CN116710133A - 肌萎缩侧索硬化的治疗用药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含抗EphA4抗体作为有效成分的用以治疗ALS的新颖药物组合物，该抗EphA4抗体能够与EphA4结合，促进EphA4的切割。提供了包含抗EphA4抗体的用以治疗ALS的药物组合物，其中该抗EphA4抗体包含如下重链和轻链，该重链包含：由SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列组成的重链CDR1、由SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列组成的重链CDR2和由SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列组成的重链CDR3，并且该轻链包含：由SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1、由SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2和由SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

Description

肌萎缩侧索硬化的治疗用药物组合物

技术领域

本披露涉及一种包含与EphA4结合的抗体的用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物。

背景技术

EphA4是受体型酪氨酸激酶家族的成员。已知A型肝配蛋白和B型肝配蛋白是EphA4的配体，当EphA4与作为其配体的肝配蛋白结合时，会诱导产生脱粘附信号。EphA4在运动神经元中表达，在神经回路形成期的脊髓中，通过肝配蛋白在运动神经元的非投射区表达，而控制正确的轴突引导。已知EphA4取决于神经活动地被基质金属蛋白酶(MMP)、ADAM(去整合素和金属蛋白酶)及γ分泌酶切割。

根据常规的研究，提示抑制EphA4的功能是针对肌萎缩侧索硬化(Amyotrophiclateral sclerosis，以下也称为“ALS”)或阿尔茨海默病等神经退化性疾病、脊髓损伤的有效治疗手段。

据报告，EphA4是调整ALS的表型的基因(专利文献1、非专利文献1)。揭示有EphA4的基因缺损、或由EphA4-Fc等产生的拮抗作用会促进小鼠和大鼠的脊髓损伤时的轴突伸长或功能恢复(非专利文献2及非专利文献3)。

作为现有的EphA4抑制剂，已知有KYL肽或化合物1(专利文献1、非专利文献1及非专利文献2)。还已知具有抑制EphA4与其配体结合的活性的抗体(专利文献2及专利文献3)，但迄今为止，尚无有关具有促进EphA4的切割的活性的抗体的报告。

引证文献清单

专利文献

[专利文献1]WO 2012/156351 A1

[专利文献2]WO 2016/019280 A1

[专利文献3]WO 2017/043466 A1

非专利文献

[非专利文献1]Van Hoecke et al.，Nature Medicine，vol18：1418-1422，2012

[非专利文献2]Goldshmit et al.，PLoS one，vol6：e24636，2011

[非专利文献3]Spanevello et al.，Journal of Neurotrauma，vol30：1023-1034，2013

发明内容

本发明欲解决的问题

本披露的目的在于提供一种用以治疗ALS的新颖药物组合物。

解决问题的技术手段

本发明人为了解决上述问题而反复进行了锐意研究，结果取得了对治疗ALS有效的抗体，该抗体可与EphA4结合，促进EphA4的切割。

本披露涵盖以下特征。

(1)一种药物组合物，其是包含抗EphA4抗体的用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物，其中

该抗EphA4抗体包含如下重链和轻链，该重链包含：

(a)由SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；

(b)由SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；以及

(c)由SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且该轻链包含：

(d)由SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

(e)由SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及

(f)由SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

(2)如(1)所述的药物组合物，其中该抗EphA4抗体是人源化的。

(3)如(1)或(2)所述的药物组合物，其中该抗EphA4抗体与EphA4特异性地结合，促进EphA4的切割。

(4)如(1)至(3)中任一项所述的药物组合物，其中该抗EphA4抗体与EphA4特异性地结合，抑制EphA4与肝配蛋白的结合。

(5)如(1)至(4)中任一项所述的药物组合物，其中

该重链包含由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的可变区，并且

该轻链包含由SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列组成的可变区。

(6)如(1)至(5)中任一项所述的药物组合物，其中该重链的恒定区和该轻链的恒定区包含源自人类抗体的氨基酸序列。

(7)如(6)所述的药物组合物，其中该重链的恒定区是人类IgG的恒定区。

(8)如(7)所述的药物组合物，其中该人类IgG的恒定区是人类IgG₂的恒定区。

(9)如(8)所述的药物组合物，其中该人类IgG₂的恒定区包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列。

(10)如(6)至(9)中任一项所述的药物组合物，其中该轻链的恒定区是人类Igκ的恒定区。

(11)如(10)所述的药物组合物，其中该人类Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。

(12)一种药物组合物，其是包含抗EphA4抗体的用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列，并且

该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。

(13)如(12)所述的药物组合物，其中该重链的C末端赖氨酸缺失。

(14)一种药物组合物，其是包含抗EphA4抗体的用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，并且

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列。

(15)一种药物组合物，其是包含抗EphA4抗体的用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列，并且

该重链的C末端赖氨酸缺失。

(16)如(1)至(15)中任一项所述的药物组合物，其进一步包含至少一种药学上可接受的载剂。

(17)一种抗EphA4抗体，其中

该抗EphA4抗体包含如下重链和轻链，该重链包含：

(a)由SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；

(b)由SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；以及

(c)由SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且该轻链包含：

(d)由SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

(e)由SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及

(f)由SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

(18)如(17)所述的抗EphA4抗体，其中该抗EphA4抗体是人源化的。

(19)如(17)或(18)所述的抗EphA4抗体，其中该抗EphA4抗体与EphA4特异性地结合，促进EphA4的切割。

(20)如(17)至(19)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中该抗EphA4抗体与EphA4特异性地结合，抑制EphA4与肝配蛋白的结合。

(21)如(17)至(20)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中

该重链包含由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的可变区，并且

该轻链包含由SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列组成的可变区。

(22)如(17)至(21)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中该重链的恒定区和该轻链的恒定区包含源自人类抗体的氨基酸序列。

(23)如(22)所述的抗EphA4抗体，其中该重链的恒定区是人类IgG的恒定区。

(24)如(23)所述的抗EphA4抗体，其中该人类IgG的恒定区是人类IgG₂的恒定区。

(25)如(24)所述的抗EphA4抗体，其中该人类IgG₂的恒定区包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列。

(26)如(22)至(25)中任一项所述的抗EphA4抗体，其中该轻链的恒定区是人类Igκ的恒定区。

(27)如(26)所述的抗EphA4抗体，其中该人类Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。

(28)一种抗EphA4抗体，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列，并且

该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。

(29)如(28)所述的抗EphA4抗体，其中该重链的C末端赖氨酸缺失。

(30)一种抗EphA4抗体，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，并且

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列。

(31)一种抗EphA4抗体，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列，并且

该重链的C末端赖氨酸缺失。

(32)如(17)至(31)中任一项所述的抗EphA4抗体，其用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)。

(33)一种用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的方法，该方法包括将治疗有效量的如(17)至(31)中任一项所述的抗EphA4抗体施用至有需要的患者。

(34)如(17)至(31)中任一项所述的抗EphA4抗体用以制造肌萎缩侧索硬化(ALS)治疗用的药物组合物的用途。

(35)如(34)所述的抗EphA4抗体的用途，其中该药物组合物包含至少一种药学上可接受的载剂。

(36)一种肌萎缩侧索硬化(ALS)的治疗剂，其包含如(17)至(31)中任一项所述的抗EphA4抗体。

发明效果

根据本披露，提供了一种用以治疗ALS的新颖药物组合物。该药物组合物包含抗EphA4抗体作为有效成分，该抗EphA4抗体可与EphA4结合，促进EphA4的切割。

附图说明

图1表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对于小鼠和人类EphA4的结合亲和力。

图2表示使用海马神经元的抗EphA4单克隆抗体(抗体A)的EphA4切割促进活性。

图3表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性。

图4表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)的人类EphA4-人类配体结合抑制活性。

图5表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对于各人类Eph受体的选择性。

图6表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对于各小鼠Eph受体的选择性。

图7表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对于小鼠、大鼠、猴及人类EphA4的反应性。

图8表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对于人类EphA4胞外区(ECD)、配体结合域(LBD)、纤连蛋白III型域1(FN1)、和纤连蛋白III型域2(FN2)的反应性。

图9表示抗EphA4单克隆抗体(抗体A)对于海马神经元的树突棘数量的增加效果。

图10A中，横轴表示EphA4-配体结合域(EphA4-LBD)的氨基酸，纵轴表示抗体A-Fab的结构区域。黑色小块表示存在相互作用的组合的交点。

图10B表示EphA4-配体结合域(EphA4-LBD)的表面结构。图10B中，在相应位置显示了结合域所包含的氨基酸名和残基编号，并以带状模型显示所结合的抗体A-Fab的H链和L链的CDR。

图11表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对于人类EphA4的亲和力。

图12表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)在海马神经元中的EphA4切割促进活性。

图13表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)的人类EphA4-人类配体结合抑制活性。

图14表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性。

图15表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对于人类Eph受体的选择性。

图16表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对于小鼠Eph受体的选择性。

图17表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对于小鼠、大鼠、猴和人类EphA4的反应性。

图18表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对于人类EphA4胞外区(ECD)、配体结合域(LBD)、纤连蛋白III型域1(FN1)、和纤连蛋白III型域2(FN2)的反应性。

图19表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对于海马神经元的树突棘数量的增加效果。

图20表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)在海马神经元中的人类EphA4切割促进活性。

图21表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)经由MMP和ADAM介导的对于海马神经元中树突棘数量的增加效果。

图22表示实例13中所实施的评价体系的示意图。

图23表示人源化抗EphA4单克隆抗体(抗体B)对由表达突变人类SOD1(G93A)的星形胶质细胞诱发的源自人类iPS细胞的运动神经元死亡的影响。

具体实施方式

本文使用的SEQ ID NO.指定或编码的区域如下所示：

根据本披露的抗EphA4抗体是可识别并结合EphA4的抗体，如以下所述，该抗体可以是完整的抗体，或者也可以是合成抗体(例如重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体)，只要具有与EphA4的结合亲和力即可。本说明书中，EphA4可理解为指源自人类、小鼠、大鼠和猴的EphA4。源自人类、小鼠、大鼠和猴的EphA4可获自美国生物技术信息中心(U.S.NationalCenter for Biotechnology Information)提供的Genbank等登录有序列信息的公共数据库。除此以外，还可通过基于有近缘关系的动物种类的EphA4的碱基序列信息来设计引物，从所需动物种类提取RNA，由所提取的RNA进行克隆，从而获取EphA4基因的序列信息。例如，人类、小鼠、大鼠、猴的EphA4的碱基序列信息分别以Genbank登录号NM_004438.5、NM_007936.3、NM_001162411.1、NM_001260870.1登录在数据库中。

在一个方面，抗EphA4抗体是与EphA4特异性地结合的抗体。术语“特异性结合”是该技术领域中的技术人员众所周知的术语，且用于确定抗体或其抗原结合片段对于抗原或表位的特异性结合的方法也众所周知。在一个实施例中，“特异性结合”可理解为：相比于与其他靶分子结合，抗EphA4抗体能够以更大的结合亲和力、结合活性并更迅速、和/或持续更长时间地通过免疫学反应与EphA4结合。这并不意味着与EphA4特异性地结合的抗体不与其他靶分子结合。在另一个实施例中，“特异性结合”可由对EphA4具有至少约10^-7M、或至少约10^-8M、或至少约10^-9M、或更低的KD的抗体显示。此外，在又一个实施例中，“特异性结合”可理解为通过免疫学反应与EphA4结合，但基本上不与Eph受体的其他家族分子结合。

在一个方面，抗EphA4抗体是与EphA4的胞外区结合的抗体。在一个实施例中，抗EphA4抗体是与EphA4的胞外区中的配体结合域(LBD)结合的抗体。

在一个实施例中，抗EphA4抗体可与EphA4特异性地结合，促进EphA4的切割。在特定实施例中，抗EphA4抗体可与EphA4特异性地结合，促进利用基质金属蛋白酶(MMP)或ADAM(去整合素和金属蛋白酶)切割EphA4胞外域。

