些实施方案中，靶细胞表面上Fz受体的数目增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少5倍或至少10倍。在特定的实施方案中，Fz受体包括一种或多种人卷曲蛋白Fz1、Fz2、Fz3、Fz4、Fz5、Fz6、Fz7、Fz8、Fz9和Fz10。例如，本公开内容提供了用于增加肝脏细胞表面上Fz受体的方法，其包括使肝脏细胞与有效量的本文公开的肝脏特异性Wnt信号增强分子接触，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以肝脏特异性方式结合肝脏组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，靶向模块结合ASGR1或ASGR2。在某些实施方案中，靶向模块包含本文公开的抗体或其抗原结合片段。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在一些实施方案中，接触发生在体外、离体或体内，例如，将肝脏特异性Wnt信号增强分子施用或提供给对象。在特定的实施方案中，细胞是培养的细胞，并且接触发生在体外。在某些实施方案中，肝脏细胞或组织最初直接与Wnt信号增强分子接触，然而在其它相关实施方案中，肝脏组织或细胞最初与编码Wnt信号增强分子的多核苷酸(例如表达载体)接触，由此细胞摄取多核苷酸并表达Wnt信号增强分子。
本文所述的用于增加Wnt信号传导的任何方法也可用于增加肝脏组织或肝脏细胞上的Ki-67。
用于治疗疾病和病症的方法
关于融合蛋白在本文中例示的肝脏特异性Wnt信号增强分子可以例如通过增加靶肝脏细胞、组织或器官中的Wnt信号传导而用于治疗疾病、病症或病状。因此，在一些方面，本发明提供了用于治疗有需要的对象中的疾病或病况的方法，所述疾病或病症是例如与降低的Wnt信号传导相关的疾病或病症，或者对于所述疾病或病症，增加的Wnt信号传导将提供治疗益处，所述方法包括使对象与有效量的本公开内容的组合物接触。在特定的实施方案中，所述组合物是药物组合物，其包含以下中的任一种：肝脏特异性Wnt信号增强分子，例如小分子或多肽；一种或多种多核苷酸，其包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子(例如DNA或mRNA，任选地修饰的mRNA)的核酸序列；一种或多种载体，其包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列，例如表达载体或病毒载体；或者包含编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的一个或多个核酸序列的细胞，例如用编码肝脏特异性Wnt信号增强分子的表达载体或病毒载体转导的细胞。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在特定的实施方案中，所述疾病或病况是病理性疾病或病症，或损伤，例如由伤口引起的损伤。在某些实施方案中，伤口可以是另一种治疗性治疗的结果。在某些实施方案中，所述疾病或病况包括受损的组织修复、愈合或再生，或者将受益于增加的组织修复、愈合或再生。在一些实施方案中，接触发生在体内，即，将主题组合物施用至对象。
在相关方面，本发明提供了用于治疗疾病或病况的方法，所述疾病或病况是例如与降低的Wnt信号传导相关的疾病或病症，或者对于所述疾病或病况，增加的Wnt信号传导将提供治疗益处，所述方法包括向有需要的对象施用药物组合物或使有需要的对象接触药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的肝脏特异性Wnt信号增强分子，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以组织或细胞特异性方式结合靶组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。
在相关方面，本发明提供了用于治疗疾病或病况的方法，所述疾病或病况是例如与降低的Wnt信号传导相关的疾病或病症，或者对于所述疾病或病况，增加的Wnt信号传导将提供治疗益处，所述方法包括向有需要的对象施用药物组合物或使有需要的对象接触药物组合物，所述药物组合物包含有效量的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明的肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以组织或细胞特异性方式结合靶组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。
在相关方面，本发明提供了用于治疗疾病或病况的方法，所述疾病或病况是例如与降低的Wnt信号传导相关的疾病或病症，或者对于所述疾病或病况，增加的Wnt信号传导将提供治疗益处，所述方法包括使有需要的对象接触药物组合物，所述药物组合物包含有效量的一种或多种载体，所述载体包含编码本发明的肝脏特异性Wnt信号增强分子的核酸序列，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以组织或细胞特异性方式结合靶组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。
在相关方面，本发明提供了用于治疗疾病或病况的方法，所述疾病或病况是例如与降低的Wnt信号传导相关的疾病或病症，或者对于所述疾病或病况，增加的Wnt信号传导将提供治疗益处，所述方法包括使有需要的对象接触药物组合物，所述药物组合物包含有效量的细胞，所述细胞包含编码本发明的肝脏特异性Wnt信号增强分子的一个或多个核酸序列，其中所述分子包含靶向模块，所述靶向模块以组织或细胞特异性方式结合靶组织或细胞上的细胞表面受体。在特定的实施方案中，所述细胞是干细胞，例如脂肪组织衍生的干细胞或造血干细胞。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。
Wnt信号传导在干细胞的发育过程和维持中起关键作用。Wnt信号的再活化与损伤和疾病后大多数组织的再生和修复相关。肝脏特异性Wnt信号增强分子可以提供响应于肝脏损伤和疾病的愈合和组织修复的益处。肝脏组织损伤和损失的原因包括但不限于衰老、变性、遗传病况、感染和炎症、创伤性损伤、毒素/代谢诱导的毒性或其它病理学病状。Wnt信号和Wnt信号的增强子已显示活化成体组织驻留干细胞。在一些实施方案中，施用本发明的化合物用于治疗患病或受损的肝脏组织，用于肝脏组织再生以及用于肝脏细胞生长和增殖，和/或用于肝脏组织工程。
与Wnt途径的突变相关的人类疾病为Wnt信号在疾病治疗和预防中的增强提供了强有力的证据。临床前体内和体外研究提供了Wnt信号参与许多疾病状况的另外证据，并且进一步支持肝脏特异性Wnt信号增强分子在各种人类疾病中的利用。例如，本发明的组合物还可以用于增强肝脏细胞再生，例如，肝脏再生，治疗肝硬化，增强肝移植，治疗急性肝衰竭，治疗伴有肝炎(A、B或C)病毒感染的慢性肝脏疾病或抗病毒后药物疗法，酒精性肝病，包括酒精性肝炎，例如急性或重度酒精性肝炎，伴有脂肪变性或脂肪性肝炎的非酒精性肝病等。本发明的组合物可以治疗疾病和病症，包括但不限于需要再生性肝脏组织或细胞生长的病况。在某些实施方案中，所述组合物用于治疗例如慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)或肝性脑病。在特定的实施方案中，所述组合物包含Wnt信号增强分子，其选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24EASE-EE或8M2 EASE-RA。在某些实施方案中，所述方法用于治疗酒精性肝炎，例如急性酒精性肝炎或重度酒精性肝炎，所述Wnt信号增强分子是EEST-EE，并且在特定的实施方案中，静脉内施用所述Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，所述方法用于治疗酒精性肝炎，例如急性酒精性肝炎或重度酒精性肝炎，所述Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA，并且在特定的实施方案中，静脉内施用所述Wnt信号增强分子。
已经通过谱系追踪研究鉴定了用于肝细胞稳态更新的增殖细胞的特定群体，例如中心周围区域中的Axin2阳性细胞。谱系追踪研究还鉴定了另外潜在的肝祖细胞，包括但不限于Lgr阳性细胞。自我更新的肝脏细胞和其它潜在的祖细胞群(包括Lgr5阳性和Axin2阳性细胞)被鉴定为能够在损伤后响应于Wnt信号和/或R-脊椎蛋白而再生。急性肝损伤和衰竭以及慢性肝脏疾病的许多临床前模型显示肝细胞的恢复和再生受益于增强Wnt信号。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗例如各种原因的急性肝衰竭、药物诱导的急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)、肝性脑病、酒精性肝病、各种原因的慢性肝衰竭、代偿失调肝衰竭、晚期代偿性肝衰竭、肝硬化、各种原因的肝纤维化、门脉高压、各种原因的慢性肝功能不全、终末期肝病(ESLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(脂肪肝)、酒精性肝炎、急性酒精性肝炎(AAH)、慢性酒精性肝炎、酒精性肝病(ALD)(也称为酒精相关的肝病(ARLD))、丙型肝炎病毒诱导的肝病(HCV)、乙型肝炎病毒诱导的肝病(HBV)、其它病毒性肝炎(例如甲型肝炎病毒诱导的肝病(HAV)和丁型肝炎病毒诱导的肝病(HDV))、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、有肝病症状的手术、肝损伤、静脉闭塞性疾病(VOD)、窦性阻塞综合征(SOS)、原发性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝移植、肝手术和移植中的“小体积”综合征、先天性肝脏疾病和病症、由于APAP(对乙酰氨基酚)过量导致的肝衰竭、以及由遗传疾病、变性、衰老、药物或损伤引起的任何其它肝脏疾病或病症。它们还可以用于增强肝脏细胞在体内或体外的再生。在某些实施方案中，所述方法导致增加的肝细胞再生、改善的肝脏功能和/或减少的纤维化。用于肝脏组织再生的方法受益于施用本发明的化合物，其可以是全身性的或局部性的。这些包括但不限于全身施用的方法和局部施用的方法，例如通过注射到肝脏组织中，通过注射到静脉或血管中而引导进入肝脏中，通过植入持续释放制剂等。在特定的实施方案中，所述组合物包含Wnt信号增强分子，其选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24EASE-EE或8M2 EASE-RA。
在特定的实施方案中，本文公开的肝脏特异性Wnt信号增强分子用于治疗、抑制或预防酒精性肝炎(AH)，如急性酒精性肝炎(AAH)，也称为重度酒精性肝炎(重度AH)。AAH(或重度AH)是一种严重形式的与显著的短期死亡率相关的酒精相关的肝脏疾病。酒精性肝炎通常发生在超过10年的经常大量饮酒之后；在一项研究中的平均消耗量为100g/天(相当于每天10次饮酒)。典型的患者表现为最近出现黄疸，腹水和近端肌肉损失。发热和白细胞增多也是常见的，但应提示对感染，尤其是自发性细菌性腹膜炎的评价。这些患者的肝活检显示脂肪变性，含有嗜酸性包涵体(Mallory)的肝细胞肿胀和显著的嗜中性炎症细胞浸润。由于临床诊断的准确性，很少需要活检，而是依靠临床和实验室特征进行诊断。急性酒精性肝炎(AH)是一种严重形式的酒精性肝病(ALD)的急性代偿失调，其发展于酗酒者中，并且特征在于黄疸、不适、厌食、触痛性肝肿大和全身性炎症反应综合征(SIRS)的特征的快速发作。重度或急性酒精性肝炎(AH)是一种灾难性疾病，180天的死亡率非常高，并且通常需要住院治疗。它可以表现为急性或慢性肝衰竭，在感染和更高等级的肝脏疾病严重程度的存在下预后更差。患者可在表现为黄疸和特征性肝酶升高模式以及凝血病、肝性脑病、静脉曲张出血和导致肝外器官衰竭的脓毒病以及其它潜在症状如瘙痒和/或发热的三个月内具有最近的大量饮酒历史。在特定的实施方案中，肝脏特异性Wnt信号增强分子选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在特定的实施方案中，其经静脉内施用。在某些实施方案中，所述方法导致增加的肝细胞再生、改善的肝脏功能和/或减少的纤维化。
本发明的组合物可以用于治疗终末期肝病(ESLD)。ESLD或慢性肝衰竭通常是严重肝硬化和由此引起的肝纤维化的结果。ESLD表现为腹水、静脉曲张出血、肝性脑病和/或肝功能损害(例如，失代偿性肝脏疾病)的发展。与ESLD相关的常见疾病或病症包括：酒精性肝炎，慢性丙型肝炎感染，慢性乙型肝炎感染，慢性丙型肝炎感染，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及遗传性疾病，如囊性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、血色沉着病、威尔逊氏病(Wilson disease)、半乳糖血症和糖原贮积病。长期暴露于药物、有毒化学品、寄生虫感染和反复的心力衰竭与肝脏充血也可导致ESLD。在特定的实施方案中，所述组合物包含Wnt信号增强分子，其选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24EASE-RA的Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在特定的实施方案中，其经静脉内施用。在某些实施方案中，所述方法导致增加的肝细胞再生、改善的肝脏功能和/或减少的纤维化。
在特定的实施方案中，胃肠外施用，例如静脉内、口服、直肠或通过注射施用组合物。在一些实施方案中，其经局部施用，例如外用或肌内施用。在一些实施方案中，将组合物施用至靶组织，例如肝脏。本发明的方法可以在体内或离体实施。在一些实施方案中，靶细胞或组织与肝脏特异性Wnt信号增强分子的接触是离体进行的，随后将细胞或组织(例如活化的干细胞或祖细胞)植入对象中。本领域技术人员可以基于所治疗的疾病或病症来确定适当的施用部位和途径。施用方法包括但不限于全身施用的方法和局部施用的方法，例如通过注射到肝脏组织中，通过注射到静脉或血管中而引导进入肝脏中，通过植入持续释放制剂等。
