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CN116726173B - Trpm2抑制剂的用途 - Google Patents

Trpm2抑制剂的用途

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CN116726173B
CN116726173B CN202210209735.XA CN202210209735A CN116726173B CN 116726173 B CN116726173 B CN 116726173B CN 202210209735 A CN202210209735 A CN 202210209735A CN 116726173 B CN116726173 B CN 116726173B
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trpm2
cells
liver cancer
huh
inhibitor
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梁廷波
蔡晓波
余夏榛
余沛霖
张宜
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Zhejiang University ZJU
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本申请公开了一种TRPM2抑制剂的用途。本申请首次建立了TRPM2介导肝癌细胞增殖的机制，阐明了TRPM2能通过Ca2+‑CaM‑CaMKII信号通路介导细胞增殖调控过程，为治疗肝癌药物的开发提供了新的靶点；也为肝癌临床干预和治疗提供了新的干预策略。

Description

TRPM2抑制剂的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及TRPM2抑制剂的用途。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是一种常见的高发恶性肿瘤，我国作为肝癌的高发区，发病人数占世界总发病人数的一半左右，其发病率和死亡率分别高居全国第三和第二。然而目前肝癌的临床治疗手段比较有限，且长期疗效不佳，5年生存率仅12％。常见的治疗手段化疗对正常细胞伤害很大，因此，研究人员致力于从肝癌发病机制出发，寻找更优的治疗策略。
瞬时受体电位M2型(Transient receptor potential melastatin 2，TRPM2)通道是一种氧化应激敏感型阳离子通道，对维持细胞内离子稳态，特别是Ca2+稳态具有至关重要的作用，已被先后报道参与神经母细胞瘤和胃癌等多种肿瘤的增殖、存活、凋亡、细胞周期调控、氧化应激反应等多种病理生理学过程。研究表明，TRPM2通道在不同肿瘤中可能分别扮演着致癌或抑癌的作用，TRPM2通道对不同肿瘤生长和增殖调控过程中的作用模式以及潜在机制存在差异性。TRPM2通道在肝癌中的作用尚不明确。因此，明确TRPM2在肝癌发生发展过程中的作用及其分子机制对于解释Ca2+稳态调控对肝癌异常增殖的影响，开发新的治疗肝癌的靶点具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TRPM2抑制剂的用途。
本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种预防和/治疗肝癌的方法。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了TRPM2抑制剂的用途，用于：
(i)制备预防和/或治疗肝癌的药物；
(ii)预防或治疗肝癌；
(iii)抑制钙离子与钙调蛋白结合；
(iv)抑制钙调蛋白的表达；
(v)抑制CaMKII的表达；
(vi)抑制CaMKII的磷酸化；或
(vii)诱导G1/S期细胞周期停滞。
在一些优选的方案中，所述TRPM2抑制剂选自：抗体、多肽、sh-RNA、dsRNA、miRNA、反义寡核苷酸、化合物或其组合。
在一些优选的方案中，所述TRPM2抑制剂为sh-RNA。
在一些优选的方案中，所述sh-RNA选自以下任一种：
(a)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(b)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；
(c)具有与(a)或(b)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；
(d)具有如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸；
(e)具有与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(f)具有与(d)或(e)中所述的核苷酸序列互补的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述TRPM2抑制剂为ACA。
在一些优选的方案中，所述TRPM2抑制剂为ACA和式(Ⅰ)所示化合物；
其中，R1为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基；
R2为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基；
R3为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基；和/或
R4为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基。
在一些优选的方案中，所述TRPM2抑制剂为式(Ⅰ)所示化合物；
其中，R1为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基；
R2为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基；
R3为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基；和/或
R4为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基。
在一些优选的方案中，式(Ⅰ)中，所述卤素优选为氟、氯、溴或碘；
在一些优选的方案中，式(Ⅰ)中，所述C1-4烷基优选为甲基或乙基，更优选为甲基。
在一些优选的方案中，式(Ⅰ)中，R1为氢、甲基或卤素；
R2为氢、甲基或卤素；
R3为氢或卤素；和
R4为氢、卤素、C1-4烷基、甲氧基或硝基。
在一些优选的方案中，式(Ⅰ)中，R1为氢；
R2为溴；
R3为氢；和
R4为甲基。
本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自以下任一种：
(a)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
(b)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；
(c)具有与(a)或(b)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；
(d)具有如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸；
(e)具有与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
(f)具有与(d)或(e)中所述的核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的多核苷酸。在一些优选的方案中，所述载体通过慢病毒构建。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的载体。
上述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的信息如下表所示。
编号 序列信息
SEQ ID NO:1 5’-GCGTGATCTACCACCTCATGA-3’