在一个实施例中，抗EphA4抗体可与EphA4特异性地结合，抑制EphA4与其配体肝配蛋白的结合。

在另一个实施例中，抗EphA4抗体可与EphA4特异性地结合，增加海马神经元的树突棘数量或使海马神经元的树突棘稳定。

在另一个实施例中，抗EphA4抗体可保护运动神经元免于由SOD1基因异常引起的细胞死亡。

在一个实施例中，本披露涵盖可与人类EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4中的至少一种特异性地结合，抑制与其配体的结合的抗EphA4抗体。在另一个实施例中，本披露涵盖可与人类EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4中的两种或更多种特异性地结合，抑制与其配体的结合的抗EphA4抗体。在又一个实施例中，本披露涵盖可与人类EphA4、小鼠EphA4、大鼠EphA4、及猴EphA4全部特异性地结合，并抑制与其配体的结合的抗EphA4抗体。

测定抗EphA4抗体对于抗原的结合特性(例如，结合亲和力和物种交叉反应性)的方法可使用该技术领域技术人员众所周知的方法。例如结合亲和力可使用Biacore^TM生物传感器、KinExA生物传感器、临近闪烁测定法、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司(IGEN))、流式细胞分析、荧光猝灭、荧光转移、酵母展示、和/或免疫染色来进行测定，但并不限定于这些。抗EphA4抗体对于EphA4和其配体的结合的中和活性可使用Biacore^TM生物传感器、ELISA、和/或流式细胞分析进行测定，但并不限定于这些。

根据本披露的抗EphA4抗体可以是单克隆抗体，只要与EphA4结合即可。

根据本披露的抗EphA4抗体可以是IgG、IgA或IgM(或者这些的亚类)等任意类别，但并不限定于特定类别。根据重链(也有时称为H链)的恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白被分为不同类别。5个主要的免疫球蛋白的类别为：IgA、IgD、[gE、IgG和IgM，其中几个类别可以进一步细分为例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂等亚类(同种型)。不同类别的免疫球蛋白所对应的重链的恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。此外，抗体的轻链(也有时称为L链)种类有λ链和κ链。根据本披露的抗EphA4抗体可以是IgG抗体，例如可以是IgG₁抗体或IgG₂抗体等。此外，根据本披露的抗EphA4抗体根据情形不同，可以为单体、二聚体或多聚体的形式。

根据本披露的抗体的可变区可以意味着抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区，抗体的恒定区可以意味着抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。重链和轻链的可变区分别由4个框架区(FR)组成，该4个框架区由也称为互补决定区的3个CDR连接。各链中的CDR被FR保持得较为靠近，从而有助于与另一条链中的CDR一同形成抗体的抗原结合位点。用以确定CDR的技术包括但不限于例如：(1)基于跨物种序列可变性的方法(例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列]，第5版，1991，National Institutes of Health[国立卫生研究院]，Bethesda MD[马里兰州贝塞斯达])；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体结构研究的方法(Al-lazikani等人，1997J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273：927-948)。也可将这些方法、其他方法组合来使用。

本说明书中，单克隆抗体可以意味着获自基本上均一的抗体群体的抗体。即，该群体中所包含的各个抗体除若干有可能存在的天然突变体以外均相同。单克隆抗体靶向单个抗原位点，具有高度特异性。进而，与靶向不同抗原或不同表位的典型多克隆抗体相比，各单克隆抗体靶向抗原的单个表位。修饰语“单克隆”表示获自基本上均一的抗体群体的抗体的特性，不应被限定性地理解为需要通过特定方法来生产抗体。

根据本披露的抗EphA4抗体可以是小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。嵌合抗体例如是使非人类(例如小鼠或大鼠)抗体的可变区与人类抗体的恒定区融合而成的抗体，例如可以指可变区源自非人类抗体、恒定区源自人类抗体的抗体。人源化抗体例如是将非人类抗体的互补决定区(CDR(有时称为高变区))引入人类抗体中所得的抗体，并且例如可以指CDR源自非人类抗体、其余抗体区域源自人类抗体的抗体。但是，嵌合抗体与人源化抗体的界限不一定必需明确，可以是可称为嵌合抗体也可称为人源化抗体的状态。此外，在嵌合抗体或人源化抗体中，源自人类抗体的抗体区域(FR，恒定区)不一定必需全部由源自人类抗体的氨基酸所构成，也可含有一个或多个源自非人类抗体的氨基酸，只要于人类受试者中能够正常使用即可。人源化抗体的一个实施例是CDR源自啮齿类抗体、其余抗体区域源自人类抗体的抗体。人源化抗体的特定实施例是CDR源自小鼠抗体、其余抗体区域源自人类抗体的抗体。在这些实施例中，CDR可以包含源自一个或多个非啮齿类抗体的氨基酸、或者源自一个或多个非小鼠抗体的氨基酸，CDR以外的抗体区域可以包含源自一个或多个非人类抗体的氨基酸。此处，“多个”是但不限于2个至20个、或者2个至15个、例如14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个；或者氨基酸序列中的氨基酸数的10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内或1％以内。人源化可使用CDR移植法(Kontermann和Dubel，Antibody Engineering[抗体工程]，Springer Lab Manual[施普林格实验室手册](2001)和Tsurushita等人，Methods[方法]36：69-83(2005))来进行，除此以外，还可以通过如下方式来进行人源化，即，使用该技术领域中众所周知的方法(例如参见Jones等人，Nature[自然]321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature[自然]332：323-327(1988)；及Verhoeyen等人，Science[科学]239：1534-1536(1988))，将CDR序列取代为人类抗体所对应的序列。

为了减少抗原性，在制作人源化抗体时，在轻链和重链两者中选择使用人类可变区可能较为重要。根据“最佳匹配”法，针对全部已知的人类FR序列库，筛选出啮齿类抗体的可变区序列。然后，最接近啮齿类序列的人类序列被视为人源化抗体的人类FR。参见例如Sims等人，J.Immuno1.[免疫学杂志]151：2296-2308(1993)和Chothia等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196：901-917(1987)。在另一方法中，使用特定的框架，该特定的框架源自轻链或重链的特定亚群的所有人类抗体的共通序列。相同的框架可用于若干不同的人源化抗体。参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Set USA[美国国家科学院院刊]89：4285-4289(1992)和Presta等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151：2623-2632(1993)。

进而，人源化抗体一般而言，较为理想的是保持对于抗原的较高结合亲和力和其他优选的生物学性质。为了达成该目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念性人源化产物的步骤而制备人源化抗体。一般而言，三维免疫球蛋白模型是可用的，且为本领域技术人员所知。可利用将选择出的候选免疫球蛋白序列的所需三维构象模式化并进行显示的计算机程序。通过对这些显示进行研究，能够分析候选免疫球蛋白序列的功能中残基的可能作用，即能够分析对候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力造成影响的残基。通过该方法，可以自接收序列和导入序列中选择FR残基并加以组合，以实现所需的抗体特性，例如增大对于单个或多个靶抗原(例如EphA4或其片段)的结合亲和力。

母庸置疑，在根据本披露的抗EphA4抗体中，也包括针对上述例示的嵌合抗体或人源化抗体进行适当改变(例如抗体的修饰，或者抗体的氨基酸序列的部分取代、添加和/或缺失)，同时保持了该抗体的功能不变(或者为了追加、提高该抗体的功能)的抗体。更具体而言，本披露的范围也包括为了修饰抗体的效应子功能而对恒定区的氨基酸序列作出改变后所得的抗体，例如本披露的范围也包括：为了降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性，人类IgG₂抗体的Eu编号中的第234位的缬氨酸(Val)被取代为丙氨酸(Ala)且第237位的甘氨酸(Gly)被取代为丙氨酸(Ala)的抗体等。进而，本披露的范围也包括：同时具有根据本披露的抗EphA4抗体的CDR序列的抗体结合位点、以及结合不同抗原的抗原结合位点的双特异性抗体(Kontermann(2012)，mAbs[单克隆抗体]4，182-97)。

根据本披露的抗EphA4抗体也可根据需要进行修饰。抗EphA4抗体的修饰也可以是进行如下改变的修饰，即改变(a)修饰区域中氨基酸序列的三维结构，例如片状或螺旋构象等；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性的状态；或者(c)修饰对维持侧链体积的影响，或者也可以为不会明显观察到这些变化的修饰。

根据本披露的抗EphA4抗体的修饰例如可通过构成的氨基酸残基的取代、缺失、添加等来达成。

本说明书中，氨基酸以其最宽泛的含义使用，不仅包括天然氨基酸，例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，还包括氨基酸变异体及衍生物等非天然氨基酸。本领域技术人员考虑这一宽泛的定义，自然会理解本文中的氨基酸包括例如：L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等不会在生物体内成为蛋白质的组分的氨基酸；及本领域技术人员众所周知的具有氨基酸特性的化学合成的化合物等。非天然氨基酸的实例包括：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸(D-天冬氨酸、D-谷氨酸等)、组氨酸样氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸等)、侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)和侧链中的羧酸官能团氨基酸被取代为磺酸基的氨基酸(磺基丙氨酸等)等。

天然存在的氨基酸残基例如基于一般的侧链特性，可分类为以下的组：

(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Asn、Gln、Cys、Ser、Thr；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)对链取向造成影响的残基：Gly、Pro；以及

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

构成抗体的氨基酸序列的非保守性取代可通过将属于其中一个组的氨基酸更换为属于另一组的氨基酸而进行。更保守性的取代可通过将属于其中一个组的氨基酸更换为同一组的另一氨基酸而进行。同样地，也可适当进行氨基酸序列的缺失或取代。

构成抗体的氨基酸的修饰例如可以是利用糖的糖基化、乙酰化或磷酸化等的翻译后修饰。抗体可在其恒定区的保守位置上进行糖基化。抗体的糖基化通常为N-结合型或O-结合型的任一种。N-结合型意味着糖部分与天冬酰胺残基侧链的结合。作为三肽序列的天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、及天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中，X是脯氨酸以外的任意氨基酸)是用以将糖部分酶促添加到天冬酰胺侧链的识别序列。通过使这些三肽序列的任一种存在于抗体中，而存在潜在的糖基化位点。O-结合型糖基化可以是N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖的任一种与羟基氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)的结合，在一些情况下，也可以是与5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的结合。本领域技术人员可根据目的适当选择糖基化的条件(在使用生物学方法进行糖基化的情形时，例如有宿主细胞或细胞培养基的类型、pH等)。

对于根据本披露的抗EphA4抗体，可进而基于本领域技术人员众所周知的技术常识，通过其他修饰方法，单独地进行修饰或组合地进行修饰。

根据本披露的抗EphA4抗体可通过本领域技术人员众所周知的方法产生。例如，可将编码根据本披露的抗EphA4抗体的核酸整合到表达载体，将该表达载体引入宿主细胞，并对该宿主细胞进行培养，由此产生抗体。因此，本披露包括：编码抗EphA4抗体的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞的步骤的抗EphA4抗体的产生方法。