给药和剂量方案可取决于医生容易确定的多种因素，如疾病或病症的性质、对象的特征和对象的病史。在特定的实施方案中，施用或提供给对象的肝脏特异性Wnt信号增强分子(例如融合蛋白)的量的范围为约0.01mg/kg至约50mg/kg、0.1mg/kg至约500mg/kg或约0.1mg/kg至约50mg/kg的对象的体重。
在某些实施方案中，对象可以是任何哺乳动物，例如人，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠)，兔，猫，犬，山羊，绵羊，猪，马，牛或灵长类动物。
在一些实施方案中，主题方法产生治疗益处，例如抑制或预防肝脏疾病或病症的发展，停止肝脏疾病或病症的进展，逆转肝脏疾病或病症的进展等。在一些实施方案中，所述方法增加肝细胞再生、增加肝脏功能和/或减少肝脏纤维化。在一些实施方案中，主题方法包括检测已经实现治疗益处的步骤。本领域普通技术人员将认识到，这种治疗功效的测量将可应用于被缓和的特定疾病或病症，并且将认识到用于测量治疗功效的适当检测方法。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗或预防与降低的Wnt信号传导相关或者将受益于肝脏组织中增加的Wnt信号传导活性的疾病或病症，诸如例如本文公开的将受益于肝脏再生的任何疾病或病症的方法，其包括向有需要的对象提供药物组合物，所述药物组合物包含Wnt信号增强分子，所述Wnt信号增强分子包含结合肝脏组织的靶向模块，例如，特异性结合ASGR1的靶向模块，其中所述Wnt信号增强分子增加或增强对象的肝脏组织中的Wnt信号传导。在特定的实施方案中，所述组合物包含Wnt信号增强分子，其选自本文公开的那些中的任一种，或者包含本文公开的多肽序列中的任一个，例如称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE或8M24 EASE-EE或8M24EASE-RA的Wnt信号增强分子。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2EASE-RA。在某些实施方案中，口服或全身施用，例如肠胃外施用药物组合物。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子包含作用模块，所述作用模块包含R-脊椎蛋白弗林蛋白酶结构域1或其片段或变体，以及任选地，突变的弗林蛋白酶结构域2或其片段或变体。
用于产生或维持肝脏细胞、组织和类器官的方法
其它实施方案部分地涉及本文公开的分子用于促进或增强肝脏细胞、肝脏组织和类器官的生长或增殖的用途，例如通过使肝脏细胞、肝脏组织或肝脏类器官与本文公开的一种或多种Wnt信号增强分子，例如1R34-EEST-EE、8M24-EASE-EE或8M24-EASE-RA接触。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是EEST-EE。在某些实施方案中，Wnt信号增强分子是8M24 EASE-EE或8M2 EASE-RA。在某些实施方案中，所述方法可以用于增强肝脏细胞、肝脏组织或肝脏类器官的生长或增殖，或者维持或增加肝脏细胞、肝脏组织或肝脏类器官的活力。在某些实施方案中，肝脏细胞、肝脏组织或肝脏类器官在离体、体外或体内接触。本文公开的方法可以用于产生和/或维持用于治疗用途的肝脏细胞、组织或类器官，例如移植或植入到对象中。它们也可以用于产生和/或维持肝脏细胞、组织或类器官以用于研究用途。Wnt信号增强分子在非治疗方法，例如在体外研究方法中具有广泛的应用。
在某些实施方案中，使肝脏组织与Wnt信号增强分子接触以维持肝脏组织的活力。在特定的实施方案中，肝脏组织是要移植到有需要的受体的供体肝脏组织。在某些实施方案中，例如在从供体取出肝脏组织之前，用包含本文公开的Wnt信号增强分子的溶液体内灌注供体肝脏组织。在某些实施方案中，例如在储存期间或在从供体运输至受体期间，用包含本文公开的Wnt信号增强分子的溶液离体灌注供体肝脏组织。在特定的实施方案中，与未与Wnt信号增强分子接触的肝脏组织相比，与Wnt信号增强分子接触的肝脏组织保持移植存活的时间延长了至少10％、至少20％、至少50％或至少100％。
在某些实施方案中，通过使肝脏类器官培养物与本文公开的一种或多种Wnt信号传导分子接触来产生肝脏类器官培养物、使肝脏类器官培养物生长或维持肝脏类器官培养物。在特定的实施方案中，Wnt信号增强分子存在于用于使肝脏类器官组织生长或维持肝脏类器官组织的培养基中。
在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开通过引用以其整体并入本文。
从上文可以理解，尽管出于说明的目的已经在本文中描述了本发明的具体实施方案，但是可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，并且不旨在将发明人认为的范围限制为他们的发明，也不旨在表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，以及压力是大气压或接近大气压。
分子生物学、细胞生物学和生物化学中的一般方法可以见于标准教科书，如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版”(Sambrook等人,Harbor LaboratoryPress 2001)；“Short Protocols in Molecular Biology,第4版”(Ausubel等人编,JohnWiley&Sons 1999)；“Protein Methods”(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；“NonviralVectors for Gene Therapy”(Wagner等人编,Academic Press 1999)；“Viral Vectors”(Kaplift&Loewy编,Academic Press 1995)；“Immunology Methods Manual”(I.Lefkovits编,Academic Press 1997)；以及“Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology”(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容通过引用并入本文中。本公开内容中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech的商业供应商获得。
在以下实施例中采用的材料和方法包括以下。
蛋白质产生：除非另有说明，否则所有重组蛋白质均通过瞬时转染在Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific)中产生。所有基于IgG和含有Fc的构建体用CaptivA蛋白质A亲和数值(Repligen)纯化并用0.1M甘氨酸(pH3.3)洗脱。用Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare Life Sciences)尺寸排阻色谱法(SEC)，使用1×HBS缓冲液(20mMHEPES pH 7.4,150mM NaCl)或2×HBS缓冲液(40mM HEPES pH 7.4,300mM NaCl)进一步纯化(polish)所有蛋白质。用甘油(至10％)补充蛋白质用于在-80℃下长期储存。通过SDS-聚丙烯酰胺电泳检查所有测试的蛋白质，估计纯度为至少90％。
SuperTop Flash(STF)测定：如所报告的(Janda等人,2017；Nature 545:234)，使用含有由Wnt响应启动子控制的荧光素酶基因的细胞系测量Wnt信号传导活性(Super TopFlash报告测定,STF)。简而言之，在处理前24小时，将细胞以每孔10,000的密度接种在96孔板中，然后用RSPO或模拟蛋白单独或与100pM WNT3A替代品R2M3-26一起处理过夜。用荧光素酶细胞培养物裂解试剂(Luciferase Cell Culture Lysis Reagent)(Promega)裂解细胞，并用荧光素酶测定系统(Promega)使用供应商建议的方法测量活性。将数据绘制为一式三份的平均值-/+标准偏差，并使用Prism(GraphPad软件)通过非线性回归进行拟合。
基因表达的半定量PCR分析：使用MagMAXTMmirVanaTM总RNA分离试剂盒(ThermoFisher,A27828)提取来自小鼠组织(肝脏和小肠样品)的RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher,43-688-14)或SuperScriptIV VILOMaster Mix(ThermoFisher,目录号11756050)产生cDNA。通过使用Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher,4444963)和Mm00443610_m1 Axin2、Mm01278617_m1Ki67、Mm01300555_g1wnt1、Mm00470018_m1 wnt2、Mm00437336_m1wnt3、Mm01194003_m1 wnt4、Mm00437347_m1wnt5a、Mm01183986_m1 wnt5b、Mm00437353_m1 wnt6、Mm00437356_m1wnt7a、Mm01301717_m1wnt7b、Mm01157914_g1 wnt8a、Mm00457102_m1 wnt9b、Mm00442104_m1 wnt10b、Mm00437327_g1wnt11、Mm00446420_m1 wnt16、Mm00507077_m1 rspo1、Mm00555790_m1rspo2、Mm01188251_m1 rspo3和Mm00615419_m1rspo4探针(ThermoFisher,4331182)测量小鼠Axin2和Ki67 mRNA表达。使用Mm02619580_g1探针(ThermoFisher,4351368)将值标准化为组成型肌动蛋白B基因的表达。
多特异性测定：使用ELISA方法来检查与非靶抗原的结合，所述非靶抗原包括人胰岛素(Sigma 91077C-100MG)、匙孔血蓝蛋白(KLH)(Sigma H7017-50MG)、来自大肠杆菌的脂多糖(LPS)(Sigma L3012-10MG)、双链DNA(dsDNA)(Sigma D1626-5G)和肝素。使用前，用超声将dsDNA剪切至200～200bp。将96孔EIA/RIA Easy WashTM透明平底聚苯乙烯高结合微板(Corning 3369)用在PBS中的50μl KLH、LPS和dsDNA(10mg/ml)在4℃下包被过夜。胰岛素以5mg/ml包被。购买肝素包被的板(Thermo Scientific C995X60)。将包被的板用300μl 300SuperBlock(Thermo 37516)在室温下封闭1小时，然后在室温下用1000mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml的100μl目的蛋白(抗体或融合物)探测1小时(或在4℃下过夜)。抗hFc-HRP(Jackson IR 109-035-098)用于检测和化学发光定量。
蛋白质热稳定性测定：使用Uncle仪器(Unchained Labs)测量蛋白质热稳定性。通过将在1×HBS缓冲液中的蛋白质样品加入到Unis中，然后通过硅酮密封件密封并封闭在框架中进行反应。在15℃-95℃的温度范围内，以1℃/min的增量，在UV266nm和Blue 473nm处测量荧光读数。使用Uncle数据分析软件获得Tm/Tagg。
小鼠研究：6周龄C57B1/6J雄性小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)并分组饲养。所有动物实验都符合国家科学院(National Academy of Sciences)制定的“实验动物护理和使用指南”的标准。动物实验方案由Surrozen机构动物护理和使用委员会批准。在开始实验之前使小鼠适应最少两天。小鼠可以无限制地获得纯化的实验室级酸化水并随意喂养(2018Teklad全球18％蛋白质啮齿动物饮食)。将小鼠保持在30％-70％湿度环境和20℃-26℃的室温下的12/12小时光/暗循环中。
在小鼠被人源化用于人ASGR基因表达的情况下，每只小鼠在第0天用1x1011个ssAAV8-CAG-hASGR1基因组拷贝(Vector Biolabs,Malvern,PA)静脉内给药。在第7天，向小鼠腹膜内(i.p.)注射αGFP、Fc-RSPO2-WT、αGFP-RSPO2-RA或αASGR1-RSPO2-RA。在蛋白质给药后的指定时间，用异氟烷麻醉小鼠并通过心脏穿刺取出血液。收集左肝叶和十二指肠的一部分用于分析。
CCl4研究中基因表达的半定量PCR分析：使用MagMAXTMmirVanaTM总RNA分离试剂盒(ThermoFisher,A27828)提取来自小鼠组织(肝脏样品)的RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher，43-688-14)或SuperScriptTMIV VILOTMMaster Mix(ThermoFisher,目录号11756050)产生cDNA。通过使用Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher,4444963)和Mm00443610_ml Axin2、Mm00432359_m1Ccnd1,Mm01278617_ml Mki67测量小鼠mRNA表达。使用Mm02619580_gl探针(ThermoFisher,4351368)将值标准化为组成型肌动蛋白B基因的表达。
血清化学：在第7天从尾尖收集血液，并在第14天经由心脏穿刺终止。通过在具有凝胶的血清分离管(Fisher,22030401)中以10,000RPM离心血液7分钟来分离血清。将上清液转移到新管中并保持在-20℃下直至分析。使用VetAxcel临床分析仪、碱性磷酸酶和白蛋白测定试剂盒(分别为404200-3,SA2002和SA2001,Alfa-Wasserman DiagnosticTechnologies)分析血清样品。