SEQ ID NO:2 5’-GGCCAAGGACATGAAGTTTGT-3’
本发明第五方面提供了一种预防和或治疗肝癌的方法，所述方法包括步骤：
向受试者施用TRPM2抑制剂或含有TRPM2抑制剂的药物组合物，优选为所述多核苷酸、ACA和/或式(Ⅰ)所示化合物，更优选为所述多核苷酸或式(Ⅰ)所示化合物或shRNA；或者
向受试者施用CaM抑制剂；或者
向受试者施用CaMKII抑制剂。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明首次建立了TRPM2介导肝癌细胞增殖的机制，阐明了TRPM2能通过Ca2+-CaM-CaMKII信号通路介导细胞增殖调控过程，为治疗肝癌药物的开发提供了新的靶点；也为肝癌临床干预和治疗提供了新的干预策略；
(2)本发明发现TRPM2抑制剂不仅从细胞层面，而且在动物层面均对肝癌有很好的抑制效果，很好的治疗肝癌的药物；
(3)本发明设计开发了新的TRPM2抑制剂，相比市面常用的ACA，不仅抑制肝癌细胞的能力更好，且选择性更好，对正常的肝细胞影响更小，毒副作用更小。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中人正常肝细胞系(MIHA、HL-7702)和肝癌细胞系(HCC-LM3、Hep3B、SNU387、SNU449、HepG2、Huh-7)中TRPM2蛋白表达水平的Western blot代表图像；
图2是根据本发明实施例中各肝细胞和肝癌细胞中人正常肝细胞系(MIHA、HL-7702)和肝癌细胞系(HCC-LM3、Hep3B、SNU387、SNU449、HepG2、Huh-7)中TRPM2蛋白表达水平Western blot定量分析结果；
图3是根据本发明实施例中人正常肝细胞系(MIHA、HL-7702)和肝癌细胞系(HCC-LM3、Hep3B、SNU387、SNU449、HepG2、Huh-7)中TRPM2 mRNA表达水平qPCR定量分析结果图；
图4是根据本发明实施例中用RNAscope特异性TRPM2-Cy5探针检测Huh-7细胞中TRPM2原位RNA表达情况confocol代表图；
图5是根据本发明实施例中HepG2细胞RNAscope检测TRPM2原位RNA表达情况的confocol代表图；
图6是根据本发明实施例中全细胞电生理记录-80mV电压下，500μM ADPR激活Huh-7细胞的TRPM2电流随时间变化的代表图和I-V曲线((n＝4)，*P＜0.05)；
图7是根据本发明实施例中HepG2细胞在30μM A10作用下TRPM2电流随时间变化的代表图和I-V曲线((n＝6)，*P＜0.05)；
图8是根据本发明实施例中HL-7702细胞在30μM A10作用下TRPM2电流随时间变化的代表图像和I-V曲线(n＝4)；
图9是根据本发明实施例中MIHA细胞在30μM A10作用下TRPM2电流随时间变化的代表图像和I-V曲线(n＝3)；
图10是根据本发明实施例中Huh-7细胞中Fluo-4的相对荧光强度随时间变化图；
图11是根据本发明实施例中单个Huh-7细胞F/F0相对荧光强度峰值定量统计结果(每组31-48个细胞)，****P＜0.0001；
图12是根据本发明实施例中HepG2细胞中Fluo-4的相对荧光强度(F/F0)随时间变化的代表图；
图13是根据本发明实施例中单个HepG2细胞F/F0相对荧光强度峰值定量统计结果(每组19-42个细胞)，****P＜0.0001；
图14是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂处理对HCC细胞生长的影响图；
图15是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂处理对HCC细胞克隆形成能力的影响图；
图16是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂A10或ACA处理对两种正常肝细胞生长的影响图；
图17是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂A10或ACA处理对两种正常肝细胞克隆形成能力的影响图；
图18是根据本发明实施例中shRNA敲降TRPM2后Huh-7和HepG2细胞中的TRPM2蛋白表达水平图；
图19是根据本发明实施例中Huh-7和HepG2细胞TRPM2敲降后mRNA表达图；
图20是根据本发明实施例中TRPM2敲降对Huh-7细胞原位RNA表达影响图；
图21是根据本发明实施例中TRPM2敲降对HepG2细胞原位RNA表达影响图；
图22是根据本发明实施例中TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞生长的影响图；
图23是根据本发明实施例中TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞克隆形成能力的影响图；
图24是根据本发明实施例中正常肝细胞TRPM2 shRNA的敲降效率结果图；
图25是根据本发明实施例中HL-7702和MIHA细胞TRPM2敲降后的mRNA表达图；
图26是根据本发明实施例中TRPM2敲降对HL-7702和MIHA细胞生长的影响图；
图27是根据本发明实施例中TRPM2敲降对HL-7702和MIHA细胞克隆形成能力影响图；
图28是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂或者TRPM2敲降对细胞增殖的影响图
图29是根据本发明实施例中TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞增殖能力的影响图
图30是根据本发明实施例中Huh-7和HepG2细胞中细胞周期分布图；
图31是根据本发明实施例中TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞周期分布的影响图；
图32是根据本发明实施例中TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞周期调控关键蛋白的表达水平影响图；
图33是根据本发明实施例中RPM2抑制剂A10(30μM)处理24h或TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞周期调控关键蛋白的表达水平影响图；
图34是根据本发明实施例中A10对正常肝细胞系HL-7702和MIHA细胞周期分布的影响示意图；
图35是根据本发明实施例中TRPM2敲降对正常肝细胞系HL-7702和MIHA细胞周期分布的影响示意图；
图36是根据本发明实施例中肝癌组织及癌旁非癌组织的转录组数据分析结果图；
图37是根据本发明实施例GO基因Cell cycle的GSEA富集分析结果图；
图38是根据本发明实施例中KEGG基因Cell cycle的GSEA富集分析结果图；
图39是根据本发明实施例中正常肝组织(n＝50)，TRPM2低表达肝癌组织(n＝187)以及TRPM2高表达肝癌组织(n＝187)的细胞周期调控蛋白相对mRNA表达水平图；
图40是根据本发明实施例中肝癌患者肝组织切片H&E染色，TRPM2、Ki67染色图；
图41是根据本发明实施例中肝癌患者肝组织切片H&E染色，TRPM2、Ki67免疫组化染色示意图；
图42是根据本发明实施例中肝癌患者肿瘤组织(T)和配对的非肿瘤组织(N)中TRPM2、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin A2等蛋白表达水平的Western blot代表图；
图43是根据本发明实施例中Ca2+螯合剂，CaM抑制剂，Zn2+螯合剂或PARP-1抑制剂单独处理或联合TRPM2抑制剂A10处理对Huh-7细胞克隆形成能力的影响图；
图44是根据本发明实施例中Ca2+螯合剂，CaM抑制剂，Zn2+螯合剂或PARP-1抑制剂单独处理或联合TRPM2抑制剂A10处理对HepG2细胞克隆形成能力的影响图；
图45是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂或CaM抑制剂处理对Huh-7细胞增殖能力影响图；