编码根据本披露的抗EphA4抗体的核酸可具有编码信号序列的DNA，可在编码重链可变区的DNA、和编码轻链可变区的DNA的5′末端上具有编码信号序列的DNA。信号序列是分泌蛋白或整合膜蛋白在核糖体上合成后穿过脂质双层所必需的、存在于蛋白质N末端的氨基酸残基，并且在本披露中信号序列无特别限制，只要是具有该功能的序列即可。根据本披露的抗EphA4抗体可包含的信号序列包括源自人类、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸡、狗、猫、酵母等的信号序列。本披露中，具体而言，与重链有关的信号序列可包括包含SEQ ID NO.12或16所表示的氨基酸序列的肽，与轻链有关的信号序列可包括包含SEQ ID NO.14或18所表示的氨基酸序列的肽。此外，只要功能上同等，则也可在SEQ ID NO.12或16所表示的氨基酸序列、SEQ ID NO.14或18所表示的氨基酸序列中具有一个或多个(例如2、3、4或5个)氨基酸的取代、添加和/或缺失。

根据本披露的抗EphA4抗体可以是依据本领域技术人员众所周知的方法经过分离或纯化的那些。

本说明书中，“经分离”或“经纯化”意味着从自然状态经人工分离或纯化。如果分子或组合物是天然存在的，则当其产生了变化或从原本环境中被移除，或者两者同时发生时，其即为“经分离”或“经纯化”。分离或纯化的方法的实例包括电泳、分子生物学、免疫学或色谱法等方法，具体而言，包括但不限于离子交换色谱法、疏水性色谱法、反相HPLC色谱法、等电点电泳、或碱萃取法等。

在一个实施例中，抗EphA4抗体包含以下的CDR：

(a)由SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；

(b)由SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；

(c)由SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；

(d)由SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

(e)由SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及

(f)由SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

在一个实施例中，抗EphA4抗体是人源化抗体或嵌合抗体，在特定的实施例中是人源化抗体。

在另一个实施例中，抗EphA4抗体包含重链和轻链，该重链包含由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的可变区，该轻链包含由SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列组成的可变区。注意，在该实施例中，该重链的可变区和/或该轻链的可变区可包括：在SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列和/或SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列中取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列。此处，“多个”无限制，只要保持对于EphA4的结合亲和力且促进EphA4的切割即可，是2个至15个、或2个至10个，例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个；或者氨基酸序列中的氨基酸数的10％以内，例如9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内或1％以内。

在一个实施例中，抗EphA4抗体的重链包含人类IgG₂的恒定区。

在特定实施例中，人类IgG₂的恒定区包含SEQ ID NO.47的氨基酸序列。

在一个实施例中，抗EphA4抗体的轻链包含人类Igκ的恒定区。

在特定实施例中，人类Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48的氨基酸序列。

在一个实施例中，抗EphA4抗体包括含有SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列的轻链。

在另一个实施例中，例如从减少通过抗体产生细胞产生的抗体的不均一性等理由考虑(美国专利申请公开号2010/0297697或Liu H等人，MAbs.[单克隆抗体]2014年9月-10月；6(5)：1145-1154)，抗EphA4抗体中，位于重链的C末端(羧基末端)的赖氨酸缺失。本披露中，重链的C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体包括：通过基因修饰而使重链的C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体、或通过羧肽酶等在翻译后切割重链的C末端赖氨酸的抗EphA4抗体等。此外，在本披露中，重链的C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体不仅包括在两条重链中C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体，还包括仅在一条重链中C末端赖氨酸缺失的抗EphA4抗体。

在一个方面，本披露涉及一种编码抗EphA4抗体的经分离的核酸。编码抗EphA4抗体且经分离的核酸是指编码抗EphA4抗体的重链和/或轻链的一个或多个核酸分子。在一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的重链。在另一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的轻链。在又一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体的重链和轻链。根据本披露的核酸还包括：编码抗EphA4抗体的重链的第一核酸分子、和编码抗EphA4抗体的轻链的第二核酸分子。

在另一个方面，本披露涉及一种包含编码抗EphA4抗体且经分离的核酸的载体。根据本披露的载体是指包含编码抗EphA4抗体且经分离的核酸的一个或多个载体。在一个实施例中，根据本披露的载体包含：编码抗EphA4抗体的重链的核酸及编码抗EphA4抗体的轻链的核酸。在另一个实施例中，根据本披露的载体包含编码抗EphA4抗体的重链和轻链的核酸。在又一个实施例中，根据本披露的载体包括：包含编码抗EphA4抗体的重链的核酸的第一载体、和包含编码抗EphA4抗体的轻链的核酸的第二载体。根据本披露的载体可以是但并不特别限于质粒、黏粒、病毒、噬菌体等。例如根据本披露的载体还包括作为病毒载体的反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体等。

在又一个方面，本披露还包括：包含根据本披露的载体的宿主细胞、和包括对该宿主细胞进行培养的步骤的抗EphA4抗体的产生方法。根据本披露的宿主细胞可以是但并不特别限于大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞等。在一个实施例中，抗EphA4抗体的产生方法包括：对宿主细胞进行培养的步骤；及自该宿主细胞(或宿主细胞的培养基)回收分泌出的抗EphA4抗体的步骤。

根据本披露的抗EphA4抗体用以治疗ALS。因此，本披露涉及一种包含根据本披露的抗EphA4抗体的用以治疗ALS的药物组合物。在另一个方面，本披露还包括一种ALS的治疗方法，该方法包括将治疗有效量的抗EphA4抗体施用至患有ALS的受试者。

在又一个方面，本披露还涵盖抗EphA4抗体用以制造ALS的治疗药的用途。

在又一个方面，本披露还涵盖抗EphA4抗体，其用以治疗ALS。

根据本披露的抗EphA4抗体在治疗方法中可单独使用、或者与其他药剂或组合物组合使用。例如根据本披露的抗EphA4抗体可与其他药剂同时施用或在不同时间施用。此种组合疗法包括组合施用(在相同或不同的配制品中包含两种或更多种的药剂)及分开施用(例如同时或连续地施用)。在分开施用两种或更多种的药剂时，根据本披露的抗EphA4抗体的施用可以在伴随的治疗方法之前进行，或在伴随的治疗方法之后进行。

接受根据本披露的抗EphA4抗体的施用的受试者并无限制，例如可对于人类或非人类哺乳动物(猴、小鼠、大鼠、兔、牛、马、山羊等)使用本发明。

将根据本披露的抗EphA4抗体施用至受试者的方法(施用路径、剂量、每天的施用次数、施用的时间等)并无特别限制，可以由本领域技术人员(例如医生)根据受试者的健康状态、疾病的程度、所组合使用的药剂的类型等来适当决定。

根据本披露的药物组合物包含上述根据本披露的抗EphA4抗体。根据本披露的药物组合物例如可以依据日本药典(JP)、美国药典(USP)或欧洲药典(EP)中所述的方法等已知的方法进行制造。

本领域技术人员可以理解，只要技术上不存在冲突，则可以将本文所述的任何和所有方面的任意一个或多个适当组合来实施本披露。进而本领域技术人员可以理解，只要技术上不存在冲突，则优选的是将本文所述的任何和所有优选或有利的方面适当组合来实施本披露。

本文所引用的文献的所有披露内容应视为均通过援引在本文明确引用，且本领域技术人员可以理解到，依据本文中的上下文，在不脱离本披露的精神和范围的情况下，将这些文献中的相关披露内容引用作本说明书的一部分。

本文中所引用的文献仅是为了披露本申请的申请日前的相关技术而提供，不应解释为诸位发明人由于先前发明或任何其他理由而承认本发明不具有先行于所述披露内容的权利。这些文献的所有描述均基于本申请人可获得的信息，并不构成对这些描述内容准确的任何断言。

本文所使用的术语是用以描述特定的实施例，并不旨在限制本发明。

除非上下文明确地表明以另外的方式理解，否则本文所用的术语“包含(comprise)”意指存在所描述的项目(例如组分、步骤、要素或数字)，不排除存在其他项目(例如组分、步骤、要素和数字)。术语“由...组成(consist of)”包括以术语“由...组成(consist of)”和/或“实质上由...组成(consist essentially of)”所述的方面。

本文所用的术语“中和活性”意指抑制EphA4与其配体的结合的活性、和/或抑制人活体内由于EphA4与其配体结合而诱导的细胞的信号转导以及分子表达应答或功能改变的活性。

除非另有定义，否则本文所用的所有术语(包括技术术语及科学术语)具有与本披露所属技术领域的技术人员所广泛理解的相同的含义。除非另有明确定义，否则本文所用的术语应解释为具有与本文和相关技术领域中的含义一致的含义，不应解释为具有理想化或过于正式的含义。

第一和第二等术语用以表达各种要素，但可以理解为，这些要素不应受这些术语本身限制。这些术语仅用于将一个要素与另一个要素进行区别，例如在不脱离本披露的范围的情况下，能够将第一要素描述为第二要素，同样地，将第二要素描述为第一要素。

除非明确指出，否则本文中用以表示组分含量或数值范围等的数值应理解为以术语“约”修饰。例如，除非明确指出，否则“4℃”理解为意指“约4℃”，当然本领域技术人员可以根据技术常识和本说明书的文意而合理地理解其程度。

除非上下文明确地指出其他含义，否则当在本文的说明书和权利要求书中使用时，应理解以单数形式表示的各方面只要技术上不存在冲突也可以是复数形式，反之亦然。

现在将参考实例更详细地描述本披露。然而，本披露可以通过各种方面来实现，不应被解释为限于本文所述的实例。相关技术领域的技术人员可以不改变本披露的精神和范围，通过各种修饰、添加、缺失、取代等方式来实施本披露。

实例

参考实例1：抗EphA4单克隆抗体的产生

(A)小鼠抗EphA4单克隆抗体的产生

为了产生与小鼠EphA4(Genbank登录号NP_031962.2、SEQ ID NO.1)结合的单克隆抗体，通过以下步骤制备在小鼠EphA4的胞外区(20-547位)(SEQ ID NO.2)融合分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和组氨酸标签而成的蛋白质(以下称为“小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质”，SEQ ID NO.3)。

首先，使用源自小鼠脑的总RNA，通过RT-PCR对编码小鼠EphA4的信号序列(SEQ IDNO.4)和胞外区(SEQ ID NO.2)的DNA序列进行扩增，并克隆至具有编码SEAP和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司(Invitrogen)/美国生命技术公司(LifeTechnologies))的SalI/NotI位点。然后，通过Gateway系统(英杰公司/美国生命技术公司)的LR反应，将编码小鼠EphA4的信号序列与胞外区、SEAP和组氨酸标签的DNA序列转移至pcDNA3.1_rfcB载体，并构建pcDNA3.1-小鼠EphA4胞外区-SEAP-His表达载体。使用TransIT-LT1(宝生物公司(TAKARA))，将所构建的pcDNA3.1-小鼠EphA4胞外区-SEAP-His表达载体转染至HEK293EBNA细胞(英杰公司/美国生命技术公司)。孵育6天(5％CO₂，37℃)后，回收培养上清液。使用Protino柱(德商马歇雷-纳格尔公司(MACHEREY-NAGEL))，从所回收的培养上清液纯化小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质(SEQ ID NO.3)。

将二十微克的小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质与同量的TiterMax Gold佐剂(美商TiterMax公司(TiterMax USA))或GERBU佐剂(葛布生物技术有限公司(GERBUBiotechnik GmbH))混合，并皮下注射至Balb/c小鼠的足底。然后，在第3天、第7天、和第10天同样地施用小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质。此时，仅在第10天使用TiterMax Gold佐剂(美商TiterMax公司)，在第3天、第7天、及第10天使用GERBU佐剂(葛布生物技术有限公司)。在第13天将小鼠处死，回收周围淋巴结以制备淋巴结细胞。在GenomeONE-CF(石原产业株式会社(Ishihara Sangyo Kaisha，Ltd.))的存在下，将所制备的淋巴结细胞与P3U1骨髓瘤细胞(由京都大学(Kyoto University)提供)以5∶1的比例融合。在96孔塑料板中培养该融合细胞。孵育7天(5％CO₂，37℃)后，回收培养上清液。

