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CN116694691A - 一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法 - Google Patents

一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法 Download PDF

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CN116694691A
CN116694691A CN202310938528.2A CN202310938528A CN116694691A CN 116694691 A CN116694691 A CN 116694691A CN 202310938528 A CN202310938528 A CN 202310938528A CN 116694691 A CN116694691 A CN 116694691A
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ginger straw
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CN202310938528.2A
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刘光鹏
张一鸣
赵岩
姚旖旎
初乐
葛邦国
马艳蕊
李学震
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Original Assignee
JINAN INST OF FRUIT PRODUCTS CHINA GENERAL SUPPLY AND MARKETING COOPERATIVE
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Abstract

本发明属于生姜秸秆废弃物综合利用技术领域，具体涉及一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法。本发明中生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，包括以下步骤：（1）生姜秸秆预处理；（2）纤维素酶对预处理后的生姜秸秆进行预糖化，获得还原糖；（3）向（2）中糖化的物料中加入酵母菌，半糖化发酵获得乙醇。本发明中，采用稀硫酸对生姜秸秆进行预处理，有利于提高纤维素酶对生姜秸秆的糖化效果，此外，本发明中酵母菌采用YPD培养基和含有生姜秸秆糖化液的培养基进行培养，提高了酵母菌对于生姜秸秆中存在的天然抑菌类成分的耐受性，进而更好地利用生姜秸秆糖化后产生的葡萄糖、木糖等还原糖并发酵生成乙醇，提高了生姜秸秆的生物利用率。

Description

一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法
技术领域
本发明属于生姜秸秆废弃物综合利用技术领域，具体涉及一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法。
背景技术
生姜秸秆处理难度大的最主要原因是：生姜秸秆中的成分与生姜的根茎很相似，含有大量的挥发油、姜辣素、姜酚、姜醇、姜黄素等生物活性成分，一方面，这些成分较辛辣，使得生姜秸秆难以被用作饲料来饲喂家畜；另一方面，这些活性成分中大多具有一定的抑菌性，是良好的天然抑菌剂，普通的微生物对其并不具有耐受性，因而生姜秸秆难以被降解，若是直接还田容易造成姜瘟。
