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CN116712555A - 一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡及其制备方法 - Google Patents

一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，更具体地，涉及一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡及其制备方法。该载药细菌外膜囊泡包括细菌外膜囊泡，以及该细菌外膜囊泡包裹的具有神经抑制作用的小分子药物，所述细菌外膜囊泡表面还修饰有神经细胞靶向分子。本发明提供的载药细菌外膜囊泡能够有效靶向肿瘤微环境中神经，同时有效阻断神经与肿瘤的相互作用，抑制肿瘤微环境中神经浸润和神经轴突生长，进而抑制肿瘤生长。本发明制备方法简单，可操作性强，制备得到的载药细菌外膜囊泡具有良好的生物相容性，具有良好的临床应用前景。

Description

一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡及其制备 方法
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，更具体地，涉及一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡及其制备方法。
背景技术
在肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)的组成部分中，肿瘤内神经浸润对肿瘤的发生和发展起着重要的促进作用，与预后不良有关。与神经系统在组织中的关键作用类似，肿瘤内神经通过旁分泌信号，如神经递质(如谷氨酸、血清素和去甲肾上腺素)、直接的电化学信号和全身神经-肿瘤相互作用，促进实体肿瘤(如胰腺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和脑胶质瘤等)和血液肿瘤的发展和转移。由于神经与肿瘤之间的串扰是一个互惠互利的过程，神经也会受到肿瘤细胞的影响。大量研究表明，肿瘤细胞来源的神经营养因子，如神经生长因子(NGF)是肿瘤组织招募神经、促进神经浸润和神经轴突生长的主要驱动因子，其中NGF似乎是肿瘤诱导神经浸润最关键的调节因子。除了肿瘤细胞外，TME中的免疫细胞也可能对肿瘤内的神经产生影响，尤其是巨噬细胞。这是因为肿瘤细胞极易侵袭神经，出现嗜神经侵袭(perineural invasion，PNI)现象，使得神经受损，进而会招募具有组织修复能力的M2型巨噬细胞，促进神经修复及生长。
目前，干预肿瘤神经支配的方式有基因阻断(腺相关病毒载体向特定神经元逆行递送基因)、化学阻断(6-羟多巴胺、肉毒毒素或辣椒素)和手术去神经支配，在动物实验中去神经支配均显示出对肿瘤生长和转移的显著抑制作用。此外，β-肾上腺素能阻滞剂治疗可减少乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤的进展，负载布比卡因的脂质体可显著抑制乳腺癌的生长和转移。这些研究表明，调控肿瘤微环境中神经可为肿瘤治疗提供新的途径。
细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是一种主要由革兰阴性菌通过出芽方式产生的天然球形囊泡，直径为30～250nm。OMVs包含来自细菌的抗原和多种病原相关分子模式，如脂多糖、鞭毛蛋白和肽聚糖等，是一种很有前景的免疫佐剂。此外，由于OMVs具有易制备、生物相容性较好、稳定性良好以及独特肿瘤靶向能力等，已广泛用于抗肿瘤药物递送的研究。
因此，研究开发靶向肿瘤组织神经的纳米递药系统，阻断神经-肿瘤串扰，以实现对肿瘤生长的抑制或者协同增效现有肿瘤疗法，具有重要的临床应用价值。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡及其制备方法，其中利用细菌外膜囊泡作为药物载体，并包裹具有神经抑制作用的小分子药物且细菌外膜囊泡表面还修饰有神经细胞靶向分子，相应得到的载药细菌外膜囊泡能够有效靶向肿瘤微环境中神经，有利于高神经密度肿瘤的靶向干预，同时，该载药细菌外膜囊泡能够有效阻断神经与肿瘤的相互作用，阻断神经-肿瘤串扰，抑制肿瘤微环境中神经浸润和神经轴突生长，进而抑制肿瘤生长。此外，该载药细菌外膜囊泡还能够有效逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞，改善肿瘤神经微环境的同时，抑制神经细胞的生长和神经轴突生成，造成神经损伤，影响神经功能。载药细菌外膜囊泡中的三种组分相互促进协同作用抑制肿瘤生长，提高治疗疗效。本发明制备方法简单，可操作性强，制备得到的载药细菌外膜囊泡具有良好的生物相容性，具有良好的临床应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡，包括细菌外膜囊泡，以及该细菌外膜囊泡包裹的小分子药物，所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物；所述细菌外膜囊泡表面还修饰有神经细胞靶向分子。
优选地，所述细菌外膜囊泡包括大肠杆菌来源的细菌外膜囊泡、嗜黏蛋白阿克曼菌来源的细菌外膜囊泡或减毒沙门氏菌来源的细菌外膜囊泡。
优选地，所述细菌外膜囊泡、所述神经细胞靶向分子、所述药物的质量比为(1-20):1:(1-200)。
优选地，所述小分子药物为Trk抑制剂、麻醉剂或其它具有神经抑制作用的小分子药物。
优选地，所述Trk抑制剂为拉罗替尼、恩曲替尼、AZ23和LOXO-195中的一种或多种；所述麻醉剂为普鲁卡因、丁卡因和利多卡因中的一种或多种；所述其它具有神经抑制作用的小分子药物为神经毒素肉毒素和6-羟基多巴胺中的一种或多种。
优选地，所述神经细胞靶向分子包括神经细胞靶向肽和偶联物，所述神经细胞靶向肽偶联于所述偶联物表面，所述偶联物能够通过脂质嵌插的方式连接到所述细菌外膜囊泡表面，所述神经细胞靶向肽选自NP41、RVG、HNP401、HNP402和HNP403中的一种或多种。
优选地，所述载药细菌外膜囊泡的粒径为30nm～250nm。
本发明还提供了一种所述载药细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将细菌外膜囊泡与神经细胞靶向分子混合孵育，通过脂质嵌插的方式使神经细胞靶向分子修饰到细菌外膜囊泡表面，收集得到神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡；
S2、将所述神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡与小分子药物混合孵育，所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物，收集得到靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡。
优选地，步骤S1中，所述细菌外膜囊泡与所述神经细胞靶向分子的质量比为(1-20):1。
优选地，步骤S1和S2中，所述收集条件为：在4℃条件下，以2000g～150000g的离心力收集。