使用所获得的培养上清液，选取与小鼠、大鼠和人类EphA4具有反应性的孔。

关于与小鼠、大鼠和人类EphA4的反应性，使用使人类IgG₁的Fc区和组氨酸标签与小鼠EphA4的胞外区、大鼠EphA4(Genbank登录号NP_001155883.1)的胞外区(20-547位)或人类EphA4(Genbank登录号NP_004429.1、SEQ ID NO.5)的胞外区(20-547位)(SEQ IDNO.6)融合而成的蛋白质(以下分别称为“小鼠EphA4胞外区-Fc-His蛋白质”、“大鼠EphA4胞外区-Fc-His蛋白质”或“人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质”)利用ELISA进行评价。

小鼠、大鼠或人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质是通过以下步骤制备的。最初，构建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人类EphA4胞外区-Fc-His表达载体。首先，使用源自小鼠、大鼠或人类的脑的总RNA，通过RT-PCR对编码小鼠、大鼠或人类EphA4的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，并克隆至具有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/美国生命技术公司)的SalI/NotI位点。然后，通过Gateway系统(英杰公司/美国生命技术公司)的LR反应，将编码小鼠、大鼠或人类EphA4的信号序列与胞外区、Fc和组氨酸标签的DNA序列转移至pcDNA3.1_rfcB载体，从而构建pcDNA3.1-小鼠、大鼠或人类EphA4胞外区-Fc-His表达载体。使用TransIT-LT1(宝生物公司)，将所构建的这些表达载体转染至HEK293EBNA细胞(英杰公司/美国生命技术公司)。孵育6天(5％CO₂，37℃)后，回收培养上清液。

使用小鼠、大鼠或人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质的ELISA是依据以下步骤进行的。将抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1x Block Ace(大日本制药有限公司(Dainippon Pharmaceutical))将孔在室温下封闭1小时。用0.02％Tween 20/PBS(半井株式会社(Nacalai Tesque))洗涤3次后，将包含小鼠、大鼠或人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质的孵育上清液添加到各孔中(最终浓度1nM)，并在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将该融合细胞的培养上清液补充到各孔中。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化酶标记的抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司(Sigma))溶液添加到各孔中，在室温下孵育5-20分钟。将等量的反应终止溶液(2N H₂SO₄，瓦科纯化工公司(Wako Pure Chemicals))添加到各孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))读取450nm的吸光度。

通过限制稀释法，从经过上述步骤而挑取出的孔克隆杂交瘤，最终获得表达对小鼠、大鼠及人类EphA4具有结合活性的小鼠抗EphA4抗体的杂交瘤克隆。

对所获得的杂交瘤克隆进行培养，使用蛋白A(通用医疗集团(GE Healthcare))，从培养上清液纯化小鼠抗EphA4单克隆抗体。

(B)EphA4切割促进活性的评价

大鼠海马神经元的制备是依据以下步骤进行的。从妊娠18天的大鼠(日本查尔斯河实验室(Charles River Laboratories Japan))中取出胎仔，切开头部将脑取出。在立体显微镜下切出海马区后，放入消化溶液(137mM NaCl(瓦科纯化工公司)、5mM KCl(瓦科纯化工公司)、7mM Na₂HPO₄(瓦科纯化工公司)、25mM Hepes(同仁化学研究所(DOJINDO))、0.5mg/mL DNA酶(西格玛公司)、0.25％胰蛋白酶(美国生命技术公司))中并在37℃下振荡10分钟。去除溶液，添加20％胎牛血清/Hanks缓冲液(西格玛公司)。去除液体，用Hanks缓冲液洗涤两次后，将海马组织移液到Hanks缓冲液中以产生细胞悬浮液。将细胞接种到加入有培养基(神经元基础培养基(美国生命技术公司)、1×B-27补充剂(美国生命技术公司)、0.5mM L-谷氨酰胺(美国生命技术公司))并涂布有聚L赖氨酸的96孔皿(福尔肯公司(Falcon))中。

使用海马神经元的EphA4切割促进活性评价是依据以下步骤进行的。用抗EphA4单克隆抗体(67nM)和γ分泌酶抑制药化合物E(50nM，恩佐生命科学公司(Enzo LifeSciences))对接种至96孔皿(福尔肯公司)的大鼠海马神经元进行处理，在16小时后使用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad))、5％2-巯基乙醇(伯乐公司))，回收细胞并煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司(Abnova))进行蛋白质印迹，对条带强度进行定量，算出EphA4C末端片段/全长EphA4的值。

获得具有促进EphA4的切割的活性的小鼠抗EphA4单克隆抗体(抗体A)。抗体A的同种型是利用单克隆抗体分型试剂盒(Serotec公司)来确定，对于重链而言是IgG₁，对于轻链而言是κ。

(C)抗体A的序列分析

通过5’-RACE(cDNA 5’末端快速扩增)法，对编码抗体A的重链和轻链的信号序列、和可变区的DNA序列进行扩增。使用RNeasy(凯杰公司(QIAGEN))，由该杂交瘤制备总RNA，并利用DNA酶(凯杰公司，无RNA酶的DNA酶集)进行处理。使用cDNA合成试剂盒(宝生物公司)，由该总RNA制备双链cDNA。将通过寡DNA ad29S(ACATCACTCCGT)(SEQ ID NO.7)和寡DNAad29AS(ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT)(SEQ ID NO.8)的退火所获得的5’接头添加至该cDNA。用5’正向引物(5’-PCR4引物，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG)(SEQ ID NO.9)和3’反向引物(小鼠IgG重链的扩增使用GCCAGTGGATAGACTGATGG(SEQ ID NO.10)，小鼠Igκ轻链的扩增使用GATGGATACAGTTGGTGCAGC(SEQ ID NO.11))，对所获得的cDNA进行扩增。将经扩增的cDNA插入至pCR2.1载体(英杰公司/美国生命技术公司)。使用ABI3130XL分析抗体A的基因序列。作为由通过本分析所鉴定出的抗体A的基因序列所编码的氨基酸序列，重链信号序列是SEQ ID NO.12所示的序列，重链可变区是SEQ ID NO.13所示的序列，轻链信号序列是SEQ ID NO.14所示的序列，轻链可变区是SEQ ID NO.15所示的序列。作为编码抗体A的基因序列的核苷酸序列，重链信号序列是SEQ ID NO.16所示的序列，重链可变区是SEQ ID NO.17所示的序列，轻链信号序列是SEQID NO.18所示的序列，轻链可变区是SEQ ID NO.19所示的序列。

抗体A的重链和轻链的全长序列是通过以下步骤获得的。使用RNeasy(凯杰公司)，由该杂交瘤制备总RNA，并利用DNA酶(凯杰公司，无RNA酶的DNA酶集)进行处理。使用RNAPCR试剂盒(宝生物公司)，由总RNA制备反转录产物。将所获得的逆转录产物用作模板，使用5’正向引物(重链的扩增使用GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTGTCCTGGTGCTGCTCC(引物ID7455)(SEQ ID NO.20)，轻链的扩增使用GCGAAGCTTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTTCCTGCTCACG(引物ID 7453)(SEQ ID NO.21))和3’反向引物(重链的扩增使用GCGGAATTCATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC(引物ID7257)(SEQ ID NO.22)，轻链的扩增使用CGCGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC(引物ID 7249)(SEQ ID NO.23))，利用PCR对编码抗体A的重链和轻链的基因序列进行扩增，并分别克隆至pEE6.4及pEE12.4载体(龙沙集团(Lonza))。使用ABI3130XL对基因序列进行分析。作为由通过本分析所鉴定出的抗体A的基因序列所编码的氨基酸序列，重链恒定区是SEQ ID NO.24所示的序列，轻链恒定区是SEQ ID NO.25所示的序列。

抗体A的CDR通过以下方法确定。根据Kabat编号系统，使用Abysis软件(UCL)对抗体A的氨基酸序列进行编号。基于该编号，依据用以鉴定CDR的Kabat的定义进行确定。将抗体A的CDR的氨基酸序列示于表1。

[表1]

抗体A的CDR的氨基酸序列

名称	序列
		重链CDR1	RYGVH(SEQ ID NO.26)
重链CDR2	VIWRGGSTDYNAAFMS(SEQ ID NO.27)
		重链CDR3	ESLFGVYYDYGYYSMDY(SEQ ID NO.28)
轻链CDR1	RASQEISGYLS(SEQ ID NO.29)
		轻链CDR2	AASTLDS(SEQ ID NO.30)
轻链CDR3	LQYASYPLT(SEQ ID NO.31)

参考实例2：抗EphA4单克隆抗体对于小鼠和人类EphA4的结合亲和力

通过使用Biacore T200(通用医疗集团)的表面等离子体共振(SPR法)而确定抗体A对于小鼠和人类EphA4的结合亲和力。首先，将抗His抗体(通用医疗集团，28-9950-56)固定化至传感器芯片CM5。固定化是通过使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、和N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法来进行，采用乙醇胺进行封闭(传感器芯片和固定化用试剂均来自通用医疗集团)。用固定化用缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.5)稀释至3.5μg/mL，依据Biacore T200附带的操作说明固定在传感器芯片上。用运行缓冲液HBS-EP(通用医疗集团，BR-1001-88)将小鼠或人类EphA4胞外区-SEAP-His10加以稀释，在流动池上进行120秒送液和捕获(约10RU的捕获量)。随后，将使用HBS-EP在100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0nM的范围内经连续稀释后的抗体A添加至传感器芯片中120秒，依次观察添加时(结合相、120秒)和添加结束后(解离相、600秒)的结合反应曲线。在各观察结束后，添加4M MgCl₂(60秒，瓦科纯化工公司)以再生传感器芯片。对于所获得的结合反应曲线，使用系统附带软件即BIA评价软件并通过1∶1的结合模型来进行拟合分析，算出对于小鼠和人类EphA4的结合亲和力(KD＝kd/ka)。

抗体A对于小鼠和人类EphA4的结合亲和力(KD值)分别为1.32×10^-9M、1.19×10^{- 9}M(图1)。对于小鼠和人类EphA4的其他结合参数也几乎相同。因此，认为抗体A对于小鼠和人类EphA4具有相似的结合亲和力。

参考实例3：抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中的EphA4切割促进活性

针对抗体A，依据以下步骤来进行使用海马神经元的EphA4切割促进活性的评价。用抗体A(2.0、6.7、20nM)和γ分泌酶抑制药化合物E(50nM，恩佐生命科学公司)对接种至96孔皿(福尔肯公司)的大鼠海马神经元进行处理，在24小时后使用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐公司)、5％2-巯基乙醇(伯乐公司))，回收细胞并煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司)进行蛋白质印迹，对条带强度进行定量，算出EphA4C末端片段/全长EphA4的值。

抗体A在海马神经元中，浓度依赖性地促进EphA4切割反应(图2)。

参考实例4：抗EphA4单克隆抗体的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性

针对抗体A，根据以下步骤来进行小鼠EphA4与小鼠配体的结合抑制活性的评价。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司(Thermo SCIENTIFIC))涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司(DS PharmaBiomedical))将孔在室温下封闭1小时。用0.02％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，将小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质添加到孔中(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将配体和抗体A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)补充到孔中。注意，配体使用生物素化小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&D系统公司(R&D Systems)，最终浓度6nM)和生物素化小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合体(R&D系统公司，最终浓度2.5nM)。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化酶标记的链霉抗生物素蛋白(通用医疗集团)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，在室温下孵育2分钟。将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体A浓度依赖性地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，对于小鼠肝配蛋白A1、肝配蛋白B2结合的IC50值分别约为5.9nM、3.1nM(图3)。因此表明抗体A较强地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合。