组织学分析和免疫荧光：将福尔马林固定的和石蜡包埋的肝脏样品切片，并用抗Ki-67兔抗体(Fisher，50245564)、抗HNF4a抗体(Abcam，ab199431)、山羊抗大鼠IgG H&L(Alexa488)(ab150157)和驴抗兔IgG H&L IgG H&L(Alexa647)(ab150075)染色。使用标准程序用Picrosirius Red(PSR)对整个组织学肝脏切片进行染色并扫描成数字图像。Image J用于量化用PSR染色的切片的百分比。
实施例1
肝脏特异性WNT信号增强分子的开发与表征
ASGR是由两种多肽ASGR1和ASGR2组成的异源寡聚体，所述多肽主要在肝细胞上表达并经历快速的内吞作用。为了产生肝脏特异性RSPO样Wnt信号传导增强分子，靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)。
产生了许多IgG样肝脏特异性Wnt信号传导增强分子，每个分子包含两条抗ASGR1抗体轻链和两条抗ASGR1抗体重链，所述重链具有经由接头序列(αASGR1-RSPO2构建体)与它们的N-末端融合的修饰的RSPO2多肽。在该设计中，分子的抗ASGR1抗体部分是提供肝脏特异性的“靶向模块”，而分子的RSPO2部分作为与E3连接酶相互作用的“作用模块”发挥功能。除非另有说明，否则Wnt信号传导增强分子包含IgG1主链。
制备的初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子包含结合ASGR1的茎区并且被称为1R34-DDNN/RA的αASGR1结合结构域。下面提供了1R34-DDNA/RA分子的轻链序列，其中CDR加下划线：
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSLERIGYLSYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQID NO:1)。
下面示出了1R34-DDNA/RA分子的具有融合的RSPO2序列的重链序列，其中CDR加下划线，RSPO2序列以斜体示出，以及接头序列以粗体示出：
与野生型人RSPO2序列相比的两个氨基酸取代显示为粗体、斜体和加下划线。
随后的αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子8M24-v1包含αASGR1结合结构域，其结合ASGR1的碳水化合物结合结构域，并且衍生自8M24抗体。下面提供了8M24-v1分子的轻链的可变结构域的序列，其中CDR加下划线：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAAINLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:3)。
下面提供了8M24-v1分子的轻链序列，其中CDR加下划线：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAAINLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:5)。
下面示出了8M24v1分子的具有融合的RSPO2序列的重链的可变结构域的序列，其中CDR加下划线，RSPO2序列以斜体示出，以及接头序列以粗体示出：
与野生型人RSPO2序列相比的两个氨基酸取代显示为粗体、斜体和加下划线。
对这两种起始分子中的每一种进行修饰用于测试，以鉴定具有优异特性的修饰形式。
1R34-DDNA/RA分子修饰
对初始αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子1R34-DDNA/RA进行各种氨基酸修饰并对其进行测试以鉴定具有改进性质的分子。图1提供了1R34-DDNA/RA起始分子的轻链多肽和重链-Rspo2融合多肽的氨基酸序列，并以粗体表示在变体中被修饰的氨基酸残基。所有分子在IgG1主链(NG)中包括N297G取代。在一些分子中，为了消除RSPO2多肽对LGR的结合，将点突变引入RSPO2的Fu2结构域内的两个高度保守的疏水残基中，据报告这两个残基对于结合LGR蛋白，F105和F109是关键的。与野生型RSPO2序列相比，图1所示的1R34-DDNA/RA重链序列包括F105R和F109A取代，它们以斜体和加下划线示出。
在1R34-DDNA/RA Wnt信号传导增强分子的ASGR1结合IgG部分的CDR中存在四个具有脱酰胺或Asp异构化能力潜力的Asn和Asp位点(在图1中以粗体示出)。在这些位置的每一个上进行各种氨基酸取代。使用标准分子生物学技术工程化分子并通过瞬时转染在Expi293细胞中表达，然后进行2次柱纯化(蛋白质A，随后进行SEC)。测试所得分子引入Wnt信号传导增强分子以消除脱酰胺或Asp异构化能力的潜力。
令人惊奇的是，重链的CDR2中的D62位置显示出被其它氨基酸替代的有限灵活性。如图2所示，突变为Ser或Ala的D62导致分子的SEC谱的显著变化，表明这些突变破坏了分子的折叠，然而突变为Glu保持折叠。后一种突变也保留了STF活性(数据未显示)。
类似地，轻链的CDR1中的D25位置不能被丝氨酸替代，因为它破坏了蛋白质折叠，如图3所示。然而，用Glu或Ala取代D25保持蛋白质折叠和STF活性(图3和数据未显示)。
轻链的CDR2中的N51位置具有被Gln、Ser或Ala替代的灵活性(图4)。这些取代中的每一种都保持了STF活性，尽管STF活性随着在位置51处Gln突变而稍微降低(数据未显示)。
如图5所示，当被Gln、Ser或Ala替代时，轻链的CDR3中N88位置的修饰不影响蛋白质SEC谱。这些取代中的每一种都保持了STF活性，尽管STF活性随着在位置88处Gln突变而稍微降低(数据未显示)。然而，SDS-PAGE分析揭示了尽管N88S和N88A突变体表达良好，但至S或A的突变导致非正确折叠的蛋白质，如图6所示。与其它突变体组合，LC N88Q损害了活性以及L88A损害了完整性。在重链CDR2 D62E，轻链CDR1 D25E和轻链CDR2 N51S取代的背景下，对CD3中的N88位置进行进一步的修饰，使其成为His(EESH)、Thr(EEST)、Arg(EESR)或Lys(EESK)(和其它氨基酸残基)，并在Huh-7和Hek-293细胞中进行测试(图50A-D)。突变体EESH和EESR具有降低的STF活性，可能是由于细胞表面上的结合位点中断。突变体EEST、EESK和EEAT具有与WT相当的STF活性，然而以下突变组合具有降低的活性：EESL、EESE、EESH、EESR、EESY、EEAL、EEAE、EEAH、EEAY和EEAR。还检查了具有不同氨基酸替代N88的突变体的各种组合的蛋白质折叠(图41)。比较了具有相似活性的序列的组合，EEST具有最高的Emax和最低的EC50(图42)。令人惊奇的是，N88到Thr的突变保持了STF活性和适当的蛋白质折叠(图41)。
基于活性选择在各种修饰位置处的优选取代，并显示在表1中，其中优选的氨基酸取代以粗体突出显示(WT表示野生型)。
表1
制备包含上文鉴定的优选氨基酸取代的各种组合的Wnt信号传导增强分子，并通过STF测定、octect结合和多特异性测定对其进行测试。这些分子在表1的位置1-4包含以下氨基酸：EESY、EEAL、EEAE、EEAH、EEAT、EEAY、EEAR、EESN、EEAN、EESL、EESE、EESH、EEST、EESR和EESK。在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE分析以确定蛋白质折叠(图7：左图面：泳道1＝标志物，泳道2-8分别＝EESY、EEAL、EEAE、EEAH、EEAT、EEAY、EEAR，非还原，以及泳道9-15分别＝EESY、EEAL、EEAE、EEAH、EEAT、EEAY、EEAR，还原的；右图面：泳道1＝标志物，泳道2-9＝EESN、EEAN、EESL、EESE、EESH、EEST、EESR、EESK)。
进行STF测定以评估这些分子在供应的Wnt源存在下调节Huh-7 STF Wnt应答报告细胞中的Wnt信号传导的能力。只有突变体1R34-EEST/RA(“EEST”)、1R34-EESA/RA(“EESA”)、1R34-EESN/RA(“EESN”)、1R34-EEAN/RA(“EEAN”)、1R34-EEAT/RA(“EEAT”)和1R34-EESK/RA(“EESK”)具有与1R34-DDNN/RA起始分子(“NG”)相当的STF活性(图8和图39A-C)。
如图8中总结的，EEST、EESN、EEAN和EEAT突变体都是单分散的，并且在液氮冷冻至室温之间对包括三轮冻融的冻融是稳定的。通过STF和SEC测定冻融稳定性(数据未显示)。还测定了与ASGR1抗原的结合。如图8和图9所示，这四种突变体和亲本分子对ASGR1抗原具有相似的结合亲和力。还检查了与胰岛素、肝素、dsDNA、KLH和LPS的多特异性结合。ELISA显示突变体中与肝素相当的相互作用。在高浓度下，突变体也显示出与dsDNA、KLH和LPS相当的弱结合，但不与胰岛素结合。因此，这些构建体显示出相当的活性和稳定性。
为了消除RSPO2多肽的LGR结合，在huRSPO2、F105和F109的Fu2结构域内的两个高度保守的疏水残基处进行不同的点突变。特别地，这些残基被F105R和F109A或F105E和F109E替代。表2显示了在这些变体的每一种中存在的特定的取代组合。
表2
下面示出了存在于这些分子的每一个中的轻链和重链：RSPO2融合蛋白的序列。
下面提供了αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)分子的轻链序列，其中CDR加下划线：
下面示出了αASGR1-RSPO2-EEST-EE分子的具有融合的RSPO2序列的重链序列，其中CDR加下划线，RSPO2序列以斜体示出，以及接头序列以粗体示出：
与野生型人RSPO2序列相比的两个氨基酸取代显示为粗体、斜体和加下划线。
下面提供了αASGR1-RSPO2-EEST-RA分子的轻链序列，其中CDR加下划线：
下面示出了αASGR1-RSPO2-EEST-RA分子的具有融合的RSPO2序列的重链序列，其中CDR加下划线，RSPO2序列以斜体示出，以及接头序列以粗体示出：
与野生型人RSPO2序列相比的两个氨基酸取代显示为粗体、斜体和加下划线。
下面提供了αASGR1-RSPO2-EEAT-EE分子的轻链序列，其中CDR加下划线：
下面提供了αASGR1-RSPO2-EEAT-EE分子的具有融合的RSPO2序列的重链序列，其中CDR加下划线，RSPO2序列以斜体示出，以及接头序列以粗体示出：
与野生型人RSPO2序列相比的两个氨基酸取代显示为粗体、斜体和加下划线。
如图10所示，F105E和F109E突变的组合(SWEETS-1_RSPO2EE_NG_EEST_G4S；1R34-EEST/EE)在STF测定中与F105R和F109A突变的组合(SWEETS-1_NG_EEST_G4S；1R34-EEST/RA)相比具有较低的体外活性，特别是在Huh-7细胞中，在所述Huh-7细胞中，后者的效力几乎是其6倍。然而，令人惊讶的是，这种更大的体外活性并没有转化为F105R和F109A突变的组合的体内活性增加。相反，当在用SWEETS-1_NG_EEST_G4S(1R34-EEST/RA)或SWEETS-1_RSPO2EE_NG_EEST_G4S(1R34-EEST/EE)处理的非人灵长类动物中分析Axin mRNA表达水平时，与F105R和F109A突变的组合相比，F105E和F109E突变的组合显示出相等的Axin2表达或Axin2表达的较大增加(图11)。这与体外效力相反。
8M24-v1分子修饰
对基于8M24的αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子(8M24-v1)进行各种氨基酸修饰并对其进行测试以鉴定具有改进性质的分子。
最初，起始8M24抗体序列的VH和VL结构域各自是人源化的两种不同方式(H1、H2、V1和V2)。原始的和人源化的VH和VL序列显示在图25中(SEQ ID NO:13-18)。在亲代8M24IgG1恒定区的背景下，将人源化VH和VL序列的各种组合进行组合，并测试其与亲代8M24 VH和VL序列相比对人ASGR1的结合亲和力。如表3所示，基于L1和H1人源化VL和VH链与人ASGR1的最低影响动态结合来选择它们的组合。
表3
VH和VL KD kon koff
亲本 <1E-12 5.89E5 <1E-7
L1H1 5.73E-12 4.6E5 2.64E-6
L1H2 <1E-12 5.11E5 <1E-7
L2H1 <1E-12 4.89E5 <1E-7
L2H2 1.10E-10 5.73E5 6.29E-5
在Wnt信号传导增强分子的8M24 ASGR1结合IgG部分的CDR中鉴定了潜在的脱酰胺或Asp异构化能力(图26中以粗体示出)。这些氨基酸中的每一个被图26中所示的各种氨基酸取代，并在STF测定中在基于L1H1人源化8M24的αASGR1-RSPO2 Wnt信号传导增强分子的情况下对其进行测试，如上所述。RSPO2序列包括上述F105R和F109A取代。当在单一突变的背景下进行测试时，选择轻链D56E突变体，并且重链N31A突变体在该位置是最有效的突变并且被选择。重链N57Q、S和A突变体都几乎同样有效。还选择了D102E突变体。在D110处的所有三个突变具有差的效能，因此选择野生型D110残基(数据未显示)。包含D56E突变的轻链与以上鉴定的各种重链突变(其显示在图27中)组合测试。如图27所示，包含N31A、N57S和D102E(EASE)重链突变的突变体具有最好的活性。在各种其它测定中测试了各种组合突变体，所述测定包括蛋白质折叠、HIC、多特异性、Tm/Tagg、稳定性和octet Kd。这些测定的结果总结在图28中。EASE突变体具有活性和octet Kd的最佳组合。下面显示了其轻链可变结构域多肽的序列，其中CDR加下划线:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAAINLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:19)。
