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CN116716332A - 重组酿酒酵母利用对香豆酸生产高圣草酚的应用 - Google Patents

重组酿酒酵母利用对香豆酸生产高圣草酚的应用 Download PDF

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CN116716332A
CN116716332A CN202310747742.XA CN202310747742A CN116716332A CN 116716332 A CN116716332 A CN 116716332A CN 202310747742 A CN202310747742 A CN 202310747742A CN 116716332 A CN116716332 A CN 116716332A
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endogenous
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元英进
李炳志
朱思雨
刘志华
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Tianjin University Advanced Research Institute Of Synthetic Biology
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Tianjin University Advanced Research Institute Of Synthetic Biology
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组酿酒酵母利用对香豆酸生产高圣草酚的应用。本发明提供了能够利用对香豆酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母。本发明通过人工途径构建、途径优化、酶的理性设计及发酵过程优化等策略获得一株能够利用对香豆酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母，实验表明其高圣草酚产量为1.005mmol/l，转化率为65.8％。在5L发酵罐中扩大生产，本发明的菌株可利用15.2mmol/l的对香豆酸生产3.2mmol/l的高圣草酚，转化率为21.1％。

Description

重组酿酒酵母利用对香豆酸生产高圣草酚的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及重组酿酒酵母利用对香豆酸生产高圣草酚的应用。
背景技术
黄酮是一种广泛存在于植物中的营养物质，具有许多健康保健作用。与非氧甲基化黄酮相比，氧甲基化黄酮具有更好的生物活性和药理特性。高圣草酚是一种存在于北美圣草中的高价值的氧甲基化黄酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌等作用。更重要的是，高圣草酚及其衍生物可以显著降低食物或药物的苦味，而不会表现出其自身的强烈味道，二者被作为苦味掩蔽剂广泛地应用于食品及药品工业。因此，实现高圣草酚的可持续供应至关重要。获得高圣草酚的传统方法包括植物提取和化学合成。然而，植物的季节性及区域性导致植物提取方法并不实用。受到有毒试剂及极端反应条件的限制，化学合成方法的安全性无法保证。近几年来，微生物生产高圣草酚的方法因其工艺周期短、效率高、环境友好等优点而受到广泛的关注。
先前的研究在大肠杆菌中构建了从阿魏酸出发生产高圣草酚生物合成途径(图1)。阿魏酸是一种甲基化苯丙酸。大多数4-对香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate-CoAligase：4CL)和查尔酮合酶(chalcone synthase：CHS)并不能将甲基化的苯丙酸及其对应的辅酶A作为底物，但几种来源于植物且具有广泛特异性的4CL和CHS可以发挥这一功能。现有技术公开了一株含有来自水稻的4CL及来自大麦的CHS的工程大肠杆菌，用于利用阿魏酸合成高圣草酚，该工作的高圣草酚产量为52mg/l，转化率为17.2％。现有技术还公开了含有来自葡萄的4CL、来自拟南芥的CHS及来自拟南芥的查尔酮异构酶(chalcone isomerase：CHI)的工程大肠杆菌，以甘油为碳源，以阿魏酸作为中间产物合成高圣草酚，该工作的高圣草酚产量为17mg/l。
目前已报道过的有关高圣草酚的微生物生产方法具有产量和转化率较低的缺点，且距离实现大规模生产还有一定的距离。除此之外，阿魏酸、对香豆酸是天然存在于木质素中的单体，其中对香豆酸的含量是阿魏酸的3～4倍，利用木质素单体合成高圣草酚既有利于木质素的高值化利用，也有利于高圣草酚的可持续绿色生产。而现有的高圣草酚生物合成途径都是使用阿魏酸作为前体或中间体，从对香豆酸到高圣草酚的途径尚未报道。因此，构建一条从对香豆酸出发高效合成高圣草酚的途径具有很重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的菌株及其应用，为基于发酵的高圣草酚的大规模生产提供了有前景的工程酵母平台。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了基因工程改造在如下项中的应用：
(I)、使酵母获得生产高圣草酚的能力；和/或
(II)、提高酵母生产高圣草酚的产量和/或转化率；
所述酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1D；
所述生产的底物包括对香豆酸；
所述基因工程改造包括：
添加来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因；和
添加来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因；和
添加来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因；和
添加来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的突变体ROMT-9N135T/I324M的基因；和
过表达酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1的基因；和
敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2的基因；和
敲除酵母内源的阿魏酸脱羧酶FDC1的基因；和
取来源于苹果的ECR基因替换酵母内源的TSC13的基因；和
过表达查尔酮合酶CHS的基因；和
添加来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因；和
过表达酵母内源同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6；和
