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CN116716389A - 检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途 - Google Patents

检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途 Download PDF

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CN116716389A
CN116716389A CN202310426626.8A CN202310426626A CN116716389A CN 116716389 A CN116716389 A CN 116716389A CN 202310426626 A CN202310426626 A CN 202310426626A CN 116716389 A CN116716389 A CN 116716389A
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CN
China
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trpc6
primer
mrna
gene
calibrator
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CN202310426626.8A
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郑志强
闫锦锦
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Wuhu Maozhi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Wuhu Maozhi Biotechnology Co ltd
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Publication date
Application filed by Wuhu Maozhi Biotechnology Co ltd filed Critical Wuhu Maozhi Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途，引物组对应于TRPC6基因mRNA的第1至第2外显子区或第8至第9外显子区或第11至第13外显子区。检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒包括TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因的PCR扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系和反转录酶。检测方法为：提取RNA样本，进行PCR扩增检测，以Actin mRNA为内参，计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRNA的浓度比值，作为检测结果。本发明的检测引物特异性高，检测方法对于阿尔兹海默症诊断具有精准、效费比高、便捷等特点，具有重大的临床意义。

Description

检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹 海默病诊断中的用途
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease，AD)，即老年痴呆症，是老年人群中引起痴呆的最常见的神经系统退行性疾病。AD起病隐匿，临床表现主要是渐进性的认知功能和日常生活能力下降。依靠医生问诊和神经心理学测试，主观性较强，医生的临床经验和神经心理学测试是否规范会对诊断的准确性造成影响，又如影像学检查MRI、PET-CT检测费用昂贵，脑脊液检测（CSF）创伤性强，因此AD诊断迫切需要有客观，准确和效费比高的生物标记物。
瞬时受体电位通道（TRPC）是非选择性阳离子通道，其功能主要是感应一系列物理或化学信号，被激活后开放，引起钙、钠等离子内流，从而使细胞和机体对外界环境作出应答。TRPC通道家族有七个成员，即TRPC1~TRPC7。人类TRPC6基因定位于第11号染色体，含有13个外显子，编码931个氨基酸。在神经系统中，TRPC6也发挥着重要作用：TRPC6在脑缺血过程中对神经元有保护作用。有研究表明，TRPC6与神经系统，神经元，学习记忆和AD毒性蛋白Aβ的产生有直接的关系，外周血中TRPC6 mRNA含量是个有高度应用价值的、有较好特异性和相关性的、适合诊断AD的生物标记物。
专利文献CN103966309A公开了一种检测外周血细胞TRPC6 mRNA水平的方法，先提取总RNA再反转录，最后进行PCR扩增来判断TRPC6 mRNA水平。但是该检测方法采用多步反应，容易累积系统误差，另一方面测得的是TRPC6 mRNA相对表达水平，这些都会降低检测结果准确性，从而影响对受试者阿尔兹海默病的判断。专利文献CN113881765A也公开了一种检测TRPC6表达产物的方法，用于2型糖尿病的早期诊断和预后评估，但该方法中RT-PCR和qPCR过程分开，也容易扩大系统误差，对检验操作有较高的要求。发展一种准确性更高的检测TRPC6 mRNA水平的方法对于临床诊断阿尔兹海默病具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的目的之一在于提供一种检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒。
其技术方案如下：
一种检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，其关键在于，包括瞬时受体电位通道6 TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因的PCR扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系和反转录酶；
所述TRPC6基因的PCR扩增引物组包括如下引物组中的至少一组：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物TPS-1-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物TPS-1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物TPS-3-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物TPS-3-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物TPS-4-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物TPS-4-R。