本发明还提供了一种治疗癌症的药物，其包括所述载药细菌外膜囊泡，还包括化疗药物。
优选地，所述化疗药物为能够促进肿瘤细胞高表达神经生长因子的化疗药物，所述能够促进肿瘤细胞高表达神经生长因子的化疗药物选自吉西他滨或阿霉素类化疗药物中的一种或多种。
进一步优选地，所述氨霉素类化疗药物选择阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和吡柔比星中的一种或多种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡，包括细菌外膜囊泡，以及该细菌外膜囊泡包裹的小分子药物，所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物；所述细菌外膜囊泡表面还修饰有神经细胞靶向分子。该载药细菌外膜囊泡能够有效靶向肿瘤微环境中神经，阻断神经与肿瘤的相互作用，在抑制肿瘤微环境中神经浸润和神经轴突生长的同时，抑制肿瘤生长。
(2)本发明将细菌外膜囊泡修饰神经细胞靶向分子后作为本发明的载药细菌外膜囊泡的载体，可使具有神经抑制作用的小分子药物在肿瘤部位蓄积，能够有效靶向肿瘤微环境中神经，降低小分子药物对机体的毒副作用，还能够有效逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型，改善肿瘤神经微环境，抑制神经细胞的生长和神经轴突生成。同时该载药细菌外膜囊泡还包裹有具有神经抑制作用的小分子药物，通过阻断神经-肿瘤串扰，进而抑制肿瘤神经浸润和神经生长。本发明提出了一种阻断神经-肿瘤串扰，以实现对肿瘤生长的抑制或者协同增效现有肿瘤疗法的新策略。
(3)本发明通过实验证明，载药细菌外膜囊泡中细菌外膜囊泡能够有效逆极化M2型肿瘤相关巨噬细胞到M1型，改善肿瘤神经微环境，抑制神经细胞的生长和神经轴突生成，而修饰有神经细胞靶向分子的细菌外膜囊泡使得包裹的小分子药物更多的与神经细胞作用，从而其阻断神经-肿瘤串扰的效果更显著，三者相互促进协同作用，使得载药细菌外膜囊泡能够显著抑制神经细胞的增殖和神经细胞的轴突生成，可以有效抑制神经细胞的功能，从而有效阻断神经与肿瘤的相互作用，还能够显著减缓神经细胞促进的肿瘤细胞的增值和迁移。
(4)与单独施用OMV、NP-OMV、Lar、Lar-OMV相比，本发明提供的载药细菌外膜囊泡(Lar@NP-OMV)在癌症治疗中表现出协同效应，Lar@NP-OMV能有效靶向肿瘤微环境中神经，抑制神经生长，进而抑制肿瘤生长，延长生存期，其治疗效果显著优于其它对照组，甚至优于单一NP-OMV和单一Lar的技术效果的简单加和。
(5)本发明提供的载药细菌外膜囊泡可以联合其他化疗药物，实现协同抗肿瘤效果，同时对生物体无明显毒副作用，具有良好的生物相容性。较佳实施例中，将本发明提供的载药细菌外膜囊泡与能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物联合治疗癌症时，能够显著抑制肿瘤生长，药物之间存在协同作用使得联合治疗的效果优于单一载药细菌外膜囊泡、单一化疗药物。
附图说明
图1为实施例1中经过神经结合肽NP41修饰后的载药细菌外膜囊泡的检测结果；其中图1A为囊泡粒径大小，图1B为囊泡Zeta电位。
图2为实施例2中经过神经结合肽NP41修饰后的载药细菌外膜囊泡的检测结果；其中图2A为囊泡粒径大小，图2B为囊泡Zeta电位。
图3为实施例3中囊泡的TEM图片。
图4为实施例4中NP41修饰的囊泡的摄取结果；其中图4A为PC12神经细胞对DiO标记的囊泡的摄取结果，图4B为DRG原代神经细胞对DiO标记的囊泡的摄取结果。
图5为实施例5中囊泡在荷瘤小鼠不同组织中的分布；其中图5A为尾静脉注射IR780标记的OMV和NP-OMV后小鼠原位胰腺肿瘤在不同时间点的活体成像结果，图5B为肿瘤部位荧光强度的定量，图5C为胰腺肿瘤和主要器官的体外荧光成像，图5D为胰腺肿瘤和主要器官荧光强度的定量分析，图5E为NP-OMV与神经标志物β3-tubulin的共定位分析，图5F为共定位分析的半定量结果。
图6为实施例6中载药囊泡对PC12神经细胞生长的影响；其中图6A为PC12神经细胞的增殖情况，图6B为PC12神经细胞轴突长度的定量。
图7为实施例7中载药囊泡作用于PC12神经细胞后对肿瘤细胞的影响；其中图7A、图7B分别为载药囊泡作用于PC12神经细胞后对Panc02增殖、迁移的影响。
图8为实施例8中载药囊泡逆极化M2型巨噬细胞的效果；其中图8A、图8B分别为载药囊泡逆极化M2型巨噬细胞后M1相关表面特征分子CD86、TNFα的表达变化，图8C、图8D分别为载药囊泡逆极化M2型巨噬细胞后M2相关表面特征分子Mgl1、Mrc1的表达变化。
图9为实施例9中载药囊泡逆极化M2型巨噬细胞后对神经细胞的影响；其中图9A、图9B分别为载药囊泡逆极化M2型巨噬细胞后上清对PC12神经细胞增殖、PC12神经细胞轴突生成的影响。
图10为实施例10中载药囊泡对Panc02原位胰腺癌的抑制效果；其中图10A为小鼠肿瘤的重量，图10B为小鼠的生存期。
图11为实施例11中载药囊泡对Panc02原位胰腺癌神经微环境的影响；其中图11A为小鼠肿瘤组织中GAP43阳性面积的比例，图11B为小鼠肿瘤组织中β3-tubulin阳性面积的比例。
图12为实施例12中载药囊泡对Panc02原位胰腺癌荷瘤小鼠的安全性；其中图12A为小鼠体重，图12B为小鼠血清中谷丙转氨酶含量，图12C为小鼠血清中肌酐含量。
图13为实施例13中吉西他滨对Panc02细胞NGF表达水平的影响。
图14为实施例14中载药囊泡联合吉西他滨对Panc02原位胰腺癌的抑制效果；其中图14A为小鼠胰腺肿瘤组织中的神经密度，图14B为小鼠胰腺肿瘤组织中的去甲肾上腺素含量，图14C为小鼠胰腺肿瘤的重量，图14D为小鼠的生存期。
图15为DRG原代神经细胞对RVG修饰的囊泡的摄取结果。
图16为实施例16中载药囊泡联合阿霉素对4T1原位乳腺癌的抑制效果；其中图16A为小鼠乳腺肿瘤组织中的神经密度，图16B为小鼠乳腺肿瘤的重量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明提供的一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡，包括细菌外膜囊泡，以及该细菌外膜囊泡包裹的小分子药物，所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物；所述细菌外膜囊泡表面还修饰有神经细胞靶向分子。
一些实施例中，上述细菌外膜囊泡可以是任一革兰氏阴性菌分泌的细菌外膜囊泡。一些实施例中，上述细菌外膜囊泡包括大肠杆菌来源的细菌外膜囊泡、嗜黏蛋白阿克曼菌来源的细菌外膜囊泡或减毒沙门氏菌来源的细菌外膜囊泡。
一些实施例中，上述细菌外膜囊泡、上述神经细胞靶向分子、上述小分子药物的质量比为(1-20):1:(1-200)。
一些实施例中，上述细菌外膜囊泡、上述神经细胞靶向分子、上述小分子药物的质量比为(1-10):1:(1-100)。
