CN116716349A - 一种dll4人源化小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法：（1）构建表达人源化DLL4的打靶载体；（2）设计并获得针对小鼠Dll4基因Exon1至Exon9部分的sgRNA；（3）将打靶载体、sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配种繁殖获得F1小鼠，筛选出DLL4人源化小鼠模型。本发明构建的DLL4人源化小鼠在肿瘤学、免疫学等领域具有应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因工程领域，具体涉及一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
近年来肿瘤免疫疗法的概念已经越来越被大众熟知，但新型免疫治疗药物的研发仍面临诸多挑战。由于一般特异性人源蛋白的抗体不能识别小鼠内源蛋白，普通野生型小鼠无法作为测试这些药物的体内模型。由于物种特异性限制，抗小鼠抗体制剂不能反映同类生物制剂在人体内的实际疗效。这些问题阻碍了免疫疗法的临床前评估，限制了新型肿瘤免疫药物研发的进展。因此，研究者们开始致力于人源化小鼠模型的开发。
人源化小鼠是携带功能性人类基因、细胞、组织和/或器官、免疫系统或微生物的小鼠，其用于生物医学研究和临床治疗方案的开发。有些人源化小鼠携带人类细胞，有些则与人类具有某些一致的遗传和生理特性。由于小鼠基因组与人类基因组高度相似，且更易于操作和改变，因此小鼠可以方便地模拟人类的生物学特性和人类疾病，从而帮助研发人员破译致病原理和其分子机制，为药物的开发指引方向。
δ样蛋白4（DLL4）是一种I型跨膜蛋白，其细胞外结构域包含一个Delta和Serrate（DSL）配体结构域和八个串联的表皮生长因子样重复序列。在与其配体Notch 1和Notch 4结合后，胞外结构域和胞质结构域被裂解，胞质结构域被转入细胞核。DLL4在生理性和病理性血管生成的部位均有表达。在Dll4启动子控制下携带lacz报告子的小鼠显示肿瘤血管系统中Dll4的表达显著增加。在人类肿瘤中，DLL4在透明细胞肾细胞癌的血管系统中表达增加，以及在浅表性和浸润性膀胱癌中表达。在培养的内皮细胞、临床前肿瘤模型和人类肿瘤样本中，VEGF和DLL4的表达密切相关。根据这些观察结果，我们很容易推测DLL4/Notch通路可能参与了肿瘤血管生成。
DLL4不仅在血管发育和稳态中至关重要，而且在肿瘤功能性血管网络的形成中也极其重要。在临床前小鼠模型中，阻断Dll4介导的Notch信号可显著增加非生产性血管生成，但显著抑制肿瘤生长。因此，DLL4已成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点。抗DLL4抗体最近已进入临床试验阶段。然而，抗DLL4的潜在毒性作用尚不清楚。已有文献报道慢性DLL4阻断异常激活内皮细胞，引起多器官病理改变，诱发血管肿瘤。这些发现需要在使用不同肿瘤动物的研究中得到证实，但是对于使用抗DLL4药物提出了重要的安全性问题，并值得在靶向DLL4的临床试验中监测这些作用。
人源化小鼠可模拟人类疾病，因此通常被用于传染病、退行性和癌症疾病的研究。最近的模型还反映了造血、自然免疫、神经生物学和影响疾病病理生物学的分子途径。一系列免疫缺陷小鼠品系允许长寿命的人类祖细胞移植。先天性和适应性免疫的存在使高水平的人血淋巴重构成为可能，细胞对广泛的微生物感染具有敏感性。这些小鼠还有助于研究人类病理生物学，自然疾病过程和广泛人类疾病的治疗效果。因此，利用基因编辑的手段将编码人类DLL4的基因敲入到其同源C57BL/6JGpt小鼠位点，可以构建表达人DLL4细胞因子的小鼠模型，该小鼠模型在研究免疫治疗、炎症、自身免疫疾病及相关药物筛选方面具有应用价值。
目前暂未见DLL4人源化小鼠模型构建方法及其在靶点药物应用方面的相关文献报道。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明的第一方面提供一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法包括如下步骤：
（1）构建表达人源化DLL4的打靶载体，用于人源化DLL4基因的插入；
（2）设计针对小鼠Dll4基因Exon1至Exon9部分的sgRNA，利用体外转录技术获得上述sgRNA；
（3）将步骤（1）构建的打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；
（4）F0小鼠与背景鼠配种繁殖获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出DLL4人源化小鼠模型。
优选的，所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源DLL4基因的结构及功能，选取人源DLL4基因的信号肽及胞外区替换鼠源Dll4基因的信号肽及胞外区序列，选取的人源DLL4基因氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源Dll4基因氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源DLL4基因的Exon1至Exon9部分替换小鼠Dll4基因的Exon1至Exon9部分，选取的人源DLL4基因序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述步骤（1）中构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为（a）SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7，或者（b）SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。
更优选的，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。
优选的，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为B6小鼠。
优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的5’端鉴定引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，3’端鉴定引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应体系如下：
。
优选的，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的PCR反应条件如下：
。
本发明的第二方面提供上述构建方法得到的小鼠在研究DLL4基因相关功能和作用机制中的应用。
优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。
本发明的第三方面提供上述构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与DLL4基因相关疾病的药物中的应用。
优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。
本发明的有益效果：
本发明根据人源DLL4蛋白功能域及人鼠同源性比较，使用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6JGpt（B6）背景的小鼠上将鼠源Dll4基因的信号肽和细胞外结构域替换为人DLL4基因的相应区域。嵌合的DLL4基因序列将在内源性调控机制的指导下表达。该模型在肿瘤学、免疫学等领域具有应用价值。
附图说明
图1是DLL4人源化小鼠模型策略图；
图2是DLL4-KI-target F0小鼠5’端和3’端基因鉴定结果电泳图；