参考实例5：抗EphA4单克隆抗体的人类EphA4-人类配体结合抑制活性

针对抗体A，根据以下步骤来进行人类EphA4与人类配体的结合抑制活性的评价。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，将人类EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质添加到孔中(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将配体和经连续稀释的抗体A(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)补充到孔中。注意，配体使用生物素化人类肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&D系统公司，最终浓度0.7nM)和生物素化人类肝配蛋白B3-Fc嵌合体(R&D系统公司，最终浓度2.3nM)。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化酶标记的链霉抗生物素蛋白(通用医疗集团)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，在室温下孵育2-5分钟。将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(分子器件公司(MolecularDevices)或珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体A浓度依赖性地抑制人类EphA4与人类配体的结合，对于人类肝配蛋白A5、肝配蛋白B3结合的IC₅₀值分别约为2.8nM、1.4nM(图4)。因此表明抗体A也较强地抑制人类EphA4与人类配体的结合。

参考实例6：抗EphA4单克隆抗体对于人类Eph受体的选择性

根据参考实例1中所述的小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质的制备方法，使用源自组织的总RNA，通过RT-PCR对编码人类的各Eph受体(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码SEAP和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/美国生命技术公司)。然后，通过Gateway系统(英杰公司/美国生命技术公司)的LR反应，将编码人类的各Eph受体的信号序列与胞外区、SEAP和组氨酸标签的DNA序列转移至pcDNA3.1_rfcB载体，从而构建表达对人类的各Eph受体的胞外区融合SEAP和His标签而成的蛋白质(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白质”)的载体(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白质表达载体”)。

然后，使用Expi293表达系统(吉布科公司(Gibco)/赛默飞世尔公司(ThermoFisher))，将人类的各Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白质表达载体引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养5天(5％CO₂，37℃，120rpm)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液用0.45μm过滤器(密理博公司(Millipore))过滤。

针对抗体A，根据以下步骤来进行人类Eph受体的结合活性的评价。

将兔抗6-His抗体(贝斯实验室(Bethyl Laboratories))涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，将人类胞外区-SEAP-His蛋白质的各Eph受体接种到各孔中(最终浓度1nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将人类IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司(Mitsubishi Pharma Corporation))和抗体A(10μg/mL)补充到孔中，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，确认到适度的显色后，将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体A仅对人类Eph受体家族中的人类EphA4具有特异性结合活性(图5)。

参考实例7：抗EphA4单克隆抗体对于小鼠Eph受体的选择性

根据参考实例1中所述的EphA4胞外区-Fc-His蛋白质的制备方法，使用源自组织的总RNA，通过RT-PCR对编码小鼠的各Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码人类IgG₁的Fc区和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/美国生命技术公司)。然后，通过Gateway系统(英杰公司/美国生命技术公司)的LR反应，将编码小鼠的各Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信号序列与胞外区、Fc和组氨酸标签的DNA序列转移到pcDNA3.1_rfcB载体，从而构建小鼠的各Eph受体的胞外区-Fc-His蛋白质表达载体。在小鼠EphA2的胞外区-Fc-His蛋白质表达载体的构建中，使用源自组织的总RNA，通过RT-PCR对编码小鼠EphA2的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.1载体，从而构建小鼠EphA2胞外区-Fc-His蛋白质表达载体。

然后，使用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)，将小鼠的各Eph受体胞外区-Fc-His蛋白质表达载体引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养5天(5％CO₂，37℃，120rpm)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液用0.45μm过滤器(密理博公司(Millipore))过滤。

针对抗体A，根据以下步骤进行小鼠Eph受体的结合活性的评价。

将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，在各孔中接种小鼠胞外区-Fc-His蛋白质的各Eph受体(最终浓度1nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充人类IgG溶液(100μg/mL，西格玛公司)和抗体A(10μg/mL)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，确认到适度的显色后，将等量的反应终止溶液(1NH₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体A仅对小鼠Eph受体家族中的小鼠EphA4具有特异性结合活性(图6)。

参考实例8：抗EphA4单克隆抗体对于小鼠、大鼠、猴及人类EphA4的反应性

小鼠、大鼠、猴及人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质的产生是依据以下步骤进行的。首先，依据参考实例1中所述的EphA4胞外区-Fc-His蛋白质的制备方法，构建猴EphA4胞外区-Fc-His蛋白质表达载体。将在载体构建中所利用的猴EphA4的氨基酸序列示于SEQ IDNO.32，将其胞外区示于SEQ ID NO.33。使用猴EphA4胞外区-Fc-His蛋白质表达载体、及参考实例1中所述的小鼠、大鼠和人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质表达载体，制备各种EphA4胞外区-Fc-His蛋白质。

针对抗体A，依据以下步骤来进行与各种EphA4胞外区的结合活性的评价。

将驴抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，在孔中接种小鼠、大鼠、猴和人类EphA4胞外区-Fc-His蛋白质(最终浓度1nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充人类IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司)和抗体A(0、0.00013、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10、μg/mL)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，确认到适度的显色后，将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体A对于小鼠、大鼠、猴和人类EphA4均具有同等的结合活性(图7)。

参考实例9：抗EphA4单克隆抗体对于人类EphA4胞外区、配体结合域、纤连蛋白III 型域1、纤连蛋白III型域2的反应性

使人类EphA4的胞外区(ECD)、配体结合域(LBD)、纤连蛋白III型域1(FN1)或纤连蛋白III型域2(FN2)与麦芽糖结合蛋白质(MBP)及组氨酸标签融合而成的蛋白质(以下称为“人类EphA4胞外区-MBP-His蛋白质”、“人类EphA4配体结合域-MBP-His蛋白质”、“人类EphA4纤连蛋白III型域1-MBP-His蛋白质”、和“人类EphA4纤连蛋白III型域2-MBP-His蛋白质”)的产生依据以下步骤来进行。最开始，构建pcDNA3.4-人类EphA4胞外区、配体结合域、纤连蛋白III型域1、或纤连蛋白III型域2-MBP-His表达载体。首先，通过PCR，对编码人类EphA4的信号序列(SEQ ID NO.34)或前胰蛋白酶原的信号序列(SEQ ID NO.35)和人类EphA4的各结构域的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码MBP和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.4载体(英杰公司/美国生命技术公司)，从而构建人类EphA4胞外区-MBP-His蛋白质、人类EphA4配体结合域-MBP-His蛋白质、人类EphA4纤连蛋白III型域1-MBP-His蛋白质、和人类EphA4纤连蛋白III型域2-MBP-His蛋白质的表达载体。在载体构建中所利用的人类EphA4的氨基酸序列示于SEQ ID NO.5，其胞外区示于SEQ ID NO.36，配体结合域示于SEQID NO.37，纤连蛋白III型域1示于SEQ ID NO.38，纤连蛋白III型域2示于SEQ ID NO.39。使用Expi293表达系统(赛默科技公司)，将上述表达载体转染至Expi293F细胞(赛默科技公司)。在4天后回收培养上清液，并通过0.45μm过滤器(密理博公司)。使用直链淀粉树脂(美商纽英伦生物技术公司(NEB))进行粗纯化，使用Zeba旋转除盐柱(赛默科技公司)将缓冲液取代为PBS(瓦科纯化工公司)。通过Superdex20010/300(通用医疗集团)对单体组分进行区分纯化。

针对抗体A，依据以下的步骤来进行与各种人类EphA4内结构域的结合活性的评价。

将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。利用0.02％Tween 20/PBS(半井株式会社)洗涤两次后，在孔中接种人类EphA4胞外区-MBP-His蛋白质、人类EphA4配体结合域-MBP-His蛋白质、人类EphA4纤连蛋白III型域1-MBP-His蛋白质、及人类EphA4纤连蛋白III型域2-MBP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充抗体A(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤5次后，在孔中添加TMB溶液(美商KPL公司(KPL))，确认到适度的显色后，在孔中添加等量的反应终止溶液(2N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm及650nm的吸光度。

抗体A对于人类EphA4胞外区(ECD)及配体结合域(LBD)具有结合活性(图8)。未与纤连蛋白III型域1(FN1)和纤连蛋白III型域2(FN2)反应。因此可知，抗体A与人类EphA4胞外区的配体结合域特异性地结合。

参考实例10：抗EphA4单克隆抗体对于海马神经元的树突棘数量的增加效果

大鼠海马神经元的制备如上述参考实例1(B)中所述进行。使用Nucleofector(龙沙集团)将EGFP基因引入大鼠海马神经元，与未进行基因引入的大鼠海马神经元混合，接种至装有涂布有聚L赖氨酸的覆盖玻璃(日商松浪硝子工业公司(Matsunami Glass Ind.，Ltd.))的24孔板(福尔肯公司)。

使用海马神经元的树突棘的计数是依据以下步骤来进行。用对照抗体(小鼠IgG1；百奥传奇公司(BioLegend))或抗体A(6.7、20nM)对接种至装有涂布有聚L赖氨酸的覆盖玻璃(日商松浪硝子工业公司)的24孔板(福尔肯公司)的培养第13天的引入了EGFP的大鼠海马神经元进行24小时处理。其后，将覆盖玻璃移至2％PFA(瓦科纯化工公司)/4％蔗糖(瓦科纯化工公司)/PBS中，静置20分钟以固定细胞。除去固定液，利用PBS将细胞洗涤3次后，添加0.25％TritonX-100(瓦科纯化工公司)/PBS，进行15分钟细胞透化处理。除去溶液，将覆盖玻璃移至2％BSA(西格玛公司)/0.25％TritonX-100/Opti-MEM(吉布科公司)中，进行1小时封闭后，使抗GFP抗体(半井株式会社)反应1小时30分钟。除去第一抗体溶液，利用PBS洗涤3次后，使第二抗体反应1小时。除去第二抗体溶液，利用PBS洗涤3次后，添加Prolong Gold抗淬灭试剂(美商分子探针公司(Molecular probes))并封入，利用LSM800(德商蔡司公司(ZEISS))进行观察。进行上述实验3次，每次实验时，从两片覆盖玻璃提取神经元，使用图像分析软件Imaris^TM(瑞士Bitplane公司)，对存在于各树突中的树突棘进行计数，算出各神经元中每10μm的树突棘数量。

抗体A使海马神经元的树突棘数量增加(图9)。本结果表明，抗体A具有于海马神经元中使树突棘稳定化的活性。

参考实例11：利用X射线晶体结构分析的EphA4-配体结合域(EphA4-LBD)的表位映 射

抗体A-Fab的制备依据以下步骤来进行。使抗体A 101.1mg溶解于以15mg/mL的浓度包含30mM L-半胱氨酸和2mM EDTA的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中。于该抗体溶液中添加相对于抗体为1/200量的木瓜蛋白酶(西格玛公司)，并于37℃下进行18小时酶消化。用PBS对抗体A酶消化液进行透析后，通过离心分离将沉淀去除(所产生的沉淀在PBS中再溶解，与离心分离上清液加以混合)。然后，为了除去抗体A-Fab以外的杂质而进行以下的步骤。

1)利用蛋白A柱进行纯化

将该酶消化溶液应用于经PBS平衡化的2mL的ProSep vA High Capacity(密理博公司)，回收流穿液组分和经PBS洗涤的组分。

2)使用抗人类IgG Fcγ抗体的亲和纯化

于NHS-活化Sepharose 4FF(通用医疗集团)上共价结合有抗人类IgG Fcγ抗体(杰克逊免疫研究实验室)的亲和柱是依据该Sepharose的指南制备的。向该亲和柱中加入上述1)中所回收的溶液，回收其流穿液溶液和经PBS洗涤的洗涤液。