本发明所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物，这里的具有神经抑制作用的小分子药物可以为医学上认可的具有神经抑制作用的小分子药物。一些实施例中，上述小分子药物为Trk抑制剂、麻醉剂或其它具有神经抑制作用的小分子药物。其中上述Trk抑制剂可以阻断NGF的神经营养作用，通过阻断NGF-Trk信号通路进而抑制神经浸润和神经生长；上述麻醉剂、其它具有神经抑制作用的小分子药物能够直接抑制神经生长。然而，还不知道小分子药物的抑制神经作用是否通过与修饰有神经细胞靶向分子的细菌外膜囊泡联合而增强。因此，通过联合具有神经抑制作用的小分子药物和修饰有神经细胞靶向分子的细菌外膜囊泡的癌症治疗的协同效应可能是本发明的一个技术特征。
一些实施例中，上述Trk抑制剂为拉罗替尼、恩曲替尼、AZ23和LOXO-195中的一种或多种；上述麻醉剂为普鲁卡因、丁卡因和利多卡因中的一种或多种；上述其它具有神经抑制作用的小分子药物为神经毒素肉毒素和6-羟基多巴胺中的一种或多种。
一些实施例中，上述神经细胞靶向分子包括神经细胞靶向肽和偶联物，上述神经细胞靶向肽偶联于上述偶联物，上述偶联物能够通过脂质嵌插的方式连接到细菌外膜囊泡表面。一些实施例中，上述偶联物包括但不限于DSPE PEG-Mal、NH2-PEG-DSPE、N3-PEG-DSPE。
一些实施例中，上述神经细胞靶向肽选自NP41、RVG、HNP401、HNP402和HNP403中的一种或多种。
在本发明一些实施例中，上述神经细胞靶向分子选自DSPE PEG-NP41、DSPE PEG-RVG、NH2-PEG-RVG29、DSPE PEG-HNP401、DSPE PEG-HNP402和DSPE PEG-HNP403中的一种或多种。
一些实施例中，上述载药细菌外膜囊泡的粒径为30nm～250nm。
较佳实施例中，上述载药细菌外膜囊泡的粒径为50nm～150nm。
本发明还提供了一种上述载药细菌外膜囊泡的制备方法，包括如下步骤：
S1、将细菌外膜囊泡与神经细胞靶向分子混合孵育，通过脂质嵌插的方式使神经细胞靶向分子修饰到上述细菌外膜囊泡表面，收集得到神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡；
S2、将上述神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡与小分子药物混合孵育，上述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物，收集得到靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡。
作为可选方式，在上述载药细菌外膜囊泡的制备方法中，步骤S1具体包括如下步骤：
S1-1、制备细菌外膜囊泡：接种培养单个细菌菌落，离心收集菌液，对菌液进行过滤和浓缩，离心收集细菌外膜囊泡；
S1-2、制备神经细胞靶向分子：将偶联物溶于有机溶剂，将神经细胞靶向肽与偶联物混匀，搅拌进行偶联反应，然后进行透析、冻干，得到神经细胞靶向肽；
S1-3、将细菌外膜囊泡与神经细胞靶向分子混合孵育，通过脂质嵌插的方式使神经细胞靶向分子修饰到上述细菌外膜囊泡表面，收集得到神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡。
本发明上述细菌外膜囊泡可以根据本领域已知的各种方法从细菌培养物中分离。从细菌培养物中分离细菌外膜囊泡的技术类型没有特别的限制，例如，可以使用超速离心、密度梯度超速离心、超滤、尺寸排阻色谱、离子交换层析、免疫亲和捕获、基于微流体的分离、双水相系统或沉淀的方法。
一些实施例中，步骤S1-1中，上述离心的条件为：2000g～150000g离心10min至2h。
一些实施例中，步骤S1-2中，上述偶联反应的条件为：室温条件下搅拌反应3h～5h。
一些实施例中，步骤S1-3中，上述细菌外膜囊泡与上述神经细胞靶向分子的质量比为(1-20):1；上述孵育的时间为6h～12h。
一些实施例中，步骤S1和S2中，上述收集条件为：在4℃条件下，以2000g～150000g的离心力收集。
本发明还提供了一种治疗癌症的药物，其包括上述载药细菌外膜囊泡，还包括化疗药物。
一些实施例中，上述化疗药物为能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物。在实际应用中，上述能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物用于癌症治疗，虽然可以杀伤肿瘤细胞，但同时会引起肿瘤细胞高表达NGF，高表达的NGF能够促进神经浸润和神经突生长，不利于癌症治疗，导致单独使用能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物的治疗效果并不太理想。然而，还不知道能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物的治疗作用是否通过与外膜囊泡联合而增强。因此，通过联合能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物和载药细菌外膜囊泡的癌症治疗的协同效应可能是本发明的一个技术特征。
较佳实施例中，上述能够促进肿瘤细胞高表达NGF的化疗药物选自吉西他滨和阿霉素类化疗药物中的一种或多种。
较佳实施例中，上述阿霉素类化疗药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和吡柔比星中的一种或多种。
在本发明的一个方面，上述载药细菌外膜囊泡和上述化疗药物可以同时地、依次地或分别地共同施用。在本发明中，“同时地”是指两种药物同时施用，而“依次地”是指一种药物在另一种药物施用后的5分钟内、10分钟内或几小时内给药。然而，提供首先施用药物的循环中的半衰期，以使两种药物以治疗有效剂量同时存在。此外，同时、依次或分别施用的方法不限于一次，并且这些施用方法可以重复或联合施用。
在一个方面，上述载药细菌外膜囊泡和上述化疗药物可以与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂一起包含在治疗癌症的药物中。
在另一个方面，上述载药细菌外膜囊泡和上述化疗药物可以以单独的药物形式或试剂盒形式提供。
如本发明上述的治疗癌症的药物可以仅包括载药细菌外膜囊泡和化疗药物，或者可以与药学上可接受的载体，进一步包括赋形剂或稀释剂一起配制成合适的形式。上述载体包括所有种类的溶剂、分散介质、水包油或油包水乳剂、水性组合物、脂质体、微珠和微粒体。
本发明的治疗癌症的药物可以通过任何方法向包括人类在内的哺乳动物施用。例如，上述治疗癌症的药物可以口服或肠胃外给药。肠胃外给药方法可以包括静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠给药，但不限于此。
本发明的治疗癌症的药物可以根据如上所述的给药途径配制成用于口服给药或肠胃外给药的制剂。
本发明治疗癌症的药物的总有效剂量可以以单次剂量施用于患者，或者根据分次治疗方案，可以以长期多次剂量施用于患者。在本发明的治疗癌症的药物中，活性成分的含量可以根据疾病的严重程度而变化。治疗癌症的药物的有效剂量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况和性别、疾病的严重程度、饮食和排泄率以及配制方法、给药途径和治疗次数，本领域技术人员可以通过考虑这些因素来确定本发明治疗癌症的药物的合适有效剂量，因此并不对治疗癌症的药物的总剂量进行限定。本发明如上所述的治疗癌症的药物不特别限于配方、给药途径和给药方法，只要显示出本发明的效果。