图46是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂或CaM抑制剂处理对HepG2细胞增殖能力影响图；
图47是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂或CaM抑制剂处理对Huh-7细胞活力影响图；
图48是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂或CaM抑制剂处理对HepG2细胞活力影响图；
图49是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞周期分布的影响图；
图50是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理对Huh-7细胞周期分布随时间的变化图；
图51是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理对HepG2细胞周期分布随时间的变化图；
图52是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞的TRPM2、CaM、p-CaMKII(Thr286)、CaMKII、Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、CDK4、p21、p27、Cyclin E1、p-CDK2(Thr160)、CDK2、p-Rb(Ser807/811)、p-Rb(Ser795)、Rb和Cyclin A2等蛋白表达水平的影响图；
图53是根据本发明实施例中TRPM2敲降联合CaM抑制剂W-7处理对Huh-7和HepG2细胞的TRPM2、CaM、Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、CDK4、p21、p27、Cyclin E1、p-CDK2(Thr160)、CDK2、p-Rb(Ser807/811)、p-Rb(Ser795)、Rb和Cyclin A2等蛋白表达水平的影响图；
图54是根据本发明实施例中TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞蛋白表达水平影响的定量统计结果图；
图55是根据本发明实施例中TRPM2敲降联合CaM抑制剂W-7处理对Huh-7和HepG2细胞蛋白表达水平影响的定量统计结果图；
图56是根据本发明实施例中肝癌患者肿瘤组织(T)和配对的非肿瘤组织(N)中CaM蛋白表达水平的Western blot代表图；
图57是根据本发明实施例中CaM蛋白Western blot定量统计分析结果；
图58是根据本发明实施例中CaMKII抑制剂KN-93处理对Huh-7和HepG2细胞增殖能力的影响图；
图59是根据本发明实施例中CaMKII抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞周期分布的影响图；
图60是根据本发明实施例中CaMKII抑制剂KN-93处理对Huh-7和HepG2细胞蛋白表达水平的影响；
图61是根据本发明实施例中CaMKII抑制剂KN-93处理对Huh-7细胞不同蛋白表达情况影响的定量统计结果图；
图62是根据本发明实施例中CaMKII抑制剂KN-93处理对HepG2细胞不同蛋白表达情况影响的定量统计结果图；
图63是根据本发明实施例中PDX移植瘤造模过程图；
图64是根据本发明实施例中用于构建PDX裸鼠移植瘤的患者的肿瘤组织中TRPM2蛋白表达水平Western blot检测结果图；
图65是根据本发明实施例中用PDX移植瘤模型从在体水平评价TRPM2抑制剂对肝癌的治疗效果图；
图66是根据本发明实施例中剥离的PDX移植瘤大小比较图；
图67是根据本发明实施例中PDX移植瘤瘤重统计结果图；
图68是根据本发明实施例中PDX移植瘤肿瘤体积生长曲线图；
图69是根据本发明实施例中Huh-7移植瘤模型评价TRPM2敲降对Huh-7细胞体内生长的影响图；
图70是根据本发明实施例中shNC和shTRPM2两组Huh-7移植瘤瘤重统计分析结果图；
图71是根据本发明实施例中PDX移植瘤和Huh-7移植瘤组织切片H&E染色，TRPM2、Ki67免疫组化染色代表图(比例尺：100μm)；
图72是根据本发明实施例中Control组和A10处理组的PDX移植瘤组织中TRPM2、Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin A2等蛋白表达水平的Western blot代表图；
图73是根据本发明实施例中Western blot定量统计结果图。
具体实施方式
肝癌作为发恶性肿瘤的一种，目前并没有效果很好的副作用小的治疗手段。TRPM2通道作为多种疾病的重要靶点，一直受到研究人员的关注。现有技术中，曾经研究过TRPM2通道和多种癌症间的关系，TRPM2通道对不同肿瘤生长和增殖调控过程中的作用模式以及潜在机制存在差异性，但尚未有人将TRPM2通道和肝癌建立联系，即TRPM2通道在肝癌中的作用尚不明确。本发明人通过研究，首次建立了TRPM2介导肝癌细胞增殖的机制，阐明了TRPM2能通过Ca2+-CaM-CaMKII信号通路介导细胞增殖调控过程，并且设计开发了TRPM2抑制剂，包括shRNA和小分子抑制剂，发明人发现，这两种抑制剂不仅对肝癌细胞抑制效果更好，而且可以选择性杀伤肝癌细胞而不影响正常肝细胞，毒副作用更小。TRPM2抑制剂的选择性杀伤能力，并未在其他癌细胞中发现，因此，发明人认为靶向抑制TRPM2的药物，很有可能具有很好的临床应用效果。
如本文中所用，术语“TRPM2”为瞬时受体电位M2，瞬时受体电位(TRP)通道是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道超家族,根据氨基酸序列的同源性,目前已经确定了28种TRP通道蛋白，并依据氨基酸序列同源性，将其分为TRPC(canonical)、TRPM(melastatin)、TRPA(ankyrin)、TRPP(polycystin)、TRPML(mucolipin)和TRPV(vanilloid)6个亚家族，瞬时受体电位M2(TRPM2)通道隶属于TRPM家族。TRPM2通道可被ADP-核糖(ADPR)、Ca2+、H2O2以及其他活性氧(ROS)所激活。现已证明，TRPM2作为氧化应激传感器，介导了氧化应激引起的细胞内Ca2+浓度升高，并参与多种细胞的生理和病理过程。
如本文中所用，术语“CaM”为钙调蛋白(Calmodulin)，是最常见的Ca2+结合蛋白，不仅能够结合Ca2+，还能作为Ca2+感受器，及时感知细胞内Ca2+浓度的瞬时变化。
如本文中所用，术语“CaMKII”为是一种蛋白激酶，它能结合Ca2+/CaM复合物并被其磷酸化激活，是Ca2+/CaM信号通路重要的下游激酶。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、TRPM2通道蛋白在肝癌细胞中呈功能性表达
本实施例证实了TRPM2通道蛋白在肝癌细胞中呈阳性表达。
(1)TRPM2通道的蛋白表达水平和mRNA表达水平分析
从上海中科院细胞库以及浙江大学医学院附属第一医院分别获得2株人正常肝细胞系(HL-7702和MIHA)，6株人肝癌细胞系(HCC-LM3、Hep3B、SNU387、SNU449、HepG2、Huh-7)，并分别对TRPM2通道的蛋白表达水平和mRNA表达水平进行对比分析，结果见图1、图2和图3。
图1中，β-actin作为内参蛋白。
图2中，用MIHA细胞进行标准化，*P＜0.05，****P＜0.0001。
图3中，用MIHA细胞进行标准化，**P＜0.01，****P＜0.0001。
由图1、2和3可知，TRPM2蛋白在正常肝细胞和肝癌细胞系中均有不同程度的表达；
Huh-7和HepG2这两种肝癌细胞系中的TRPM2蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著高于正常肝细胞系HL-7702和MIHA，与肝癌患者肿瘤组织中TRPM2表达显著高于正常肝组织的表型趋势相符。
(2)Huh-7和HepG2细胞中的TRPM2原位RNA表达水平验证
运用RNAscope技术，通过人源特异性TRPM2-Cy5探针对Huh-7和HepG2细胞中的TRPM2原位RNA表达水平进行验证，结果见图4和图5.