过表达酵母内源S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1；和
过表达酵母内源腺苷激酶ADO1；和
过表达酵母内源亚甲基四氢叶酸还原酶MET13；和
过表达来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR。
本发明还提供了基因元件，包括基因元件1、基因元件2、基因元件3、基因元件4、基因元件5、基因元件6、基因元件7、基因元件8、基因元件9、基因元件10、基因元件11和基因元件12；
所述基因元件1具有来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因；
所述基因元件2具有来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因；
所述基因元件3具有来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因；
所述基因元件4具有强启动子PTEF1；
所述基因元件5具有来源于苹果的ECR基因；
所述基因元件6具有来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因；
所述基因元件7具有酵母内源同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6的基因；
所述基因元件8具有酵母内源S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1的基因；
所述基因元件9具有酵母内源腺苷激酶ADO1的基因；
所述基因元件10具有酵母内源亚甲基四氢叶酸还原酶MET13的基因；
所述基因元件11具有来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR的基因；
所述基因元件12具有来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9突变体ROMT-9N135T/I324M的基因。
本发明还提供了表达盒，包括表达盒1、表达盒2、表达盒3、表达盒4、表达盒5、表达盒6、表达盒7、表达盒8、表达盒9、表达盒10和表达盒11；
所述表达盒1具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件1；
所述表达盒2具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件2；
所述表达盒3具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件3；
所述表达盒4具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件5；
所述表达盒5具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件6；
所述表达盒6具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件7；
所述表达盒7具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件8；
所述表达盒8具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件9；
所述表达盒9具有启动子、终止子以及上述基因元件中的所述基因元件10；
所述表达盒10具有启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件11；
所述表达盒11具有启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件12；
所述启动子包括PTPI1、PTEF1或PGPM1；
所述终止子包括TCPS1、TTEF2或TADH1。
本发明还提供了表达系统，包括表达载体、Linker和如下任一项：
(a)、上述基因元件；或
(b)、上述表达盒；或
(c)、上述表达盒和强启动子PTEF1；
所述表达载体包括Cas9编码基因、绿色荧光蛋白编码基因、His3编码基因、卡那霉素编码基因和gRNA。
在本发明中的一些具体实施方案中，上述表达系统中所述表达载体还包括表达载体1、表达载体2、表达载体3或表达载体4中的一种或多种；
所述表达载体1为用于敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2基因的载体；
所述表达载体2为用于敲除酵母内源阿魏酸脱羧酶FDC1基因的载体；
所述表达载体3为用于敲除酵母内源烯酰还原酶TSC13的基因的载体；
所述表达载体4具有：
(i)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或
(ii)、如(i)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(i)的相同或相似；或
(iii)、与如(i)或(ii)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
所述多个为2个至1000个。
本发明还提供了宿主细胞，包括：
(a)、上述基因元件；或
(b)、上述表达盒；或
(c)、上述表达系统；
所述宿主细胞包括酵母；
所述酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1D。
本发明还提供了酿酒酵母CEN.PK2-1D的重组菌株，包括：
添加来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因；和
添加来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因；和
添加来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因；和
添加来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的突变体ROMT-9N135T/I324M的基因；和
过表达酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1的基因；和
敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2的基因；和
敲除酵母内源的阿魏酸脱羧酶FDC1的基因；和
取来源于苹果的ECR基因替换酵母内源的TSC13的基因；和
过表达查尔酮合酶CHS的基因；和
添加来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因；和
过表达酵母内源同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6；和