本发明提供了载药细菌外膜囊泡和化疗药物在制备癌症治疗剂中的用途。
本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效剂量的治疗癌症的药物，上述治疗癌症的药物包含细菌外膜囊泡和化疗药物作为活性成分。
在本发明的一个方面，上述癌症可以是胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤或原发性中枢神经系统淋巴瘤，但不限于此。
本发明使用的术语“细菌外膜囊泡”是指由革兰氏阴性菌分泌的囊泡。
术语“载药细菌外膜囊泡”同“载药囊泡”，是指表面修饰有神经细胞靶向分子且包裹具有神经抑制作用的小分子药物的细菌外膜囊泡。
本发明的“有效剂量”是指当施用给受试者时，显示出改善、治疗、检测和诊断癌症、或抑制或减缓癌症进程的效果的量，并且所述“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人类在内的动物，也可以是来自动物的细胞、组织和器官。受试者可以是需要这些效果的患者。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
下述实施例所采用的主要试剂及材料来源如下：
PC12神经细胞购自中国科学院细胞库；DRG原代神经细胞从C57BL6/J小鼠脊椎提取；C57BL6/J雄性小鼠、SPF级BALB/C雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；Panc02细胞购自北京北纳创联生物技术研究院；小鼠骨髓来源巨噬细胞购自上海细胞库。
拉罗替尼、恩曲替尼、利多卡因购自MedChemExpress公司；DSPE PEG-Mal购自上海芃硕生物科技有限公司；NP41、RVG购自合肥国肽生物科技有限公司；DSPE-PEG-NP41、DSPE-PEG-RVG通过常规分子生物学手段构建获得；IR780购自Sigma-Aldrich公司；细胞膜绿色荧光染料DiO购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；IL-4购自Peprotech生物科技有限公司；TRIzol、逆转录试剂盒、SYBRGreen染料购自TaKaRa公司；吉西他滨购自山东齐鲁制药基集团有限公司；阿霉素购自Sigma公司。
实施例1神经结合肽NP41修饰的大肠杆菌来源外膜囊泡与小分子药物孵育制备载药囊泡
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41。
2.实验步骤
(1)将单个大肠杆菌菌落接种于LB培养基中，在37℃恒温摇床中培养至OD600值约为1.5，即可停止培养。收集达到培养终点的细菌悬液，4℃下2000g离心10min，取上清液经0.22μm真空过滤器过滤。浓缩滤液，150000g离心2h，收集沉淀，即得OMVs。
(2)称取10mg NP41溶于0.5mL、pH为8.0的PBS中，称取8.8mg DSPE PEG-Mal溶于0.5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，二者混匀后，补充PBS至12mL，室温条件下搅拌反应4h。使用截留分子量为3500Da的透析袋于PBS中透析，24h后将透析袋内的液体冻干后获得神经细胞靶向肽(DSPE-PEG-NP41)。
(3)将DSPE-PEG-NP41与OMVs以1:5的质量比均匀混合，37℃孵育12h，150000g离心1h，即可获得NP41修饰的囊泡。
(4)将上述NP41修饰的囊泡分散于0.5mL 0.9×PBS中，与50μg拉罗替尼混匀，37℃摇床孵育4h，150000g离心1h，PBS洗涤后，150000g离心1h，即可得到NP41修饰的载药囊泡。
(5)将上述NP41修饰的载药囊泡分散于PBS中，使用动态光散射粒度仪检测其粒径及Zeta电位。NP41修饰的载药囊泡作为实验组，未经NP41修饰的未载药囊泡作为对照组1，经NP41修饰的未载药囊泡作为对照组2，未经NP41修饰的载药囊泡作为对照组3。
3.实验结果
如图1A、图1B所示，得到的囊泡平均粒径为100-130nm左右，Zeta电位为-12mV左右，表明囊泡经NP41修饰和负载拉罗替尼后基本不改变囊泡的粒径和Zeta电位。
实施例2神经结合肽NP41修饰的大肠杆菌来源外膜囊泡与恩曲替尼孵育制备载药囊泡
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、DSPE-PEG-NP41、恩曲替尼。
2.实验步骤
(1)OMVs收集方法同实施例1；NP41修饰的囊泡收集方法同实施例1。
(2)将上述NP41修饰的囊泡分散于0.5mL 0.9×PBS中，与50μg恩曲替尼混匀，37℃摇床孵育4h，150000g离心1h，PBS洗涤后，150000g离心1h，得到NP41修饰的载药囊泡。
(3)将上述NP41修饰的载药囊泡分散于PBS中，置于4℃不同时间后使用动态光散射粒度仪检测其粒径及Zeta电位。NP41修饰的载药囊泡作为实验组，未经NP41修饰的未载药囊泡作为对照组1，经NP41修饰的未载药囊泡作为对照组2，未经NP41修饰的载药囊泡作为对照组3。
3.实验结果
实验结果显示，得到的囊泡平均粒径为130-150nm左右(图2A)，Zeta电位为-10mV左右(图2B)，而且在4℃下放置一定时间后，其平均粒径和Zeta电位仍能基本保持不变，表明囊泡经NP41修饰和负载恩曲替尼后仍然具有比较好的稳定性。
实施例3神经靶向肽NP41修饰的减毒沙门氏菌来源外膜囊泡与小分子药物孵育获得载药囊泡
1.实验材料和试剂
拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、减毒沙门氏菌(鸟苷四磷酸合成缺陷)。
2.实验步骤
(1)将单个减毒沙门氏菌菌落接种于LB培养基中，在37℃恒温摇床中培养至OD600值约为1.5，即可停止培养。收集达到培养终点的细菌悬液，4℃下2000g离心10min，取上清液经0.22μm真空过滤器过滤。浓缩滤液，150000g离心2h，收集沉淀，即得OMVs。
(2)将DSPE-PEG-NP41与OMVs以1:5的质量比均匀混合，在37℃下共孵育12h，150000g离心1h，即可获得NP41修饰的囊泡。
(3)将上述NP41修饰的囊泡分散于0.5mL 0.9×PBS中，与50μg拉罗替尼混匀，37℃摇床孵育4h，150000g离心1h，PBS洗涤后，150000g离心1h，即可得到NP41修饰的载药囊泡。
(4)4％多聚甲醛固定囊泡，10min后将固定完成的囊泡滴至置于封口膜上的铜网上，静置1h后，用2％磷钨酸液染色5min，用超纯水洗涤铜网3次以除去多余染液，将铜网置于滤纸上，室温晾干，通过HT7700型透射电镜观察囊泡的形貌。NP41修饰的载药囊泡作为实验组，未经NP41修饰的未载药囊泡作为对照组1，经NP41修饰的未载药囊泡作为对照组2，未经NP41修饰的载药囊泡作为对照组3。
3.实验结果
TEM结果显示，得到的囊泡为规则的球形形貌，粒径为50-150nm左右(图3)，表明减毒沙门氏菌来源的囊泡经NP41修饰和负载药物后基本不改变囊泡的粒径。
实施例4NP41修饰的囊泡在体外对神经细胞的靶向性