3)利用凝胶过滤进行纯化

使用超过滤膜将上述2)中所获得的流穿液组分进行浓缩。将Superose 12(通用医疗集团)利用PBS进行平衡化，应用经过浓缩的样品进行分离纯化。利用SDS-PAGE对经分离纯化的一部分组分进行分析，回收并收集含有高纯度抗体A-Fab的组分。将如此纯化后所得的样品作为抗体A-Fab。

为了产生抗体A-Fab与抗原EphA4-LBD的复合物，而制备EphA4-LBD(Qin H.等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，283：29473-29484(2008))。以EphA4-LBD相对于抗体A-Fab成为约1.5倍的摩尔比的方式将0.68μmol(200μM、3.4mL)的EphA4-LBD与0.45μmol(300μM、1.5mL)的抗体A-Fab加以混合。然后将混合溶液应用于HILOAD 26/60 Superdex 75 prepgrade(通用医疗集团)，利用色谱用缓冲液(25mM Tris/HCl(pH 7.5)、100mM NaCl)进行洗脱。利用SDS PAGE对包含复合物的组分进行分析，采集高纯度的组分并浓缩至约40.8mg/mL，将其用于结晶化。

复合物的结晶化通过使用自动结晶化装置Hydra II Plus One系统(美商矩阵科技股份有限公司(Matrix Technologies Corp.，Ltd.))的坐滴蒸气扩散法来进行。培养板使用MRC-2(美商Molecular Dimensions公司)。贮液器溶液的组成为100mM HEPES(pH7.5)、10％聚乙二醇8000、8％乙二醇，以该贮液器溶液与上述复合物溶液的体积比成为1∶1的方式加以混合而产生结晶化微滴。所产生的结晶化板是在20℃下静置。

于上述条件下进行结晶化，结果获得了空间群P212121、晶格常数的晶体。使放射光X射线入射至所获得的晶体而获得的衍射数据。通过HKL2000(美商HKL研究公司)对衍射数据进行处理，通过分子取代法来确定相位。分子取代法是使用CCP4软件套件(协同计算项目编号4[CCP4]第6.5.0版，Acta Cryst.[晶体学报]D 67：235-242(2011))所包含的程序PHASER(第2.5.0版，McCoy A.J.等人，J.Appl.Cryst.[应用晶体学杂志]40：658-674(2007))。作为分子取代法的搜索模型，使用EphA4-LBD的晶体结构(PDBID：3CKH)和IgG的Fab区域的晶体结构(PDBID：2VXT(L链)与1FGN(H链))。以与自所确定的相位获得的电子密度匹配的方式，使用程序COOT(Emsley P.等人，Acta Cryst.[晶体学报]D 60：2126-2132n(2004))来构建分子模型，并使用程序REFMAC(Murshudov G.N.，Acta Cryst.[晶体学报]D53：240-255(1997))进行结构精密化。

通过以上的结构计算而获得分辨率的复合物晶体结构(R＝0.212、Rfree＝0.258)。

使用计算化学系统MOE 2018.0101(加拿大化学计算集团公司(ChemicalComputing Group Inc))所搭载的相互作用检测工具对所获得的抗体A-Fab/EphA4-LBD复合物的晶体结构进行分析，鉴定与抗体A-Fab直接接触的EphA4-LBD上的氨基酸残基(图10A)。鉴定出的氨基酸残基是Glu51、Gly52、Ile59、Gln71、Cys73、Asn74、Val75、Met76、Glu77、Thr104、Arg106、Leu111、Pro112、Met115、Arg162、Met164、Cys191、Ala193、Val195。图10B中表示由Maestro(第11.0版，薛定谔股份有限公司(Schrodinger，LLC))生成的EphA4-LBD的表面结构。该结果为，诸位发明人得出了如下结论：存在这些氨基酸残基的区域是EphA4-LBD中的抗体A-Fab结合区域。

实例1：抗体A的人源化抗体的产生

人源化抗EphA4抗体的制备

设计人源化抗体的可变区。基于抗体A的框架区(FR)的较高同源性，从人类抗体的FR中，关于重链，选择IGHV3-33*03(SEQ ID NO.42)和JH6(SEQ ID NO.43)作为人源化抗体的FR，关于轻链，选择IGKV1-17*01(SEQ ID NO.40)和JK4(SEQ ID NO.41)作为人源化抗体的FR。其后，使用小鼠抗体A的3D结构预测模型，预测会与CDR的氨基酸相互作用的FR中的氨基酸，与重链的CDR1中具有Y32F突变的抗体A的CDR(SEQ ID NO.44、27、28、和29-31)一起移植，设计出HK2-42(SEQ ID NO.45)作为人源化抗体的重链可变区，设计出L1-8(SEQ IDNO.46)作为人源化抗体的轻链可变区。将所移植的CDR的氨基酸序列示于表2，将核酸序列示于表3。

作为重链恒定区，使用人类IgG₂的恒定区(SEQ ID NO.47)。作为轻链恒定区，使用人类Igκ(SEQ ID NO.48)。使用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)，将包含编码人源化抗体的氨基酸序列的基因序列的表达载体(pcDNA3.4)转染至Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。作为编码人源化抗体的氨基酸序列的基因序列，分别为：重链可变区使用SEQ ID NO.55所示的核酸序列，轻链可变区使用SEQ ID NO.56所示的核酸序列，重链恒定区使用SEQ ID NO.57所示的核酸序列，轻链恒定区使用SEQ ID NO.58所示的核酸序列。人源化抗体的重链全长(不包括信号序列)的氨基酸序列是SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，轻链全长(不包括信号序列)的氨基酸序列是SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列。编码人源化抗体的重链全长的核酸序列是SEQ ID NO.61所示的核酸序列，编码轻链全长的核酸序列是SEQ ID NO.62所示的核酸序列。回收上清液，使用MabSelect SuRe(通用医疗集团)纯化抗体A的人源化抗体(抗体B)。

[表2]

抗体B的CDR的氨基酸序列

[表3]

抗体B的CDR的核酸序列

实例2：人源化抗EphA4单克隆抗体对于人类EphA4的亲和力

通过使用Biacore T200(通用医疗集团)的表面等离子体共振(SPR法)而确定实例1中所获得的抗体B对于人类EphA4的结合亲和力。首先，将抗His抗体(通用医疗集团，28-9950-56)固定化至传感器芯片CM5。固定化是通过使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、和N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法来进行，采用乙醇胺进行封闭(传感器芯片和固定化用试剂均来自通用医疗集团)。用固定化用缓冲液(10mM乙酸钠，pH 4.5)稀释至3.5μg/mL，依据Biacore T200附带的操作说明固定在传感器芯片上。使用运行缓冲液HBS-EP(通用医疗集团，BR-1001-88)将人类EphA4胞外区-SEAP-His10加以稀释，在流动池上进行120秒送液和捕获(约10RU的捕获量)。然后，将使用HBS-EP在100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0nM的范围内进行连续稀释后的抗体B添加至传感器芯片中120秒，依序观察添加时(结合相，120秒)和添加结束后(解离相、600秒)的结合反应曲线。在各观察结束后，添加4M MgCl2(60秒，瓦科纯化工公司)以再生传感器芯片。对于所获得的结合反应曲线，使用系统附带软件BIA评价软件并利用1∶1的结合模型来进行拟合分析，算出对于人类EphA4的亲和力(KD＝kd/ka)。

抗体B对于人类EphA4的结合亲和力(KD值)是1.34×10^-9M(图11)。可知抗体B显示与进行人源化之前的抗体A大致同等的亲和力。

实例3：人源化抗EphA4单克隆抗体在海马神经元中的EphA4切割促进活性

针对实例1中所获得的抗体B，依据以下步骤进行使用海马神经元的EphA4切割促进活性的评价。

用抗体B(2.0、6.7、20nM)和γ分泌酶抑制药化合物E(50nM、恩佐生命科学公司)对接种至96孔皿(福尔肯公司)的大鼠海马神经元进行处理，在24小时后使用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐公司)、5％2-巯基乙醇(伯乐公司))，回收细胞并煮沸5分钟。用该样品进行SDS-PAGE，用抗EphA4单克隆抗体(亚诺法公司)进行蛋白质印迹，对条带强度进行定量，算出EphA4C末端片段/全长EphA4的值。

抗体B在海马神经元中，浓度依赖性地促进EphA4切割反应(图12)

实例4：人源化抗EphA4单克隆抗体的人类EphA4-人类配体结合抑制活性

针对实例1中所获得的抗体B，依据以下步骤来进行人类EphA4与人类配体的结合抑制活性的评价。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，在孔中接种人类EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充配体和经连续稀释的抗体B(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)。注意，配体使用生物素化人类肝配蛋白A5-Fc嵌合体(R&D系统公司，最终浓度0.7nM)和生物素化人类肝配蛋白B3-Fc嵌合体(R&D系统公司，最终浓度2.3nM)。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化酶标记的链霉抗生物素蛋白(通用医疗集团)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，在室温下孵育2-5分钟。将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(分子器件公司或珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体B浓度依赖性地抑制人类EphA4与人类配体的结合，对于人类肝配蛋白A5、肝配蛋白B3结合的IC₅₀值分别约为4.9nM、1.6nM。因此可知，抗体B较强地抑制人类EphA4与人类配体的结合，表明与进行人源化之前的抗体A大致同等的抑制活性(图13)。

实例5：人源化抗EphA4单克隆抗体的小鼠EphA4-小鼠配体结合抑制活性

针对实例1中所获得的抗体B，依据以下步骤来进行小鼠EphA4与小鼠配体的结合抑制活性的评价。将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.02％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，将小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质添加到孔中(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充配体和经连续稀释的抗体B(0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000、3000nM)。注意，配体使用生物素化小鼠肝配蛋白A1-Fc嵌合体(R&D系统公司(R&D Systems)，最终浓度6nM)和生物素化小鼠肝配蛋白B2-Fc嵌合体(R&D系统公司，最终浓度2.5nM)。在室温下孵育1小时并洗涤3次后，添加辣根过氧化酶标记的链霉抗生物素蛋白(通用医疗集团)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，在室温下孵育2分钟。将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(分子器件公司或珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体B浓度依赖性地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，对于小鼠肝配蛋白A1、肝配蛋白B2结合的IC₅₀值分别约为8.7nM、4.2nM。因此可知，抗体B较强地抑制小鼠EphA4与小鼠配体的结合，表明与进行人源化之前的抗体A大致同等的抑制活性(图14)。

实例6：人源化抗EphA4单克隆抗体对于人类Eph受体的选择性

与参考实例1中所述的小鼠EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质的制备方法同样地，使用源自组织的总RNA，通过RT-PCR对编码人类的各Eph受体(EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码SEAP蛋白质及组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/美国生命技术公司)。然后，通过Gateway系统(英杰公司/美国生命技术公司)的LR反应，将编码人类的各Eph受体的信号序列与胞外区、SEAP蛋白质和组氨酸标签的DNA序列转移至pcDNA3.1_rfcB载体，从而构建表达对人类的各Eph受体的胞外区融合SEAP蛋白质及His标签而成的蛋白质(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白质”)的载体(称为“Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白质表达载体”)。

然后，使用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)，将人类的各Eph受体胞外区-SEAP-His蛋白质表达载体引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养5天(5％CO₂，37℃)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm进行5分钟离心。将离心上清液用0.45μm过滤器(密理博公司(Millipore))过滤。

针对实例1中所获得的抗体B，依据以下步骤进行人类Eph受体的结合活性的评价。

将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，将人类胞外区-SEAP-His蛋白质的各Eph受体接种到各孔中(最终浓度1nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充人类IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司)和抗体B(10μg/mL)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的驴抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，确认到适度的显色后，将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