图3是DLL4-KI-target F1小鼠5’端和3’端基因鉴定结果电泳图；
图4是B6-hDLL4纯合小鼠mRNA表达检测结果；
图5是B6-hDLL4纯合小鼠DLL4蛋白表达检测结果。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
试验例1、DLL4人源化小鼠模型的建立
本发明使用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6JGpt（B6）背景的小鼠上将鼠源Dll4基因的信号肽和细胞外结构域替换为人DLL4基因的相应区域（具体策略见图1），嵌合的DLL4基因序列将在内源性调控机制的指导下表达，从而构建可以表达人源DLL4的小鼠模型，具体方法如下：
1、确定人源片段替换区域及插入的人源序列
根据人源DLL4基因的结构及功能，选取人源DLL4基因的信号肽及胞外区替换鼠源Dll4基因的信号肽及胞外区序列，选取的人源DLL4基因氨基酸序列如SEQ ID No.1（Aa：1-529）所示，被替换的鼠源Dll4基因氨基酸序列如SEQ ID No.2（Aa：1-529）所示。
MAAASRSASGWALLLLVALWQQRAAGSGVFQLQLQEFINERGVLASGRPCEPGCRTFFRVCLKHFQAVVSPGPCTFGTVSTPVLGTNSFAVRDDSSGGGRNPLQLPFNFTWPGTFSLIIEAWHAPGDDLRPEALPPDALISKIAIQGSLAVGQNWLLDEQTSTLTRLRYSYRVICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSTPWQCTCDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGATCSNSGQRSYTCTCRPGYTGVDCELELSECDSNPCRNGGSCKDQEDGYHCLCPPGYYGLHCEHSTLSCADSPCFNGGSCRERNQGANYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCLNRGPSRMCRCRPGFTGTYCELHVSDCARNPCAHGGTCHDLENGLMCTCPAGFSGRRCEVRTSIDACASSPCFNRATCYTDLSTDTFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPW （SEQ ID No.1）
MTPASRSACRWALLLLAVLWPQQRAAGSGIFQLRLQEFVNQRGMLANGQSCEPGCRTFFRICLKHFQATFSEGPCTFGNVSTPVLGTNSFVVRDKNSGSGRNPLQLPFNFTWPGTFSLNIQAWHTPGDDLRPETSPGNSLISQIIIQGSLAVGKIWRTDEQNDTLTRLSYSYRVICSDNYYGESCSRLCKKRDDHFGHYECQPDGSLSCLPGWTGKYCDQPICLSGCHEQNGYCSKPDECICRPGWQGRLCNECIPHNGCRHGTCSIPWQCACDEGWGGLFCDQDLNYCTHHSPCKNGSTCSNSGPKGYTCTCLPGYTGEHCELGLSKCASNPCRNGGSCKDQENSYHCLCPPGYYGQHCEHSTLTCADSPCFNGGSCRERNQGSSYACECPPNFTGSNCEKKVDRCTSNPCANGGQCQNRGPSRTCRCRPGFTGTHCELHISDCARSPCAHGGTCHDLENGPVCTCPAGFSGRRCEVRITHDACASGPCFNGATCYTGLSPNNFVCNCPYGFVGSRCEFPVGLPPSFPWVA （SEQ ID No.2）
2、注射获得阳性鼠
利用CRISPR Cas9的方式将人源DLL4基因的Exon1至Exon9部分替换小鼠Dll4基因的Exon1至Exon9部分，建立DLL4基因人源化小鼠模型。以B6为背景鼠，成功获得了DLL4人源化小鼠模型。
1）确定人源片段替换区域及插入的人源序列
根据人源DLL4蛋白胞外功能域及人鼠同源性比较，人源DLL4基因的Exon1至Exon9部分替换小鼠Dll4基因的Exon1至Exon9部分，选取的人源DLL4基因替换的序列为SEQ IDNo.3所示（下划线部分为Exon序列，无下划线部分为Intron序列）。
ATGGCGGCAGCGTCCCGGAGCGCCTCTGGCTGGGCGCTACTGCTGCTGGTGGCACTTTGGCAGCAGGT AACACGTCCCGCGCCCTCTCCGTCCCCTCTGCCGCGCTCTGGGCCTCAGCCCCGGGCACCAGCTGAGCTGACCGGT CCCCTCCCTCCTTCCCTCGGTCCCTGTGCAATAGCGCGCGGCCGGCTCCGGCGTCTTCCAGCTGCAGCTGCAGGAG TTCATCAACGAGCGCGGCGTACTGGCCAGTGGGCGGCCTTGCGAGCCCGGCTGCCGGACTTTCTTCCGCGTCTGCC TTAAGCACTTCCAGGCGGTCGTCTCGCCCGGACCCTGCACCTTCGGGACCGTCTCCACGCCGGTATTGGGCACCAA CTCCTTCGCTGTCCGGGACGACAGTAGCGGCGGGGGGCGCAACCCTCTCCAACTGCCCTTCAATTTCACCTGGCCGGTGAGCACAGCCTGGGCGCACTGGGAGGTCGCAGAAGCCGAGAGAGGAGGCGCCCTGGGACCAAAGCCCCCTCCCCAGATTTCCTTGTACACACACCCCCACCCCCAAAAAGCCCAGGATGCATTCTTTCCTGGCTCTTCCCGACTCTCTCCTGAGACTGATCCCAGAAAAGGCTCTCACCAGTCTCCGTCTTCCCAGTTTATGTCCTCCCGTCCCCAGCTCTTGGGACACGATTTTCATTACCTACCACTCTGGGGCGGTACCCTACCACCCCCTCCTCCAGTGGCTCTCCCTTACACTCTCCCGTCTCTCAACCCTCCCTCTACCGGGGGTTCTCCTCTCGCCTTCCCTGCTCAAGCGCTACACTGTGCACAGCCCCGTTATGTTGACCCGGGCGCAGTAACTGAATCCTGCAATTAGATTAATTAAACAGGCTGCCGCAAGGCACCCCCACCTCTCCCCGCTTGCTCATCTCGCCATCTCTCCGTCCCCCCACCCCCTTTCCCAGGGTACCTTCTCGCTCATCATCGAA GCTTGGCACGCGCCAGGAGACGACCTGCGGCCAGGTGAGTAGCTCGCTCCGCCACCACAGGGGGGCGACACGGCGCAGCGCCGAAAGAGTTAATCTGTTCTAGGCGGGGGAAGTGCGGGCTTGGGGGTGGGAGGCAGGACGCTTAGCTTGGCCTGGAGCTGCGCCCCGCGCTGGACGCTCGGATTCCGCTCGCTGCCTGGACTCAGAGCACAATTGCGTTTCCTGCGGGTTATTTTTGGCGTGGGAACGCGGGGAGTACGGCGGTGAGAAAGGCTGAAGCTGCCAGCGCCGCTGACGGGCCCCTTCCTGTATTTTACACCTTTCGCGAATTCCGCTCCTTTGGAAAGGGAATAATGGCTTTGGGATGTTGTTCTGACACAGAGGAAAAGGATATTTCAGCAGCACAACAATTCTCACTTTGAAAAGGAAAAAAGAAAACCATTACCCACCTCTGGAGGCAGAACCCCTGAATGGGCACCAAAGGACCCCCTGCTCCCAGGGTCCTCTCTAGCCTGGGGAGCTTTTCTTTCTTTTTCTCTTTTTTCCATTTTGACCTCTTTTCCTCTTTCCCCTCCCTATCTGCCTCCAAGACCCTGGGATATCTTAACATCCTTCTATTGTCCCCTTTTTGAATACTATCAGGCCCCCTGCACATGCACACACGTAGGGCAGCTACGTAGCGGGGCTTTGGGTCCCTCTGGCCTGTTCTTGCTGGCAGGCGGGGGTCATCTGGATAACTGGGCTGATTGGTTGGCTGATCACCATCATCACAGCCAAGAAGGACATTGGCCAGCCGTCACTGGCACCCTTGGGGACTGGCGACCCTTCCCTGACCCGACCCTCTGCCCCCTCAGAGGCCTTGCCACCAGATGCACTCATCAGCAAGATCGCCATCCAGGGCTCCCTAGCTGT