下面显示了其重链可变区与RSPO2变体序列融合的序列，其中RSPO2序列以斜体示出，接头以粗体示出，以及CDR加下划线：
完整的重链还包含如ID NO：所示的恒定区序列。
基于上述研究，鉴定了具有特定突变组合的Wnt信号增强分子，所述突变组合只能凭经验确定以提供优异的性质。
实施例2
肝脏特异性WNT信号增强分子的体内肝脏作用
为了证明实施例1中描述的αASGR1-RSPO2构建体能够在体内以组织特异性方式激活Wnt信号传导途径，用各种构建体处理小鼠。
为了分析Wnt信号传导增强分子对Wnt信号传导途径的组织特异性活化，天然小鼠(mice)接受10mg/kg的αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)、R-spo2或对照(抗βgal或抗GFP-mutRSPO)的单次i.p.剂量(n＝5只小鼠/组)。EEST表示在图1的位置1-4处存在的取代，以及以下EE表示RSPO2区域中的N105E和N109E取代。处理后48小时，收集各种器官和组织进行分析。测定Axin2/ActB基因表达并标准化至对照。在用Rspo2处理后的大多数组织中，Axin2mRNA水平显著增加。然而，αASGR1-RSPO2-EEST-EE仅导致肝脏中Axin2 mRNA的增加(图12)。对于每个组织，从左到右显示抗bgal、抗GFP-mutRSPO、αASGR1-RSPO2-EEST-EE和RSPO2。所得数据显示Wnt信号增强分子选择性地激活肝脏中的Wnt途径(图12)。
通过RT-PCR和免疫荧光测定Ki67在肝脏和小肠中的mRNA和蛋白表达，以及通过免疫荧光测定HNF4α的蛋白表达。抗原Ki-67是一种与增殖相关并用作增殖的细胞标志物的核蛋白，以及肝细胞核因子4a(HNF4α)是一种在肝分化中起主要作用的孤儿核受体。如图21和22所示，αASGR1-RSPO2-EEST-EE(EE)刺激肝细胞的增殖(图21)，但不刺激小肠细胞的增殖(图22)。此外，用αASGR1-RSPO2-EEST-EE处理的动物的肝脏通过免疫荧光显示Ki67和HNF4α的表达。
为了分析在Wnt-信号传导途径活化时上调的基因表达，天然小鼠接受10mg/kg的αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)、αASGR1-RSPO2-EEST-RA(1R34-EEST/RA)或αGFP-IgG的单次i.p.剂量(n＝20只小鼠/组)。在用于表达分析的蛋白质给药后1小时、4小时、24小时和72小时收集血清和肝脏样品(在每个时间点，每组n＝5)。通过qPCR分析mRNA表达，并将样品标准化为ActB。通过将1小时时抗GFP组的平均值设定为1的值来计算相对倍数。
与用αGFP-IgG阴性对照处理的小鼠中的表达相比，用αASGR1-RSPO2-EEST-EE或αASGR1-RSPO2-EEST-RA处理显著诱导肝脏Axin2、Ccnd1和Notum的表达(图13；在每个时间点从左至右：αGFP-IgG、αASGR1-RSPO2-EEST-EE和αASGR1-RSPO2-EEST-RA；双向ANOVA，Holm-Sidak多重比较(针对抗GFP)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)。这些结果表明αASGR1-RSPO2变体在体内激活肝脏中的Wnt途径。
在另一项研究中，小鼠接受10mg/kg的αASGR1-RSPO2-EEST-EE、αASGR1-RSPO2-EEST-RA或αGFP-IgG的单次i.p.剂量(n＝5只小鼠/组)。在1小时、4小时、24小时和72小时后收集肝脏样品用于表达分析和组织免疫化学。当与用αGFP-IgG阴性对照处理的小鼠相比时，用αASGR1-RSPO2-EEST-EE或αASGR1-RSPO2-EEST-RA处理诱导细胞增殖标志物基因Mki67的表达(图14A；在每个时间点从左至右：αGFP-IgG、αASGR1-RSPO2-EEST-EE和αASGR1-RSPO2-EEST-RA；双向ANOVA，Holm-Sidak多重比较(针对抗GFP)，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001)。这些结果表明αASGR1-RSPO2变体能够刺激肝脏实质细胞的增殖。另外的研究显示这种作用是剂量依赖性的(图14B)。
通过在用αASGR1-RSPO2构建体处理前7天IV注射ssAAV8-CAG-hASGR1(每只小鼠使用1×1011个基因组颗粒)，诱导小鼠肝脏中人ASGR1的表达，该剂量显示达到与内源性肝脏Asgr1 mRNA等同的转基因表达水平(数据未显示)。
证明了原始的8M24-RA分子(8M24-v1)和8M24-RA EASE突变体(8M24-EASE)诱导由Wnt信号传导途径调节的基因表达的能力。小鼠接受单次i.p.剂量的8M24-RA(8M24-v1)或8M24-RA EASE(8M24-EASE-RA；1、3、10或30mg/kg)、抗GFP(10mg/kg)或αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)，以IgG2形式代替其正常的IgG1形式。处理后24h、48h或72h收集血清和肝脏样品(每个时间点n＝4)。通过qPCR的mRNA表达被标准化为Actb。通过将每个时间点的抗GFP组的平均值设置为1来计算相对倍数。如图29所示，8M24-RA诱导Wnt信号靶基因Axin2和Ccnd1以及增殖标志物Mki67的表达。如图30所示，8M-24-EASE-RA也诱导Wnt信号靶基因Axin2和Ccnd1以及增殖标志物Mki67的表达。8M24-RA和8M-24-EASE-RA也都诱导ALP的少量但显著的剂量依赖性增加，这与ASGR在消除血清ALP中的作用一致(数据未显示)。
实施例3
肝脏特异性WNT信号增强分子的药代动力学特征
在小鼠中检查Wnt信号增强分子的药代动力学特征。将小鼠分成6组(n＝25只/组)，并接受单剂量的以3、10、30、100mg/kg IV或者以10或30mg/kg i.p.注射的EEST-EE构建体。在蛋白质给药后(n＝5只/组)5和30分钟(IV)，30分钟和1小时(i.p.)以及2h、6h、24h、第4天、第7天、第10天或第14天(IV和i.p.)，在每个时间点收集血清样品(稀少的)。通过用ASGR1或RNF43捕获配体进行ELISA来定量EEST-EE的血清水平。清除率、终末半衰期、Cmax和MRT显示在图15的表中。在蛋白质给药后(对于每个时间点n＝5)30分钟(IV)、1h(i.p.)、6h、24h、第7天或第14天(IV和i.p.)终止时收集肝脏样品。通过将每个时间点的抗GFP组的平均值设置为1来计算相对倍数。如图15所示，1R34-EEST/EE显示对增加剂量的非线性PK反应。IV和i.p.给药之间获得的AUC的比较显示高的生物利用度。
进行类似的研究以比较1R34-EEST/RA、1R34-EEST/EE、8M24-EASE-RA和8M24-EASE-EE构建体。结果提供在图31中。
实施例4
肝脏靶向WNT信号增强分子改善小鼠肝脏纤维化模型中的肝脏功能
在两个小鼠肝脏纤维化模型中检查Wnt信号传导增强分子对肝脏功能的影响。
使用慢性硫代乙酰胺诱导小鼠肝脏纤维化模型。用硫代乙酰胺(TAA)处理6周龄的C57B1/6J雄性小鼠。将TAA以200mg/L的浓度加入到饮用水中，持续13周以诱导肝脏纤维化。此外，在TAA调节的最后8周期间，向小鼠i.p.施用TAA，每周3次。在给药αASGR1-RSPO2蛋白前2天停止TAA处理，并将小鼠放回纯化的实验室级酸化饮用水中。每天用重组αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)或αASGR1-RSPO2-EEST-RA(1R34-EEST/RA)或者用αGFP-IgG或Rspo2每周两次腹膜内(i.p.)注射小鼠，持续一周，如图16所示。
在图16中所示的时间，使用Roche CoaguChek–XS Plus测量INR。在开始给药后第3天、第10天和/或第30天，用异氟烷麻醉小鼠，并通过心脏穿刺取出血液。收集左肝叶和十二指肠的一部分用于分析。将福尔马林固定的和石蜡包埋的肝脏样品切片并用抗Ki-67兔抗体(Abcam,ab15580)染色。使用Image J计算每个随机选择的视野中Ki-67-阳性细胞核的数目(使用10x物镜放大100倍)。用αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EESD/EE)处理导致INR显著降低，然而用αASGR1-RSPO2-EEST-RA(1R34-EEST/RA)或Rspo2处理则没有(图17A；单向ANOVA，与抗GFP比较；(*)p<.05,(**)p<.01,(***)p<.001,(****)p<.0001)。用αASGR1-RSPO2-EEST-EE或Rspo2处理也导致axin2和CYP2E1mRNA表达的显著增加，然而用αASGR1-RSPO2-EEST-RA处理显示axin2和CYP2e1 mRNA表达的较小但显著的增加(图17B和17C；(*)p<.05,(**)p<.01,(***)p<.001,(****)p<.0001)。Ki67免疫荧光染色也证实了TAA诱导的损伤模型中的肝细胞特异性(图18)。
在CCl4诱导的损伤模型中也检查了αASGR1-RSPO2-EEST-EE的作用。CCl4i.p.C57BL/6J雄性小鼠接受CCl4 i.p.注射，每周两次，持续11周。对照组小鼠仅接受橄榄油i.p.注射(n＝8)。停止CCl4处理，将小鼠分成10组(n＝8)，每日或隔日(q.o.d.)给药不同剂量的αASGR1-RSPO2-EEST-EE或αASGR1-RSPO2-EEST-RA(mg/kg)，或者每周两次给药抗GFP(10mg/kg)或RSPO2(4.6mg/kg)。在第7天或第14天终止时收集血液和肝脏样品。
如图19所示，αASGR1-RSPO2-EEST-EE在第7天显著诱导了Axin 2和Mki67 mRNA水平。与αASGR1-RSPO2-EEST-RA相比，利用αASGR1-RSPO2-EEST-EE观察到Axin2、Ccnd1和Mki67mRNA的较大增加。此外，免疫荧光证实了该增加是肝细胞特异性的(图20)。
实施例5
WNT信号增强分子改善肝脏合成功能并减少纤维化
用硫代乙酰胺(TAA)处理6周龄的C57B1/6J雄性小鼠。将TAA以200mg/L的浓度加入到饮用水中持续18周以诱导肝脏纤维化。此外，在TAA调节的最后7周期间，向小鼠i.p.施用TAA，每周3次，导致肝脏纤维化。在给药αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)之前2天停止TAA处理，并将小鼠放回纯化的实验室级酸化饮用水。每天以10mg/kg向小鼠腹膜内(i.p.)注射重组的αASGR1-RSPO2-EEST-EE或阴性对照，持续14天。
在图16A中所示的时间，使用Roche CoaguChek–XS Plus测量INR。INR(内化标准化比率)测量血块形成的速度。高的INR水平反映肝脏疾病或肝硬化，并且表明相关的不能产生正常量的蛋白质和较不理想的血液凝固。在开始给药后第3天、第7天和第14天，用异氟烷麻醉小鼠，并通过心脏穿刺取出血液。与对照相比，用αASGR1-RSPO2-EEST-EE处理导致INR的显著降低(图16B)。在这种小鼠纤维化模型中，用Rspo和αASGR1-RSPO2-EEST-EE的短期处理导致适度的可变的纤维化减少(数据未显示)。
实施例6
组织靶向RSPO模拟物对慢性CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型中肝脏功能的影响
还使用慢性CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型检查肝脏纤维化。特别地，在免疫缺陷和具有免疫活性的小鼠中比较1R23-EEAT/EE对CCl4诱导的肝纤维化的作用。
向32只6周龄的C57BL/6J雄性(Jackson Laboratories)和32只NOD.CB17-Prkdcscid/J(SCID)腹膜内注射CCl4(0.5mL/kg，两次/周)，持续10周。向每种品系的16只小鼠腹膜内注射橄榄油载体(0.5mL/kg)。CCl4处理后，处死每种品系的8只小鼠(进行或不进行CCl4处理)，并收集血液和组织用于基线测量。将剩余的CCl4处理的小鼠基于体重随机分成处理组(表4)，并用蛋白质给药2周。针对每种品系的处理组如下：20mg/kg的1R34-EEAT/EE，n＝8(每天给药)；4.6mg/kg的Fc-RSPO2-WT，n＝8(每周给药两次)；10mg/kg的抗GFP，n＝8(每周给药两次)。包括先前仅用油注射的另外的对照组，n＝8。在第7天(蛋白质给药的第一天表示为第0天)从小鼠抽取血液用于血清化学测试。在第14天处死小鼠。测量总体重和肝脏重量，收集血液、肝脏组织并保存用于测试。
表4提供了CCl4诱导的小鼠纤维化模型的处理组的描述。免疫缺陷的NOD.CB17-Prkdc scid/J或具有免疫活性的C57BL/6J雄性用在橄榄油载体中稀释的CCl4或仅用橄榄油预处理。如所示将小鼠分成A至L组。然后以所示的剂量和频率向小鼠注射测试物品，然后在第0天在基线处或者在测试物品给药开始后第14天终止。
表4：CCl4诱导的纤维化处理组
在用RSPO2阳性对照处理的组以及用RSPO模拟物1R34-EEAT/EE处理的组中肝脏与体重的比率显著升高(图32)。
在蛋白质处理一周和两周后的时间点，测量血清碱性磷酸酶(ALP)和白蛋白。在第7天从尾部采血收集小鼠血清，在第14天终止，并使用VetAxcel(Alfa-Wasserman)进行分析。数据呈现在图33A和33B中。在一周和两周的时间点，血清ALP都是统计学上较高的，这与由于ASGR1-KO小鼠模型中所述的ASGR受体的消除而导致的碱性磷酸酶蛋白水平的上调一致(参见，例如，Cell Host Microbe.2018Oct10；24(4):500-513)。血清白蛋白水平响应于RSPO2和1R34-EEAT/EE显著降低。该结果表明由于Wnt信号传导增加诱导的中心周围肝细胞扩增增加而导致的门静脉周肝细胞功能的预期暂时降低。