发现抗体B与进行人源化之前的抗体A同样地，在人类Eph受体家族间与人类EphA4特异性地结合(图15)。

实例7：人源化抗EphA4单克隆抗体对于小鼠Eph受体的选择性

依据参考实例1中所述的EphA4胞外区-Fc-His蛋白质的制备方法，使用源自组织的总RNA，通过RT-PCR对编码小鼠的各Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码人类IgG₁的Fc区和组氨酸标签的DNA序列的pENTR1A载体(英杰公司/美国生命技术公司)。然后，通过Gateway系统(英杰公司/美国生命技术公司)的LR反应，将编码小鼠的各Eph受体(EphA1、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)的信号序列与胞外区、Fc和组氨酸标签的DNA序列转移到pcDNA3.1_rfcB载体，从而构建小鼠的各Eph受体的胞外区-Fc-His蛋白质表达载体。在小鼠EphA2的胞外区-Fc-His蛋白质表达载体的构建中，使用源自组织的总RNA，通过RT-PCR对编码小鼠EphA2的信号序列与胞外区的DNA序列进行扩增，克隆至具有编码Fc和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.1载体，从而构建小鼠EphA2胞外区-Fc-His蛋白质表达载体。

然后，使用Expi293表达系统(吉布科公司/赛默飞世尔公司)，将小鼠的各Eph受体胞外区-Fc-His蛋白质表达载体引入Expi293F细胞(吉布科公司/赛默飞世尔公司)。培养5天(5％CO₂，37℃，120rpm)后，回收培养上清液，在室温下以1500rpm离心5分钟。将离心上清液用0.45μm过滤器(密理博公司(Millipore))过滤。

针对抗体B，依据以下步骤来进行小鼠Eph受体的结合活性的评价。

将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，在各孔中接种小鼠胞外区-Fc-His蛋白质的各Eph受体(最终浓度1nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充人类IgG溶液(100μg/mL，西格玛公司)和抗体B(10μg/mL)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的山羊抗人类κ轻链抗体(IBL)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，确认到适度的显色后，将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体B仅对小鼠Eph受体家族中的小鼠EphA4具有特异性结合活性(图16)。

实例8：人源化抗EphA4单克隆抗体对于小鼠、大鼠、猴及人类EphA4的反应性

针对抗体B，依据以下步骤来进行与各种EphA4的结合活性的评价。

将抗碱性磷酸酶抗体(赛默科技公司)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。用0.05％Tween 20/PBS(赛默科技公司)洗涤3次后，在孔中接种小鼠、大鼠、猴和人类EphA4胞外区-SEAP-His蛋白质(最终浓度1nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充人类IgG溶液(100μg/mL，三菱药物公司)和抗体B(0、0.00013、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10μg/mL)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的驴抗人类IgG抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，将TMBZ(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，西格玛公司)溶液添加到孔中，确认到适度的显色后，将等量的反应终止溶液(1N H₂SO₄，瓦科纯化工公司)添加到孔中，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm的吸光度。

抗体B对于小鼠、大鼠、猴和人类EphA4均具有同等的结合活性(图17)。

实例9：人源化抗EphA4单克隆抗体对于人类EphA4胞外区、配体结合域、纤连蛋白 III型域1、纤连蛋白III型域2的反应性

针对实例1中所获得的抗体B，依据以下步骤来进行与各种人类EphA4内结构域的结合活性的评价。

将兔抗6-His抗体(贝斯实验室)涂布在96孔板(Nunc公司)的孔上。在4℃下孵育过夜后，通过1％Block Ace(DS制药生物医药公司)将孔在室温下封闭1小时。利用0.02％Tween 20/PBS(半井株式会社)洗涤两次后，在孔中接种人类EphA4胞外区-MBP-His蛋白质、人类EphA4配体结合域-MBP-His蛋白质、人类EphA4纤连蛋白III型域1-MBP-His蛋白质、及人类EphA4纤连蛋白III型域2-MBP-His蛋白质(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。洗涤3次后，在孔中补充抗体B(最终浓度10nM)，在室温下孵育1小时。添加辣根过氧化酶标记的兔抗人类IgG Fcγ片段抗体(杰克逊免疫研究实验室)，在室温下孵育1小时。洗涤5次后，在孔中添加TMB(美商KPL公司)溶液，确认适度的显色后，在孔中添加等量的反应终止溶液(2NH₂SO₄，瓦科纯化工公司)，通过酶标仪(珀金埃尔默公司)读取450nm及650nm的吸光度。

抗体B对于人类EphA4胞外区(ECD)和配体结合域(LBD)具有结合活性(图18)。未与纤连蛋白III型域1(FN1)和纤连蛋白III型域2(FN2)反应。因此可知，抗体B与人类EphA4胞外区的配体结合域特异性地结合。

实例10：人源化抗EphA4单克隆抗体对于海马神经元的树突棘数量的增加效果

大鼠海马神经元的制备如参考实例1(B)中所述进行。使用Nucleofector(龙沙集团)将EGFP基因引入大鼠海马神经元，接种至装有涂布有聚L赖氨酸的覆盖玻璃(日商松浪硝子工业公司)的24孔板(福尔肯公司)。

使用海马神经元的树突棘的计数是依据以下步骤来进行。用对照抗体(人类；西格玛公司)或抗体B(6.7、20nM)对接种至装有涂布有聚L赖氨酸的覆盖玻璃(日商松浪硝子工业公司)的24孔板(福尔肯公司)中的培养第13天的引入了EGFP的大鼠海马神经元进行24小时处理。其后，将覆盖玻璃移至2％PFA(瓦科纯化工公司)/4％蔗糖(瓦科纯化工公司)/PBS中，静置20分钟以固定细胞。除去固定液，利用PBS将细胞洗涤3次后，添加0.25％TritonX-100(瓦科纯化工公司)/PBS，进行15分钟细胞透化处理。除去溶液，将覆盖玻璃移至2％BSA(西格玛公司)/0.25％TritonX-100/OPTI-MEM(吉布科公司)中，进行1小时封闭后，使抗GFP抗体(半井株式会社)反应1小时30分钟。除去第一抗体溶液，利用PBS洗涤3次后，使第二抗体反应1小时。除去第二抗体溶液，利用PBS洗涤3次后，添加Prolong Gold抗淬灭试剂(美商分子探针公司)并封入，利用LSM800(德商蔡司公司)进行观察。进行上述实验3次，每次实验时，从两片覆盖玻璃提取神经元，使用图像分析软件Imaris^TM(瑞士Bitplane公司)，对存在于各树突中的树突棘进行计数，算出各神经元中每10μm的树突棘数量。

抗体B使海马神经元的树突棘数量增加(图19)。本结果表明，抗体B具有在海马神经元中使树突棘稳定化的活性。

实例11：人源化抗EphA4单克隆抗体的人类EphA4切割促进活性

针对实例1中获得的抗体B，依据以下步骤来进行对于人类EphA4的切割促进活性的评价。

大鼠海马神经元的制备如参考实例1(B)中所述进行。使用Nucleofector(龙沙集团)将人类EphA4-HA蛋白质表达载体导入大鼠海马神经元，接种至涂布有聚L赖氨酸的96孔皿(福尔肯公司)。用抗体B(6.7、20、67nM)和γ分泌酶抑制药化合物E(50nM、恩佐生命科学公司)对所接种的大鼠海马神经元进行处理，在约24小时后利用PBS(瓦科纯化工公司)洗涤，添加SDS样品缓冲液(Laemmli样品缓冲液(伯乐公司)，5％2-巯基乙醇(伯乐公司))，回收细胞并煮沸5分钟。使用该样品进行SDS-PAGE，使用大鼠抗HA单克隆抗体(瑞士罗氏公司(Roche))进行蛋白质印迹，对条带强度进行定量，算出EphA4C末端片段/全长EphA4的值。

抗体B在海马神经元中促进人类EphA4切割反应(图20)。

实例12：MMP和ADAM与人源化抗EphA4单克隆抗体的海马神经元的树突棘数量增加 效果的相关性

大鼠海马神经元的制备如参考实例1(B)中所述进行。使用Nucleofector(龙沙集团)将EGFP基因引入一部分大鼠海马神经元，接种至装有涂布有聚L赖氨酸的覆盖玻璃(日商松浪硝子工业公司)的24孔板(福尔肯公司)。

使用海马神经元的树突棘的计数是依据以下步骤来进行。用对照抗体(人类IgG2；西格玛公司)或抗体B(20nM)、及DMSO(西格玛公司)或MMP和ADAM的抑制剂即GM6001(2.5μM，MedChemExpress公司)对接种至装有涂布有聚L赖氨酸的覆盖玻璃(日商松浪硝子工业公司)的24孔板(福尔肯公司)中的培养第13天的引入了EGFP的大鼠海马神经元进行24小时处理。其后，将覆盖玻璃移至2％PFA(瓦科纯化工公司)/4％蔗糖(瓦科纯化工公司)/PBS中，静置20分钟以固定细胞。除去固定液，利用PBS将细胞洗涤3次后，添加0.25％TritonX-100(瓦科纯化工公司)/PBS，进行15分钟细胞透化处理。除去0.25％TritonX-100/PBS，将覆盖玻璃移至2％BSA(西格玛公司)/0.25％TritonX-100/OPTI-MEM(吉布科公司)中，进行1小时封闭后，使抗GFP抗体(半井株式会社)反应1小时30分钟。除去第一抗体溶液，利用PBS洗涤3次后，使第二抗体反应1小时。除去第二抗体溶液，利用PBS洗涤3次后，添加Prolong Gold抗淬灭试剂(美商分子探针公司)并封入，利用LSM800(德商蔡司公司)进行观察。进行上述实验3次，每次实验时，从两片覆盖玻璃提取神经元，使用图像分析软件Imaris^TM(瑞士Bitplane公司)，对存在于各树突中的树突棘进行计数，算出各神经元中每10μm的树突棘数量。

通过用GM6001同时处理，利用抗体B的海马神经元的树突棘数量增加受到抑制(图21)。本结果表明，抗体B在海马神经元中具有经由MMP和ADAM介导的树突棘稳定化活性。

实例13：人源化抗EphA4单克隆抗体于体外ALS模型中的源自人类iPS细胞的运动 神经元保护效果

(A)人类iPS细胞的维持培养

人类iPS细胞的维持培养依据以下步骤来进行。将在液态氮中以干细胞冻存液(Stem cell banker)(宝生物公司)冷冻保存的人类iPS细胞(201B7)自液态氮层中取出，悬浮于预先加温至37℃的人类iPS细胞培养基(Essential 8，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))5mL中并进行溶解。将细胞悬浮液回收至15mL锥形管(赛默飞世尔科技公司)中，在1000rpm、室温的条件下离心5分钟后，去除上清液，悬浮于新的培养基中后，接种至预先涂布有0.3μg/cm²iMatrix-511(日商Nippi公司)的细胞培养皿(康宁公司(康宁公司))，添加10μM Y-27632(WAKO)后，在CO₂孵育箱(37℃、5％CO₂)中进行培养。每天更换培养基，在达到亚融合时进行继代培养，由此进行人类iPS细胞的维持培养。继代培养以如下方式来进行。抽吸亚融合状态的人类iPS细胞的培养基，利用2mL PBS(WAKO)洗涤后，添加细胞消化液(Accutase)(半井株式会社)1mL，在CO₂孵育箱(37℃，5％CO₂)中孵育5分钟。在包含10μM Y-27632的4mL的人类iPS细胞培养基中进行悬浮，由此使人类iPS细胞分离成单细胞，其后回收至15mL的锥形管中。在1000rpm、室温的条件下进行5分钟离心，抽吸上清液后，使人类iPS细胞悬浮在包含10μM Y-27632的1mL的人类iPS细胞培养基中。计数细胞数，使2×10⁵个人类iPS细胞悬浮于4mL的人类iPS细胞培养基中后，接种至涂布有0.3μg/cm²iMatrix-511的细胞培养皿，在CO₂孵育箱(37℃，5％CO₂)内进行培养。实验中使用实施过一次以上的继代培养的人类iPS细胞。