现阶段，对于生姜秸秆的利用大多是采用化学的方法将生姜秸秆中的活性成分提取出来，以提高生姜秸秆的利用率，但是化学方法提取处活性成分后，生姜秸秆的固体残渣依旧没有良好的处理方式，最终以固体废弃物的形式而丢弃，造成资源的浪费以及环境的污染。
生姜秸秆是作物秸秆的一种，传统的玉米、小麦、高粱等秸秆无疑是生物质燃料的良好原料，但是由于生姜秸秆中成分的特殊性，目前并无直接将生姜秸秆进行转化来生产生物质能源的相关研究。
发明内容
为了解决以上的技术问题，本发明提供了一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法。
本发明所提供的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，主要包括以下的步骤：
(1)生姜秸秆的预处理：生姜秸秆分段、破碎、稀酸处理；
(2)采用纤维素酶对(1)中经预处理后的生姜秸秆进行预糖化，获得还原糖；
(3)向(2)中糖化后的物料中加入酵母菌，发酵制备乙醇。
上述的步骤中，(1)中所述的稀酸为稀硫酸、稀醋酸中的任一种。
优选的，(1)中所述的稀酸为稀硫酸。
进一步的，(1)中所述的稀酸，其质量分数为0.3～0.5％，稀酸处理的温度为120～130℃，生姜秸秆与稀酸的质量体积之比为1g：5～10mL。
优选的，(1)中所述的稀酸，其质量分数为0.5％，稀酸处理的温度为121℃，生姜秸秆与稀酸的质量体积之比为1g：5mL。
进一步的，(1)中所述的生姜秸秆预处理，具体操作如下：
取生姜秸秆，分段、破碎成1～3cm的小块，将粉碎后的生姜秸秆小块置于高温高压蒸煮锅中，同时向其中加入0.3～0.5％的稀硫酸，生姜秸秆与稀硫酸的质量体积比为1g：5～10mL，然后于120～130℃条件下处理1～2h，过滤，收集预处理后的生姜秸秆固体残留物，用自来水冲洗至中性，烘干，然后于常温条件下保存备用。
上述的步骤(2)中，所述的糖化温度为40～50℃，反应的pH为4.0～5.0，糖化的过程中搅拌，搅拌的转速为160～200rpm，糖化8～15h。
优选的，(2)中所述的糖化温度为48℃，反应的pH为4.8，糖化的过程中搅拌，搅拌的转速为180rpm，糖化12h。
优选的，(2)中所采用的纤维素酶为商用纤维素酶Cellic CTec2，该酶制剂由诺维信提供，滤纸酶的活性为180FPU/g。
上述的步骤(3)中，以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD培养基)和含有(2)中生姜秸秆糖化液的培养基对酵母菌进行培养，其中酵母浸出粉胨葡萄糖培养基包括2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母粉。
步骤(3)中，酵母菌的接种量为3～6％，发酵的温度为25～35℃，pH为4.0～5.0，发酵时间为60～84h。
优选的，步骤(3)中，酵母菌的接种量为6％，发酵的温度为30℃，pH为4.8，发酵时间为72h。
本发明的有益效果在于：
一方面，本发明开发了生姜秸秆的一种新的应用途径，即将生姜秸秆发酵生产制备生物质燃料乙醇，特别是本发明中酵母菌采用YPD培养基与含有生姜秸秆糖化液的培养基进行培养，使得酵母菌对生姜秸秆水解液中存在的糠醛、羟甲基糠醛、甲酸、乙酸等天然抑菌性活性成分的耐受性得到了提升，使其在发酵过程中能够承受生姜发酵液中的不利成分的抑制作用，成功实现了将生姜秸秆中纤维素糖化后获得的还原性糖到乙醇的转化，最终葡萄糖的乙醇转化率高达90.31％，乙醇浓度13.95g/L。