定量PCR用于测量肝脏基因表达的变化。用RSPO2或1R34-EEAT/EE处理小鼠导致SCID小鼠中Wnt诱导型Axin2基因的表达增加，但在第14天在C57BL/6J小鼠中则没有。这些结果表明，在两周后，测试物品的活性在免疫缺陷小鼠中是持续的，而在具有免疫活性小鼠中则没有。
用RSPO2和1R34-EEAT/EE处理还显示出在1R34-EEAT/EE处理后肝脏中Mki67和细胞周期蛋白D1(Ccnd1)增殖标志物增加的趋势，以及在RSPO2处理后显著增加(图34)。肝脏切片的免疫荧光染色显示在来自SCID小鼠的RSPO2和1R34-EEAT/EE肝脏样品中Ki67-HNF4α双阳性细胞的数目增加(图35)。使用来自C57BL/6J小鼠的肝脏样品获得类似的结果(数据未显示)。这些结果表明RSPO2和1R34-EEAT/EE促进肝细胞的增殖。
用天狼猩红对组织学肝脏切片进行染色以测量纤维化水平(图36A)。通过Image J(NIH)定量天狼猩红染色的面积(图36B)。这些结果显示，1R34-EEAT/EE显著降低了具有免疫活性和免疫缺陷小鼠中天狼猩红染色的胶原纤维的面积百分比。RSPO2也降低了用天狼猩红染色的面积百分比，尽管在SCID小鼠中不显著。
这些数据共同表明，RSPO模拟物1R34-EEAT/EE对小鼠肝脏可解决(resolve)纤维化和再生功能性肝细胞的速率具有显著影响。
实施例7
肝脏靶向的RSPO WNT信号增强分子激活非人灵长类动物中的Wnt信号传导并结合靶标
在第1天和第15天通过静脉推注用10mg/kg的αASGR1-RSPO2-EEST-EE(1R34-EEST/EE)、αASGR1-RSPO2-EEST-RA(1R34-EEST/RA)、8M24αASGR1-RSPO2-EASE-RA(M24-EASE/RA)、8M24-EASE-RSPO2-EASE-EE(8M24/EASE/EE)或媒介物对照处理非人雌性灵长类动物，然后在第16天在第二次给药后24小时终止。获得肝脏样品并进行血液学分析和组织病理学检查。通过qPCR分析肝脏样品的AXIN2表达并标准化为ACTB表达。通过将媒介物组的平均值设定为1来计算相对倍数。平均值+/-SEM。单因素ANOVA,Holm-Sidak多重比较(针对媒介物)，*p<0.05。
用αASGR1-RSPO2-EEST-EE、αASGR1-RSPO2-EEST-RA、8M24αASGR1-RSPO2-EASE-RA或8M24-EASE-RSPO2-EASE-EE进行的处理导致计划外的死亡，没有异常的临床观察，并且在体重或食物消耗方面没有变化。Axin2 mRNA水平在肝脏中显著增加，并且在用αASGR1-RSPO2-EEST-EE、8M24αASGR1-RSPO2-EASE-RA或8M24-EASE-RSPO2-EASE-EE处理后比用αASGR1-RSPO2-EEST-RA处理后略高(图11)。对于临床病理学，在血液学方面没有实质性变化，但是ALP有实质性短暂的增加，这与分子与ASGR1的结合一致，从而抑制该受体清除ALP(图24)。
这些研究证明Wnt信号传导增强分子在非人灵长类动物中是良好耐受的和有活性的。
实施例8
人ASGR1-CBD:8M24复合物的晶体结构
去唾液酸糖蛋白受体(ASGR；ASGPR)是一种主要在哺乳动物肝脏细胞(肝细胞)中表达的C-型凝集素，经由受体介导的内吞作用介导去唾液酸化的半乳糖-或N-乙酰半乳糖胺-终止的血浆糖蛋白的清除。ASGR的组装被认为是由分别称为H1和H2的两个ASGR1和一个ASGR2多肽组成的异源三聚体。在结构上，ASGR1(H1)和ASGR2(H2)多肽都是II型膜蛋白，其具有短的N-末端胞质结构域，随后是单跨膜螺旋以及包含螺旋茎区的外质区，所述螺旋茎区经由卷曲螺旋结构和在它们的C-末端的碳水化合物结合结构域(CBD)介导寡聚化。人ASGR1和ASGR2之间共有54％的序列同一性。
测定了与命名为8M24的抗体的Fab结构域复合的人ASGR1-CBD(HuASGR1-CBD)结构域(uniprot条目P07306的残基154至291；https://www.dot.uniprot.org/uniprot/P07306)的晶体结构。用于结构研究的在其N-末端包含八组氨酸基序和生物素受体肽(BAP)的HuASGR1-CBD构建体的序列如下：
HuASGR1-CBD_P07306_154-291
HHHHHHHHGSGSGLNDIFEAQKIEWHESGSGCPVNWVEHERSCYWFSRSGKAWADADNYCRLEDAHLVVVTSWEEQKFVQHHIGPVNTWMGLHDQNGPWKWVDGTDYETGFKNWRPEQPDDWYGHGLGGGEDCAHFTDDGRWNDDVCQRPYRWVCETELDKASQEPPLL(SEQ ID NO:52)。
用于结构研究的HuASGR1-CBD的表达和纯化
按照制造商(Polyplus Transfection NY USA)的标准方案，使用FectoPro转染剂，转染表达HuASGR1-CBD的质粒以在Expi293细胞(ThermoFisher USA)中表达，规模通常为1000mL。连续细胞生长4天后，通过离心收集培养基，通过与在50mM磷酸二氢钠pH8.0，300mM NaCl中预平衡的HisComplete树脂(1mL/L培养物；Roche)孵育，用10mM咪唑洗涤以及用平衡缓冲液中的250mM咪唑洗脱从培养基中纯化HuASGR1-CBD。将洗脱液浓缩至5mL，并在用HBS(20mM HEPES pH7.4和150mM氯化钠)预平衡的HiLoad 16/600Superdex 200pg柱(GELife Sciences)上进一步纯化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；来自Bio-Rad,Hercules,CA的Tris-HCl 4-15％凝胶)以证实内容物。在Laemmli样品缓冲液中制备样品并在100℃下加热5分钟。将含有HuASGR1-CBD的级分浓缩至1.78mg/mL并在10％甘油存在下冷冻以在-80℃储存直至进一步使用。使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)通过直接UV A280方法测定蛋白质浓度。基于Beer-Lamber方程，吸光度与蛋白质浓度的关系是线性的，A＝ε1c；A是吸光度值，ε是波长依赖性消光系数，l是以厘米计的路径长度，以及c是蛋白质浓度。所有产生的蛋白质的消光系数通过它们的氨基酸序列来估计。
8M24 Fab的表达和纯化
使用FectoPro转染剂，按照制造商(Polyplus Transfection NY USA)的标准方案，转染表达8M24 Fab(L1H1版本，对应于SZP19057+19056)的轻链和重链(在其C末端具有六组氨酸标签)的质粒以在Expi293细胞(ThermoFisher USA)中表达，规模通常为1000mL。在连续细胞生长4天后，通过离心收集培养基，并结合至在PBS中预平衡的Complete-His树脂(2.5mL/1L培养物；Roche)以及使用在PBS中的250mM咪唑在重力流下洗脱。将含有Fab结合物的洗脱物浓缩至～5mL，并在用HBS预平衡的HiLoad 16/600Superdex 200pg柱(GELife Sciences)上进一步纯化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；来自Bio-Rad,Hercules,CA的Tris-HCl 4-15％凝胶)以证实内容物。在Laemmli样品缓冲液中制备样品并在100℃下加热5分钟。将含有8M24 Fab的级分浓缩至7.12mg/mL并在10％甘油存在下冷冻以在-80℃储存直至进一步使用。使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)通过直接UV A280方法测定蛋白质浓度。基于Beer-Lamber方程，吸光度与蛋白质浓度的关系是线性的，A＝ε1c；A是吸光度值，ε是波长依赖性消光系数，l是以厘米计的路径长度，以及c是蛋白质浓度。所有产生的蛋白质的消光系数通过它们的氨基酸序列来估计。
HuASGR1-CBD:8M24复合物形成、结晶和结构测定
将纯化的HuASGR2-CBD和8M24 Fab以1.1:1的摩尔比(稍微过量的HuASGR1-CBD)混合，并与羧肽酶A和B以100:1的w/w比在4℃下孵育过夜。通过观察在HBS中预平衡的SuperdexS200Increase(10/300GL)柱上的单主峰来证实复合物形成。通过SDS-PAGE进一步检查含有复合物的级分，并浓缩至～20mg/mL用于结晶筛选。使用市售的MCSG1、MCSG2、MCSG3、MCSG4、PACT(Molecular Dimensions USA)、PEGs I和PEGs II(Qiagen USA)的结晶筛选使用Mosquito(TTP LabTech)液体处理器进行，并在EchoTherm培养箱(Torrey PinesScientific USA)中在18℃下平衡。经由DiscoveryV20立体显微镜(Zeiss USA)定期手动监测96孔板晶体筛选实验，并通过在各种冷冻保护剂(通常15-30％v/v的甘油或乙二醇)存在下投入液氮中来冷冻晶体以收集数据。在加州伯克利的高级光源(ALS)的伯克利结构生物学中心(Berkeley Center for Structural Biology)收集X-射线衍射数据集，并用XDS[XDS.Kabsch W.(2010)Acta Cryst.D66,125-132]和xdsme[Legrand P.(2017)XDSME:XDSMade Easier GitHub repository,https://github.com/legrandp/xdsme DOI 10.5281/zenodo.837885]程序处理。HuASGR1-CBD:8M24复合物的结构通过使用Phaser[[Phaser结晶软件.McCoy AJ,Grosse-Kunstleve RW,Adams PD,Winn MD,Storoni LC和Read RJ.(2007)J Appl Crystallogr 40,658-674]和ASGR1-CBD的公开结构的聚丙氨酸模型[PDB code:5JPV；Efficient Liver Targeting by Polyvalent Display of a Compact Ligand forthe Asialoglycoprotein Receptor.Sanhueza CA,Baksh MM,Thuma B,Roy MD,Dutta S,Preville C,Chrunyk BA,Beaumont K,Dullea R,Ammirati M,Liu S,Gebhard D,FinleyJE,Salatto CT,King-Ahmad A,Stock I,Atkinson K,Reidich B,Lin W,Kumar R,Tu M,Menhaji-Klotz E,Price DA,Liras S,Finn MG,Mascitti V.(2017)J.Am.Chem.Soc.139:3528-3536]以及Surrozen Inc.先前确定的不相关Fab的晶体结构的可变和恒定结构域，随后通过在Phenix[PHENIX:用于大分子结构解析的基于Python的综合系统(acomprehensivePython-based system for macromolecular structure solution).P.D.Adams,P.V.Afonine,G.Bunkoczi,V.B.Chen,I.W.Davis,N.Echols,J.J.Headd,L.W.Hung,G.J.Kapral,R.W.Grosse-Kunstleve,A.J.McCoy,N.W.Moriarty,R.Oeffner,R.J.Read,D.C.Richardson,J.S.Richardson,T.C.Terwilliger和P.H.Zwart.(2010)Acta CrystD66,213-221；MolProbity:all-atom structure validation for macromolecularcrystallography.Chen VB,Arendall WB,Headd JJ,Keedy DA,Immormino RM,Kapral GJ,Murray LW,Richardson JS和Richardson DC.(2010)Acta Cryst.D66,12-21]中实施的MolProbity的改进和验证通过分子置换法确定HuASGR1-CBD:8M24复合物的结构。使用COOT人工检查和建立晶体学模型[Features and development of Coot.Emsleym P,LohkampB,Scott WG和Cowtan K.(2010)Acta Cryst.D66,486-501]。使用MOE(CCG)和PyMol(Schrodinger)进行精细晶体结构的分析和图像创建。
HuASGR2-CBD:8M24复合物的结构
下面显示了用于结构研究的8M24 Fab的轻链和重链的序列。
8M24L1轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISENIYSNLAWYQQKP GKAPKLLIYAAINLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:53)。
8M24H1重链：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYGINWVR QAPGQGLEWMGEIFPRSDNTFYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKGRDYGTSHYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGSGHHHHHH(SEQ ID NO:54)。