在一种实施方式中，上述PCR扩增反应液体系包括DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、荧光染料。
本发明提供的目的之二在于提供一种如上试剂盒的用途，用于制备筛查诊断阿尔兹海默病的试剂盒。
在一种实施方式中，筛查诊断阿尔兹海默病的试剂盒以人外周血细胞总RNA提取物为临床样本。
在一种实施方式中，上述试剂盒中TRPC6基因的PCR扩增引物组在临床样本诊断中检测准确度不低于85%，灵敏度不低于80%，特异性度不低于80%；进一步准确度不低于90%，特异性不低于80%，灵敏度不低于85%。
本发明提供的目的之三在于提供一种检测血液TRPC6 mRNA水平的方法。
其技术方案如下：
一种检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，使用如上任意一项所述的试剂盒，其关键在于步骤为：
S1，提取RNA样本：取受试者血液，提取血液白细胞中总RNA；
S2，PCR扩增检测：采用两个PCR扩增检测体系，使用一步法实时荧光定量PCR扩增法对RNA样本进行反转录扩增检测，分别获得RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值；
对系列梯度浓度的TRPC6目的基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值；
对系列梯度浓度的Actin内参基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的Actin内参基因校准品CT值；
S3，数据处理：使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值及TRPC6目的基因校准品浓度，建立TRPC6目的基因CT值-浓度数量关系；
使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值及Actin内参基因校准品浓度，建立Actin内参基因CT值-浓度数量关系；
分别基于上述TRPC6目的基因和Actin内参基因CT值-浓度数量关系，根据RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值，计算RNA样本中TRPC6 mRNA浓度和Actin mRNA浓度；
计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRNA的浓度比值，作为检测结果。
在一种实施方式中，上述方法还包括步骤S4，将检测结果与设定阈值比较，当检测结果低于阈值时，判定为异常结果。
在一种实施方式中，上述步骤S3中，建立CT值-浓度数量关系的方法为：
使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值作为横坐标，TRPC6目的基因校准品浓度的2的对数值作为纵坐标，建立TRPC6目的基因CT值-浓度标准曲线，计算标准曲线方程；
使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值作为横坐标，Actin内参基因校准品浓度的2的对数值作为纵坐标，建立Actin内参基因CT值-浓度标准曲线，计算标准曲线方程。
在一种实施方式中，上述步骤S2中反转录扩增检测过程为：
（1）配制反应体系，以反应总体系为20ul计，包括反应混合液10ul、反转录酶0.4ul、引物0.6ul（10uM）、9ul校准品、150ng模板RNA；
（2）反转录条件为50℃保温5min，变性条件为94℃保温30s；
（3）进行40个扩增循环反应，条件为：变性，94℃，5s；退火，61℃，15s；延伸，72℃，15s；
（4）生成熔解曲线，升温过程为从65℃逐渐升温至95℃，速率为5s升温0.5℃。
本发明提供的目的之四在于提供一种检测TRPC6 mRNA水平的引物组。
其技术方案如下：
一种检测TRPC6 mRNA水平的引物组，其关键在于，包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物TPS-1-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物TPS-1-R；
或
所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物TPS-3-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TPS-3-R；
或
所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TPS-4-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物TPS-4-R；
或
所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物TPS-5-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物TPS-5-R。
本发明提供的目的之五在于提供一种上述任意一组引物组在制备用于检测样本中TRPC6 mRNA水平的试剂盒中的应用。
附图说明
图1为血液总RNA样本的电泳检测结果图；
图2为试剂盒的TRPC6校准品的一步法qRT-PCR扩增曲线；
图3为试剂盒的Actin校准品的一步法qRT-PCR扩增曲线；
图4为RNA检测样本的一步法qRT-PCR扩增曲线；
图5为试剂盒TRPC6校准品的标准曲线。
图6为试剂盒Actin校准品的标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例一 用于检测TRPC6基因mRNA的引物组
依据NCBI Gene Bank（NM-004621.6）公开的TRPC6基因的第1至13外显子区，利用primer5.0软件，设计出用于检测TRPC6基因mRNA的表达量的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增引物组，每组引物组分别包括上游引物和下游引物。本实施例中，引物组有五组，分别对应于TRPC6基因mRNA的第1至第2外显子区、第8至第9外显子区、第11至第13外显子区，见表1。
表1 TRPC6扩增引物核苷酸序列
实施例二 用于检测TRPC6基因mRNA水平的试剂盒
一种用于检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，包括TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系、反转录酶。以一人份检测试剂盒为例，具体包括：
（1）TRPC6基因的PCR扩增引物组。包括如实施例一中引物组中的任意一组或几组，引物组浓度为10μM，30μl。
（2）Actin内参基因扩增引物组