过表达酵母内源S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1；和
过表达酵母内源腺苷激酶ADO1；和
过表达酵母内源亚甲基四氢叶酸还原酶MET13；和
过表达来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR。
本发明还提供了组合物，包括对香豆酸和如下任意项：
(I)、上述基因元件；
(II)、上述表达盒；
(III)、上述表达系统；
(IV)、上述宿主细胞；
(V)、上述重组菌株。
本发明还提供了如下任意项在制备高圣草酚中的应用：
(I)、上述基因元件；
(II)、上述表达盒；
(III)、上述表达系统；
(IV)、上述宿主细胞；
(V)、上述重组菌株；
(VI)、上述组合物。
本发明还提供了高圣草酚的制备方法，包括：
(A)、将上述基因元件整合至酵母的基因组，然后与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(B)、取上述表达盒整合至酵母，然后与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(C)、取上述表达系统转化酵母，然后与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(D)、取上述宿主细胞与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(E)、取上述重组菌株与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(F)、培养上述组合物，获得所述高圣草酚；
所述酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1D。
在本发明中的一些具体实施方案中，上述基因元件或上述重组菌株中：
所述来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因具有：
(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
和/或
所述来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS的基因具有：
(4)、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
和/或
所述来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的基因具有：
(7)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
和/或
所述来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因具有：
(10)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或
(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
和/或
所述来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因具有：
(13)、如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或
(14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或
(15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
和/或
所述来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的基因具有：
(16)、如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或
(17)、如(16)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(16)的相同或相似；或
(18)、与如(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
和/或
所述突变体ROMT-9N135T/I324M的基因具有：
(19)、如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或
(20)、如(19)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(19)的相同或相似；或
(21)、与如(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
所述突变体ROMT-9N135T/I324M具有：
(22)、如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或
(23)、如(22)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(22)的相同或相似；或
(24)、与如(22)或(23)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个至160个。
在本发明中的一些具体实施方案中，上述基因元件组合或上述重组菌株中，所述融合酶包括来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS的基因和来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的基因以连接体连接获得。
在本发明中的一些具体实施方案中，上述基因元件组合或上述重组菌株中，所述连接体的序列具有如SEQ ID NO:33所示的序列。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因在酵母中的插入位点为Delta15。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS的基因在酵母中的插入位点为Delta15。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的基因在酵母中的插入位点为Delta15。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因在酵母中的插入位点为Delta15。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因在酵母中的插入位点为Delta22。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于细胞色素P450还原酶ATR1的基因在酵母中的插入位点为Delta22。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的基因在酵母中的插入位点为Delta22。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的突变体ROMT-9N135T/I324M的基因在酵母中的插入位点为Delta22。