图4中，BF代表明场，TRPM2用红色荧光Cy5标记，DAPI被用于标记细胞核(蓝色)，DapB基因被作为阴性对照，比例尺：20μm。
图5中，比例尺：20μm
由图4和图5可知，2种肝癌细胞中均存在TRPM2原位RNA的稳定表达。
实施例2、TRPM2通道蛋白在肝癌细胞中具有离子通道功能
本实例证实了TRPM2通道蛋白在肝癌细胞中具有离子通道功能。本实施例中所用TRPM2抑制剂为A10和ACA，其中，ACA为N-(对戊基桂皮酰基)邻氨基苯甲酸；A10为(6-Bromo-8-methyl-2-(3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(1H)-one)。
(1)细胞电生理记录肝癌细胞和正常肝细胞中的TRPM2特征性电流
对Huh-7和HepG2细胞进行全细胞电；生理记录结果见图6至图9。
由图6至图9可知，TRPM2特异性胞内激动剂ADPR(500μM)能够快速引发肝癌细胞产生TRPM2电流，并且该电流能被TRPM2抑制剂(A10或ACA)完全抑制，并呈现特征性的TRPM2I-V曲线，说明TRPM2通道蛋白在肝癌细胞中具有离子通道功能。
相同浓度的ADPR激活几乎记录不到明显的TRPM2电流，说明TRPM2在正常肝细胞中仅有微弱的通道功能。
(2)钙成像实验
选择特异性的Ca2+荧光探针Fluo-4 AM对两种肝癌细胞进行活细胞钙成像实验，Fluo-4AM负载后，细胞分别用溶剂对照(0.1％DMSO)，A10(30μM)或ACA(30μM)预孵30分钟，结果见图10至图13。
由图10至图13可知，用3mM H2O2激活TRPM2通道能够显著增加Huh-7和HepG2细胞内的Ca2+浓度，使胞内Ca2+荧光强度显著增加；而TRPM2抑制剂(A10或ACA)提前预孵30分钟均能有效抑制由H2O2诱导的Ca2+内流，说明H2O2介导的Ca2+内流与TRPM2通道直接相关。
实施例3、抑制TRPM2通道的功能和表达均可抑制肝癌细胞生长
本实施例证实了抑制TRPM2通道的功能和表达均可抑制肝癌细胞生长，且TRPM2抑制剂对肝癌细胞和正常肝细胞的生长抑制作用存在选择性。
(1)CCK-8检测TRPM2抑制剂处理对HCC细胞和正常干细胞生长的影响
Huh-7和HepG2细胞分别用溶剂对照(0.1％DMSO)，30μM A10或ACA处理24、48和72小时，然后用CCK-8检测其生长活力，每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示，用双因素方差分析进行统计分析，并用Bonferroni法进行两两比较，下同。结果见图14。
正常肝细胞同上述方式处理，结果见图15。
图14和图16中，****表示A10 VS Control，P＜0.0001；####表示ACA VS Control，P＜0.0001。
(2)TRPM2抑制剂处理对HCC细胞和正常干细胞克隆形成能力的影响
将Huh-7和HepG2细胞接种于6孔板中，分别用Control(0.1％DMSO)、A10或ACA(30μM)处理10-14天，4％PFA固定后用0.1％的结晶紫水溶液进行染色。结果见图15。
正常肝细胞同上述方式处理，结果见图16。
由图14至图17可知，TRPM2抑制剂A10和ACA处理细胞，Huh-7和HepG2细胞的生长活力相较于对照组细胞均有明显降低；并且细胞克隆形成能力也有显著下降。对正常肝细胞系HL-7702和MIHA细胞进行检测，观察到A10和ACA处理对正常肝细胞的细胞生长活力和克隆形成能力几乎没有影响。
实施例4、抑制TRPM2通道的功能和表达均可抑制肝癌细胞生长
本实施例通过敲降TRPM2证实了抑制TRPM2通道的功能和表达均可抑制肝癌细胞生长且对正常肝细胞影响较小。
(1)TRPM2敲降可显著抑制肝癌细胞生长
通过慢病毒包被的shRNA对TRPM2进行特异性敲降，Huh-7和HepG2细胞分别用慢病毒包被的阴性对照shRNA(shNC)、TRPM2 shRNA-#1(shTRPM2)或TRPM2 shRNA-#2(shTRPM2#2)转染72h，收集全细胞裂解液，用Western blot检测TRPM2的敲降效率。结果见图18。与阴性对照组shRNA(shNC)相比，2条特异性TRPM2 shRNA(shTRPM2和shTRPM2#2)都能够明显降低Huh-7和HepG2细胞中的TRPM2蛋白表达水平，shTRPM2的敲降效率更高。
Negative Control(shNC) 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’
shTRPM2: 5’-GCGTGATCTACCACCTCATGA-3’
shTRPM2#2 5’-GGCCAAGGACATGAAGTTTGT-3’
用qPCR检测Huh-7和HepG2细胞TRPM2敲降后的mRNA表达情况，每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示，用配对样本t检验进行统计分析；**P＜0.01，****P＜0.0001。结果见图19。
RNAscope检测TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞TRPM2原位RNA表达水平的影响，结果分别见图20和图21。
CCK-8检测TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞生长的影响，每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示，用双因素方差分析进行统计分析，并用Bonferroni法进行两两比较，*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001,结果见图22。
将TRPM2敲降的Huh-7和HepG2细胞接种于6孔板中，4％PFA固定后用0.1％的结晶紫水溶液进行染色。测定TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞克隆形成能力的影响，结果见图23。
由图18至23可知，与shNC相比，shTRPM2的确能够显著降低TRPM2的mRNA表达水平，并且RNAscope特异性TRPM2探针检测的结果也观察到TRPM2敲降后，shTRPM2组的Huh-7和HepG2细胞中TRPM2原位RNA表达水平与shNC相比均有明显的降低，TRPM2敲降后，Huh-7和HepG2细胞的生长活力以及克隆形成能力与shNC相比，均有显著降低，该结果与TRPM2抑制剂处理结果相似，说明TRPM2敲降能显著抑制肝癌细胞生长。
(2)TRPM2敲降对正常肝细胞影响较小
使用正常肝细胞进行TRPM2敲降实验，步骤同上。实验结果见图24至27。
由图24和27可知，抑制TRPM2通道对正常肝细胞影响较小。
实施例5、抑制TRPM2通道的功能和表达可诱导G1/S期细胞周期停滞
本实施例证实了抑制TRPM2通道的功能和表达可诱导G1/S期细胞周期停滞，抑制细胞增殖。
(1)TRPM2参与调控肝癌细胞的增殖过程