另一方面，本发明中采用稀硫酸对生姜进行预处理，通过稀硫酸对半纤维素的水解，并进一步破坏生姜秸秆中的部分木质素结构，脱除木质素，更有利于生姜秸秆半糖化发酵的进行，此外，本发明中采用半糖化发酵的工艺还能够避免高浓度糖对酶解过程的抑制，同时在反应初期还可以获得高的酶解反应速率。
附图说明
图1为本发明的实施例1中采用YPD培养基和生姜秸秆糖化液培养基培养获得的酵母菌对稀硫酸预处理后的生姜秸秆进行发酵后的样品HPLC图；
图2为本发明的对比例1中采用YPD培养基培养获得的酵母对蒸汽爆破预处理后的生姜秸秆进行发酵后的样品HPLC图；
图3为本发明的对比例2中不同纤维素酶剂量下蒸汽爆破预处理后的生姜秸秆发酵过程中葡萄糖的转化率；
图4为本发明的对比例3中稀酸预处理和汽爆预处理姜秸秆发酵液中残糖浓度的变化情况；
图5为本发明的对比例3中稀酸预处理和汽爆预处理姜秸秆发酵液中乙醇生成量的变化情况；
图6为本发明的对比例4中不同预处理分批补料半同步糖化发酵过程中各成分的变化情况，其中，(a)图为发酵过程中残余葡萄糖的含量变化情况，(b)图为发酵过程中乙醇的转化率变化情况，(c)图为发酵过程中残余木糖含量变化情况。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
本发明中的生姜秸秆原料均取自山东潍坊。
商用纤维素酶Cellic CTec2由诺维信提供，滤纸酶活性为180FPU/g。
本发明中所采用的酵母菌为市售的普通酵母菌。
实施例1
(1)生姜秸秆预处理：取生姜秸秆，分段、破碎成1～3cm的小块，将粉碎后的生姜秸秆小块置于高温高压蒸煮锅中，同时向其中加入0.5％的稀硫酸，生姜秸秆与稀硫酸的质量体积比为1g：5mL，然后于125℃条件下处理1.5h，过滤并收集预处理后的生姜秸秆固体残留物，用自来水冲洗至中性，40℃烘干，于常温条件下保存备用；
(2)将(1)中经稀硫酸预处理后的生姜秸秆固体残留物、商业纤维素酶CellicCTec2、醋酸钠缓冲液(0.2M、pH为4.8)，加入三角瓶中，于48℃，150rpm的条件下酶解糖化12h，其中，初始固形物浓度为10％，纤维素酶用量为40FPU/g底物[干物质(DM)]；
(3)选用YPD培养基和含有姜秸秆糖化液的培养基对酵母菌进行培养，进一步提高酵母对姜秸秆抑制物的耐受性，2天后观察到酵母大量繁殖，证明酵母菌能够在姜秸秆糖化液中正常生长。
然后向糖化12h之后的物料中接种该酵母菌，于30℃，200rpm的条件下进行发酵。
在不同的时间间隔下，取0.5mL样品处理后采用HPX-87H柱(日本京都岛津)高效液相色谱(HPLC)测定乙醇、葡萄糖、木糖等成分的含量，如下表1以及附图1所示。
表1不同发酵时间下的葡萄糖的浓度与乙醇浓度
可以看出，采用YPD培养基+生姜秸秆糖化液培养基培养获得的酵母菌能够利用生姜糖化后产生的葡萄糖，并发酵生成乙醇，实现了生姜秸秆发酵制备成生物质燃料乙醇的成功转化。
对比例1
(1)生姜秸秆预处理：取生姜秸秆，分段、破碎成1～3cm的小块，采用蒸汽爆破的方式来替代稀硫酸对生姜秸秆进行预处理，蒸汽爆破预处理条件为：反应压力1.5MPa，反应温度为180℃。
(2)同实施例1；
(3)向糖化12h之后的物料中接种酵母菌，于30℃，200rpm的条件下进行发酵。
本对比例中的酵母菌仅采用YPD培养基进行培养。
取发酵产物0.5mL，经处理后采用高效液相色谱测定产物样品中乙醇、葡萄糖、木糖等各成分的含量，如附图2所示。
附图2中的高效液相色谱图中显示，该发酵液中并无乙醇产生，推测产生这一现象的主要原因是：纤维素酶水解底物产生的糖并没有被酵母菌利用，可能是生姜秸秆的水解液中存在着糠醛、羟甲基糠醛、甲酸、乙酸等抑制物，这些物质会对酵母菌产生强烈的抑制作用，而对比例1中使用的酵母菌在培养时并未以生姜秸秆糖化液为糖源，其对这些抑制物的耐受性较差，无法正常利用生姜秸秆水解产生的还原糖。