(B)星形胶质细胞的建立和维持培养

来自新生小鼠的星形胶质细胞的建立和维持培养依据以下步骤来进行。将出生后2天龄的野生型新生小鼠(C57BL/6JJmsSlc(日商SLC公司))和野生型小鼠与突变人类SOD1(G93A)Tg-(B6.Cg-Tg(SOD1G93A)1Gur/J(杰克逊免疫研究实验室))小鼠的杂交新生小鼠于异氟醚吸入麻醉下通过断头而安乐死后，分离大脑皮质，利用0.25％胰蛋白酶-EDTA(赛默飞世尔科技公司)以37℃进行15分钟处理而进行分散。酶处理后，通过包含10％FBS(赛默飞世尔科技公司)和1％青霉素-链霉素(半井株式会社)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(赛默飞世尔科技公司)(10％FBS-DMEM)4mL进行稀释，而使酶消化停止。其后，通过细胞滤器(康宁公司)将单一细胞以外的杂质进行过滤，并以1500rpm进行5分钟离心。抽吸上清液，将细胞稀释至4mL的新鲜10％FBS-DMEM，每个个体均接种至细胞培养皿，并于37℃下培养。接种两天后，抽吸培养基，将4mL的新鲜10％FBS-DMEM添加至细胞中，并进行培养基更换。于达到融合后，实施继代培养。源自新生小鼠的星形胶质细胞的继代培养以如下方式来实施。于细胞培养皿上抽吸达到融合的星形胶质细胞的10％FBS-DMEM后，利用PBS(WAKO)2mL进行洗涤，添加1mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA，在CO₂孵育箱(37℃，5％CO₂)中进行3分钟孵育。通过悬浮于3mL的10％FBS-DMEM中而将星形胶质细胞解离成单细胞，其后回收至15mL锥形管。于1500rpm、室温的条件下进行3分钟离心，抽吸上清液后，向细胞添加8mL的新鲜10％FBS-DMEM，接种至细胞培养皿(继代1)。继代培养是于细胞达到融合时通过与上述相似的方法来进行。再者，于在细胞培养皿中经过培养的星形胶质细胞的继代培养时，使用4mL的PBS、和2mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA。此外，在继代培养时回收细胞悬浮液的一部分，供于突变人类SOD1(G93A)的基因分型。将进行总共3次继代培养后的星形胶质细胞稀释至细胞冻存液(日本全药工业株式会社(NIPPON ZENYAKU KOGYOCO.，LTD.))中，在-80℃下冷冻保存直至供于试验。供于试验时，使冷冻保存的细胞悬浮液分别在恒温槽内溶解后，利用预先加温至37℃的10％FBS-DMEM进行稀释。将各细胞悬浮液离心后(1500rpm，3分钟，室温)，去除上清液，悬浮于新的培养基中后，接种至8孔腔室(美商易必迪公司)，在CO₂孵育箱(37℃，5％CO₂)中进行维持培养。

突变人类SOD1(G93A)的基因分型使用REDExtract-N-Amp^TM组织PCR试剂盒(西格玛公司)来进行。将在星形胶质细胞的继代培养时回收的细胞悬浮液移至1.5mL管中，以1500rpm进行3分钟离心。离心后，抽吸上清液，将1mL的PBS添加于细胞中并进行洗涤，于再次离心后进行抽吸。将五十微升提取溶液及12.5μL组织制备溶液加以混合并添加至样品中。混合后，移至聚合酶链反应(PCR)管中，在GeneAmp^TM PCR系统9700(Appliedbiosystems^TM)中在55℃下反应10分钟，在95℃下反应3分钟，其后，添加试剂盒附带的中和溶液50μL而制备基因组DNA。

使用所提取的基因组DNA，以表4所示的组成进行基因组PCR。PCR中所使用的引物序列示于表5。PCR后以1％琼脂糖凝胶/100V/20分钟进行电泳。将检测到内部标准324bp、和突变人类SOD1(G93A)236bp的2个条带者鉴定为表达突变人类SOD1(G93A)的星形胶质细胞。

[表4]

基因组PCR混合物

试剂名	液量
		模板：	1μL
Red mix：	5μL
		引物1(100μmol/L)：	0.05μL
引物2(100μmol/L)：	0.05μL
		引物3(100μmol/L)：	0.05μL
引物4(100μmol/L)：	0.05μL
		蒸馏水：	3.8μL
总量：	10μL

Red mix＝REDExtract-N-Amp PCR反应混合物

[表5]

引物的核苷酸序列

(C)体外ALS模型中的源自人类iPS细胞的运动神经元保护效果的评价

体外ALS模型中的源自人类iPS细胞的运动神经元保护效果的评价依据以下步骤来进行。通过与上述(A)的继代培养相似的方法获得人类iPS细胞的单细胞悬浮液后，于1000rpm、室温的条件下进行5分钟离心，抽吸上清液。使人类iPS细胞悬浮于DFK20培养基(包含20％Knockout血清替代物(KSR，赛默飞世尔科技公司)、1％非必需氨基酸(NEAA，赛默飞世尔科技公司)、1％GlutaMAX-I补充剂(赛默飞世尔科技公司)、100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素(半井株式会社)、100μMβ-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12(赛默飞世尔科技公司))中后，对细胞数进行计数。使3×10⁵个人类iPS细胞悬浮于包含10μMSB431542(西格玛公司)、100nM LDN193189(西格玛公司)、3μM CHIR99021(美商开曼化学公司(Cayman Chemical))、10μM Y-27632的DFK20培养基2mL中，接种至低粘附性6孔细胞培养板(康宁公司)的一个孔中，并于CO₂孵育箱(37℃、5％CO₂)中进行培养。在培养第3天，将人类iPS细胞分化细胞块(SFEB)连同培养基一起回收至15mL锥形管中，在300rpm、常温的条件下进行2分钟离心，由此使细胞块沉淀。抽吸该上清液，使SFEB缓慢地悬浮于包含10μMSB431542、100nM LDN193189、3μM CHIR99021(美商开曼化学公司)、5μM Y-27632、1μM视黄酸(西格玛公司)的DFK20培养基中，返回至原本的孔中，由此进行培养基更换。于培养第5天也通过相似的方法进行培养基更换。注意，使Y-27632的浓度为2.5μM而进行培养基更换(其他化合物与培养第3天相同)。在培养第7天，将SFEB连同培养基一起回收至15mL锥形管中，在常温下静置10分钟，由此使SFEB沉淀。抽吸该上清液，使SFEB悬浮于包含1μM视黄酸、1μM嘌吗啡胺(Purmorphamine)(德商美天旎生物技术公司(Myltenyi Biotech))的3mL的DFK5培养基(包含5％KSR、1％NEAA、1％GlutaMAX-I补充剂、100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素、100μMβ-巯基乙醇的DMEM/F12)中，返回至原本的孔中，在CO₂孵育箱(37℃、5％CO₂)中进行培养。其后，每2至3天，通过与培养第7天相同的步骤进行培养基更换，使人类iPS细胞分化诱导为运动神经元。在培养第33天，将SFEB连同培养基一起回收至15mL锥形管中，在常温下静置5分钟，由此使SFEB沉淀。抽吸上清液，添加包含10μM Y-27632的2mL的细胞消化液，并于37℃恒温水槽中孵育10分钟。其后，利用P1000移液管进行30次移液，使细胞块分散后，在包含10μM Y-27632的10mL的DFK5培养基中使酶反应停止。将细胞悬浮液回收至新的15mL锥形管中，在1000rpm、室温的条件下进行5分钟离心，抽吸上清液。使细胞再悬浮于包含10μM Y-27632的DFK5培养基后，通过细胞滤器(康宁公司)进行过滤，其后计数细胞数。在共培养培养基(包含2％B27补充剂(赛默飞世尔科技公司)、10μM Y-27632、1％GlutaMax-I补充剂、100单位/mL青霉素-100μg/mL链霉素的神经基础培养基(赛默飞世尔科技公司))中将细胞制备成5×10⁵个/mL的悬浮液，分为对照组、媒剂添加组和药物处理组。药物的稀释是使用共培养培养基。将媒剂(共培养培养基)和作为药物的抗体B添加至各组中后，以200μL/孔接种至预先以8×10⁴个细胞/孔接种有源自小鼠的野生型星形胶质细胞或表达突变人类SOD1(G93A)的星形胶质细胞的8孔腔室中，以星形胶质细胞与运动神经元的共培养细胞的形式用于评价。将在野生型星形胶质细胞与运动神经元的共培养中所观察到的运动神经元数作为对照。在媒剂添加组和药物处理组中，进行表达突变人类SOD1(G93A)的星形胶质细胞与运动神经元的共培养，将条件设为媒剂添加(1％共培养培养基)、抗体B(10、30、100nmol/L)。在各条件下在CO₂孵育箱(37℃，5％CO₂)中培养2天后，使用抗ISL1抗体(英商艾博抗公司(Abcam))和抗人类核抗原(HNA)抗体(密理博公司)，以免疫细胞化学方式对运动神经元细胞进行染色。将每孔的ISL1/HNA共阳性细胞以存活运动神经元来计数，运动神经元存活率以相对于对照的％而算出。图22显示表示评价系统的步骤的简单示意图。

在表达突变人类SOD1(G93A)的星形胶质细胞/源自人类iPS细胞的运动神经元共培养(体外ALS模型)中，运动神经元存活率显著地降低。抗体B浓度依赖性地抑制由表达突变人类SOD1(G93A)的星形胶质细胞诱发的源自人类iPS细胞的运动神经元死亡(图23)。本结果表明，抗体B在体外ALS模型中促进运动神经元的存活。

Claims (15)

1.一种药物组合物，其是包含抗EphA4抗体的用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物，其中

该抗EphA4抗体包含如下重链和轻链，该重链包含：

(a)由SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；

(b)由SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；以及

(c)由SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且

该轻链包含：

(d)由SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

(e)由SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及

(f)由SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中该抗EphA4抗体是人源化的。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中该抗EphA4抗体与EphA4特异性地结合，促进EphA4的切割。

4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中该抗EphA4抗体与EphA4特异性地结合，抑制EphA4与肝配蛋白的结合。

5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中

该重链包含由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的可变区，并且

该轻链包含由SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列组成的可变区。

6.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中该重链的恒定区和该轻链的恒定区包含源自人类抗体的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中该重链的恒定区是人类IgG的恒定区。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中该人类IgG的恒定区是人类IgG₂的恒定区。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中该人类IgG₂的恒定区包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列。

10.如权利要求6至9中任一项所述的药物组合物，其中该轻链的恒定区是人类Igκ的恒定区。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中该人类Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列。

12.一种药物组合物，其是包含抗EphA4抗体的用以治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物，其中

该抗EphA4抗体包含重链和轻链，

该重链包含SEQ ID NO.59所示的氨基酸序列，

该轻链包含SEQ ID NO.60所示的氨基酸序列，并且

该重链的C末端赖氨酸可任选地缺失。

13.如权利要求12所述的药物组合物，其中该重链的C末端赖氨酸缺失。

14.抗EphA4抗体用于制造用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的药物组合物的用途，其中

该抗EphA4抗体包含如下重链和轻链，该重链包含：

(a)由SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；

(b)由SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；以及

(c)由SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；并且

该轻链包含：

(d)由SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；

(e)由SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；以及

(f)由SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。

15.如权利要求14所述的抗EphA4抗体的用途，其中

该重链包含由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的可变区，并且

该轻链包含由SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列组成的可变区。