GGGTCAGAACTGGTTATTGGATGAGCAAACCAGCACCCTCACAAGGCTGCGCTACTCTTACCGGGTCATCTGCAGT GACAACTACTATGGAGACAACTGCTCCCGCCTGTGCAAGAAGCGCAATGACCACTTCGGCCACTATGTGTGCCAGC CAGATGGCAACTTGTCCTGCCTGCCCGGTTGGACTGGGGAATATTGCCAACAGCGTAAGCAGTCAAGCTCCCACCTGTGTGGAAGGGGAGGGTCCCCTGAGGAAACACAGTGGAGCTTCTTGGTCACAGCTTGCCTCCCTTGAAGAGTGGGTCTGGGCCTCCTACTAGCTGGGCCTCAGGGATGCTGAGGGTGGGCTTGACCTCAGACCTCCTGTCTCTTCCCAGTGCTCCTCCCATCATGCCAAAGCCCACAAGAACCCCATCATGACATTCCATCCAGTTTGGCTTCTCCTTCCCTGTGCCATTATTTCACTTTAAGACACTCGGGGCTCCTCTGGGAGGCCAGGAGTAGGAAGAGGGCCCAGGAGAGCTAGGGGATCCCCAGGGCCAGCAGGTGAGAATGGGGCTTAAGAGTCCTTGGTATCCCAGCCTCACCCAGCTCTGTGTTCTTCCCTTAGCTATCTGTCTTTCGGGCTGTCATGAACAGAATGGCTACTGCAGCAAGCCAGCAGAGTGCCTGTGAGTAGGGGACAGGAAGTGGTGAGTGGGAGCCCTCCCTTGGCCAAGGCCTCTCACCTCACTCTGCCTCTCTCTTGTTCCCCAGCTGC CGCCCAGGCTGGCAGGGCCGGCTGTGTAACGAATGCATCCCCCACAATGGCTGTCGCCACGGCACCTGCAGCACTC CCTGGCAATGTACTTGTGATGAGGGCTGGGGAGGCCTGTTTTGTGACCAAGGTGAGTCAGGGTGAAGAGAGGGTGCAGAGGGTGCAAGAGATATGGGGCTGGGGGGTGGAAATCCGATTCGTCACCTGGATCCTTCTTACTTGGTGACTGCAGACTTGGCTTTCCCATGATCTTCCAAGGATCTTGGGTCTTTTAAGGATCTTTACAACTGGCCCAGAATGAGGCGGTGGGTCCTTCTCCAGGTGCGGCGGCAGGGGGTGGTGGAGCCAGGGTGGCTGAAAAACCCAGGGGGGTGACAAGGTCGGCAGCCTGGAGGTTGCACTCATAAATCCTAGCAAAGCCAAAGAGAGAGGGATGGCAGGCTCAGTTCCTCTTTCAACCCCGTAGTTACCTATTAACCCCCTGAGTGTTTGCTTACCTTCCAGGGCTGTTTGAGCAGCTCTCCCCTAAACAGCTGTCCGGTGGGGTGTGCCCACCGGCCACCTGAGGCTGTGGGTGAGCTGGGCCTCTGGGCGGAGTGGCATCTAACCGACTTTTCGGTGTGGGCACAAACGGCCTCCCCTGCTCTTACCTAGTTACCACCTGCCTGAACCCATGCGGTCTCTACCTGGTGTTTAGGGGTAGTCACTCTCTGGCTATACAGGGGCCTTTCAGCCCCAACCTTGGGGGAGGAGGAAGCCTTTTTTCTTGCATCCTGCTAGCCAGCTGCAGCCAGCTGCAGCTCCCATTTTCAGGATCAAATGGGTGCACCTGCTGCCCAGAGACACCGGCGCAGGCCTGGGTAGGGTGGGCAGAGAGCTTGCCAGGGTGGAAAGAAATTGCCTAGGCCCTGACTTGCTGTCAACAAGGGGCTTGGGATTCAGTCCCTGTGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTGTCCCTTTACTACCATCCCCACCCCAACACTCACACACCTGGTTCCTGCTCATTCTCTTCCCTCTCCACCATATTTGCTCCCAGGTGACACAGTCATATACTCATCATATGCAAACACAGCACTTGCAGGCCATATATTTACTCTGTCTGGTTCTCCCTCCCTGTCCTTCCCAAATAAAAAAACAAATACTTATATTTCAAAATACCCTTGTAACACCTCTTCCTTTAAAAAATGCCCGATTACTGCCTATGGTGGCTCTCATCTCTCCTCTACCATTTCTACCTGTTGAAATTTTATCCCTCCTTCCAGGCTTATCTCAGCTGCCCCTCCTCCATGAAGCCTTTTCTGACTTCCTCCCCGACATGTGGCCTTGCCCTCTGCTCTTCTTCCTTATCTTCATCCTACTTGGGTTGGCAGTTTGTGAGTTTCCCTGGCAGGACGTCTTCCAGTTCCAGTTGTGTTGTTTCACTTTTGGTTGACTGCACTGGTCATATGTGATTCAAGGTGCTTTAAGAAACATGATTTTCATCCTGGCTAACACAGTGAAACCCTGTCTGTATTAAAAATACAAAAGTTAGCCAGGTGTGGTGGCAGGCACCTGTAGCCCCAGCTGCTGGGAAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGAAGTAGAGCTTGCAGTGAGCCGAGGTCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGAGTGACAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAACATGATTTTAGGCTGGGTGCGATGGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTAGGTGGATCACTTGAAGTCAGGAGTTCGAGACCATCCTGGCCATCCTGGTGAAACCCCTGTAAAAATACAAATATTAATCGGGCACAGTGGCGCATGCCTGTAATCCCAGCTACTTAGAAGGTTGAGGTATGAGAATCGCTTGAACCCGGAAGGCGAAGGTTGTAGTGAGCCTATATCACATCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGTGAGACTCTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGGAAAGAAAGAGAAAGAGAGAGAAAGAAAGAAAGAAAGAGAAAGAAAAAAGATTTTATTGGTGGTGGAGGAAGGATGTTTGGGCCTGGGAGACTTTGAGTTGAGGTGTCTTTGAGCCAAACATGGGGGCAAACATGGACTGCAAGGAGCCTGGAGGTGAGTGCATTCCCTGGCCCTGCTCAGCTGCTTGGTTCCTGTTTCTGCAGATCTCAACTACTGCACCCACCACTCCCCATGCAAGAATGGGGCAACGTGCTCC