试验例1
分别对本发明的实施例1以及对比例1，采用不同预处理方式对生姜秸秆进行处理，经纤维素酶糖化后，物料中各种主要成分的含量情况，如表2所示。
表2预处理前后生姜秸秆物料中化学成分比较
物料 纤维素(％) 木聚糖(％) 阿拉伯聚糖(％) 总木质素(％) 抽出物(％)
姜秸秆原料 32.70 7.76 4.11 9.38 9.65
汽爆处理秸秆 35.10 10.21 4.31 13.08 8.58
稀硫酸处理 34.06 10.46 4.44 10.12 7.87
从上表2中可以直观地看出：无论是采用蒸汽爆破，还是采用稀硫酸对生姜秸秆进行预处理，原料中的纤维素、木聚糖含量均有所增加，但是稀硫酸预处理的木质素含量变化不大，汽爆预处理的生姜秸秆中木质素含量相对升高，且较为明显，可能是汽爆处理过程中糖类物质损失较多，但并不能脱除木质素，导致木质素含量相对提高。
由于木质素含量较高会阻碍纤维素酶对细胞壁中纤维素的水解，并且对纤维素酶产生非生产性吸附作用，降低水解效率，因此由于蒸汽爆破的预处理方式并不能显著降低木质素的含量，反而因为某些原因造成木质素含量的显著升高，因而不利于后期的纤维素酶作用的发挥。
而稀硫酸预处理生姜秸秆之后，由于稀硫酸能够水解半纤维素生成单糖和寡糖，破坏部分木质素结构，部分脱除木质素，因而相较于蒸汽爆破处理而言，稀酸预处理更有利于生姜秸秆半糖化发酵的进行。
对比例2
探究纤维素酶的用量对汽爆预处理生姜秸秆发酵能力的影响。
(1)分别准备不进行任何预处理的生姜秸秆原料，以及经汽爆预处理的生姜秸秆原料备用；
(2)向不进行任何预处理的生姜秸秆原料中添加商用纤维素酶35FPU/g底物；
同时，向汽爆处理后的生姜秸秆原料中添加商用纤维素酶35FPU/g底物、40FPU/g底物、45FPU/g底物；
(3)分别于相同的条件下接种6％的酵母菌(经YPD培养基+生姜秸秆糖化液培养基培养)进行半同步糖化发酵，设置初始底物浓度10％，在12h时补料5％。
不同纤维素酶剂量下生姜秸秆发酵过程中，葡萄糖的转化率情况如下表3所示。
表3不同纤维素酶剂量下生姜秸秆发酵过程中葡萄糖的转化率
上表中显示：经蒸汽爆破后的原料，发酵开始时，随着纤维素酶用量的提高，底物中葡萄糖的转化率也显著提高，这无疑说明生姜秸秆在此条件下能够正常糖化。
补料后，葡萄糖浓度并未继续提高，且经检测发现发酵液中并无乙醇产生，推测产生这一现象的主要原因是：纤维素酶水解底物产生的糖并没有被酵母菌利用，因此发酵液中积累了高浓度的葡萄糖，对纤维素酶活性产生了抑制作用，使其无法继续水解底物。
但是，经汽爆预处理的姜秸秆比未预处理姜秸秆转化率明显提高，可能是由于蒸汽爆破降低了纤维素的结晶度，破坏了木质素和半纤维素结合层，使得原料的比表面积增加，打破了纤维的结构，提高了纤维素酶的可及性，并且汽爆秸秆在纤维素酶添加45FPU/g时葡萄糖转化率最快，40FPU/g次之，但经72h发酵后，45FPU/g和40FPU/g转化率相近，综合葡萄糖转化率和成本考虑，选择纤维素酶添加量为40FPU/g。
对比例3
探究实施例1中培养的酵母菌对汽爆预处理生姜秸秆的发酵能力。
(1)生姜秸秆预处理：取生姜秸秆，分段、破碎成1～3cm的小块，采用蒸汽爆破的方式来替代稀硫酸对生姜秸秆进行预处理，蒸汽爆破预处理条件为：反应压力1.5MPa，反应温度为180℃。
(2)～(3)均同实施例1。
选择3％固形物含量进行糖化发酵，酶用量为40FPU/g底物，12h时接种酵母菌，发酵过程中对发酵液成分进行检测，不同发酵时间下的葡萄糖浓度与乙醇浓度如下表4所示。
表4不同发酵时间下的葡萄糖浓度与乙醇浓度
由上表中的数据可以发现，本发明中所采用的对生姜秸秆糖化液具有高耐受性的酵母菌可以利用经蒸汽爆破预处理后的生姜秸秆纤维素水解产生的葡萄糖进行发酵生成乙醇。