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、DSPE-PEG-NP41、PC12神经细胞、DRG原代神经细胞。
2.实验步骤
(1)按照实施例1制备NP41修饰的囊泡，并使用细胞膜绿色荧光染料DiO进行标记。
(2)将DRG原代神经细胞、PC12神经细胞分别以每孔3×105个细胞密度铺于6孔板，培养12h后，弃去上清，加入无血清新鲜培养基。
(3)向上述DRG原代神经细胞培养板中分别加入DiO标记的OMV、DiO标记的NP-OMV，37℃、5％ CO2下共培养6h。孵育完成后，弃去上清，PBS洗3次，胰酶消化细胞，1200rpm离心3min后，用300μL PBS重悬细胞，使用CytoFlex S流式细胞仪检测细胞DiO平均荧光强度。检测参数设置为：Ex＝488nm，检测滤光片为FITC。OMV为对照组，NP-OMV为实验组。PC12神经细胞摄取DiO标记的囊泡的方法同DRG原代神经细胞。
3.实验结果
流式细胞术检测结果显示，同OMV相比，PC12神经细胞中NP-OMV的荧光强度更强(图4A)。同样的，DRG原代神经细胞能够摄取更多的NP-OMV(图4B)。
实施例5NP41修饰的囊泡在体内的组织分布
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、DSPE-PEG-NP41、C57BL6/J小鼠。
2.实验步骤
(1)小鼠胰腺癌原位模型的构建：在小鼠左侧肋弓下5～10mm进行手术切口，用1mL胰岛素注射器吸取25μL Panc02细胞悬液(含1×106个细胞)注入小鼠胰腺头部，构建Panc02小鼠胰腺癌原位模型。
(2)接种肿瘤细胞4周后，将荷瘤小鼠随机分为2组，每组3只。将制备的IR780标记的NP41修饰的囊泡以蛋白定量1.75mg/kg的给药量经尾静脉注射3只荷瘤小鼠作为实验组，对3只荷瘤小注射相同剂量的IR780标记的未经NP41修饰的囊泡作为对照组。
(3)在静脉注射后0h、6h、12h、24h、48h和72h，使用IVIS Lumina II小动物成像系统对小鼠体内IR780荧光进行成像和拍照，并对肿瘤区域荧光总量进行定量分析。
(4)注射72h后，用颈椎脱臼法处死小鼠，取出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)及胰腺肿瘤，生理盐水冲洗后擦干表面水分，采用IVIS Lumina II小动物成像进行IR780荧光离体成像并对荧光总量进行统计分析。
(5)用4％ PFA固定小鼠肿瘤组织，经过梯度酒精脱水、组织透明、组织浸蜡及包埋后进行组织切片，使用Alexa Fluor 594-β3-tubulin抗体标记肿瘤组织中的神经纤维，通过共聚焦显微镜观察IR780标记的NP41修饰的囊泡或未经NP41修饰的囊泡和神经纤维的共定位情况，并用Image J进行分析。
3.实验结果
活体成像结果显示，随着时间的增加，IR780荧光信号在肿瘤组织逐渐增加，并在注射后24h达到峰值，且IR780标记的NP41修饰的囊泡在胰腺肿瘤组织中的荧光强度显著高于未经NP41修饰的囊泡组(图5A，图5B)。离体成像结果也显示，NP41修饰的囊泡在胰腺肿瘤组织中富集最多(图5C，图5D)。此外，免疫荧光染色结果显示，NP41修饰的囊泡与神经纤维可以很好地进行共定位(图5E，图5F)。以上结果表明，NP41修饰的囊泡可以靶向胰腺肿瘤组织中的神经。
实施例6载药囊泡对PC12神经细胞的影响
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、PC12神经细胞。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)将PC12神经细胞以每孔1×104个细胞的密度铺于96孔板，培养过夜后，加入含50ng/mL NGF(神经生长因子)和1％ FBS(胎牛血清)的RPMI 1640培养基及载药囊泡，37℃、5％ CO2条件下培养。24h后，弃去上清，每孔加入有CCK8试剂的新鲜无血清培养基孵育4h，培养结束后使用酶标仪检测450nm波长处溶液的吸光度值。按5μg/mL(蛋白量)加入NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)的PC12神经细胞作为实验组，不做处理的PC12神经细胞作为对照组1，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的囊泡(OMV)的PC12神经细胞作为对照组2，按5μg/mL(蛋白量)加入经NP41修饰的囊泡(NP-OMV)的PC12神经细胞作为对照组3，按50ng/mL加入拉罗替尼(Lar)的PC12神经细胞作为对照组4，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的载药囊泡(Lar@OMV)的PC12神经细胞作为对照组5。
(3)将PC12神经细胞以每孔1×104细胞的密度铺于12孔板，培养过夜后，加入含50ng/mL NGF和1％ FBS的RPMI 1640培养基及载药囊泡，37℃、5％ CO2条件下培养。每日观察各组细胞轴突生长情况，并于加药72h后，利用LEICA倒置荧光显微镜拍照记录，通过Image J(Fiji)的简单神经突示踪插件对神经突生长情况进行定量分析，统计平均轴突长度。按5μg/mL(蛋白量)加入NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)的PC12神经细胞作为实验组，不做处理的PC12神经细胞作为对照组1，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的囊泡(OMV)的PC12神经细胞作为对照组2，按5μg/mL(蛋白量)加入经NP41修饰的囊泡(NP-OMV)的PC12神经细胞作为对照组3，按50ng/mL加入拉罗替尼(Lar)的PC12神经细胞作为对照组4，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的载药囊泡(Lar@OMV)的PC12神经细胞作为对照组5。
3.实验结果
如图6A所示，相较于未经NP41修饰的囊泡、NP41修饰的囊泡、游离拉罗替尼和未经NP41修饰的载药囊泡，经NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)能显著抑制NGF诱导的PC12神经细胞的增殖和PC12神经细胞的轴突生成(图6B)，甚至优于对照组3(NP-OMV)和对照组4(Lar)的技术效果的简单加和。以上结果表明，NP41修饰的包载拉罗替尼的囊泡可以有效抑制神经细胞的功能，有效阻断NGF-Trk信号通路，从而阻断神经与肿瘤的相互作用，证实了NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)中三种组分的协同效应。
实施例7载药囊泡作用于PC12神经细胞后对肿瘤细胞生长的影响