在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的突变体ROMT-9N135T/I324M的基因在酵母中的插入位点为Delta22，插入的拷贝数为1份、2份、3份、4份或5份。
本发明的菌株及其应用有如下效果：
实验表明，含有基础途径的菌株Yzsy003的高圣草酚产量为0.017mmol/l，圣草酚为0.069mmol/l。优化后的菌株Yher007对的高圣草酚产量为1.005mmol/l。二者高圣草酚产量利用student t检验，单尾分布，双样本异方差假设，p＝0.008。转化率为65.8％。在5L发酵罐中进行扩大生产，Yher007最终可利用15.2mmol/l的对香豆酸生产3.2mmol/l的高圣草酚，转化率为21.1％。而之前最佳技术可在补加1.0mmol/l阿魏酸的情况下生产0.17mmol/l的高圣草酚，转化率为17.2％。相比之下本发明的利用酵母生产高圣草酚的产量及转化率都较高，为大规模基于发酵生产高圣草酚的方式提供了有前景的工程酵母平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示从阿魏酸出发生产高圣草酚生物合成途径；
图2示从对香豆酸出发生产高圣草酚生物合成途径；
图3示增强前体柚皮素的供应；
图4示增强辅因子SAM的供应；
图5示ROMT-9催化圣草酚转化为高圣草酚；
图6示同源建模结果及可靠对接构象；
图7示ROMT-9假定的催化机理；
图8示一轮突变结果及二轮突变结果(WT：野生型；N135T：Asn135突变为Thr135)；其中，a示一轮突变结果；b示二轮突变结果；
图9示摇瓶发酵产量。
具体实施方式
本发明公开了菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过人工途径构建、途径优化、酶的理性设计及发酵过程优化等策略获得一株能够利用对香豆酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母。
为了打通由对香豆酸到高圣草酚的途径，本发明通过在酿酒酵母CEN.PK2-1D(可在BiobW：https://www.biobw.org/购买，编号为：Bio-110854)中表达来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL、来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS、来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI、来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H和细胞色素P450还原酶ATR1，以及来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9，实现了高圣草酚的合成(图2)。
接下来进行代谢通路的调节，首先通过过表达酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1、敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2来强化PDH途径，从而为高圣草酚的合成提供更多丙二酰辅酶A。其次，为了进一步实现高效生产，本发明对酵母自身消耗对香豆酸的副反应途径进行了敲除。酵母内源基因阿魏酸脱羧酶FDC1会引起酿酒酵母自发使对香豆酸脱掉羧基，酵母内源必需基因烯酰还原酶TSC13会引起对香豆酰辅酶A的还原反应，故对FDC1基因进行敲除，用来源于苹果的ECR基因对TSC13进行同源基因替换。接着，对途径中的限速酶查尔酮合酶CHS进行过表达。为了避免由中间体扩散造成转化率较低的问题，本发明利用通用的酶融合连接体(GGGGS)1(SEQ ID NO:36)将查尔酮合酶CHS与查尔酮异构酶CHI进行了酶融合，并将酶融合后的基因片段的多份拷贝整合至酵母基因组(图3)。然后，针对该生物合成途径中的甲基化过程，本发明进行了辅因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的供应强化。将酵母内源基因同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6、S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1、腺苷激酶ADO1、亚甲基四氢叶酸还原酶MET13，及来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR过表达(图4)。
最后，为提高甲基化反应的效率，本发明尝试提高氧甲基化酶与底物的结合能力。通过理性设计，对3’-O-甲基转移酶ROMT-9进行两轮点突变获得有效突变体ROMT-9N135T /I324M。将ROMT-9N135T/I324M表达盒(PTPI1-ROMT-9N135T/I324M-TCPS1)的多份拷贝整合至酵母基因组，获得最终菌株Yher007。
关于3’-O-甲基转移酶ROMT-9，其已经被证明是一种高特异性的酶，它可以在体外将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到圣草酚，生成高圣草酚(图5)。ROMT-9的体外转化率较低，仅为52.4％，且ROMT-9的体内催化能力尚未得到证实，故难以实现在酿酒酵母体内高效地将圣草酚转化为高圣草酚。
目前已有技术在酿酒酵母体内表达该酶，分离纯化后在体外使用该酶催化圣草酚转化为高圣草酚。虽然效率较低，但目前尚未出现通过酶改造的方式提高该酶效率的技术。不过已经有报道对ROMT-9活性位点进行预测，研究人员将ROMT-9与来源于苜蓿的咖啡酸氧甲基转移酶COMT、来源于拟南芥的氧甲基转移酶AtOMT1、来源于苜蓿的查尔酮氧甲基转移酶ChOMT及来源于苜蓿的异黄酮氧甲基转移酶IOMT进行序列比对，预测出可能的底物结合位点有Met134、ASN135、LEU140、ALA160、HIS170、PHE176、PHE180、MET184、HIS187、VAL321、ILE324、MET325、ASN329。除此之外，Zhu等人针对与ROMT-9序列相似度较高的来源于黄连的3'-羟基-N-甲基十二烷基-4'-O-甲基转移酶HOMT提出了假定的催化机理。以上结果对ROMT-9的理性设计及改造奠定了基础。
本发明涉及的序列信息如下：
4CL序列(SEQ ID NO:1)：
CHS序列(SEQ ID NO:2)：
CHI序列(SEQ ID NO:3)：
F3’H序列(SEQ ID NO:4)：
ATR1序列(SEQ ID NO:5)：
ROMT-9序列(SEQ ID NO:6)：
ROMT-9N135T/I324M序列(SEQ ID NO:7)：