为了明确抑制TRPM2通道的功能和表达诱导肝癌细胞生长抑制的潜在机制，发明人探究了TRPM2是否参与调控肝癌细胞的增殖过程。首先用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)来明确TRPM2抑制剂或者TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞增殖的影响。结果见图28。图28中，Control为0.1％DMSO的溶剂对照组，左图为EdU染色的代表图像，其中BF代表明场，EdU用Alexa Fluor 555红色荧光标记，Hoechst 33342(Hoechst)被用于标记细胞核(蓝色)，Merge为EdU和Hoechst的合并图像，比例尺：100μm。
由图28可知，对照组(0.1％DMSO)相比，30μM A10处理24小时，Huh-7和HepG2细胞中EdU染色阳性细胞的比例均显著下降。
使用EdU染色定量分析TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞增殖能力的影响，*P＜0.05，****P＜0.0001。每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示，结果见图29。图29中同样观察到TRPM2敲降组(shTRPM2)肝癌细胞的增殖活性相比于阴性对照组(shNC)有明显降低的现象。上述结果充分证实抑制TRPM2通道的功能和表达均能显著抑制肝癌细胞增殖。
(2)抑制TRPM2通道的功能和表达可诱导G1/S期细胞周期停滞
为了探讨TRPM2在肝癌细胞生长和增殖调控中的作用机制，发明人用流式细胞术探究了TRPM2在细胞周期进程中的作用。
Huh-7和HepG2细胞分别用对照组(0.1％DMSO)，A10(30μM)处理细胞24h，随后用PI染色确定细胞周期分布情况，结果见图30。图30中，左图为细胞周期分布代表图像，右图为G1，S，G2各分期细胞所占百分比的统计结果(双因素方差分析进行显著性分析，随后用Bonferroni法进行两两比较，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001)。
由图30可知，A10处理24小时后，Huh-7和HepG2细胞中G1期细胞比例均显著增加，而S期细胞比例则明显降低。
同法检测TRPM2敲降对Huh-7和HepG2细胞周期分布的影响，结果见图31。
用Western blot检测细胞周期调控关键蛋白的表达水平。TRPM2抑制剂A10(30μM)处理24h或TRPM2敲降对Huh-7细胞TRPM2、Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、Cyclin E1、CyclinA2、p-CDK2(Thr160)、p-JNK(Thr183/Tyr185)、JNK、Cyclin B1和p-CDC2(Tyr15)等蛋白表达水平的影响,其中，β-actin被作为内参蛋白，每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示。结果见图32。
同样地，TRPM2抑制剂A10(30μM)处理24h或TRPM2敲降对HepG2细胞TRPM2、CyclinD1、p-CDK4(Thr172)、Cyclin E1、Cyclin A2、p-CDK2(Thr160)、p-JNK(Thr183/Tyr185)、JNK、Cyclin B1和p-CDC2(Tyr15)等蛋白表达水平的影响，β-actin被作为内参蛋白，每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示。结果见图33。
由图30至33可知，抑制或者敲降TRPM2均能显著下调Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、Cyclin E1、Cyclin A2和p-CDK2(Thr160)等G1/S期细胞周期调控关键蛋白的表达和磷酸化水平，而对p-JNK(Thr183/Tyr185)、JNK以及G2/M期细胞周期调控密切相关的Cyclin B1、p-CDC2(Tyr15)的表达和磷酸化水平没有明显影响，与细胞周期检测的结果相符，从而进一步证实抑制TRPM2的功能和表达可诱导G1/S期细胞周期停滞的发生，而对G2/M期影响较小。
(3)抑制TRPM2通道的功能和表达可诱导G1/S期细胞周期停滞
对两种正常肝细胞的细胞周期分布情况进行检测。TRPM2抑制剂A10(30μM)处理正常肝细胞系HL-7702和MIHA细胞24h，测定A10对正常肝细胞系HL-7702和MIHA细胞周期分布的影响。结果见图34。同法测定TRPM2敲降对正常肝细胞系HL-7702和MIHA细胞周期分布的影响。结果见图35。
由图34和图35可知，结果发现无论是TPRM2抑制剂A10处理，还是TRPM2特异性敲降，HL-7702和MIHA细胞中G1、S和G2各分期的细胞比例与对照组相比均无显著性差异，提示抑制TRPM2通道的功能和表达对正常肝细胞的细胞周期几乎没有影响。也进一步明确了以TRPM2为靶点的细胞干预方式对正常肝细胞和肝癌细胞有明显的选择性。
(4)TRPM2通道表达与细胞周期调控呈正相关
通过Metascape富集分析软件对GEO数据库中的GSE124535数据集中的35例配对的肝癌组织及癌旁非癌组织的转录组数据进行差异分析(差异分析方法：Limma包，padj＜0.05，|log2FC|＞1)，并对其表达上调的基因进行富集分析。结果见图36至。
图36展示了排序前20位的信号通路，排名第一的信号通路就是细胞周期通路，可见细胞周期调控在肝癌疾病进展中的核心作用。
通过clusterProfiler(vesion：3.18.1)对基于TCGA-LIHC数据库中肝癌组织与癌旁非癌组织表达矩阵中的差异基因进行基因集富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis，GSEA)，差异分析方法：Limma包，padj＜0.05，|log2FC|＞1，并对GO(GeneOntology)基因集以及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)基因集进行Cell cycle通路的富集分析，结果见图37和图38。
由图37和图38可知，GO和KEGG基因集的Cell cycle通路均显著上调，提示细胞周期通路在肝癌发生过程中的确发挥了关键性的正向调控作用。
对比分析TCGA-LIHC数据库中正常肝组织(n＝50)，TRPM2低表达肝癌组织(n＝187)以及TRPM2高表达肝癌组织(n＝187)的细胞周期调控蛋白Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E1、Cyclin E2、Cyclin A1、Cyclin A2和Cyclin B1的相对mRNA表达水平，单因素方差分析进行显著性分析，随后用Tukey’s post hoc进行两两比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。结果见图39。