Actin内参基因扩增引物组依据NCBI Gene Bank（XM-032773537.1）公开的Actin基因序列，利用primer5.0软件，设计出用于检测Actin基因mRNA的表达量的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）扩增引物组，包括上游引物和下游引物。本实施例中，Actin引物组序列见表2。
表2 Actin扩增引物核苷酸序列
（3）TRPC6目的基因校准品。可以使用一个较大浓度的溶液作为母液，临用时稀释成梯度浓度溶液，也可以是预先配制好的梯度浓度溶液。本实施例中，共有五个不同浓度的梯度溶液，每种54μl，分别为T1（4×105拷贝数/μl）、T2（1×105拷贝数/μl）、T3（2.5×104拷贝数/μl）、T4（6.25×103拷贝数/μl）、T5（1.5625×103拷贝数/μl）。
（4）Actin内参基因校准品。可以使用一个较大浓度的溶液作为母液，临用时稀释成梯度浓度溶液，也可以是预先配制好的梯度浓度溶液。本实施例中，共有五个不同浓度的梯度溶液，每种54μl，分别为A1（3.2×108拷贝数/μl）、A2（8×107拷贝数/μl）、A3（2×107拷贝数/μl）、A4（5×106拷贝数/μl）、A5（1.25×106拷贝数/μl）。
（5）PCR扩增反应液体系。例如，2×反应混合液1.92ml：5Units/μl Taq DNA聚合酶（北京全式金生物，货号：AP151-01） 80μl、2.5mM dNTP 80μl、0.1M MgSO4 100μl、1000×SYBR Green I荧光染料40μl。
（6）反转录酶。共80μl，包括4Units/μl One-step酶（北京全式金生物，货号：AH101） 40ul，50%甘油40μl。
（7）空白对照品：1×文库稀释液。
上述试剂可以采用市售生物医学试剂。
实施例三 检测TRPC6基因mRNA水平的试剂盒在筛查诊断阿尔兹海默病中的应用
采用实施例二的试剂盒，检测受试者血细胞中TRPC6基因mRNA表达水平。过程为：
S1，提取RNA样本：取受试者血液，提取血液白细胞中总RNA；
S2，PCR扩增检测：采用两个PCR扩增检测体系，使用一步法实时荧光定量PCR扩增法对RNA样本进行反转录扩增检测，分别获得RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值；
对系列梯度浓度的TRPC6目的基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值；
对系列梯度浓度的Actin内参基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的Actin内参基因校准品CT值；
S3，数据处理：使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值及TRPC6目的基因校准品浓度，建立TRPC6目的基因CT值-浓度数量关系；
使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值及Actin内参基因校准品浓度，建立Actin内参基因CT值-浓度数量关系；
分别基于上述TRPC6目的基因和Actin内参基因CT值-浓度数量关系，根据RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值，计算RNA样本中TRPC6 mRNA浓度和Actin mRNA浓度；
计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRNA的浓度比值，作为检测结果。
以一人份为例，具体过程为：
（1）采集一份受试者的血液样本1ml，提取血液白细胞中的总RNA备用。使用康为血液RNA提取试剂盒（货号：CWY027S），参照试剂盒说明书提取总RNA。使用1% Agarose 凝胶电泳，结果如图1。
（2）一步法qRT-PCR扩增：
① 扩增检测
TRPC6目的基因校准品：进行5个PCR反应；
Actin内参基因校准品：进行5个PCR反应；
RNA样本：进行2个PCR反应，分别为TRPC6目的基因引物反应和分别为Actin目的基因引物反应；
空白对照品：进行2个PCR反应，分别为TRPC6目的基因引物反应和分别为Actin目的基因引物反应。
②每个反应体系总体积为20ul，包括：
反应混合液 10ul；
反转录酶 0.4ul；
上、下游合并引物（10uM） 0.6ul；16.7ng/μl RNA样本 9ul；
TRPC6目的基因校准品 9ul；
Actin内参基因校准品 9ul。
③ 一步法qRT-PCR扩增反应条件：
反转录50℃保温5min，变性94℃保温30s；
40个扩增循环反应，其条件为：变性94℃ 5s，退火61℃ 15s，延伸72℃ 15s；
生成熔解曲线，从65℃缓慢升温至95℃，升温速率为5s升温0.5℃。
试剂盒检测一人份样本的TRPC6校准品扩增曲线、Actin校准品扩增曲线以及1人份样本的扩增曲线，分别如图2、图3和图4。（3）数据处理
标准曲线的绘制
用TRPC6目的基因校准品和Actin内参基因校准品的检测CT值作为横坐标，用TRPC6目的基因校准品和Actin内参基因校准品的浓度（拷贝数/μl）的2的对数值为纵坐标，建立标准曲线，采用线性拟合获得标准曲线方程，计算线性相关系数。。TRPC6和Actin校准品的标准曲线方程分别如图5和图6。
② 将一人份样品检测的CT值作为横坐标值，代入标准曲线方程，即可得出检测RNA样本的TRPC6 mRNA和Actin mRNA的浓度。
用TRPC6 mRNA浓度/Actin mRNA浓度的比值作为检测结果。
按照上述方法，利用表1的引物组对110例收集的临床受试者样本（AD患者55例、健康人55例）进行检测。用GraphPad prism 5.0对检测数据进行统计分析，得到检测的准确度、特异性、灵敏度以及最佳的试剂盒阈值线。五对特异性引物组的检测指标见表3。
表3 包含5对PCR扩增引物组试剂盒检测110例样本的结果
从表3可以看出：5对PCR扩增引物组中任意1对引物及其试剂盒，均能有效用于阿尔兹海默症筛查诊断；当检测样本的TRPC6 mRNA浓度/Actin mRNA浓度比值低于阈值时，被认为患有阿尔兹海默症的风险。
值得注意的是，具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的引物TPS-4-F和具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物TPS-4-R的引物组，在临床样本筛查诊断中，显示出极高的可靠性，准确度为96.5%，灵敏度为95%，特异性度为80%。
与现有技术报道的TRPC6 mRNA表达水平检测方法相比，本发明采用一步法qRT-PCR扩增检测，RNA样本在同一管内完成RT-PCR和qPCR，同时引入目的基因校准品和内参基因校准品，通过建立标准曲线方程，对样本进行浓度检测，创新性引入浓度比值的数据分析方法，能够可靠用于筛查诊断阿尔兹海默症。