AACAGTGGGCAGCGAAGCTACACCTGCACCTGTCGCCCAGGCTACACTGGTGTGGACTGTGAGCTGGAGCTCAGCG AGTGTGACAGCAACCCCTGTCGCAATGGAGGCAGCTGTAAGGTGAGGCCCAGACCAGCGCAGGAAGACAGAGGTGTCAGGTGGTGTCTGGGCATCCCTAACCTAGGCAGTTAGTGGATGTACAGCCATGGACAGGCATTGTGGGCAGGTGGAGCCCAGCCTTCAGTCACACATCCCTGCCCCCCAGGGTCTGACTTTGGCCCCTTTATGGTCTCTCTCCAGGACCAGG AGGATGGCTACCACTGCCTGTGTCCTCCGGGCTACTATGGCCTGCATTGTGAACACAGCACCTTGAGCTGCGCCGA CTCCCCCTGCTTCAATGGGGGCTCCTGCCGGGAGCGCAACCAGGGGGCCAACTATGCTTGTGAATGTCCCCCCAAC TTCACCGGCTCCAACTGCGAGAAGAAAGTGGACAGGTGCACCAGCAACCCCTGTGCCAACGGTGCGTGCTGCTGCCCTGCTAACCTGGTGGACTGGCCCTGGGGCTGAGAGAGACTTCTGGTGAGGGAGGGTCAGGAGAGGAGCGAGGCATTGTCTGCCACTCTGGCCCCCCATCTGCTCTGGAGGGCGAAGAGCTTGCTTGATCAGCTGGGGGGCTGTGGAAGCGGAGCTGGTTAGTTGCACGCAGGCCTTAGGAGCAGGGGTGGTATGCACCCTGCATAGCTTCCATTCCTATTCCCATGTCAGAACCCCGTCCTGGCTGGGGTGGCCTCTGACCCTCCCCAGGAAGTCCTGAGCTGGAGAGAGGGATGTTGGAGGCTTCATGTTTCTCCTCAAAGGAGGCAGTGATTCAGTCAGAGCCCTGCTCCTGGAGGCCTCATCTTGCCCCGTGCCCAGGTAGAGCATGAGGTAGCATGAGGCATCTTGAATGTTTGCACCTTTTGAGGCACAAAGCCTGTTGGTAATCCTTGTCTATCTGGCTCCCAGGTGACCCTCTGTGAGGCAGGCAGGCAGGCAGCGCTCAGGAGCTGGAGAGGGGTGGGAAGGGCTGAGAGGGAGTCTGCTCTCTCACTGAAGCCTCTGGCACTGCCATTTCTTCATCACTGAATGGGAAACTATAATACCTGTCCTCTGTCCTTCATGTGGTTGTGAAGATGAAGTAAAACAGTCATGATTGTACTTATCCGAGCATTAACTATATACCAAACATGGGCTCTTGCCTTCATGTACCTTCCCGGCTATCCTATGAAGGGGCTAGCATTCTACTCCAGTCTAACAAATGGGGAAACTGAGGCTTAGAGACACGGTTAAGCAGCAAGTGCCAGATCTCAGGCCACAGAGTGACAGCTGAGGTCCCAACTCAAGCCTATCTGTCTGATTCTACGTTAAAGTTCTGTAAGATGCTAGTCATTTTTATACATGAGCCCACTGAGGCCGAGAGAATCAAGGTCATGCTAAACTCCAGGTCTCCTGACTCTGTGCAGTTCTCTTTGTAGTGGGCTCTGCAGGTGGAGGTAGAAGGGCCCGAACGTGTTCCTGGAATGGGGCTCCCACCCCCTGCCCCAGGGAGCTCCCAGGCTATCACTGACTTGTGTCTCATGCGTCCTCACAGGGGGACAGTGCCTGAACCGAGGTCCAAGCCGCATGTGCCGCTGCC GTCCTGGATTCACGGGCACCTACTGTGAACTCCACGTCAGCGACTGTGCCCGTAACCCTTGCGCCCACGGTGGCAC TTGCCATGACCTGGAGAATGGGCTCATGTGCACCTGCCCTGCCGGCTTCTCTGGCCGACGCTGTGAGGTGCGGACA TCCATCGATGCCTGTGCCTCGAGTCCCTGCTTCAACAGGGCCACCTGCTACACCGACCTCTCCACAGACACCTTTG TGTGCAACTGCCCTTATGGCTTTGTGGGCAGCCGCTGCGAGTTCCCCGTGGGCTTGCCGCCCAGCTTCCCCTGG（SEQ ID No.3）
2）人源化打靶载体构建
将人源的DLL4基因的Exon1至Exon9部分构建成打靶载体，利用同源重组的技术替换鼠源Dll4基因的Exon1至Exon9部分，构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示（斜体表示插入的片段，1238bp-8143bp表示插入的人源DLL4基因片段）。
1 ACGAGC CAGGAG GGAGTG GGGGTG GGGGAC AAAGAG AGAAGG CACGCG CTGGGC ACGCCC
61 TGCTGC TTGAGG TGACAC GCCTAC CAGGTG CAGAGA AGACCA GAGTCC TAGACG CTTGGC
121 CCTTTG CCTTGC TTGGAA TAGCCA GGGAAA GGTTAA GGCGTC GGATGG CTTCCC TGCGGT
181 GCTGGG GACGCG TGGAGG GTGGGC ACACAT AGGCTG GAGGCC AGCGAG GCAGGA GCTACC
241 TAAAGT CTGGAA AGGAAA GGGAGA TCCAAA TCCCCT GGTCCT GCTTTT TGCTTT CCTAGT
301 TTAAGC TTTCCC CACCTG CTAGAG GACTGT AGGTAT CTAATG CCTGGA TCAGGT GCACCG
361 CCTACG GGGACC CCTTAG AGTTTC CACCCC CTGGAC CATTCG GGAACC ACCTCA CCTCCC
421 GCCGCA TCACTG GGCTAC CCTCCT ATCCTC TGGTGG CGAGGG TCTCAG CCTTTA AGCAGA
481 CGATCT CTAAGG ACTGCT CGCCGG GCACGC GCAGAG CTGGAA GCCCAG AAGTTG GAAGAG
541 GGGCGG GGACCT GCGCCC TACTGG CTGGCT GACAGG GGGAGC GGCGGG GGCGGA GGCCCC
601 CTCCGG TGGGTG CTGGGA CTGTAG CCACTA GAGGCC TGGAGG GGAGGG GAGAGT GACCGT
661 GAGTCT GTCTGA CTGACA GGCTGC GAAGAG CAGCCA ATATAT ATAAGA AAGGCT CTGGAG
721 CAAGCA GGTTTC AGTAGC GGCGCT GCTCGC AGGCTA GGAACC CGAGGC CAAGAG CTGCAG
781 CCAAAG TCACTT GGGTGC AGTGTA CTCCCT CACTAG CCCGCT CGAGAC CCTAGG ATTTGC
841 TCCAGG ACACGT ACTTAG AGCAGC CACCGC CCAGTC GCCCTC ACCTGG ATTACC TACCGA
901 GGCATC GAGCAG CGGAGT TTTTGA GAAGGC GACAAG GGAGCA GCGTCC CGAGGG GAATCA