由图39可知，与正常肝组织(Normal)相比，TRPM2高表达的肝癌组织中，与G1期和S期细胞周期调控密切相关的Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E1、Cyclin E2、Cyclin A1和Cyclin A2的表达均显著上调；而与TRPM2低表达肝癌组织相比，TRPM2高表达的肝癌组织中除Cyclin A1之外，其它G1/S期调控蛋白的mRNA表达水平也均有显著提高，提示TRPM2表达水平与G1/S期细胞周期调控蛋白的表达呈正相关。此外，我们也发现与G2/M期细胞周期调控密切相关的Cyclin B1，虽可见正常肝组织中Cyclin B1的表达显著低于肿瘤组织，但TRPM2低表达和TRPM2高表达的肝癌组织中，其表达水平并无明显差别，也提示TRPM2表达可能与肝癌的G2/M期细胞周期调控没有直接关联。
综上，可以说明TRPM2通道在细胞周期调控过程中发挥了重要作用，抑制TRPM2通道的功能和表达均可诱导G1/S期细胞周期停滞，抑制细胞增殖，从而减慢肝癌细胞生长。值得一提的是，抑制TRPM2通道的功能和表达对正常肝细胞的细胞周期调控以及细胞增殖几乎没有影响，与前述结果中抑制或敲降TRPM2对正常肝细胞生长影响较小的现象相吻合，也进一步说明以TRPM2为靶点的细胞干预方式在正常肝细胞和TRPM2高表达的肝癌细胞中具有明显的选择性。
实施例6、TRPM2高表达肝癌组织中，细胞增殖水平显著提高
(1)免疫组化染色
取肝癌患者肝组织切片H&E染色，TRPM2、Ki67免疫组化染色结果见图40。
由图40可知，免疫组化染色结果显示TRPM2表达显著上调的肝癌组织中，Ki67染色阳性细胞比例也明显增多，提示TRPM2高表达的肝癌组织的细胞增殖能力更强。
(2)Western blot检测细胞增殖和细胞周期调控相关蛋白的表达
使用Western blot检测了肝癌患者肿瘤组织(T)和配对的非肿瘤组织(N)中TRPM2、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin A2等蛋白表达水平，结果见图42，β-actin被作为内参蛋白。
由图42可知，与正常肝组织相比，TRPM2表达显著上调的肝癌组织中，细胞增殖关键蛋白PCNA的表达显著增加，与之相对应的，G1/S期细胞周期调控关键蛋白Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2的表达水平也都有明显的提高，与免疫组化结果相吻合。
上述结果说明TRPM2高表达的肝癌组织中，细胞增殖水平显著提高。
实施例7、抑制TRPM2能通过Ca2+/CaM信号通路诱导G1/S期细胞周期停滞，抑制细胞增殖
(1)Ca2+和Zn2+螯合研究
可透过细胞膜的特异的Ca2+螯合剂：BAPTA-AM；
可透过细胞膜的特异的Zn2+螯合剂：TPEN。
Ca2+螯合剂，CaM抑制剂，Zn2+螯合剂或PARP-1抑制剂单独处理或联合TRPM2抑制剂A10处理Huh-7和HepG2，检测其对细胞克隆形成能力的影响，将Huh-7或HepG2细胞接种于6孔板中，分别用Control(0.1％DMSO)、BAPTA-AM(10μM)、W-7(40μM)、TPEN(5μM)、PJ-34(20μM)单独处理或联合A10(30μM)处理10-14天，4％PFA固定后用0.1％的结晶紫水溶液进行染色，结果见图43和44。
根由图43和44可知，单独使用BAPTA-AM螯合胞内Ca2+能显著抑制Huh-7和HepG2细胞的克隆形成能力，并且BAPTA-AM联合TRPM2抑制剂A10处理并不会进一步增加对细胞克隆形成能力的抑制作用；然而单独使用TPEN螯合胞内Zn2+却并未见Huh-7和HepG2细胞克隆形成能力减弱的现象。
使用EdU染色来定量分析TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂或CaM抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞增殖能力的影响。Control(0.1％DMSO)、A10(30μM)、BAPTA-AM(10μM)或W-7(40μM)处理24小时后进行EdU染色，结构见图45和46。
图45和46中，左编为EdU染色的代表图像，比例尺：100μm；右边为EdU染色阳性细胞占Hoechst阳性细胞比例的定量统计结果，单因素方差分析进行显著性分析，随后用Dunnett法进行两两比较，****P＜0.0001。
通过CCK-8检测TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂或CaM抑制剂处理单独或联合处理对Huh-7和HepG2细胞活力的影响。Control(0.1％DMSO)、A10(30μM)、BAPTA-AM(10μM)、A10+BAPTA-AM、W-7(40μM)、A10+W-7处理24小时后进行CCK-8检测，****P＜0.0001。每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示。结果见图47和图48。
由图45至图48可知，螯合胞内Ca2+能显著降低Huh-7和HepG2细胞中EdU染色阳性细胞比例，对细胞活力也有明显的抑制，且BAPTA-AM联合A10处理并不会进一步诱导细胞活力的下降。以上结果说明抑制TRPM2介导的肝癌细胞增殖抑制的现象主要是通过Ca2+实现，而非Zn2+。
(2)Ca2+/CaM信号通路在TRPM2介导的细胞增殖调控过程发挥作用
通过(1)中的实验结果，可知40μM的W-7处理能显著抑制Huh-7和HepG2细胞的克隆形成能力，降低EdU增殖阳性细胞比例，并诱导细胞活力下降；且W-7联合A10处理不会进一步抑制细胞克隆形成能力，也不会进一步增加细胞活力的下降，与BAPTA-AM处理的结果相似，提示Ca2+/CaM信号通路在TRPM2介导的细胞增殖调控过程中发挥了重要作用。
综合上述结果，可以证明抑制TRPM2能通过Ca2+/CaM信号通路起到抑制细胞增殖和生长的作用。
实施例6、抑制TRPM2能通过Ca2+/CaM信号通路诱导G1/S期细胞周期停滞
分别用Control(0.1％DMSO)、A10(30μM)、BAPTA-AM(10μM)、W-7(40μM)处理细胞24小时，随后用PI染色确定细胞周期分布情况。结果见图49。
图49中，左边为细胞周期分布代表图像，右边为不同处理组G1，S，G2期各分期细胞所占百分比的统计结果，双因素方差分析进行显著性分析，随后用Bonferroni法进行两两比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