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、PC12神经细胞、Panc02细胞。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)将PC12神经细胞以每孔1×104个细胞的密度铺于12孔板，培养过夜后，加入含50ng mL-1NGF和1％ FBS的RPMI 1640培养基及载药囊泡，培养72h后，将培养基更换为新鲜的无血清RPMI 1640培养基。24h后，收集上清液，使用0.22μm无菌滤器过滤去除碎片和死细胞，即得到不同药物处理的PC12神经细胞条件培养基，-80℃超低温冰箱保存备用。按5μg/mL(蛋白量)加入NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)的PC12神经细胞作为实验组，不做处理的PC12神经细胞作为对照组1，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的囊泡(OMV)的PC12神经细胞作为对照组2，按5μg/mL(蛋白量)加入经NP41修饰的囊泡(NP-OMV)的PC12神经细胞作为对照组3，按50ng/mL加入拉罗替尼(Lar)的PC12神经细胞作为对照组4，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的载药囊泡(Lar@OMV)的PC12神经细胞作为对照组5。
(3)将Panc02细胞(小鼠胰腺癌细胞)以每孔1×104个细胞的密度铺于96孔板，培养过夜后，弃去上清，加入上述不同药物处理的PC12神经细胞条件培养基，37℃、5％ CO2条件下培养。24h后，弃去上清，每孔加入有CCK8试剂的新鲜无血清培养基孵育4h，培养结束后使用酶标仪检测450nm波长处溶液的吸光度值，以评价NP41修饰的载药囊泡作用于神经细胞后对肿瘤细胞增殖的影响。
(4)将划痕模具于装有75％酒精的培养皿中浸泡并通过紫外线照射灭菌，PBS洗去模具上残余酒精，晾干后备用。将模具置于12孔板中，使模具底部与孔板表面紧密贴合。将Panc02细胞以2×104个细胞每孔的密度铺于划痕模具孔中，培养过夜后，轻轻取出模具，弃去上清，用PBS洗3次，加入上述不同药物处理的PC12神经细胞条件培养基，在37℃、5％CO2条件下培养。在培养的0h和12h使用倒置显微镜对Panc02细胞划痕愈合情况进行观察和拍照，划痕面积通过Image J软件进行统计，计算划痕愈合比例，以评价NP41修饰的载药囊泡作用于神经细胞后对Panc02细胞迁移的影响。
3.实验结果
如图7A所示，NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)显著减缓了神经细胞促Panc02细胞的增殖作用；此外，NP41修饰的载药囊泡处理组Panc02细胞划痕愈合百分比最小(图7B)，甚至优于对照组3(NP-OMV)和对照组4(Lar)的技术效果的简单加和，证实了NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)中三种组分的协同效应。以上结果表明NP41修饰的载药囊泡减缓了神经细胞促进的Panc02细胞增殖和迁移。
实施例8载药囊泡对逆极化M2型巨噬细胞的影响
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、小鼠骨髓来源巨噬细胞、IL-4、TRIzol、逆转录试剂盒和SYBRGreen染料。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)在IL-4诱导得到的M2型骨髓来源巨噬细胞中，加入载药囊泡共培养，24h后收集细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA，使用荧光定量PCR检测M1、M2相关基因的表达。按5μg/mL(蛋白量)加入NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)的PC12神经细胞作为实验组，不做处理的PC12神经细胞作为对照组1，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的囊泡(OMV)的PC12神经细胞作为对照组2，按5μg/mL(蛋白量)加入经NP41修饰的囊泡(NP-OMV)的PC12神经细胞作为对照组3，按50ng/mL加入拉罗替尼(Lar)的PC12神经细胞作为对照组4，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的载药囊泡(Lar@OMV)的PC12神经细胞作为对照组5。
3.实验结果
如图8A、图8B、图8C、图8D所示，相较于游离拉罗替尼，未经NP41修饰的囊泡、NP41修饰的囊泡、未经NP41修饰的载药囊泡和经NP41修饰的载药囊泡能显著升高M1相关基因CD86和TNFα的表达水平，显著下调M2相关基因Mgl1和Mrc1的表达。表明本发明提供的囊泡可以有效逆极化M2型巨噬细胞。
实施例9载药囊泡逆极化M2型巨噬细胞后对神经细胞的影响
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、小鼠骨髓来源巨噬细胞、PC12神经细胞、IL-4、TRIzol、逆转录试剂盒和SYBRGreen染料。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)在IL-4诱导得到的M2型骨髓来源巨噬细胞中，加入载药囊泡共培养，24h后弃去上清，PBS清洗3次，更换为新鲜的无血清RPMI 1640培养基，继续培养12h后收取细胞上清，即可得到巨噬细胞条件培养基。按5μg/mL(蛋白量)加入NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)的PC12神经细胞作为实验组，不做处理的PC12神经细胞作为对照组1，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的囊泡(OMV)的PC12神经细胞作为对照组2，按5μg/mL(蛋白量)加入经NP41修饰的囊泡(NP-OMV)的PC12神经细胞作为对照组3，按50ng/mL加入拉罗替尼(Lar)的PC12神经细胞作为对照组4，按5μg/mL(蛋白量)加入未经NP41修饰的载药囊泡(Lar@OMV)的PC12神经细胞作为对照组5。
(3)将PC12神经细胞以每孔1×104个细胞的密度铺于96孔板，培养过夜后，弃去上清，更换为100μL巨噬细胞条件培养基继续培养24h。培养结束后，每孔加入10μL CCK8试剂孵育4h，使用酶标仪检测在450nm波长处溶液的吸光度值，计算细胞存活率。
(4)将PC12神经细胞以每孔1×105个细胞的密度铺于12孔板，培养过夜后，弃去上清，加入巨噬细胞条件培养基于37℃、5％ CO2条件下培养。每日观察各组细胞轴突生长情况，并于培养72h后，利用LEICA倒置荧光显微镜拍照记录，通过Image J(Fiji)的简单神经突示踪插件对神经突生长情况进行定量分析，统计轴突长度，以研究NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)逆极化M2型巨噬细胞后对神经细胞轴突生成的影响。
3.实验结果
如图9A所示，相较于PBS和游离拉罗替尼组，未经NP41修饰的囊泡、经NP41修饰的囊泡、未经NP41修饰的载药囊泡和经NP41修饰的载药囊泡能显著抑制PC12神经细胞的生长，并能显著抑制PC12神经细胞的轴突生成(图9B)。表明本发明提供的囊泡可以逆极化M2型巨噬细胞后不利于PC12神经细胞的生长。