961 GCTTTT CAGGAA CTCGGC TGGCAG ACGGGA CTTGCG GGAGAG CGACAT CCCTAA CAAGCA
1021 GATTCG GAGTCC CGGAGT GGAGAG GACACC CCAAGG GATGGC GGCAGC GTCCCG GAGCGC
1081 CTCTGG CTGGGC GCTACT GCTGCT GGTGGC ACTTTG GCAGCA GGTAAC ACGTCC CGCGCC
1141 CTCTCC GTCCCC TCTGCC GCGCTC TGGGCC TCAGCC CCGGGC ACCAGC TGAGCT GACCGG
1201 TCCCCT CCCTCC TTCCCT CGGTCC CTGTGC AATAGC GCGCGG CCGGCT CCGGCG TCTTCC
1261 AGCTGC AGCTGC AGGAGT TCATCA ACGAGC GCGGCG TACTGG CCAGTG GGCGGC CTTGCG
1321 AGCCCG GCTGCC GGACTT TCTTCC GCGTCT GCCTTA AGCACT TCCAGG CGGTCG TCTCGC
1381 CCGGAC CCTGCA CCTTCG GGACCG TCTCCA CGCCGG TATTGG GCACCA ACTCCT TCGCTG
1441 TCCGGG ACGACA GTAGCG GCGGGG GGCGCA ACCCTC TCCAAC TGCCCT TCAATT TCACCT
1501 GGCCGG TGAGCA CAGCCT GGGCGC ACTGGG AGGTCG CAGAAG CCGAGA GAGGAG GCGCCC
1561 TGGGAC CAAAGC CCCCTC CCCAGA TTTCCT TGTACA CACACC CCCACC CCCAAA AAGCCC
1621 AGGATG CATTCT TTCCTG GCTCTT CCCGAC TCTCTC CTGAGA CTGATC CCAGAA AAGGCT
1681 CTCACC AGTCTC CGTCTT CCCAGT TTATGT CCTCCC GTCCCC AGCTCT TGGGAC ACGATT
1741 TTCATT ACCTAC CACTCT GGGGCG GTACCC TACCAC CCCCTC CTCCAG TGGCTC TCCCTT
1801 ACACTC TCCCGT CTCTCA ACCCTC CCTCTA CCGGGG GTTCTC CTCTCG CCTTCC CTGCTC
1861 AAGCGC TACACT GTGCAC AGCCCC GTTATG TTGACC CGGGCG CAGTAA CTGAAT CCTGCA
1921 ATTAGA TTAATT AAACAG GCTGCC GCAAGG CACCCC CACCTC TCCCCG CTTGCT CATCTC
1981 GCCATC TCTCCG TCCCCC CACCCC CTTTCC CAGGGT ACCTTC TCGCTC ATCATC GAAGCT
2041 TGGCAC GCGCCA GGAGAC GACCTG CGGCCA GGTGAG TAGCTC GCTCCG CCACCA CAGGGG
2101 GGCGAC ACGGCG CAGCGC CGAAAG AGTTAA TCTGTT CTAGGC GGGGGA AGTGCG GGCTTG
2161 GGGGTG GGAGGC AGGACG CTTAGC TTGGCC TGGAGC TGCGCC CCGCGC TGGACG CTCGGA
2221 TTCCGC TCGCTG CCTGGA CTCAGA GCACAA TTGCGT TTCCTG CGGGTT ATTTTT GGCGTG
2281 GGAACG CGGGGA GTACGG CGGTGA GAAAGG CTGAAG CTGCCA GCGCCG CTGACG GGCCCC
2341 TTCCTG TATTTT ACACCT TTCGCG AATTCC GCTCCT TTGGAA AGGGAA TAATGG CTTTGG
2401 GATGTT GTTCTG ACACAG AGGAAA AGGATA TTTCAG CAGCAC AACAAT TCTCAC TTTGAA
2461 AAGGAA AAAAGA AAACCA TTACCC ACCTCT GGAGGC AGAACC CCTGAA TGGGCA CCAAAG
2521 GACCCC CTGCTC CCAGGG TCCTCT CTAGCC TGGGGA GCTTTT CTTTCT TTTTCT CTTTTT
2581 TCCATT TTGACC TCTTTT CCTCTT TCCCCT CCCTAT CTGCCT CCAAGA CCCTGG GATATC
2641 TTAACA TCCTTC TATTGT CCCCTT TTTGAA TACTAT CAGGCC CCCTGC ACATGC ACACAC
2701 GTAGGG CAGCTA CGTAGC GGGGCT TTGGGT CCCTCT GGCCTG TTCTTG CTGGCA GGCGGG
2761 GGTCAT CTGGAT AACTGG GCTGAT TGGTTG GCTGAT CACCAT CATCAC AGCCAA GAAGGA
2821 CATTGG CCAGCC GTCACT GGCACC CTTGGG GACTGG CGACCC TTCCCT GACCCG ACCCTC
2881 TGCCCC CTCAGA GGCCTT GCCACC AGATGC ACTCAT CAGCAA GATCGC CATCCA GGGCTC
2941 CCTAGC TGTGGG TCAGAA CTGGTT ATTGGA TGAGCA AACCAG CACCCT CACAAG GCTGCG
3001 CTACTC TTACCG GGTCAT CTGCAG TGACAA CTACTA TGGAGA CAACTG CTCCCG CCTGTG
3061 CAAGAA GCGCAA TGACCA CTTCGG CCACTA TGTGTG CCAGCC AGATGG CAACTT GTCCTG
3121 CCTGCC CGGTTG GACTGG GGAATA TTGCCA ACAGCG TAAGCA GTCAAG CTCCCA CCTGTG
3181 TGGAAG GGGAGG GTCCCC TGAGGA AACACA GTGGAG CTTCTT GGTCAC AGCTTG CCTCCC
3241 TTGAAG AGTGGG TCTGGG CCTCCT ACTAGC TGGGCC TCAGGG ATGCTG AGGGTG GGCTTG
3301 ACCTCA GACCTC CTGTCT CTTCCC AGTGCT CCTCCC ATCATG CCAAAG CCCACA AGAACC
3361 CCATCA TGACAT TCCATC CAGTTT GGCTTC TCCTTC CCTGTG CCATTA TTTCAC TTTAAG
3421 ACACTC GGGGCT CCTCTG GGAGGC CAGGAG TAGGAA GAGGGC CCAGGA GAGCTA GGGGAT
3481 CCCCAG GGCCAG CAGGTG AGAATG GGGCTT AAGAGT CCTTGG TATCCC AGCCTC ACCCAG
3541 CTCTGT GTTCTT CCCTTA GCTATC TGTCTT TCGGGC TGTCAT GAACAG AATGGC TACTGC
3601 AGCAAG CCAGCA GAGTGC CTGTGA GTAGGG GACAGG AAGTGG TGAGTG GGAGCC CTCCCT
3661 TGGCCA AGGCCT CTCACC TCACTC TGCCTC TCTCTT GTTCCC CAGCTG CCGCCC AGGCTG