ROMT-9N135T/I324M的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：
CRISPR质粒序列，以靶向delta15位点的质粒为例，下划线加粗部分为gRNA(SEQID NO:9)：
本发明中所述高圣草酚是指一种高价值的甲基化黄酮类化合物。
本发明中所述Linker即连接体，连接两个酶的编码基因。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：将4CL基因整合至酵母基因组delta15位点的方法
主要利用的是CRISPR以及同源重组的技术：
首先构建4CL基因的表达盒：PTPI1-4CL-TCPS1。
启动子PTPI1以酵母基因组为模板，用以下引物进行扩增：
tatatctaggaacccatcaggt(SEQ ID NO:10)；
ttttagtttatgtatgtgttttttgtagt(SEQ ID NO:11)。
4CL基因(擎科生物公司合成)利用引物进行扩增：
aaacacatacataaactaaaaGCatgggtgactgcgttgc(SEQ ID NO:12)；
gactattcaatcattgcgcGCttacttcggcaggtcgcc(SEQ ID NO:13)。
此处4CL的上下引的5’端分别带有与启动子、终止子同源的20bp区域。
终止子TCPS1以酵母基因组为模板，用以下引物进行扩增：
gcgcaatgattgaatagtcaaa(SEQ ID NO:14)；
agaataggtttcgttttctggaa(SEQ ID NO:15)。
将以上三个扩增片段进行overlap PCR，获得4CL的表达盒。接下来以酵母基因组作为模板，扩增同源重组所用的连接体片段。
Linker1-1用引物进行扩增，下引带有与启动子同源的20bp：
cgattcaattttggggattct(SEQ ID NO:16)；
atttgagaaagtggtgtattttaagattatatctaggaacccatcaggt(SEQ ID NO:17)。
Linker2-1用引物进行扩增，上引带有与终止子同源的20bp：
agaataggtttcgttttctggaaatggcaaagactataatattatgcat(SEQ ID NO:18)；
atattttggcattactcttcatcat(SEQ ID NO:19)。
将linker1-1与启动子片段进行overlap PCR，linker2-1与终止子片段进行overlap PCR，分别获得linker1与linker2。接下来在delta15位点上寻找pam序列(NGG)前20bp作为gRNA，本例gRNA为：ATATGTTTGGTTTCGATTGT(SEQ ID NO:20)。接下来将CRISPR-gRNA-Cas9-his质粒与4CL表达盒、linker1、linker2转化至酿酒酵母CEN.PK2-1D内，涂布在酵母基础培养基(SC-his)培养3-4天获得重组酵母菌株。在插入位点上游、基因寻找第一对验证引物，验证接口1长度为1000bp左右。在插入位点下游、基因寻找第二对验证引物，验证接口2长度为1000bp左右。此例第一对验证引物：aggaatgaaacatataaaacgaaagg(SEQ IDNO:21)、atgctttggaatgtaaatgtcc(SEQ ID NO:22)。第二对验证引物：agattctgcgtaaggatctg(SEQ ID NO:23)、ttgaaattgtaatcttaagatgctctt(SEQ ID NO:24)。
来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS的基因、来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的基因、来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因、细胞色素P450还原酶ATR1的基因、来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的基因、ROMT-9N135T/I324M突变体的基因、查尔酮合酶CHS与查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因或来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR的基因整合至酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组的方法同上述将4CL基因整合至酵母基因组delta15位点的方法。
所述融合酶为利用通用的酶融合连接体(GGGGS)1将查尔酮合酶CHS与查尔酮异构酶CHI进行酶融合。
用来源于苹果的ECR基因对TSC13进行同源基因替换的方法同上述将4CL基因整合至酵母基因组delta15位点的方法。
限速酶查尔酮合酶CHS的基因、酵母内源基因同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6的基因、S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1的基因、腺苷激酶ADO1的基因、亚甲基四氢叶酸还原酶MET13的基因、来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR的基因的过表达方法同上述将4CL基因整合至酵母基因组delta15位点的方法。
酿酒酵母CEN.PK2-1D内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1的基因的过表达方法为：将ACC1基因启动子替换为PTEF1，其具体方式同上述将4CL基因整合至酵母基因组delta15位点的方法。
实施例2：敲除FDC1基因的方法
首先以酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组为模板，用引物扩增linker1，其中下引带有linker2的同源序列20bp：
cactttttctgagcattttattacg(SEQ ID NO:25)；
ccgtagaaagtctatggcaagtcaagaatagaataactcagagg(SEQ ID NO:26)。
再用引物：ttgccatagactttctacgga(SEQ ID NO:27)、acatcatcatggtgctttactaa(SEQ ID NO:28)扩增linker2。将以上两个linker进行overlap PCR获得linker。在FDC1基因上寻找gRNA：AATACCATCTCACTCGTTGC(SEQ ID NO:29)。最后将CRISPR-gRNA-Cas9-his质粒、linker转化酿酒酵母CEN.PK2-1D体内，涂布在酵母基础培养基(SC-his)培养3-4天获得敲除掉FDC1的酵母菌株。在linker上下游寻找验证引物，此例验证引物：tgggaaggaataaaaagcaagt(SEQ ID NO:30)、tactctataaatgtaacatcgttaaagca(SEQ ID NO:31)。若基因被敲掉，则验证长度为1000bp以内；反之长度为2500bp。