实施例10载药囊泡对Panc02原位胰腺癌的抑制效果
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、雄性C57BL6/J小鼠。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)小鼠Panc02胰腺癌原位模型的构建同实施例5。
(3)接种肿瘤细胞7天后，将荷瘤小鼠平均分成6组，每组16只，尾静脉注射PBS、OMV、NP-OMV、Lar、Lar@OMV和Lar@NP-OMV，其中PBS处理组注射200μL PBS；未载药囊泡(OMV处理组、NP-OMV处理组)按照蛋白定量1.75mg/kg，分散于200μL PBS进行给药；Lar处理组给药量为0.25mg/kg，分散于200μL PBS进行给药；载药囊泡(Lar@OMV处理组、Lar@NP-OMV处理组)按照Lar给药剂量0.25mg/kg，分散于200μLPBS进行给药。每隔3天给药1次，共给药6次。给药结束后，每组随机取8只继续进行生存期实验。Lar@NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为实验组，PBS处理的C57BL6/J小鼠作为对照组1，OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组2，NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组3，游离Lar处理的C57BL6/J小鼠作为对照组4，Lar@OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组5。
3.实验结果
如图10A所示，给药结束后，取出的肿瘤组织的称重结果表明Lar@NP-OMV显著抑制了胰腺原位肿瘤生长，其肿瘤抑制效果明显优于其他对照组，证实了NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)中三种组分的协同效应。生存期结果也发现(图10B)，Lar@NP-OMV治疗后，延长了荷瘤小鼠的生存期，显著优于其他对照组。
实施例11载药囊泡对Panc02原位胰腺癌神经微环境的影响
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、雄性C57BL6/J小鼠。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)按照实施例10的方法对小鼠胰腺癌原位荷瘤小鼠进行给药处理。
(3)给药处理小鼠，治疗结束后，取出肿瘤组织，用4％ PFA固定，经过不同浓度酒精梯度脱水、石蜡包埋后进行切片。用β3-tubulin和GAP43抗体进行免疫荧光染色，研究Lar@NP-OMV治疗后肿瘤神经微环境的变化。Lar@NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为实验组，PBS处理的C57BL6/J小鼠作为对照组1，OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组2，NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组3，游离Lar处理的C57BL6/J小鼠作为对照组4，Lar@OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组5。
3.实验结果
如图11A，图11B所示，荷瘤小鼠经药物治疗后，Lar@NP-OMV组肿瘤组织中神经密度显著降低，甚至优于NP-OMV组和Lar组的技术效果的简单加和，证实了NP41修饰的载药囊泡(Lar@NP-OMV)中三种组分的协同效应。以上结果说明Lar@NP-OMV能有效靶向肿瘤微环境中神经，抑制神经生长。
实施例12载药囊泡的生物安全性
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、雄性C57BL6/J小鼠。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)按照实施例10的方法对小鼠胰腺癌原位荷瘤小鼠进行给药处理。
(3)治疗期间每天称量并记录小鼠体重。治疗结束后，对小鼠进行眼眶取血，收集上清进行血生化指标检测。检测血清中谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)水平以评价肝功能；检测肌酐(Creatinine，CREA)水平以评价肾功能。Lar@NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为实验组，PBS处理的C57BL6/J小鼠作为对照组1，OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组2，NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组3，游离Lar处理的C57BL6/J小鼠作为对照组4，Lar@OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组5。
3.实验结果
如图12A所示，荷瘤小鼠经药物治疗后，与PBS组相比，Lar@NP-OMV组小鼠体重无明显变化，且小鼠血清中谷草转氨酶和肌酐含量也没有明显变化(图12B，图12C)说明其肝肾毒性很低，用NP41修饰的载药囊泡对机体基本没有副作用。
实施例13吉西他滨对Panc02细胞NGF表达水平的影响
1.实验材料和试剂
吉西他滨、Panc02细胞、TRIzol、逆转录试剂盒和SYBR Green染料。
2.实验步骤
(1)将Panc02细胞以每孔2×105个细胞的密度铺于6孔板，培养12h。
(2)向上述6孔板加入0.03μg/mL的吉西他滨处理细胞，24h后收集细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA，使用荧光定量PCR检测NGF的表达。吉西他滨处理的Panc02细胞作为实验组，不做处理的Panc02细胞作为对照组。
3.实验结果
如图13所示，相较于对照组，吉西他滨能显著升高NGF的表达水平，表明吉西他滨可能会促进肿瘤组织神经生成。
实施例14载药囊泡联合吉西他滨对Panc02原位胰腺癌的抑制效果
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、拉罗替尼、DSPE-PEG-NP41、雄性C57BL6/J小鼠、吉西他滨。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1。
(2)小鼠Panc02胰腺癌原位模型的构建同实施例5。