胸苷(thymidine，TdR)双阻断法诱导Huh-7和HepG2这两种肝癌细胞的细胞周期同步化，使其细胞周期均同步在G1/S期交界处，随后分别用含0.1％DMSO(Control)、A10(30μM)、BAPTA-AM(10μΜ)或W-7(40μΜ)的新鲜培养基使细胞周期分别释放0、2、4、6、8和12小时，来观察不同处理对细胞周期转变的影响。具体操作为：先用TdR(thymidine)双阻断法诱导Huh-7(D)和HepG2(E)细胞同步化，随后分别用含0.1％DMSO(Control)，A10(30μM)，BAPTA-AM(10μΜ)或W-7(40μΜ)的新鲜培养基使细胞周期释放0-12小时，用PI染色法确定各个时间点的细胞周期分布情况。每组实验至少进行三次独立重复实验，数据用均数±标准误表示。结果见图50和51。
A10处理后进入S期的细胞百分比与对照组相比明显减少；相似的结果在BAPTA-AM和W-7处理后也同样可以看到，从而进一步明确了TRPM2和Ca2+/CaM信号通路在肝癌细胞G1/S细胞周期调控中的重要作用。
由图49可知，BAPTA-AM和W-7处理均能显著增加G1期细胞比例，而S期和G2期细胞比例则有不同程度的降低。
由图50和51可知A10处理后进入S期的细胞百分比与对照组相比明显减少；相似的结果在BAPTA-AM和W-7处理后也同样可以看到，从而进一步明确了TRPM2和Ca2+/CaM信号通路在肝癌细胞G1/S细胞周期调控中的重要作用。
方法一：TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理Huh-7和HepG2细胞；
方法二：TRPM2敲降联合CaM抑制剂W-7处理Huh-7和HepG2细胞；
方法三：TRPM2抑制剂、Ca2+螯合剂、CaM抑制剂处理Huh-7和HepG2细胞；
方法四：TRPM2敲降联合CaM抑制剂W-7处理Huh-7和HepG2细胞。
使用Western blot检测其对TRPM2、CaM、p-CaMKII(Thr286)、CaMKII、Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、CDK4、p21、p27、Cyclin E1、p-CDK2(Thr160)、CDK2、p-Rb(Ser807/811)、p-Rb(Ser795)、Rb和Cyclin A2等蛋白表达水平的影响，β-actin被作为内参蛋白。结果见图52。将结果进行定量统计，单因素方差分析进行显著性分析，随后用Dunnett法与control组进行两两比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。结果见图52至55。
由图52至55可知，BAPTA-AM(10μM)和W-7(40μM)处理24小时后，TRPM2蛋白的表达水平并未发生明显改变，而CaM表达水平显著降低(与30μM A10单独处理后的结果相近)；与之相对应的，G1/S期细胞周期调控关键蛋白Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、Cyclin E1、p-CDK2(Thr160)和Cyclin A2的蛋白表达水平与对照组(Control组)细胞相比均有显著降低；
螯合胞内Ca2+或抑制CaM均能够显著抑制Rb的磷酸化，并上调p21和p27的表达。
TRPM2敲降本身也同样能够显著下调CaM、Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、CyclinE1、p-CDK2(Thr160)、Cyclin A2、p-Rb(Ser807/811)和p-Rb(Ser795)的蛋白表达或磷酸化水平，并上调p21和p27的表达水平，与TRPM2抑制剂A10处理的结果基本一致。
TRPM2敲降联合W-7处理并不会进一步增加上述这些蛋白表达水平的改变，提示TRPM2极可能就是直接通过Ca2+/CaM信号通路发挥细胞周期调控的作用。
(3)肝癌患者组织样本中CaM的蛋白表达水平检测
通过检测肝癌患者组织样本中CaM的蛋白表达水平，结果见图56和图57，与正常肝组织相比，TRPM2高表达的肝癌组织中，也同样观察到CaM的蛋白表达水平有明显的提高，提示TRPM2与CaM的表达水平之间呈正相关关系。
综合上述结果，可以充分说明抑制TRPM2能通过Ca2+/CaM信号通路，抑制下游G1/S期细胞周期调控相关蛋白的表达和磷酸化激活过程，诱导G1/S期细胞周期停滞，从而抑制肝癌细胞增殖。
实施例7、抑制CaMKII能诱导G1/S期细胞周期停滞，显著抑制肝癌细胞增殖
可渗透细胞的竞争性CaMKII抑制剂：KN-93。
使用抑制剂KN-93处理细胞，并使用EdU染色定量分析CaMKII抑制剂KN-93处理对Huh-7和HepG2细胞增殖能力的影响。Control(0.1％DMSO)、KN-93(5μM)处理24小时后进行EdU染色，结果见图58。图58中，左图为EdU染色的代表图像，比例尺：100μm；右图为EdU染色阳性细胞占Hoechst阳性细胞比例的定量统计结果，两独立样本t检验，****P＜0.0001。
CaMKII抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞：分别用Control(0.1％DMSO)、KN-93(5μM)处理细胞24小时，随后用PI染色确定细胞周期分布情况，结果见图59。图59中，左图为细胞周期分布代表图像，右图为不同处理组G1、S和G2期各分期细胞所占百分比的统计结果，双因素方差分析进行显著性分析，随后用Bonferroni法进行两两比较，*P＜0.05，***P＜0.001。
CaMKII抑制剂处理对Huh-7和HepG2细胞，对Huh-7和HepG2细胞TRPM2、CaM、p-CaMKII(Thr286)、CaMKII、Cyclin D1、p-CDK4(Thr172)、CDK4、p-Rb(Ser807/811)、p-Rb(Ser795)、Rb、p21、p27、Cyclin E1、p-CDK2(Thr160)、CDK2和Cyclin A2等蛋白表达水平的影响。结果见图60，定量统计结果见图61至62。
实施例8、抑制或敲降TRPM2通道能显著减缓PDX移植瘤和Huh-7移植瘤的生长
(1)肝癌疾病模型构建
构建病人来源的裸鼠移植瘤模型(Patient-derived xenografts，PDX移植瘤)以及Huh-7细胞来源的裸鼠移植瘤模型(简称Huh-7移植瘤)分别进行动物在体层面探究。PDX移植瘤造模过程见图63，将肝癌患者手术中切除的部分肝癌组织接种到BALB/c Nude裸鼠皮下，皮下成瘤后进行扩增传代，至P3代后进行药物干预和处理。Western blot的结果证实用于造模的肝癌患者的肿瘤组织中，TRPM2表达显著上调(图64)。
(2)市售TRPM2抑制剂ACA和发明人设计的TRPM2抑制剂A10抑制PDX移植瘤和Huh-7移植瘤效果验证。