本发明的有益效果：本发明提供了用于检测TRPC6 mRNA表达水平的引物组，实时荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法，能够将目的基因的反转录和扩增在一个反应管内完成，避免现有技术中分步转移操作带来的系统误差，同时创造性地在检测TRPC6 mRNA表达水平时引入目的基因校准品和Actin校准品，通过建立浓度和荧光PCR扩增检测Ct值之间的关系来计算提取的RNA样本中TRPC6 mRNA和Actin mRNA浓度，以两者浓度的比值作为判断受试者患阿尔兹海默病的风险指数，判断结果更为准确可靠。本发明的方法对于阿尔兹海默症诊断具有精准、效费比高、便捷等特点，具有重大的临床意义。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，其特征在于：包括瞬时受体电位通道6 TRPC6基因的PCR扩增引物组、肌动蛋白Actin内参基因的PCR扩增引物组、TRPC6目的基因校准品、Actin内参基因校准品、PCR扩增反应液体系和反转录酶；
所述TRPC6基因的PCR扩增引物组包括如下引物组中的至少一组：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物TPS-1-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物TPS-1-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物TPS-3-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物TPS-3-R；
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物TPS-4-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物TPS-4-R。
2.根据权利要求1所述的检测TRPC6 mRNA水平的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增反应液体系包括DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、荧光染料。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒在制备筛查诊断阿尔兹海默病的试剂盒中的应用。
4.一种检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，使用如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于步骤为：
S1，提取RNA样本：取受试者血液，提取血液白细胞中总RNA；
S2，PCR扩增检测：采用两个PCR扩增检测体系，使用一步法实时荧光定量PCR扩增法对RNA样本进行反转录扩增检测，分别获得RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值；
对系列梯度浓度的TRPC6目的基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值；
对系列梯度浓度的Actin内参基因校准品进行PCR扩增检测，得到不同浓度的Actin内参基因校准品CT值；
S3，数据处理：使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值及TRPC6目的基因校准品浓度，建立TRPC6目的基因CT值-浓度数量关系；
使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值及Actin内参基因校准品浓度，建立Actin内参基因CT值-浓度数量关系；
分别基于上述TRPC6目的基因和Actin内参基因CT值-浓度数量关系，根据RNA样本中TRPC6 mRNA的CT值和Actin mRNA的CT值，计算RNA样本中TRPC6 mRNA浓度和Actin mRNA浓度；
计算RNA样本中TRPC6 mRNA与Actin mRNA的浓度比值，作为检测结果。
5.根据权利要求4所述的检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，其特征在于：还包括步骤S4，将检测结果与设定阈值比较，当检测结果低于阈值时，判定为异常结果。
6.根据权利要求5所述的检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，其特征在于：步骤S3中，建立CT值-浓度数量关系的方法为：
使用不同浓度的TRPC6目的基因校准品CT值作为横坐标，TRPC6目的基因校准品浓度的2的对数值作为纵坐标，建立TRPC6目的基因CT值-浓度标准曲线，计算标准曲线方程；
使用不同浓度的Actin内参基因校准品CT值作为横坐标，Actin内参基因校准品浓度的2的对数值作为纵坐标，建立Actin内参基因CT值-浓度标准曲线，计算标准曲线方程。
7.根据权利要求6所述的检测血液TRPC6 mRNA水平的方法，其特征在于步骤S2中反转录扩增检测过程为：
（1）配制反应体系，以反应总体系为20ul计，包括反应混合液10ul、反转录酶0.4ul、引物0.6ul（10uM）、9ul校准品、150ng模板RNA；
（2）反转录条件为50℃保温5min，变性条件为94℃保温30s；
（3）进行40个扩增循环反应，条件为：变性，94℃，5s；退火，61℃，15s；延伸，72℃，15s；
（4）生成熔解曲线，升温过程为从65℃逐渐升温至95℃，速率为5s升温0.5℃。
8.一种用于检测TRPC6 mRNA水平的引物组，其特征在于：包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物TPS-1-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物TPS-1-R；
或
所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物TPS-3-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物TPS-3-R；
或
所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物TPS-4-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物TPS-4-R；
或
所述上游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物TPS-5-F，所述下游引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物TPS-5-R。
9.如权利要求8所述的引物组在制备用于检测样本中TRPC6 mRNA水平的试剂盒中的应用。
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