(3)接种肿瘤细胞7天后，将荷瘤小鼠平均分成4组，每组14只，尾静脉注射PBS、吉西他滨(GEM)、Lar@NP-OMV、吉西他滨和Lar@NP-OMV，其中PBS给药量为200μLPBS；Lar@NP-OMV按照Lar给药剂量0.25mg/kg，并分散于200μL PBS进行给药；GEM给药量为20mg/kg，并分散于200μL PBS进行给药；吉西他滨和Lar@NP-OMV的给药方式为混合给药，给药剂量为单一两种药物的给药量的加和，并分散于200μL PBS进行给药。每隔3天给药1次，共给药6次。给药结束后，每组随机取8只继续进行生存期实验。吉西他滨和Lar@NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为实验组，PBS处理的C57BL6/J小鼠作为对照组1，吉西他滨处理的C57BL6/J小鼠作为对照组2，Lar@NP-OMV处理的C57BL6/J小鼠作为对照组3。
3.实验结果
如图14A所示，给药结束后，取出肿瘤组织，进行免疫荧光染色(图14A)和ELISA检测(图14B)，结果显示，吉西他滨治疗增加了胰腺肿瘤组织中的神经密度以及去甲肾上腺素含量，表明吉西他滨可促进肿瘤组织神经生长。通过对肿瘤重量进行检测发现，吉西他滨联合Lar@NP-OMV显著抑制了胰腺原位肿瘤生长，其肿瘤抑制效果明显优于吉西他滨、Lar@NP-OMV(图14C)，证实了药物之间的协同效应。生存期结果(图14D)也表明，吉西他滨联合Lar@NP-OMV治疗后，延长了荷瘤小鼠的生存期，显著优于其他对照组。特别地，在单独施用吉西他滨的对照组中，所有小鼠在第62天死亡，但在联合施用吉西他滨和Lar@NP-OMV的实验组中，直到第80天仍有小鼠存活，表明两种药物的组合可以有效提高吉西他滨的胰腺癌治疗效果。
实施例15RVG修饰的囊泡在体外对神经细胞的靶向性
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、DSPE-PEG-RVG、DRG原代神经细胞。
2.实验步骤
(1)按照实施例1制备RVG修饰的囊泡，其中神经细胞靶向分子为DSPE-PEG-RVG，然后使用细胞膜绿色荧光染料DiO对囊泡进行标记。
(2)按照实施例4的方法处理DRG原代神经细胞，并通过流式细胞术检测DRG原代神经细胞DiO平均荧光强度。OMV为对照组，RVG-OMV为实验组。
3.实验结果
流式细胞术检测结果显示，同OMV相比，DRG原代神经细胞中RVG-OMV的荧光强度更强(图15)，说明DRG原代神经细胞能够摄取更多的RVG-OMV。
实施例16载药囊泡联合阿霉素对4T1原位乳腺癌的抑制效果
1.实验材料和试剂
大肠杆菌Nissle 1917、利多卡因(Lidocaine)、DSPE-PEG-NP41、SPF级BALB/C雌性小鼠、阿霉素。
2.实验步骤
(1)载药囊泡的收集同实施例1，其中小分子药物为利多卡因。
(2)乳腺癌原位模型的构建：取对数生长期的4T1乳腺癌细胞，用0.05％的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至1×107个/mL，于小鼠右侧乳腺脂肪垫处注射50μL乳腺癌细胞悬液。
(3)待乳腺肿瘤体积长至50-100mm3，将荷瘤小鼠随机分为4组，每组6只，尾静脉注射PBS、阿霉素(DOX)、Lido@NP-OMV、阿霉素和Lido@NP-OMV，其中PBS给药量为200μL PBS；Lido@NP-OMV按照Lido给药剂量1mg/kg，并分散于200μL PBS进行给药；DOX给药量为4mg/kg，并分散于200μL PBS进行给药；阿霉素和Lido@NP-OMV的给药方式为混合给药，给药剂量为单一两种药物的给药量的加和，并分散于200μL PBS进行给药。每隔3天给药1次，共给药6次。阿霉素和Lido@NP-OMV处理的BALB/C小鼠作为实验组，PBS处理的BALB/C小鼠作为对照组1，阿霉素处理的BALB/C小鼠作为对照组2，Lido@NP-OMV处理的BALB/C小鼠作为对照组3。
3.实验结果
给药结束后，取出肿瘤组织，进行免疫荧光染色，结果如图16A所示，阿霉素治疗增加了乳腺肿瘤组织中的神经密度，表明阿霉素可促进肿瘤组织神经生长。通过对肿瘤重量进行检测发现，阿霉素联合Lido@NP-OMV显著抑制了乳腺原位肿瘤生长，其肿瘤抑制效果明显优于阿霉素、Lido@NP-OMV(图16B)，证实了药物之间的协同效应。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡，其特征在于，包括细菌外膜囊泡，以及该细菌外膜囊泡包裹的小分子药物，所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物；所述细菌外膜囊泡表面还修饰有神经细胞靶向分子。
2.根据权利要求1所述的载药细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡包括大肠杆菌来源的细菌外膜囊泡、嗜黏蛋白阿克曼菌来源的细菌外膜囊泡或减毒沙门氏菌来源的细菌外膜囊泡。
3.根据权利要求1所述的载药细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡、所述神经细胞靶向分子、所述药物的质量比为(1-20):1:(1-200)。
4.根据权利要求1所述的载药细菌外膜囊泡，其特征在于，所述小分子药物为Trk抑制剂、麻醉剂或其它具有神经抑制作用的小分子药物；
所述神经细胞靶向分子包括神经细胞靶向肽和偶联物，所述神经细胞靶向肽偶联于所述偶联物表面，所述偶联物能够通过脂质嵌插的方式连接到所述细菌外膜囊泡表面，所述神经细胞靶向肽选自NP41、RVG、HNP401、HNP402和HNP403中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的载药细菌外膜囊泡，其特征在于，所述Trk抑制剂为拉罗替尼、恩曲替尼、AZ23和LOXO-195中的一种或多种；所述麻醉剂为普鲁卡因、丁卡因和利多卡因中的一种或多种；所述其它具有神经抑制作用的小分子药物为神经毒素肉毒素和6-羟基多巴胺中的一种或多种。
6.一种根据权利要求1至5任一项所述的载药细菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将细菌外膜囊泡与神经细胞靶向分子混合孵育，通过脂质嵌插的方式使神经细胞靶向分子修饰到细菌外膜囊泡表面，收集得到神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡；
S2、将所述神经细胞靶向分子修饰的细菌外膜囊泡与小分子药物混合孵育，所述小分子药物为具有神经抑制作用的小分子药物，收集得到靶向干预肿瘤神经微环境的载药细菌外膜囊泡。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述细菌外膜囊泡与所述神经细胞靶向分子的质量比为(1-20):1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1和S2中，所述收集条件为：在4℃条件下，以2000g～150000g的离心力收集。
9.一种治疗癌症的药物，其特征在于，其包括如权利要求1至5任一项所述的载药细菌外膜囊泡，还包括化疗药物。
10.根据权利要求9所述的治疗癌症的药物，其特征在于，所述化疗药物为能够促进肿瘤细胞高表达神经生长因子的化疗药物，所述能够促进肿瘤细胞高表达神经生长因子的化疗药物选自吉西他滨或阿霉素类化疗药物中的一种或多种；
所述阿霉素类化疗药物选择阿霉素、表阿霉素、柔红霉素和吡柔比星中的一种或多种。
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