为了更清晰更直观地比较本对比例与实施例1中葡萄糖浓度、乙醇生成量之间的关系，现根据表4以及表1的数据分被绘制成曲线图，如附图4、附图5所示。
图4为稀硫酸预处理和汽爆预处理姜秸秆发酵液中残糖浓度的变化情况；图5为稀硫酸预处理和汽爆预处理姜秸秆发酵液中乙醇生成量变化情况。
对比于实施例1中的数据，并结合附图3～4进行理解，稀硫酸预处理生姜秸秆的乙醇生成量高于汽爆预处理，这可能是因为汽爆预处理的生姜秸秆中木质素的含量较高，而较高的木质素含量会物理性阻碍纤维素酶对纤维素的水解，并且对纤维素酶产生非生产性吸附作用，进而降低水解效率，因而经汽爆处理的生姜秸秆，其糖化过程中的葡萄糖浓度较低，发酵时产生的乙醇的含量也远不如经稀硫酸处理过的生姜秸秆的乙醇含量高。
对比例4
不同预处理条件下，分批补料半同步糖化发酵与中途不补料的工艺生产纤维素乙醇情况的比较。
在工业生产中，从蒸馏的成本角度考虑，一般要求乙醇可蒸馏的最低浓度为40g/L，要达到此标准，必须提高糖化发酵过程中的底物浓度，以获得高的可发酵糖浓度，但是，一方面，高固形物浓度下进行酶解发酵，意味着预处理过程中生产的对酶解和发酵过程具有抑制作用的物质含量也在增加，从而对糖化发酵过程产生更强的抑制，严重时甚至导致发酵完全不能进行；另一方面，反应体系中底物浓度增加也会导致传质困难，从而降低酶解发酵过程的效率，降低纤维素乙醇的转化率，而采用分批补料的方式则可以较好地解决上述问题。
因此，本对比例对发酵过程中的补料方式进行进一步的优化与验证。
设置初始固含量10％时，稀硫酸预处理秸秆体系不呈流动态，因此稀硫酸预处理的初始固形物含量设置为8％；汽爆预处理初始固含量设置为10％。
实验组一，不分批补料：分别设置固形物含量8％、5％的生姜秸秆为底物，经过稀硫酸、汽爆的不同预处理方式处理后进行发酵，其余操作同实施例1；
实验组二，分批补料：分别设置固形物含量8％、5％的生姜秸秆为底物，经过稀硫酸、汽爆的不同预处理方式处理后进行发酵，发酵12h后进行补料，固形物含量8％时，二次补料4％；固形物含量5％时，二次补料5％；固形物含量10％时，二次补料5％；其余操作同实施例1；
发酵过程中不同预处理条件下，不补料与分批补料半同步糖化发酵时残余葡萄糖含量、乙醇转化率、残余木糖含量情况如下表5以及附图5中的(a)～(c)所示。
表5不同预处理条件下发酵过程中各成分含量及转化率
上表中显示：各工艺发酵12h时，汽爆预处理生姜秸秆的液化效果好于稀酸预处理，可能是因为蒸汽爆破打破了外部纤维结构，降低了纤维素结晶度，破坏了木质素和半纤维素结合层，增加了原料的比表面积，导致液化效果较好。
发酵12h时，稀硫酸处理生姜秸秆的葡萄糖、木糖生成量均高于汽爆预处理，在发酵24h前，主要消耗底物中的葡萄糖进行转化，木糖转化为辅，24h时各工艺葡萄糖转化基本完全，24h后以底物中木糖转化为主，稀酸预处理8％底物浓度的乙醇转化率最高，发酵72h结束时，乙醇转化率可达90.31％，乙醇浓度达13.95g/L。这可能是由于稀硫酸可以水解半纤维素生成单糖和寡糖，同时破坏部分木质素结构，脱除部分木质素，另外，破坏了纤维素晶体结构，使聚合度降低，导致了更高的酶解转化率和乙醇转化率。
无论是稀酸预处理还是蒸汽爆破预处理，在发酵12h时，底物均有部分固形物未完全液化，分别进行补料，继续发酵后，发现仍不能完全液化，但是补料比未补料的样品乙醇生成量明显升高，这可能是因为选用的商业纤维素酶Cellic CTec2中的酶组分不完全适合生姜秸秆样品，生姜秸秆中仍有部分半纤维素未被水解，从而阻碍了内部纤维素的水解。
根据图6的(a)、(c)图可知，接种该特定酵母菌后，葡萄糖的浓度迅速降低，说明葡萄糖能较快被利用，而木糖含量在12h后才开始逐渐降低，意味着酵母菌在葡萄糖利用完毕后才开始利用木糖，且木糖的利用速率较低。