Linker序列选择标准：基因组整合基因，linker选择在gRNA上下游400bp的片段；敲除基因，linker选择被敲除基因的上下游400bp片段。
酿酒酵母CEN.PK2-1D内源柠檬酸合酶CIT2的基因的敲除方法同上述敲除FDC1基因的方法。
实施例3：ROMT-9的理性设计及改造
首先利用SWISS-MODEL(www.swissmodel.expasy.org/)网站进行同源建模。以来自高粱的咖啡酸O-甲基转移酶(带有SAM配体)为模板，选择ROMT-9与配体SAM的复合体结构(见图6中的a)。接着使用Autodock软件对该复合体与底物圣草酚进行分子对接。在分子对接之前，对ROMT-9与SAM复合体进行了脱水和加氢，对圣草酚进行了加氢和自动电荷分配的预处理。调整对接网格盒坐标，使其包围住所有底物结合位点：MET134、ASN135、LEU140、ALA160、HIS170、PHE176、PHE180、MET184、HIS187、VAL321、ILE324、MET325、ASN329。在对接过程中，ROMT-9与SAM复合体被视为刚性结构，底物圣草酚被视为柔性结构。对接方法为半柔性对接。
为了尽可能揭示酶与底物真实的结合构象，根据HOMT的催化机制对对接结果进行了筛选。由于HOMT与ROMT-9具有高度的序列相似性，因此可结合序列比对结果来推测ROMT-9的催化机理。可以推断圣草酚的氧甲基化反应涉及到ROMT-9的His274和Asp275残基。电子从反应中心的水分子转移到His274的咪唑环，然后转移到Asp275，导致圣草酚的3'-羟基成为富电子基团。最后，SAM的甲基被圣草酚的3'-羟基亲核攻击，形成高圣草酚和s-腺苷同型半胱氨酸(SAH)(图7)。基于以上催化机理及对接结果得分，筛选出三个可靠的构象(图6中的b、c、d)。
根据图6中的b、c、d的可靠构象，选择活性位点Asn135、Ile324和Asn329作为候选突变位点。为了找出使底物和酶结合能力增强的突变体，使用Discovery StudioTM分别对这三个位点进行了虚拟氨基酸饱和突变。在输出结果的Effect栏中，“stabilizing”代表该突变可能使酶与底物结合能力增强，对结果为“stabilizing”的点突变进行实验验证。
突变方法(以将Asn135突变为Ala135为例)：
将ROMT-9的编码基因分为片段A、片段B进行PCR，使用KOD-FX高保真酶。片段A的上引除去扩增片段A的部分，还带有与启动子同源的20bp；下引在较靠近5’端处引入点突变，将Asn的密码子替换为Ala的密码子。B片段上引在较靠近5’端处引入点突变，将Asn的密码子替换为Ala的密码子；下引除去扩增片段B的部分，还带有与终止子同源的20bp。同时要保证A、B片段在引入该突变后，具有20bp左右的同源区域。故当构建PTPI1-ROMT9N135A-TCPS1时，A片段上引序列为：actacaaaaaacacatacataaactaaaaG(SEQ ID NO:32)，下引序列为：GACCTTGTCTTGTGCCATCAAAGCCAATGC(SEQ ID NO:33)；B片段上引序列为：ATTGGCTTTGATGGCACAAGACAAGGTCTTG(SEQ ID NO:34)；下引序列为：tgactattcaatcattgcgcGCTTACTTAGTGAATTCAATAGCCCAAG(SEQ ID NO:35)。然后使用A片段上引、B片段下引将两个片段进行overlap-PCR。将PCR产物与线性化的pRS413-PTPI1-TCPS1进行无缝克隆。获得带有突变体的游离表达盒。将该表达盒转化至生产圣草酚的酵母菌株Yeri001(产量为0.75mmol/l，原始底盘为CEN.PK2-1D，菌株内带有来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL、来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS、来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI、来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H和细胞色素P450还原酶ATR1。该菌株过表达酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1、敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2，敲除了酵母内源阿魏酸脱羧酶FDC1，用来源于苹果的ECR基因对酵母内源必需基因烯酰还原酶TSC13进行同源基因替换，利用通用的酶融合连接体(GGGGS)1(SEQ ID NO:36)将查尔酮合酶CHS与查尔酮异构酶CHI进行了酶融合。)，发酵72h，来测定高圣草酚的产量，与带有pRS413-PTPI1-ROMT9-TCPS1的酵母菌株进行对比，从而确定突变体是否有效。
通过向Yeri001转入pRS413-PTPI1-ROMT9-TCPS1后，发酵72h，获得0.36mmol/l的圣草酚及0.25mmol/l的高圣草酚，可知ROMT-9的体内转化率约为41.2％。首先对Asn135进行第一轮点突变，获得ROMT-9N135T，其转化率为62.6％，比ROMT-9的转化率高出51.9％(见图8中的a和表1)，p<0.01。随后，将突变体ROMT-9N135T作为Ile324突变的模板，进行第二轮点突变，双突变体ROMT-9N135T/I324M的转化率达到77.6％，比ROMT-9高出89.3％(见图8中的b和表2)，p<0.05。最后以ROMT-9N135T/I324M为模板对Asn329点突变进行验证，但未发现有效的突变体。
表1：一轮突变结果
突变体 高圣草酚(mmol/1)-平行1 高圣草酚(mmol/1)-平行2
WT 0.25208 0.25413
N135T 0.38359 0.39274
N135A 0.07757 0.07616
N135M 0.02452 0.02446
N135W 0.02258 0.02324
N135L 0.02171 0.02194
N135Y 0.01928 0.01895
N135R 0.01879 0.01901
N135Q 0.01397 0.01413
N135I 0.00607 0.00638
N135F 0 0
N135K 0 0
N135H 0 0
表2：二轮突变结果
突变体 高圣草酚(mmol/1)-平行1 高圣草酚(mmol/1)-平行2
N135T 0.43998 0.42045
N135T/I324M 0.56787 0.57105
N135T/I324L 0.33015 0.32793
N135T/I324V 0.15737 0.16356
N135T/I324C 0.07083 0.0718
N135T/I324H 0.06803 0.06592