分别用TRPM2抑制剂ACA和A10对PDX移植瘤裸鼠进行药物干预实验，按照30mg/kg/天的剂量分别给予溶剂对照组(Control，n＝5)，ACA处理组(n＝5)和A10处理组(n＝5)连续腹腔注射给药，28天后脱颈椎处死，红色圈出部位即为移植瘤。通过腹腔注射连续给药处理28天后发现TRPM2抑制剂处理组裸鼠(ACA处理组或A10处理组)的移植瘤相比于对照组裸鼠(Control组)明显更小(见图65)，并且PDX移植瘤的肿瘤重量以及肿瘤生长曲线与对照组相比也都有显著下降(图66和图67)，而对裸鼠体重(裸鼠体重，每2天测量一次移植瘤的长径(a)和短径(b)，肿瘤体积用公式：V＝1/2×a×b2计算得到，*P＜0.05；G.PDX裸鼠体重随时间变化的曲线图，每天测量一次)并没有明显影响(图68)，提示抑制TRPM2能显著减缓PDX移植瘤的生长，同时对生物体的副作用相对较小。
实施例9、抑制或敲降TRPM2通道能显著减缓PDX移植瘤和Huh-7移植瘤的生长
发明人构建了一批Huh-7移植瘤，分别将相同数量的成功转染shTRPM2或shNC的Huh-7细胞接种至BALB/c Nude裸鼠皮下进行成瘤，Huh-7细胞分别转染慢病毒包被的shNC和shTRPM2，随后按照3×105细胞/只裸鼠的比例，分别皮下接种Huh-7shNC(n＝9)和Huh-7shTRPM2(n＝9)细胞，连续观察35天，至移植瘤体积约为1000mm3时，脱颈椎处死裸鼠，并剥离收集移植瘤(红色全出部分为移植瘤)。结果同样观察到TRPM2敲降组(shTRPM2组)的Huh-7移植瘤的肿瘤大小和肿瘤重量均显著低于shNC对照组(图69和图70)。
以上两种在体移植瘤模型的结果充分证明抑制或敲降TRPM2通道均能显著减缓PDX移植瘤和Huh-7移植瘤的生长。
实施例10、抑制或敲降TRPM2能显著抑制PDX移植瘤和Huh-7移植瘤的细胞增殖水平和细胞周期相关蛋白表达
发明人检测PDX移植瘤和Huh-7移植瘤组织的细胞增殖和G1/S期细胞周期调控关键蛋白的表达情况，结果见图71。
由图71可知，在PDX移植瘤中，ACA和A10处理对TRPM2的蛋白表达水平没有明显影响，但能显著下调增殖关键蛋白Ki67的表达水平。
由图71至73可知，对照组相比，A10处理能显著降低Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin A2的蛋白表达水平，说明了抑制TRPM2能显著抑制PDX移植瘤的细胞增殖水平和G1/S期细胞周期调控蛋白的表达水平。而在Huh-7移植瘤中，相较于shNC对照组，shTRPM2组移植瘤组织中TRPM2的免疫组化染色水平显著降低，证明TRPM2被成功敲降，并且Ki67染色的结果也同样证实TRPM2敲降后，Huh-7移植瘤组织的细胞增殖水平显著降低。
以上结果充分证明抑制或敲降TRPM2能显著抑制PDX移植瘤和Huh-7移植瘤的细胞增殖水平，并下调G1/S期细胞周期调控相关蛋白的表达。
实施例11、TRPM2在人肝癌组织中高表达，并与患者预后呈负相关
我们利用生物信息学分析的方法对The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库和GEO数据库中的GSE124535数据集进行分析，其中TCGA数据库中共提取到49例正常肝组织(Non-tumor)和361例肝癌组织(Tumor)的mRNA表达数据，GSE124535队列中获取35例配对的肝癌组织和正常肝组织RNA测序数据，通过对上述两个数据库中的正常肝组织和肝癌组织中TRPM2的mRNA表达水平进行对比分析发现肝癌组织中TRPM2的mRNA表达水平均显著高于正常肝组织。随后，我们依据TRPM2 mRNA表达水平高低，将TCGA数据库中的361例肝癌患者分为TRPM2高表达组和TRPM2低表达组，并使用GEPIA2中的“Survival Analysis”模块对其进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示TRPM2高表达组患者的生存期要显著低于低表达患者，P＝0.041，HR＝1.4。提示TRPM2高表达与肝癌患者的不良预后密切相关。
为了验证生物信息学分析的结果，我们与浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科开展合作研究，并先后获得104例配对的临床肝癌患者手术切除的冰冻组织和87例配对的石蜡包埋组织样本。首先通过Western blot对TRPM2的蛋白表达水平进行检测，发现104例患者中，有88例患者肝癌组织中的TRPM2蛋白表达水平高于正常肝组织，占总病例的84.6％；并且定量统计分析的结果进一步证实，肝癌组织中TRPM2蛋白表达水平显著上调。随后，我们分别对石蜡包埋的正常肝组织和肝癌组织样本进行H&E染色和TRPM2免疫组化染色，同样发现在87例患者中，有53例患者肝癌组织中的TRPM2染色阳性强度要显著高于正常肝组织，。
同时我们也对104例患者进行定期跟踪随访，并验证了TRPM2表达水平与患者总生存期的相关性。并且我们根据Western bolt定量检测的TRPM2相对表达水平的中位数，将患者分TRPM2高表达组和TRPM2低表达组，进行Kaplan-Meier总生存期比较，发现TRPM2高表达组患者术后总生存时间明显小于TRPM2低表达患者，HR＝2.044，P＝0.0285，与生信分析的结果相吻合。综上，可以明确TRPM2在肝癌组织中高表达，并与患者预后呈负相关。
实施例12、药物筛选获得TRPM2抑制剂
发明人对以A10的结构为基础，设计了下述20种分子，A10以及下述20种TRPM2抑制剂分子结构如下表1，并按照实施例8同样的方法在动物水平验证抑制PDX移植瘤和Huh-7移植瘤能力。
表1
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> TRPM2抑制剂的用途
<130> P220158-1CNCNB5
<140> 202210209735X
<141> 2022-03-03
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gcgtgatcta ccacctcatg a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
ggccaaggac atgaagtttg t 21

Claims (5)

1.TRPM2抑制剂用于制备预防和/或治疗肝癌的药物；其中，所述TRPM2抑制剂为sh-RNA，所述sh-RNA为如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸或如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸；
或者，所述TRPM2抑制剂为ACA和/或A10。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；或具有如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸。
3.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求2所述的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3或4所述的载体。
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