HuASGR1-CBD:8M24复合物(浓度＝20mg/mL)的衍射质量晶体在含有0.1M SPG(琥珀酸、磷酸二氢钠一水合物、甘氨酸缓冲液)pH9.0和25％w/v PEG 1500的PACT-A6结晶条件下生长。在孔溶液中使用20％甘油对晶体进行低温保护。HuASGR1-CBD:8M24复合物在P212121空间群中结晶，每个不对称单元具有一个复合物分子。HuASGR1-CBD:8M24复合物的结构在的分辨率下确定，并且分别精确至17.3％和20.5％的Rcryst和Rfree因子。
图37A显示了HuASGR1-CBD:8M24复合物的总体结构。HuASGR1-CBD的结构分析显示，其总体折叠和对CBD的结构稳定性重要的三个Ca2+离子与其先前公开的结构类似[PDBCode:1DV8；Crystal structure of the carbohydrate recognition domain of the H1subunit of the asialoglycoprotein receptor.Meier M,Bider MD,Malshkevich VN,Spiess M和Burkhard P.(2012)J Mol Biol 300,857-865]。该结构还显示了ASGR1上的8M24表位远离Ca2+离子定位，所述Ca2+离子是天然配体结合位点的一部分(图37B)。
复合物的结构用于鉴定人ASGR1上8M24的表位，其中以下残基定义了核心相互作用位点(截止值)：
Gly163、Pro165、Val166、Asn167、Cys175、Trp177、Ser181、Lys183、Ala184、Ala186、Asp187、Asn190、Tyr191、Arg193、Leu194、Glu195、Asp196、Trp285、Thr289、Glu290和Leu291。
此外，人ASGR1上的以下残基被鉴定为8M24的直接相互作用位点(原子间距且)：
Cys164、Trp168、Arg173、Ser174、Phe178、Ser179、Arg180、Gly182、Trp185、Ala188、Asp189、Cys192、Ala197、Gln227、Cys279、Gln280、Arg281、Cys287和Glu288。
HuASGR1-CBD:8M24复合物的结构用于鉴定来自人ASGR1的任何原子的在小于或等于的8M24的以下残基：
8M24重链：Asn31、Phe52、Arg54、Ser55、Asn57、Phe59、Lys99、Arg101、Asp102、Tyr103、Gly104、Thr105、Ser106和His107。
8M24轻链：Tyr30、Ser31、Asn32、Phe91、Trp92、Gly93和Phe96。
此外，HuASGR1-CBD：8M24复合物的结构显示了8G8的以下残基是原子间距且的人ASGR1的直接相互作用位点：
8M24重链：Thr28、Thr30、Tyr32、Gly33、Asn35、Glu50、Ile51、Pro53、Asp56、Thr58、Gly100、Tyr108和Phe109。
8M24轻链：Ile2、Asn28、Ile29、Ala50、His90和Thr94。
实施例9
肝细胞靶向的RSPO模拟物对对乙酰氨基酚诱导的肝脏损伤后肝脏功能和组织修复的影响
对乙酰氨基酚(APAP)肝毒性小鼠模型是一种公认的急性肝脏损伤模型，其机制和严重程度在小鼠和人之间是相似的。检查1R34-EEAT-EE修复APAP诱导的肝脏损伤的肝毒性作用的能力。
基于体重，将100只雄性C57BL/6J小鼠(9周龄)随机分成10个研究组(A-J组)，然后禁食过夜。为了诱导肝脏损伤，向小鼠施用单次腹膜内(IP)剂量的APAP 300mg/kg(组B-J，n＝90)；向对照组(A组，n＝10)IP施用盐水。然后，将小鼠放回笼中，并随意获取食物。在APAP施用后2小时，根据随机分组，B-J组中的小鼠接受单次IP注射以下处理剂之一：10mg/kg的抗GFP(阴性对照)、1200mg/kg的N-乙酰半胱氨酸(NAC)(阳性对照)或10mg/kg的1R34-EEAT-EE。继续跟踪A组小鼠，不再另外注射施用的媒介物。然后跟踪小鼠长达72小时，处理后24小时、48小时或72小时终止。
在各个终止时间点，收集血液和肝脏用于临床化学和免疫组织病理学分析。肝脏mRNA的定量聚合酶链式反应(qPCR)分析测量Wnt靶基因和关键细胞色素P450(CYP)代谢酶的表达水平。
表5：APAP诱导的肝脏损伤处理组
1R-34EEAT-EE激活Wnt/β-连环蛋白信号传导途径，如通过Wnt/β-连环蛋白活化的标志物Axin2的肝脏mRNA表达增加以及Wnt靶基因和细胞周期的G1/S期转变的增殖标志物细胞周期蛋白D1(Ccnd1)的诱导所显示的(图43)。此外，通过1R34-EEAT-EE诱导了Notum，其是一种Wnt靶基因和Wnt配体的生理负调节子。
在APAP诱导的肝脏损伤后，所有组中Cyp1a2和Cyp2e1基因的表达均显著降低(图43)。在给药后48小时和72小时，1R34-EEAT-EE处理导致显著较高水平的Cyp1a2和Cyp2e1表达。
在处理后72小时，通过在用抗GFP处理的肝脏的中心周围区域中的免疫荧光观察到自发修复，如由免疫反应性Ki67+细胞核的存在所证明的。1R34-EEAT-EE的再生能力通过Ki67+/HNF4α+双阳性肝细胞(图44，白色正方形)增加超过自发发生的能力来证明，在所有肝区(包括门脉周区)中均匀分布，如通过用Ki-67双免疫荧光染色和门脉周表达的CYP2F2所示(图45)。相比之下，基于具有不可检测的HNF4α的Ki67+细胞核(黄色正方形)的存在，在抗GFP和N-乙酰半胱氨酸组中，显著比例的非肝细胞似乎在增殖。
组织学分析显示了对照组中肝脏中心周围区域的弥漫性坏死的大区域，但在1R34-EEAT-EE处理的肝脏中坏死减少(图46)。
在处理后24小时和48小时，血清碱性磷酸酶(ALP)显著增加，这与1R34-EEAT-EE对ASGR1的占据以及ASGR在ALP清除中的已知作用一致(图47)。在所有测量的时间点，与抗GFP相比，1R34-EEAT-EE显著降低血氨水平。在任何测量的时间点，1R34-EEAT-EE和抗GFP之间的血清AST或ALT水平没有显著差异。
在APAP诱导的肝脏损伤的鼠模型中的该研究表明，1R34-EEAT-EE通过靶向激活肝脏中的Wnt/β-连环蛋白信号传导和刺激肝细胞特异性再生来减轻APAP诱导的肝毒性。
实施例10
肝细胞靶向的RSPO模拟物对慢性饮酒诱导的肝脏损伤后肝脏功能和组织修复的影响
酒精性肝损伤的动物模型在不同程度上再现了患者中AH的许多特征，如脂肪变性和炎性体组分(如IL-1β)的升高的肝脏表达。慢性饮酒模型(chronic-binge model)是一种常用的模型，由使用含有Lieber-DeCarli液体乙醇(EtOH)的饮食和通过口服管饲递送的乙醇的随意喂养组成(Bertola等人,2013)。本研究检查了1R34-EEST-EE对老年小鼠中长期慢性、多次暴饮暴食、急性酒精性肝炎(AAH)模型中肝细胞扩增和功能的影响，其中小鼠肝脏的自发再生能力显著受损。
11月龄C57BL/6J雌性小鼠随意喂养对照Lieber-DeCarli饮食5天以使其适应流质饮食和管饲(图48)。然后将所有小鼠随机化(图55)。使EtOH喂养组中的小鼠自由获取含有5％(vol/vol)EtOH的Lieber-DeCarli(L-D)饮食，持续7周，并且配对喂养(pair-fed)组接受L-D对照饮食，其中用等热量量的麦芽糖糊精代替乙醇。从喂养期的第2周开始并持续到第7周，EtOH喂养和配对喂养的小鼠分别接受每周两次管饲剂量的EtOH 20％(5.23g/kg体重)或等热量的麦芽糖糊精。在EtOH喂养期结束后，将小鼠放回对照L-D流质饮食中，并随机进行1R34-EEST-EE(30mg/kg)或抗GFP(10mg/kg)处理；每天一次经由腹膜内注射施用处理。然后在处理3天或7天后处死小鼠。
表6：乙醇诱导的损伤处理组
在各个终止时间点，收集血液和组织样品用于临床化学分析。通过肝脏mRNA的定量聚合酶链式反应(qPCR)分析来检查Wnt途径的活化、增殖和炎症标志物。
1R34-EEST-EE激活Wnt/β-连环蛋白信号传导途径，如通过两个Wnt靶基因Axin2和Ccnd1的肝脏mRNA表达增加(图49)以及肝增殖标志物如Rrm2、Cdk1、Ccnb1、Cdc20和Mki67的诱导(图50)所显示的。1R34-EEST-EE的肝细胞特异性再生活性通过用增殖标志物Ki67和肝细胞特异性标志物HNF4A进行双重免疫荧光染色来证实(图51)。
此外，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量的，1R34-EEST-EE显著增加Wnt活化的两种血清生物标志物，即白细胞衍生的趋化因子-2(Lect2)和血管生成素(图53)。与抗GFP(对照组)相比，1R34-EEST-EE还降低炎性标志物(白细胞介素Il1b和Il6)的mRNA表达(图54)，ALT轻微升高，以及AST响应1T34-EEST-EE显著降低，在用1R34-EEST-EE处理3天后观察到显著变化，导致AST/ALT比率的显著降低(图52)。此外，在第3天，与抗GFP相比，1R34-EEST-EE显著降低了循环氨(图52)。
总之，在老年小鼠的AAH模型中，1R34-EEST-EE诱导肝脏特异性Wnt/β连环蛋白信号传导。此外，1R34-EEST-EE刺激肝细胞特异性细胞再生。这些数据提供了以下概念证明：1R34-EEST-EE在由于年龄和酒精使用而导致的增殖受损的条件下刺激肝细胞扩增。
实施例11
药物诱导的肝衰竭再生的生物标志物
由于对乙酰氨基酚(APAP)过量或其它药物诱导的肝损伤(DILI)导致的急性肝衰竭(ALF)具有有限的治疗选择。尽管65％的患有APAP诱导的ALF的患者自发地存活，但在美国每年约有500例死于APAP肝毒性。在DILI中，未经移植的存活率约是25％，在美国估计有300-500例死亡。对于肝脏移植，列出了在一线治疗(如静脉内N-乙酰半胱氨酸)后预期不会恢复的患者。由于肝脏移植的需求增加而供应有限，因此需要一种预测肝脏恢复的可靠试验。
在发育和组织修复的过程中，Wnt信号传导在肝细胞扩增中起重要作用。由β-连环蛋白稳定介导的下游典型Wnt信号传导与ALF患者中增加的再生相关(Apte 2009,Bhushan2014)。
在本文中，测定未接受肝脏移植的ALF患者和进行肝脏移植或死亡的ALF患者之间的肝脏损伤生物标志物(甲胎蛋白和胆碱酯酶)和Wnt信号传导标志物(血管生成素和白细胞衍生的趋化因子2)的血清水平差异。
甲胎蛋白(AFP)由未成熟肝细胞增殖而分泌，并在肝脏损伤中升高。在ALF中，自发存活者第3天与第1天的AFP比率高于死亡或移植的患者，表明AFP水平变化的预后价值(2006)。
丁酰胆碱酯酶(BChE)是由肝脏产生的非特异性酯酶，并且在许多肝脏功能障碍(包括急性和慢性肝脏损伤、炎症和感染)中降低。
血管生成素是主要由肝细胞分泌的直接Wnt靶标。血管生成素诱导血管生成并在细胞生长和存活中起作用。尚未报告血管生成素与ALF结果之间是否存在联系。
白细胞衍生的趋化因子2(LECT2)是一种几乎仅由肝细胞分泌的肝脏因子并且是直接的Wnt靶标。LECT2在肝脏再生中起关键作用：对ALF具有特异性，当肝脏功能恢复时，LECT2水平增加(Sato2004)，但在损伤后的前3天期间低的LECT2水平与较高的存活概率相关(Slowik 2019)。
血清样品选自美国成人急性肝衰竭研究组登记处(NCT 00518440)。如ALFSG所规定的，将肝衰竭的病因分为两组：APAP或DILI/其它/不确定的。自发存活者(SS)被定义为在没有移植的情况下恢复的患者，并且将其与进行移植或死亡的患者(LT/D)进行比较。在登记后第1天、第3天和第7天抽取的SS组中有10名APAP过量患者和5名DILI患者的样品，以及在第1天和第3天抽取的LT/D组中有10名APAP和10名DILI患者的样品(参见表7)。
表7：肝衰竭患者的存活
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量AFP、血管生成素和LECT2，以及通过酶活性测定来测量BChE。
自研究登记以来的时间代表了患者临床过程的不同时间。为了说明这一点，在自入院以来的时间背景下解释生物标志物水平。通过进行随机混合效应模型来模拟生物标志物水平的对数标度，其中协变量包括自入院以来的时间项和指示SS或LT/D的状态组。假设非结构化相关性说明了同一患者随时间重复测量的相关性。估计每个状态组的点估计值和最小二乘均值的95％置信区间(CI)，以及两种状态之间的差异。
分别针对SS和LT/D，将AFP、血管生成素、LECT2和BChE的分布相对于入院时间作图。比较SS和LT/D之间的点估计值和最小二乘均值的95％ CI。SS与LT/D的倍数差总结在表8中。
表8：AFP、血管生成素、LECT2和BChE分布
SS和LT/D之间血管生成素和LECT2的点估计值的倍数差异是显著的，而AFP和BChE的倍数差并不显著。
对于肝衰竭的病因(APAP和DILI/其它)，分别比较SS和LT/D之间的点估计值的倍数差。在APAP患者中血管生成素和LECT2存在显著的倍数差，但在DILI/其它患者中，仅血管生成素有显著的倍数差(表9)。
表9：AFP、血管生成素、LECT2和BChE分布
在ALF中，在没有进行肝脏移植而恢复的患者中，在入院后早期观察到循环血管生成素增加>2.5倍以及循环LECT2增加>6倍。这些结果表明血清标志物可作为再生的预后指标发挥功能，并且可作为Wnt信号传导活化的生物标志物发挥功能。此外，由于在实施例10中显示1R34-EEST-EE具有显著增加的LECT2和血管生成素，这些数据表明用1R34-EEST处理与增加的Wnt信号传导和再生相关。
参考文献：
Acute liver failure induced by idiosyncratic reaction to drugs:challenges in diagnosis and therapy.Authors:Tujios,S；Lee,W.Journal Title:Liver International.Publisher:Wiley.Publication Date:01/2018.Volume:38.Issue:1.Pages:6-14.DOI:10.1111/liv.13535.PMID:28771932.