3721 GCAGGG CCGGCT GTGTAA CGAATG CATCCC CCACAA TGGCTG TCGCCA CGGCAC CTGCAG
3781 CACTCC CTGGCA ATGTAC TTGTGA TGAGGG CTGGGG AGGCCT GTTTTG TGACCA AGGTGA
3841 GTCAGG GTGAAG AGAGGG TGCAGA GGGTGC AAGAGA TATGGG GCTGGG GGGTGG AAATCC
3901 GATTCG TCACCT GGATCC TTCTTA CTTGGT GACTGC AGACTT GGCTTT CCCATG ATCTTC
3961 CAAGGA TCTTGG GTCTTT TAAGGA TCTTTA CAACTG GCCCAG AATGAG GCGGTG GGTCCT
4021 TCTCCA GGTGCG GCGGCA GGGGGT GGTGGA GCCAGG GTGGCT GAAAAA CCCAGG GGGGTG
4081 ACAAGG TCGGCA GCCTGG AGGTTG CACTCA TAAATC CTAGCA AAGCCA AAGAGA GAGGGA
4141 TGGCAG GCTCAG TTCCTC TTTCAA CCCCGT AGTTAC CTATTA ACCCCC TGAGTG TTTGCT
4201 TACCTT CCAGGG CTGTTT GAGCAG CTCTCC CCTAAA CAGCTG TCCGGT GGGGTG TGCCCA
4261 CCGGCC ACCTGA GGCTGT GGGTGA GCTGGG CCTCTG GGCGGA GTGGCA TCTAAC CGACTT
4321 TTCGGT GTGGGC ACAAAC GGCCTC CCCTGC TCTTAC CTAGTT ACCACC TGCCTG AACCCA
4381 TGCGGT CTCTAC CTGGTG TTTAGG GGTAGT CACTCT CTGGCT ATACAG GGGCCT TTCAGC
4441 CCCAAC CTTGGG GGAGGA GGAAGC CTTTTT TCTTGC ATCCTG CTAGCC AGCTGC AGCCAG
4501 CTGCAG CTCCCA TTTTCA GGATCA AATGGG TGCACC TGCTGC CCAGAG ACACCG GCGCAG
4561 GCCTGG GTAGGG TGGGCA GAGAGC TTGCCA GGGTGG AAAGAA ATTGCC TAGGCC CTGACT
4621 TGCTGT CAACAA GGGGCT TGGGAT TCAGTC CCTGTG TTGTGT GTGTGT GTGTGT GTGTGT
4681 GTGTGT GTCTGT CCCTTT ACTACC ATCCCC ACCCCA ACACTC ACACAC CTGGTT CCTGCT
4741 CATTCT CTTCCC TCTCCA CCATAT TTGCTC CCAGGT GACACA GTCATA TACTCA TCATAT
4801 GCAAAC ACAGCA CTTGCA GGCCAT ATATTT ACTCTG TCTGGT TCTCCC TCCCTG TCCTTC
4861 CCAAAT AAAAAA ACAAAT ACTTAT ATTTCA AAATAC CCTTGT AACACC TCTTCC TTTAAA
4921 AAATGC CCGATT ACTGCC TATGGT GGCTCT CATCTC TCCTCT ACCATT TCTACC TGTTGA
4981 AATTTT ATCCCT CCTTCC AGGCTT ATCTCA GCTGCC CCTCCT CCATGA AGCCTT TTCTGA
5041 CTTCCT CCCCGA CATGTG GCCTTG CCCTCT GCTCTT CTTCCT TATCTT CATCCT ACTTGG
5101 GTTGGC AGTTTG TGAGTT TCCCTG GCAGGA CGTCTT CCAGTT CCAGTT GTGTTG TTTCAC
5161 TTTTGG TTGACT GCACTG GTCATA TGTGAT TCAAGG TGCTTT AAGAAA CATGAT TTTCAT
5221 CCTGGC TAACAC AGTGAA ACCCTG TCTGTA TTAAAA ATACAA AAGTTA GCCAGG TGTGGT
5281 GGCAGG CACCTG TAGCCC CAGCTG CTGGGA AGGCTG AGGCAG GAGAAT GGCGAA GTAGAG
5341 CTTGCA GTGAGC CGAGGT CGTGCC ACTGCA CTCCAG CCTGAG TGACAG AGCAAG ACTCCG
5401 TCTCAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA AAAAAA GAAACA TGATTT TAGGCT GGGTGC GATGGC
5461 CTGTAA TCCCAG CACTTT GGGAGG CCGAGG TAGGTG GATCAC TTGAAG TCAGGA GTTCGA
5521 GACCAT CCTGGC CATCCT GGTGAA ACCCCT GTAAAA ATACAA ATATTA ATCGGG CACAGT
5581 GGCGCA TGCCTG TAATCC CAGCTA CTTAGA AGGTTG AGGTAT GAGAAT CGCTTG AACCCG
5641 GAAGGC GAAGGT TGTAGT GAGCCT ATATCA CATCAC TGCACT CCAGCC TGGGCG ACAGAG
5701 TGAGAC TCTGTT AAAAAA AAAAAA AAAAGA AGGAAA GAAAGA GAAAGA GAGAGA AAGAAA
5761 GAAAGA AAGAGA AAGAAA AAAGAT TTTATT GGTGGT GGAGGA AGGATG TTTGGG CCTGGG
5821 AGACTT TGAGTT GAGGTG TCTTTG AGCCAA ACATGG GGGCAA ACATGG ACTGCA AGGAGC
5881 CTGGAG GTGAGT GCATTC CCTGGC CCTGCT CAGCTG CTTGGT TCCTGT TTCTGC AGATCT
5941 CAACTA CTGCAC CCACCA CTCCCC ATGCAA GAATGG GGCAAC GTGCTC CAACAG TGGGCA
6001 GCGAAG CTACAC CTGCAC CTGTCG CCCAGG CTACAC TGGTGT GGACTG TGAGCT GGAGCT
6061 CAGCGA GTGTGA CAGCAA CCCCTG TCGCAA TGGAGG CAGCTG TAAGGT GAGGCC CAGACC
6121 AGCGCA GGAAGA CAGAGG TGTCAG GTGGTG TCTGGG CATCCC TAACCT AGGCAG TTAGTG
6181 GATGTA CAGCCA TGGACA GGCATT GTGGGC AGGTGG AGCCCA GCCTTC AGTCAC ACATCC
6241 CTGCCC CCCAGG GTCTGA CTTTGG CCCCTT TATGGT CTCTCT CCAGGA CCAGGA GGATGG
6301 CTACCA CTGCCT GTGTCC TCCGGG CTACTA TGGCCT GCATTG TGAACA CAGCAC CTTGAG
6361 CTGCGC CGACTC CCCCTG CTTCAA TGGGGG CTCCTG CCGGGA GCGCAA CCAGGG GGCCAA