(c)图，发酵液中木糖浓度的变化可见，发现随着发酵时间的延长，木糖浓度缓慢下降，由此可知，该酵母菌的耐受性强，能够利用木糖产生乙醇，相较于仅采用YPD培养基培养的酵母菌完全不能利用木糖的特点，这也是该酵母菌的一大优势。
以上的实验数据表明，对生姜秸秆进行稀酸预处理和蒸汽爆破预处理均能够提高原料的纤维素含量，利于下一步的纤维素酶解过程，但是汽爆预处理秸秆的木质素含量较高，物理性阻碍了纤维素酶与内部纤维的接触，同时对酶产生非生产性的吸附作用，导致酶解效率降低，此外，生姜秸秆水解液中的抑制物会对酵母菌产生抑制作用，导致酵母菌无法利用还原性糖产生乙醇，而经过特殊培养基培养的酵母菌对生姜秸秆糖化液具有高耐受性，其能够高效利用姜秸秆水解产生的葡萄糖、木糖等还原糖发酵生产纤维素乙醇。

Claims (7)

1.一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）生姜秸秆预处理：生姜秸秆分段、破碎、稀酸处理；
（2）采用纤维素酶对（1）中经预处理后的生姜秸秆进行预糖化，获得还原糖；
（3）向（2）中糖化后的物料中加入酵母菌，发酵制备乙醇。
2.如权利要求1所述的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，（1）中所述的稀酸为稀硫酸、稀醋酸中的任一种。
3.如权利要求1所述的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，（1）中所述的稀酸，其质量分数为0.3~0.5%，稀酸处理的温度为120~130℃，生姜秸秆与稀酸的质量体积之比为1 g：5~10 mL。
4.如权利要求1所述的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，（1）中所述的生姜秸秆预处理，具体操作如下：
取生姜秸秆，分段、破碎成1~3 cm的小块，将粉碎后的生姜秸秆小块置于高温高压蒸煮锅中，同时向其中加入0.3~0.5%的稀硫酸，生姜秸秆与稀硫酸的质量体积比为1 g：5~10mL，然后于120~130℃条件下处理1~2 h，过滤，收集预处理后的生姜秸秆固体残留物，用自来水冲洗至中性，烘干，然后于常温条件下保存备用。
5.如权利要求1所述的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，（2）中所述的糖化温度为40~50℃，反应的pH为4.0~5.0，糖化的过程中搅拌，搅拌的转速为160~200 rpm，糖化8~15 h。
6.如权利要求1所述的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，（3）中，以酵母浸出粉胨葡萄糖培养基和含有（2）中生姜秸秆糖化液的培养基对酵母菌进行培养，其中酵母浸出粉胨葡萄糖培养基包括2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。
7.如权利要求1所述的一种生姜秸秆半糖化发酵制备乙醇的方法，其特征在于，（3）中，酵母菌的接种量为3~6%，发酵的温度为25~35℃，pH为4.0~5.0，发酵时间为60~84 h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117297114A (zh) * 2023-10-25 2023-12-29 河北农业大学 一种生姜秸秆可溶性膳食纤维改性方法及应用

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