N135T/I324A 0.05655 0.05876
N135T/I324Q 0.05447 0.05443
N135T/I324F 0.02993 0.03063
N135T/I324S 0.01829 0.01817
N135T/I324G 0.01357 0.01351
N135T/I324T 0 0
N135T/I324R 0 0
N135T/I324K 0 0
本实施例中，首先测定在酿酒酵母体内野生型ROMT-9的转化率，接着按照Asn135、Ile324和Asn329的顺序依次验证。在获得N135T突变体后，以该突变体作为Ile324突变的模板；在获得N135T/I324M突变体后，以该突变体为模板进行Asn329的突变验证。验证方法是将突变体的表达盒PTPI1-ROMT9mut-TCPS1构建在通用质粒上，在产圣草酚的酵母菌株Yeri001中进行游离表达，测定菌株发酵后高圣草酚的产量及圣草酚的残留量，计算转化率。最终获得的有效的突变体是ROMT-9N135T/I324M。相比于先前在重组大肠杆菌中表达甲基转移酶来从圣草酚生产高圣草酚的技术，本发明结合了酶的理性设计提高了酶的转化率，即使在该酶表达盒的拷贝数较低(1～2份)时，也能实现较高转化率(77.6％)。
效果例
在按照如实施例1、2所述的方法完成菌株优化及酶改造后，获得最终菌株Yher007，并对最终菌株Yher007进行生产水平的评估。首先进行摇瓶发酵，培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基YPD。发酵条件：初始OD600＝0.1，在0h补加1.52mmol/l的对香豆酸，30℃，220rpm摇床中培养72h。产量如图9(对应数据见表3)，Yzsy003为含有基础途径4CL、CHS、CHI、F3’H、ATR1、ROMT-9的菌株，高圣草酚产量为0.017mmol/l，圣草酚为0.069mmol/l。Yher007为经过以上优化后的菌株，高圣草酚产量为1.005mmol/l。二者高圣草酚产量利用student t检验，单尾分布，双样本异方差假设，p＝0.008。转化率为65.8％。
接着在5L发酵罐中进行扩大生产。将Yher007菌落接种到5ml的酵母基础培养基(缺少尿嘧啶、亮氨酸)SC-URA-LEU中，并在30℃，220rpm培养18小时。接下来，以1％(v/v)的接种量将一级种子接种到50ml的SC-URA-LEU培养基中，并在30℃，220rpm培养。当OD600达到6时，以1％(v/v)的接种量将二级种子转接到含有2.5LYPD培养基的5L发酵罐中。发酵温度为30℃，空气流量为3.0vvm，pH控制在5.5。当培养基中20g/l的葡萄糖耗尽，以18ml/h的速度加入600g/l葡萄糖母液。在发酵12h、24h、36h和48h加入100ml浓缩酵母提取物溶液(100g/l)。当OD600达到15，每12h加入一次50ml对香豆酸溶液(25g/l)，共加5次。最终可利用15.2mmol/l的对香豆酸生产3.2mmol/l的高圣草酚，转化率为21.1％。
之前最佳技术可在补加1.0mmol/l阿魏酸的情况下生产0.17mmol/l的高圣草酚，转化率为17.2％。该产量距离大规模生产距离较大。相比之下本发明的优点在于利用酵母生产高圣草酚的产量及转化率都较高，为大规模基于发酵生产高圣草酚的方式提供了有前景的工程酵母平台。
表3
菌株 圣草酚-1 圣草酚-2 高圣草酚-1 高圣草酚-2
Yzsy003 0.070 0.068 0.0145 0.0185
Yher007 0 0 0.98 1.03
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.基因工程改造在如下项中的应用：
(I)、使酵母获得生产高圣草酚的能力；和/或
(II)、提高酵母生产高圣草酚的产量和/或转化率；
所述酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1D；
所述生产的底物包括对香豆酸；
所述基因工程改造包括：
添加来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因；和
添加来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因；和
添加来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因；和
添加来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的突变体ROMT-9N135T/I324M的基因；和
过表达酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1的基因；和
敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2的基因；和
敲除酵母内源的阿魏酸脱羧酶FDC1的基因；和
取来源于苹果的ECR基因替换酵母内源的TSC13的基因；和
过表达查尔酮合酶CHS的基因；和
添加来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因；和
过表达酵母内源同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6；和
过表达酵母内源S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1；和
过表达酵母内源腺苷激酶ADO1；和
过表达酵母内源亚甲基四氢叶酸还原酶MET13；和
过表达来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR。
2.基因元件，其特征在于，包括基因元件1、基因元件2、基因元件3、基因元件4、基因元件5、基因元件6、基因元件7、基因元件8、基因元件9、基因元件10、基因元件11和基因元件12；
所述基因元件1具有来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因；
所述基因元件2具有来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因；
所述基因元件3具有来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因；
所述基因元件4具有强启动子PTEF1；
所述基因元件5具有来源于苹果的ECR基因；
所述基因元件6具有来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因；
所述基因元件7具有酵母内源同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6的基因；
所述基因元件8具有酵母内源S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1的基因；
所述基因元件9具有酵母内源腺苷激酶ADO1的基因；