6421 CTATGC TTGTGA ATGTCC CCCCAA CTTCAC CGGCTC CAACTG CGAGAA GAAAGT GGACAG
6481 GTGCAC CAGCAA CCCCTG TGCCAA CGGTGC GTGCTG CTGCCC TGCTAA CCTGGT GGACTG
6541 GCCCTG GGGCTG AGAGAG ACTTCT GGTGAG GGAGGG TCAGGA GAGGAG CGAGGC ATTGTC
6601 TGCCAC TCTGGC CCCCCA TCTGCT CTGGAG GGCGAA GAGCTT GCTTGA TCAGCT GGGGGG
6661 CTGTGG AAGCGG AGCTGG TTAGTT GCACGC AGGCCT TAGGAG CAGGGG TGGTAT GCACCC
6721 TGCATA GCTTCC ATTCCT ATTCCC ATGTCA GAACCC CGTCCT GGCTGG GGTGGC CTCTGA
6781 CCCTCC CCAGGA AGTCCT GAGCTG GAGAGA GGGATG TTGGAG GCTTCA TGTTTC TCCTCA
6841 AAGGAG GCAGTG ATTCAG TCAGAG CCCTGC TCCTGG AGGCCT CATCTT GCCCCG TGCCCA
6901 GGTAGA GCATGA GGTAGC ATGAGG CATCTT GAATGT TTGCAC CTTTTG AGGCAC AAAGCC
6961 TGTTGG TAATCC TTGTCT ATCTGG CTCCCA GGTGAC CCTCTG TGAGGC AGGCAG GCAGGC
7021 AGCGCT CAGGAG CTGGAG AGGGGT GGGAAG GGCTGA GAGGGA GTCTGC TCTCTC ACTGAA
7081 GCCTCT GGCACT GCCATT TCTTCA TCACTG AATGGG AAACTA TAATAC CTGTCC TCTGTC
7141 CTTCAT GTGGTT GTGAAG ATGAAG TAAAAC AGTCAT GATTGT ACTTAT CCGAGC ATTAAC
7201 TATATA CCAAAC ATGGGC TCTTGC CTTCAT GTACCT TCCCGG CTATCC TATGAA GGGGCT
7261 AGCATT CTACTC CAGTCT AACAAA TGGGGA AACTGA GGCTTA GAGACA CGGTTA AGCAGC
7321 AAGTGC CAGATC TCAGGC CACAGA GTGACA GCTGAG GTCCCA ACTCAA GCCTAT CTGTCT
7381 GATTCT ACGTTA AAGTTC TGTAAG ATGCTA GTCATT TTTATA CATGAG CCCACT GAGGCC
7441 GAGAGA ATCAAG GTCATG CTAAAC TCCAGG TCTCCT GACTCT GTGCAG TTCTCT TTGTAG
7501 TGGGCT CTGCAG GTGGAG GTAGAA GGGCCC GAACGT GTTCCT GGAATG GGGCTC CCACCC
7561 CCTGCC CCAGGG AGCTCC CAGGCT ATCACT GACTTG TGTCTC ATGCGT CCTCAC AGGGGG
7621 ACAGTG CCTGAA CCGAGG TCCAAG CCGCAT GTGCCG CTGCCG TCCTGG ATTCAC GGGCAC
7681 CTACTG TGAACT CCACGT CAGCGA CTGTGC CCGTAA CCCTTG CGCCCA CGGTGG CACTTG
7741 CCATGA CCTGGA GAATGG GCTCAT GTGCAC CTGCCC TGCCGG CTTCTC TGGCCG ACGCTG
7801 TGAGGT GCGGAC ATCCAT CGATGC CTGTGC CTCGAG TCCCTG CTTCAA CAGGGC CACCTG
7861 CTACAC CGACCT CTCCAC AGACAC CTTTGT GTGCAA CTGCCC TTATGG CTTTGT GGGCAG
7921 CCGCTG CGAGTT CCCCGT GGGCTT GCCGCC CAGCTT CCCCTG GGTCTC GCTGGG CGTGGG
7981 GCTAGT GGTACT GCTGGT GCTCCT GGTCAT GGTGGT AGTGGC TGTGCG GCAGCT GCGGCT
8041 TCGGAG GCCCGA TGACGA GAGCAG GGAAGC CATGAA CAATCT GTCAGA CTTCCA GAAGGA
8101 CAACCT AATCCC TGCCGC CCAGCT CAAAAA CACAAA CCAGAA GAAGGA GCTGGA AGTGGA
8161 CTGTGG TCTGGA CAAGTC CAATTG TGGCAA ACTGCA GAACCA CACATT GGACTA CAATCT
8221 AGCCCC GGGACT CCTAGG ACGGGG CGGCAT GCCTGG GAAGTA TCCTCA CAGTGA CAAGAG
8281 CTTAGG AGAGAA GGTGCC ACTTCG GTTACA CAGGTA AGCCAC ACCTGG AAGCCC ATAGCT
8341 TGGTCA CAGACC CTTCCA TAGTTT GACAGG ATCTCC TAGGCT GAGTGG GAGGCT GGCATC
8401 AGGCCT TGGCAA CTTTTA ATCAAG TAAGAT TGTAGT ACTGAC AAGAAG ACACTC TAGTTA
8461 CATTTA TTTTTT TTTGTG GGGGGT GGGGTG GGGTTT TTTGAG ACAAAG TTTCTC TGTGTA
8521 GCCCTA GCTGTC CTGGAA CTCACT TTGTAG ACCAGG CTGGCC TCCAAC TCAGAA ATTCAC
8581 CTGCCT CTGCCT CCCGAG TGCTGG GATTAA AGGCGT GCGTCA CCACGC CAGGCT TCTAGT
8641 TACATT TCTATA GGGACC CAGGCA CAGTGG CACAGA CTTTGT AGCCCT ACCTAC TTAGGC
8701 TAAGAC AGGAGG ATTGCT AGTTTG ATGCTA GCCTGG GTAACA TAGCAG CAGATC ATGTCT
8761 CAAAAA CATTGA GATGGC TCAGAG AGTAAA GGCACC TGCTGC CAAGCC TGGTGA CTGAAT
8821 CTGACC TCCAGG ACCTAC ATATTA GAAGTC CTTTAA CTTCTG AGACGG TGCAGT CACACA
8881 CACACA CACACA CACACA CACACA CACACA CACACA CACACA CACACA CACTAA TTTTTA
（SEQ ID No.4）。
3）sgRNA的构建
（1）分别合成sgRNA上下游引物，引物纯化方式为PAGE；
（2）sgRNA上下游引物分别稀释至100μmol/μl，以1:1的配比混匀，室温自行缓慢退火；
（3）退火形成的双链与Puc57-sgRNA-NEO-Amp （Bsa I）连接1h，转化，涂布Amp+平板；
（4）挑取单克隆，进行PCR鉴定；
（5）PCR阳性的单克隆进一步测序确认，测序引物为pUC57-T7-F；
（6）以测序正确的克隆为模板，然后用引物PCR扩增sgRNA转录的DNA产物；
（7）以sgRNA转录的DNA产物为模板，转录sgRNA并进一步纯化。然后将构建好的打靶载体通过转录然后再逆转录，获得可用于注射的ssDNA donor。