Beta-catenin activation promotes liver regeneration afteracetaminophen-induced injury.Authors:Apte,U；Singh,S；Zeng,G；Cieply,B；Virji,M；Wu,T；Monga,S.Journal Title:The American Journal of Pathology.Publisher:Elsevier.Publication Date:09/2009.Volume:175.Issue:3.Pages:1056-1065.DOI:10.2353/ajpath.2009.080976.PMID:19679878.
Pro-regenerative signaling after acetaminophen-induced acute liverinjury in mice identified using a novel incremental dose model.Authors:Bhushan,B；Walesky,C；Manley,M；Gallagher,T；Borude,P；Edwards,G；Monga,S；Apte,U.Journal Title:The American Journal of Pathology.Publisher:Elsevier.Publication Date:11/2014.Volume:184.Issue:11.Pages:3013-3025.DOI:10.1016/j.ajpath.2014.07.019.PMID:25193591.
Alpha-fetoproitein and prognosis in acute liver failure.Authors:F；Ostapowicz,G；Murray,N；Satyanarana,R；Zaman,A；Munoz,S；Lee,W.JournalTitle:Liver Transplantation.Publisher:Wiley.Publication Date:12/2006.Volume:12.Issue:12.Pages:1776-1781.DOI:10.1002/lt.20886.PMID:17133565.
Serum LECT2 level as a prognostic indicator in acute liverfailure.Authors:Sato,Y.；Watanabe,H.；Kameyama,H.；Kobayashi,T.；Yamamoto,S.；Takeishi,T.；Hirano,K.；Oya,H.；Nakatsuka,H.；Watanabe,T.；Kokai,H.；Yamagoe,S.；Suzuki,K.；Oya,K.；Kojima,K.；Hatakeyama,K.Journal Title:TransplantationProceedings.Publisher:Elsevier.Publication Date:10/2004.Volume:36.Issue:8.Pages:2359-2361.DOI:10.1016/j.transproceed.2004.07.007.PMID:15561249.
Leukocyte cell derived chemotaxin-2(Lect2)as a predictor of survivalin adult acute liver failure.Authors:Slowik,V；Borude,P；Jaeschke,H；Woolbright,B；Lee,W；Apte,U,the Acute Liver Failure Study Group.Journal Title:Translational Gastroenterology and Hepatology.Publisher:AME PublishingCompany.Publication Date:03/2019.Volume:4.Issue:17.Pages:2359-2361.DOI:10.21037/tgh.2019.03.03.PMID:30976720.
可以组合上述各种实施方案以提供进一步的实施方案。
可以修改实施方案的方面以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供进一步的实施方案。根据以上详细描述，可以对实施方案进行这些和其它改变。通常，在所附权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所享有的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。
在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开通过引用以其整体并入本文。
序列表
<110> Surrozen, Inc.
<120> 肝脏特异性Wnt信号增强分子及其用途
<130> SRZN-019/03WO 328202-2142
<150> US 63/114,457
<151> 2020-11-16
<150> US 63/182,106
<151> 2021-04-30
<150> US 63/248,157
<151> 2021-09-24
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu
85 90 95
Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
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Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
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Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 2
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体1R34-DDNN/RA重链
<400> 2
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
165 170 175
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180 185 190
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565 570
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-由8M24抗体改造的人源化VL结构域
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体重链可变结构域
<400> 4
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1 5 10 15
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225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-由8M24抗体改造的人源化VL链
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体重链
<400> 6
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Phe Pro Arg
165 170 175
Ser Asp Asn Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Arg Asp
210 215 220
Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 7
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-突变的轻链序列
<400> 7
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Glu Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu
85 90 95
Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 8
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体突变的EEST/EE重链
<400> 8
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Glu Ser Lys Asp Glu Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Ser
210 215 220
Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
245 250 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
340 345 350
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
355 360 365
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
370 375 380
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
385 390 395 400
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
405 410 415
Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
420 425 430
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
435 440 445
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
450 455 460
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
465 470 475 480
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
485 490 495
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
515 520 525
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-突变的1R34-EEST/RA轻链
<400> 9
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Glu Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu
85 90 95
Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 10
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体突变的1R34-EEST/RA重链
<400> 10
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Ser
210 215 220
Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
245 250 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
340 345 350
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
355 360 365
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
370 375 380
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
385 390 395 400
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
405 410 415
Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
420 425 430
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
435 440 445
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
450 455 460
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
465 470 475 480
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
485 490 495
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
515 520 525
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 11
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-突变的1R34-EEAT/EE轻链
<400> 11
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Glu Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu
85 90 95
Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 12
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体突变的1R34-EEAT/EE重链
<400> 12
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Glu Ser Lys Asp Glu Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Ser
210 215 220
Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
245 250 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
340 345 350
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
355 360 365
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
370 375 380
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
385 390 395 400
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
405 410 415
Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
420 425 430
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
435 440 445
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
450 455 460
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
465 470 475 480
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
485 490 495
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
500 505 510
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
515 520 525
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-8M24抗体重链可变结构域
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Asp Asn Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Arg Asp Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24抗体轻链可变结构域
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro His Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24抗体重链可变结构域(人源化1)
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Asp Asn Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Arg Asp Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24抗体重链可变结构域(人源化2)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Asp Asn Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Arg Asp Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24抗体轻链可变结构域(人源化1)
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24抗体轻链可变结构域(人源化2)
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE-RA轻链可变结构域
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体8M24-EASE-RA重链可变结构域
<400> 20
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Phe Pro Arg
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Arg Glu
210 215 220
Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 21
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE-EE轻链
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 22
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体8M24-EASE-EE重链
<400> 22
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Glu Ser Lys Asp Glu Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Phe Pro Arg
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Arg Glu
210 215 220
Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 23
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-DDNN/RA轻链可变结构域
<400> 23
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu
85 90 95
Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 24
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体1R34-DDNN/RA重链可变结构域
<400> 24
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Ser
210 215 220
Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE轻链
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体8M24-EASE重链 (人IgG1_N297G)
<400> 26
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Phe Pro Arg
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Arg Glu
210 215 220
Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 27
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-1R34-EEST/EE轻链可变结构域
<400> 27
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Glu Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu
85 90 95
Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 28
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体1R34-EEST/EE重链可变区
<400> 28
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Glu Ser Lys Asp Glu Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Ser
210 215 220
Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-修饰的R-脊椎蛋白-2
<400> 29
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu
100 105
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-修饰的R-脊椎蛋白-2
<400> 30
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Ala Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu
100 105
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-修饰的R-脊椎蛋白-2
<400> 31
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Glu Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu
100 105
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-修饰的R-脊椎蛋白-2
<400> 32
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Glu Ser Lys Asp Glu Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu
100 105
<210> 33
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-DDNN/RA重链
<400> 33
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Phe Ser Ser Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEST/EE CDRH1
<400> 34
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEST/EE CDRH2
<400> 35
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEST/EE CDRH3
<400> 36
Asp Phe Ser Ser Arg Arg Trp Tyr Leu Glu Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEST/EE CDRL1
<400> 37
Gln Gly Glu Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEST/EE CDRL2
<400> 38
Tyr Gly Lys Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEST/EE CDRL3
<400> 39
Cys Thr Ser Leu Glu Arg Ile Gly Tyr Leu Ser Tyr Val
1 5 10
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 1R34-EEAT/EE CDRL2
<400> 40
Tyr Gly Lys Ala Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE CDRL1
<400> 41
Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE CDRL2
<400> 42
Ala Ala Ile Asn Leu Ala Glu
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE CDRL3
<400> 43
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE CDRH1
<400> 44
Ala Tyr Gly Ile Asn
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE CDRH2
<400> 45
Glu Ile Phe Pro Arg Ser Asp Ser Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24-EASE CDRH3
<400> 46
Lys Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 263
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile
20 25 30
Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser
35 40 45
Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu
50 55 60
Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys
85 90 95
Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser
130 135 140
Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser
145 150 155 160
Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr
165 170 175
Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp
180 185 190
Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu
195 200 205
Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn
210 215 220
Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg
225 230 235 240
Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro
245 250 255
Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala
260
<210> 48
<211> 243
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Met Gln Phe Arg Leu Phe Ser Phe Ala Leu Ile Ile Leu Asn Cys Met
1 5 10 15
Asp Tyr Ser His Cys Gln Gly Asn Arg Trp Arg Arg Ser Lys Arg Ala
20 25 30
Ser Tyr Val Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys
35 40 45
Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg
50 55 60
Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys
85 90 95
Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys
100 105 110
Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys
115 120 125
Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly
130 135 140
Cys Glu Val Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn
145 150 155 160
Arg Thr Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile
165 170 175
Val Lys Lys Pro Val Lys Asp Thr Ile Leu Cys Pro Thr Ile Ala Glu
180 185 190
Ser Arg Arg Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg
195 200 205
Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu
210 215 220
Ile Glu Arg Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg
225 230 235 240
Ala Asn Gln
<210> 49
<211> 272
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met
1 5 10 15
Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys
35 40 45
Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala
50 55 60
Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys
65 70 75 80
Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr
85 90 95
Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr
100 105 110
Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn
115 120 125
Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser
130 135 140
Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr
145 150 155 160
Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val
165 170 175
Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro
180 185 190
Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys
195 200 205
Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn
210 215 220
Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser
225 230 235 240
Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys
245 250 255
Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His
260 265 270
<210> 50
<211> 234
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Met Arg Ala Pro Leu Cys Leu Leu Leu Leu Val Ala His Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Leu Ala Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gln Val Gly Thr Gly Leu Gly
20 25 30
Gly Asn Cys Thr Gly Cys Ile Ile Cys Ser Glu Glu Asn Gly Cys Ser
35 40 45
Thr Cys Gln Gln Arg Leu Phe Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gly Ile Arg
50 55 60
Gln Tyr Gly Lys Cys Leu His Asp Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Gly Ile
65 70 75 80
Arg Gly Gln Glu Val Asn Arg Cys Lys Lys Cys Gly Ala Thr Cys Glu
85 90 95
Ser Cys Phe Ser Gln Asp Phe Cys Ile Arg Cys Lys Arg Gln Phe Tyr
100 105 110
Leu Tyr Lys Gly Lys Cys Leu Pro Thr Cys Pro Pro Gly Thr Leu Ala
115 120 125
His Gln Asn Thr Arg Glu Cys Gln Gly Glu Cys Glu Leu Gly Pro Trp
130 135 140
Gly Gly Trp Ser Pro Cys Thr His Asn Gly Lys Thr Cys Gly Ser Ala
145 150 155 160
Trp Gly Leu Glu Ser Arg Val Arg Glu Ala Gly Arg Ala Gly His Glu
165 170 175
Glu Ala Ala Thr Cys Gln Val Leu Ser Glu Ser Arg Lys Cys Pro Ile
180 185 190
Gln Arg Pro Cys Pro Gly Glu Arg Ser Pro Gly Gln Lys Lys Gly Arg
195 200 205
Lys Asp Arg Arg Pro Arg Lys Asp Arg Lys Leu Asp Arg Arg Leu Asp
210 215 220
Val Arg Pro Arg Gln Pro Gly Leu Gln Pro
225 230
<210> 51
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-与RSPO2融合的融合构建体8M24-EASE-RA重链
<400> 51
Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys Asp Asn Gly Cys
1 5 10 15
Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Met
20 25 30
Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly
35 40 45
His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu Asn
50 55 60
Cys Asp Ser Cys Arg Ser Lys Asp Ala Cys Thr Lys Cys Lys Val Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly Phe
85 90 95
Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Phe Pro Arg
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile
180 185 190
Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Arg Glu
210 215 220
Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565 570
<210> 52
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-修饰的人ASGR1
<400> 52
His His His His His His His His Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp
1 5 10 15
Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ser Gly Ser Gly Cys
20 25 30
Pro Val Asn Trp Val Glu His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg
35 40 45
Ser Gly Lys Ala Trp Ala Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp
50 55 60
Ala His Leu Val Val Val Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln
65 70 75 80
His His Ile Gly Pro Val Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn
85 90 95
Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys
100 105 110
Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Gly Glu Asp Cys Ala His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp
130 135 140
Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Glu Pro Pro Leu Leu
165
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24L1轻链
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ile Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ile Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 54
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备- 8M24H1重链
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Asp Asn Thr Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Arg Asp Tyr Gly Thr Ser His Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Ser Gly Ser Gly His His His His His His
225 230 235
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 55
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 56
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Gly Lys
1 5
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg
1 5
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 61
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 在实验室中制备-肽接头
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (51)

1.肝脏特异性Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)信号增强分子或其药学上可接受的盐，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域特异性结合选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶，所述第二结构域特异性结合去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)，其中：
(a)所述第一结构域包含修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体；以及
(b)所述第二结构域包含修饰的抗体或其抗原结合片段，所述修饰的抗体或其抗原结合片段包含：CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；以及CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。
2.根据权利要求1所述的分子，其中所述R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体包含弗林蛋白酶结构域1序列和任选的野生型或突变的弗林蛋白酶结构域2序列或其片段或变体，其中与全长野生型R-脊椎蛋白多肽相比，所述R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体具有降低的与富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-6(LGR4-6)的结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分子，其中所述R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体在对应于人R-脊椎蛋白2的氨基酸105和109的位置处包含氨基酸取代。
4.根据权利要求3所述的分子，其中所述氨基酸取代是：
(a)F105R、F105A或F105E；以及
(b)F109A或F109E。
5.根据权利要求4所述的分子，其中所述两个氨基酸取代是：
(a)F105R和F109A；
(b)F105A和F109A；
(c)F105E和F109A；或
(d)F105E和F109E。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分子，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的组合选自以下：
(a)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)、QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；
(b)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)、QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKANRPS(SEQ ID NO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；或
(c)分别为RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQ ID NO:42)、QHFWGTPFT(SEQ IDNO:43)、AYGIN(SEQ ID NO:44)、EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQID NO:46)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分子，其中所述第二结构域包含抗体轻链多肽和抗体重链多肽，并且其中所述第一结构域任选地经由接头部分与所述抗体重链多肽的N-末端融合。
8.根据权利要求7所述的分子，其中所述接头部分是肽基接头序列。
9.根据权利要求8所述的分子，其中所述接头序列包含一个或多个选自以下的氨基酸：甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分子，其包含两个抗体轻链多肽和两个融合多肽，其中每个融合多肽包含经由接头部分，任选地肽基接头序列与所述抗体重链多肽的N-末端融合的修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体，其中所述两个融合多肽彼此连接，并且所述两个抗体轻链多肽各自与所述融合多肽的不同重链多肽连接。
11.根据权利要求10所述的分子，其中：
(i)所述两个抗体轻链多肽包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、14、17、18、19、21、23、25或27中任一个的可变区序列具有至少95％同一性的可变区序列，或其可变区；和/或
(ii)所述两个抗体重链多肽包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、13、15、16、20、22、24、26、28、33或51中任一个的可变区序列具有至少95％同一性的可变区序列，或其可变区。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的分子，其中所述两个融合多肽各自包含与SEQID NO:2、4、6、8、10、12、13、14、15、16、20、22、24、26、28、33或51中的任一个具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的分子，其中所述两个抗体轻链多肽包含与SEQID NO:7具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及所述两个融合多肽各自包含与SEQID NO:8具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的分子，其中所述两个抗体轻链多肽包含与SEQID NO:25具有至少95％同一性的序列，或其可变区；以及所述两个融合多肽各自包含与SEQID NO:26具有至少95％同一性的序列，或其可变区。
15.核酸序列，其编码权利要求10-14中任一项所述的抗体轻链多肽或融合多肽，或者与SEQ ID NO:1-33或51中任一个具有至少95％同一性的多肽，或其可变区。
16.根据权利要求15所述的核酸序列，其中所述核酸序列是DNA或mRNA。
17.载体，其包含权利要求16所述的核酸序列。
18.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体是包含与所述核酸序列可操作地连接的启动子序列的表达载体。
19.根据权利要求17所述的载体，其中所述载体是包含与所述核酸序列可操作地连接的启动子序列的病毒。
20.宿主细胞，其包含权利要求17-19中任一项所述的载体。
21.产生权利要求10-14中任一项所述的抗体轻链多肽或融合多肽的方法，其包括在其中所述多肽由所述表达载体表达的条件下培养权利要求20所述的宿主细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其还包括分离产生的融合多肽的步骤。
23.药物组合物，其包含：
a)权利要求1-14中任一项所述的分子、权利要求15-16中任一项所述的核酸序列、权利要求17-19中任一项所述的载体或权利要求20所述的宿主细胞；以及
b)药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
24.用于增加肝脏组织中Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)信号传导的方法，其包括使所述肝脏组织与以下接触：
a)权利要求1-14中任一项所述的分子；
b)权利要求15-16中任一项所述的核酸；
c)权利要求17-19中任一项所述的载体；
d)权利要求20所述的宿主细胞；或
e)权利要求23所述的药物组合物，
其中所述分子结合所述肝脏组织并隔离所述肝脏组织中选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶或者增加所述肝脏组织中选自锌和环指3(ZNRF3)和环指蛋白43(RNF43)的一种或多种跨膜E3泛素连接酶的内吞作用。
25.治疗或预防有需要的对象中的肝脏疾病或肝脏病症的方法，其中所述肝脏疾病或肝脏病症与降低的Wnt(“无翼相关的整合位点”或“无翼和Int-1”或“无翼-Int”)信号传导相关，或者将受益于增加的Wnt信号传导，所述方法包括向所述对象施用有效量的
a)权利要求1-14中任一项所述的分子；
b)权利要求15-16中任一项所述的核酸；
c)权利要求17-19中任一项所述的载体；
d)权利要求20所述的宿主细胞；或
e)权利要求23所述的药物组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1-14中任一项所述的分子。
27.根据权利要求25所述的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求15-16中任一项所述的核酸。
28.根据权利要求25所述的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求17-19中任一项所述的载体。
29.根据权利要求25所述的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求20所述的宿主细胞。
30.根据权利要求25所述的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求23所述的药物组合物。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述肝脏疾病或肝脏病症选自：各种原因的急性肝衰竭、药物诱导的急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)、肝性脑病、酒精性肝病、各种原因的慢性肝衰竭、代偿失调肝衰竭、晚期代偿性肝衰竭、肝硬化、各种原因的肝纤维化、门脉高压、各种原因的慢性肝功能不全、终末期肝病(ESLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(脂肪肝)、酒精性肝炎、急性酒精性肝炎(AAH)、慢性酒精性肝炎、慢性酗酒诱导的肝损伤、酒精性肝病(ALD)(也称为酒精相关的肝病(ARLD))、丙型肝炎病毒诱导的肝病(HCV)、乙型肝炎病毒诱导的肝病(HBV)、其它病毒性肝炎(例如甲型肝炎病毒诱导的肝病(HAV)和丁型肝炎病毒诱导的肝病(HDV))、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、有肝病症状的手术、肝损伤、静脉闭塞性疾病(VOD)、窦性阻塞综合征(SOS)、原发性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝移植、肝手术和移植中的“小体积”综合征、先天性肝脏疾病和病症、由于APAP(对乙酰氨基酚)过量导致的肝衰竭、以及由遗传疾病、变性、衰老、药物或损伤引起的任何其它肝脏疾病或病症。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述肝脏疾病或肝脏病症选自急性酒精性肝炎、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭(ACLF)、急性肝代偿失调、肝硬化腹水、肝硬化患者的低钠血症、肝肾综合征-急性肾损伤(HRS-AKI)、肝性脑病或肝硬化。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的方法，其中将所述分子、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物经肠胃外、口服、肌内或局部施用至所述肝脏，任选地经静脉内施用至所述肝脏。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物，任选地是人。
35.产生、培养或维持肝脏细胞、肝脏组织或肝脏类器官的方法，其包括使所述细胞、组织或类器官与以下接触：
a)权利要求1-14中任一项所述的分子；
b)权利要求15-16中任一项所述的核酸；
c)权利要求17-19中任一项所述的载体；
d)权利要求20所述的宿主细胞；或
e)权利要求23所述的药物组合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其用于维持离体肝脏组织的活力，包括任选地通过用包含权利要求1-14中任一项所述的分子的组合物灌注所述离体肝脏组织而接触从供体获得的肝脏组织。
37.根据权利要求35所述的方法，其用于维持肝脏组织的活力，包括使供体肝脏组织在体内与包含权利要求1-14中任一项所述的分子的组合物接触。
38.根据权利要求35所述的方法，其用于产生或维持肝脏类器官培养物，包括任选地通过在包含权利要求1-14中任一项所述的分子的培养基中培养所述肝脏类器官培养物而接触所述肝脏类器官培养物。
39.多肽，其包含与SEQ ID NO:1-28、33或51中的任一个具有至少95％同一性的序列，或其可变区，任选地其中所述多肽包含以下CDR组之一：
(a)SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)和DFSSRRWYLEY(SEQID NO:36)；
(b)QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ IDNO:39)；
(c)QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKANRPS(SEQ ID NO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ IDNO:39)
(d)RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQ ID NO:42)和QHFWGTPFT(SEQ ID NO:43)；或
(e)AYGIN(SEQ ID NO:44)、EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQID NO:46)。
40.根据权利要求39所述的多肽，其中所述多肽是融合蛋白，所述融合蛋白包含经由接头部分，任选地肽基接头序列与抗体重链多肽的N-末端融合的修饰的R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体，其中所述R-脊椎蛋白多肽或其片段或变体在对应于人R-脊椎蛋白2的氨基酸105和109的位置处包含两个氨基酸取代。
41.根据权利要求40所述的多肽，其中所述两个氨基酸取代是：
(a)F105R、F105A或F105E；以及
(b)F109A或F109E。
42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述两个氨基酸取代是：
(a)F105R和F109A；
(b)F105A和F109A；
(c)F105E和F109A；或
(d)F105E和F109E。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的多肽，其中所述抗体重链多肽包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列的组合：
(a)分别为SYAMS(SEQ ID NO:34)、AISGSGGSTYYEDSVKG(SEQ ID NO:35)、DFSSRRWYLEY(SEQ ID NO:36)；或
(b)分别为RISENIYSNLA(SEQ ID NO:41)、AAINLAE(SEQ IDNO:42)、QHFWGTPFT(SEQ IDNO:43)。
44.根据权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含修饰的抗体轻链多肽。
45.根据权利要求44所述的多肽，其中所述修饰的抗体轻链多肽包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的组合：
(a)分别为QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:37)、YGKSNRPS(SEQ ID NO:38)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；
(b)分别为QGESLRSYYAS(SEQ ID NO:38)、YGKANRPS(SEQ ID NO:40)和CTSLERIGYLSYV(SEQ ID NO:39)；或
(c)分别为AYGIN(SEQ ID NO:44)、EIFPRSDSTFYNEKFKG(SEQ ID NO:45)和KGREYGTSHYFDY(SEQ ID NO:46)。
46.根据权利要求1-14中任一项所述的分子、根据权利要求15或权利要求16所述的核酸序列、根据权利要求17-19中任一项所述的载体、根据权利要求20所述的宿主细胞、根据权利要求21或权利要求22所述的方法、根据权利要求23所述的药物组合物或根据权利要求24-38中任一项所述的方法，其中所述分子选自称为EEST-EE、EEST-RA、EEAT-EE、8M24EASE-EE或8M24 EASE-RA的Wnt信号增强分子。
47.根据权利要求46所述的分子、核酸序列、载体、宿主细胞、方法、药物组合物或方法，其中所述分子是EEST-EE。
48.根据权利要求46所述的分子、核酸序列、载体、宿主细胞、方法、药物组合物或方法，其中所述分子是EEST-RA。
49.根据权利要求46所述的分子、核酸序列、载体、宿主细胞、方法、药物组合物或方法，其中所述分子是EEAT-EE。
50.根据权利要求46所述的分子、核酸序列、载体、宿主细胞、方法、药物组合物或方法，其中所述分子是8M24 EASE-EE。
51.根据权利要求46所述的分子、核酸序列、载体、宿主细胞、方法、药物组合物或方法，其中所述分子是8M24 EASE-RA。
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