所述基因元件10具有酵母内源亚甲基四氢叶酸还原酶MET13的基因；
所述基因元件11具有来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR的基因；
所述基因元件12具有来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9突变体ROMT-9N135T /I324M的基因。
3.表达盒，其特征在于，包括表达盒1、表达盒2、表达盒3、表达盒4、表达盒5、表达盒6、表达盒7、表达盒8、表达盒9、表达盒10和表达盒11；
所述表达盒1具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件1；
所述表达盒2具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件2；
所述表达盒3具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件3；
所述表达盒4具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件5；
所述表达盒5具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件6；
所述表达盒6具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件7；
所述表达盒7具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件8；
所述表达盒8具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件9；
所述表达盒9具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件10；
所述表达盒10具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件11；
所述表达盒11具有启动子、终止子以及如权利要求1所述的基因元件中的所述基因元件12；
所述启动子包括PTPI1、PTEF1或PGPM1；
所述终止子包括TCPS1、TTEF2或TADH1。
4.表达系统，其特征在于，包括表达载体、Linker和如下任一项：
(a)、如权利要求2所述的基因元件；或
(b)、如权利要求3所述的表达盒；或
(c)、如权利要求3所述的表达盒和强启动子PTEF1；
所述表达载体包括Cas9编码基因、绿色荧光蛋白编码基因、His3编码基因、卡那霉素编码基因和gRNA。
5.如权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述表达载体还包括表达载体1、表达载体2、表达载体3或表达载体4中的一种或多种；
所述表达载体1为用于敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2基因的载体；
所述表达载体2为用于敲除酵母内源阿魏酸脱羧酶FDC1基因的载体；
所述表达载体3为用于敲除酵母内源烯酰还原酶TSC13的基因的载体；
所述表达载体4具有：
(i)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或
(ii)、如(i)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(i)的相同或相似；或
(iii)、与如(i)或(ii)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
所述多个为2个至1000个。
6.宿主细胞，其特征在于，包括：
(a)、如权利要求2所述的基因元件；或
(b)、如权利要求3所述的表达盒；或
(c)、如权利要求4或5所述的表达系统；
所述宿主细胞包括酵母；
所述酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1D。
7.酿酒酵母CEN.PK2-1D的重组菌株，其特征在于，包括：
添加来源于欧芹的4-对香豆酰辅酶A连接酶4CL的基因；和
添加来源于拟南芥的类黄酮3’-单加氧酶F3’H的基因；和
添加来源于拟南芥的细胞色素P450还原酶ATR1的基因；和
添加来源于日本水稻的3’-O-甲基转移酶ROMT-9的突变体ROMT-9N135T/I324M的基因；和
过表达酵母内源的乙酰辅酶A羧化酶ACC1的基因；和
敲除酵母内源的柠檬酸合酶CIT2的基因；和
敲除酵母内源的阿魏酸脱羧酶FDC1的基因；和
取来源于苹果的ECR基因替换酵母内源的TSC13的基因；和
过表达查尔酮合酶CHS的基因；和
添加来源于矮牵牛的查尔酮合酶CHS与来源于苜蓿的查尔酮异构酶CHI的融合酶的基因；和
过表达酵母内源同型半胱氨酸S-甲基转移酶MET6；和
过表达酵母内源S-腺苷-l-半胱氨酸水解酶SAH1；和
过表达酵母内源腺苷激酶ADO1；和
过表达酵母内源亚甲基四氢叶酸还原酶MET13；和
过表达来源于拟南芥的亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR。
8.组合物，其特征在于，包括对香豆酸和如下任意项：
(I)、如权利要求2所述的基因元件；
(II)、如权利要求3所述的表达盒；
(III)、如权利要求4或5所述的表达系统；
(IV)、如权利要求6所述的宿主细胞；
(V)、如权利要求7所述的重组菌株。
9.如下任意项在制备高圣草酚中的应用：
(I)、如权利要求2所述的基因元件；
(II)、如权利要求3所述的表达盒；
(III)、如权利要求4或5所述的表达系统；
(IV)、如权利要求6所述的宿主细胞；
(V)、如权利要求7所述的重组菌株；
(VI)、如权利要求8所述的组合物。
10.高圣草酚的制备方法，其特征在于，包括：
(A)、将如权利要求2所述的基因元件整合至酵母的基因组，然后与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(B)、取如权利要求3所述的表达盒整合至酵母，然后与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(C)、取如权利要求4或5所述的表达系统转化酵母，然后与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(D)、取如权利要求6所述的宿主细胞与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(E)、取如权利要求7所述的重组菌株与对香豆酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或
(F)、培养如权利要求8所述的组合物，获得所述高圣草酚；
所述酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1D。
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