4）DLL4人源化小鼠制备的sgRNA筛选
设计并合成了2组sgRNA（5S1+3S1和5S2+3S2，具体序列信息见表1），将5’端靶点位和3’靶点位的sgRNA两两配对，然后将2对sgRNA与Cas9蛋白进行孵育后，注射到0.5天的受精卵中，进行培养至囊胚后，通过对小鼠Dll4基因的KO阳性率进行鉴定，以此对sgRNA切割活性进行验证。
sgRNA切割实验鉴定方法：将收集的囊胚进行PCR扩增，PCR的方案如表4-5所示，将扩增的条带进行二代测序，结果与WT条带进行对比，统计发生突变的概率（鉴定结果如表2所示）。
表1 sgRNA信息
表2 sgRNA切割活性
5）DLL4人源化小鼠模型建立
将筛选得到的sgRNA（5S2+3S2）设计并构建携带人源序列的ssDNA donor，将ssDNA donor及Cas9/sgRNA系统注射至3只0.5d的小鼠受精卵中，移植至0.5d假孕雌鼠体内，等小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠（F0）2只。
同样将筛选得到的sgRNA（5S1+3S1）设计并构建携带人源序列的ssDNA donor，将ssDNAdonor及Cas9/sgRNA系统注射至4只0.5d的小鼠受精卵中，移植至0.5d假孕雌鼠体内，但出生的小鼠经基因鉴定均未获得阳性F0。
6）人源化F0小鼠基因型鉴定
对获得的F0小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用表3所示的两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，PCR反应条件和反应程序如表4和表5所示。引物GPT0X0250-01-mDll4-5tF1/GPT0X0250-01-hDLL4-5tR1分别位于5’端同源臂外及ssDNA donor的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组5’端进行了有效插入；GPT0X0250-01-hDLL4-3tF1/GPT0X0250-01-mDll4-3tR1分别位于ssDNA donor的人源片段内及3’端同源臂外，如该对引物扩增产生PCR引物，说明目标donor在小鼠基因组3’端进行了有效插入。
表3 F0鉴定引物
表4 PCR反应体系
表5 PCR反应条件
本试验例使用筛选得到的sgRNA（5S2+3S2）共注射获得F0小鼠3只，采用上述鉴定方案检测阳性F0小鼠。如图2 PCR电泳结果所示（WT为C57BL6JGpt基因组DNA（阴性对照）；N为negative空白对照（无模板的对照）；M为DNA Marker：TRANS 2K PLUS II条带：8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），2#和3#号小鼠的人源DLL4基因5’及3’端鉴定均为阳性，发生串联，可尝试繁育，1#为阴性。此外，通过上述鉴定方法对其他多批F0小鼠进行鉴定，均得到可进行繁育的F0阳性小鼠。
阳性F0小鼠与背景鼠配繁获得F1，对F1代鼠尾进行基因鉴定，F1代小鼠基因鉴定结果见图3所示，6#和9#小鼠人源DLL4基因5’及3’端鉴定均为阳性，同时鼠源检测也为阳性，表明获得的小鼠为正确进行基因重组的杂合阳性小鼠。F1小鼠大量扩繁后进行互配，获得F2纯合子小鼠。
试验例2、B6-hDLL4人源化纯合小鼠基因和蛋白表达验证
（1）B6-hDLL4人源化纯合小鼠mRNA表达检测
1、试验方法
收集B6-hDLL4 F2纯合小鼠和B6背景小鼠的肺和胸腺组织进行RT-PCR检测。
2、试验结果
RT-PCR检测结果如图4所示，鼠源Dll4 mRNA只在野生型小鼠的肺和胸腺组织中被检测到，人源DLL4 mRNA仅在纯合的B6-hDLL4小鼠的肺和胸腺组织中检测到，表明B6-hDLL4纯合小鼠只表达人源DLL4基因。
（2）B6-hDLL4人源化纯合小鼠DLL4蛋白表达检测
1、试验方法
收集B6-hDLL4 F2纯合小鼠和B6背景小鼠的肺组织进行WB检测，使用人鼠共识别的DLL4抗体检测。
2、试验结果
检测结果如图5所示，用已知的人鼠共识别抗DLL4抗体在野生型小鼠和纯合B6-hDLL4小鼠中均可检测到DLL4表达。结合图4结果说明，在B6-hDLL4人源化纯合小鼠中成功表达人DLL4蛋白，而不表达鼠Dll4蛋白。
上述试验结果表明，本发明通过将小鼠DLL4基因进行人源化基因的替换，成功构建得到B6-hDLL4小鼠模型，预示着该模型在肿瘤学、免疫学等领域的研究中具有广阔的应用前景。
尽管已经对本方法实施步骤进行详细说明，但是对于本领域的技术人员来讲，依然可以在本发明范围内对方法中部分参数及整体方案进行修改。因此，凡在本发明精神和原则范围之内做的更改、替换、调整等行为均应在该发明所涵盖范围内。
Claims (10)
1.一种DLL4人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
（1）构建表达人源化DLL4的打靶载体，用于人源化DLL4基因的插入；
（2）设计针对小鼠Dll4基因Exon1至Exon9部分的sgRNA，利用体外转录技术获得上述sgRNA；
（3）将步骤（1）构建的打靶载体、步骤（2）获得的sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；
（4）F0小鼠与背景鼠配种繁殖获得F1小鼠，对F1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出DLL4人源化小鼠模型。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源DLL4基因的结构及功能，选取人源DLL4基因的信号肽及胞外区替换鼠源Dll4基因的信号肽及胞外区序列，选取的人源DLL4基因氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，被替换的鼠源Dll4基因氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源DLL4基因的Exon1至Exon9部分替换小鼠Dll4基因的Exon1至Exon9部分，选取的人源DLL4基因序列如SEQ ID No.3所示。
4. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No.4所示。
5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为（a）SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7，或者（b）SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。
6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中sgRNA的基因序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为B6小鼠。
8. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中F0小鼠基因型鉴定使用的5’端鉴定引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，3’端鉴定引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
9.权利要求1-8任一项所述构建方法得到的小鼠在研究DLL4基因相关功能和作用机制中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与DLL4基因相关疾病的药物中的应用。
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