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CN116694661B - 一种调控植物萌发速率的ShN/AINV5-4D基因及其应用 - Google Patents

一种调控植物萌发速率的ShN/AINV5-4D基因及其应用

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CN116694661B
CN116694661B CN202310521837.XA CN202310521837A CN116694661B CN 116694661 B CN116694661 B CN 116694661B CN 202310521837 A CN202310521837 A CN 202310521837A CN 116694661 B CN116694661 B CN 116694661B
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germination
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张南南
赖瑞强
方俊腾
樊丽娜
薛晓明
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Zhongkai University of Agriculture and Engineering
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Guangdong Provincial Laboratory Of Lingnan Modern Agricultural Science And Technology
Zhongkai University of Agriculture and Engineering
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Abstract

本发明公开了一种调控植物萌发速率的ShN/AINV5‑4D基因及其应用。所述ShN/AINV5‑4D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明前期通过拟南芥突变体筛选得到一个种子延迟萌发的突变体Atinve，利用农杆菌GV3101将基因ShN/AINV5‑4D通过遗传转化转入拟南芥突变体Atinve中进行基因功能验证，得到回补株系#1、#8、#16这3个株系，通过种子萌发试验发现，ShN/AINV5‑4D能够促进种子萌发，提高种子的萌发速率。

Description

一种调控植物萌发速率的ShN/AINV5-4D基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控植物萌发速率的ShN/AINV5-4D基因及其应用。
背景技术
种子是裸子植物和被子植物的特殊繁殖体。种子萌发是种子植物生命周期中的重要发育事件，它意味着植物开始了新的生命周期，决定了植物何时进入自然或农业生态系统。在自然条件下，为抵御不良生长环境，种子会通过改变自身代谢水平调控休眠过程，在合适的时间以及环境条件下启动种子萌发这一生理过程。种子的早萌和胎萌对植物后期结实的产量及质量有很大影响。因此，种子萌发与作物收成及作物经济效益关系十分密切，对农业生产有着重要意义。
种子萌发根据吸水过程主要可分为3个阶段，包括吸水期、滞缓期和重新吸水期。种子萌发过程中涉及多种生物学变化，包括DNA修复，线粒体合成，mRNA合成，蛋白合成、降解以及翻译后修饰等。有研究表明，拟南芥中AtINV基因的表达与花器官、种子的生长发育有关；拟南芥细胞壁转化酶活性增加会加速开花，使种子产量增加近30％。抑制烟草中的N/AINV基因表达会导致花粉发育受阻，并导致雄性不育。在番茄中抑制INVINH1可以提高INV的活性，延缓叶片衰老并提高种子和果实产量。
发明内容
本发明的目的在于深入探讨ShN/AINV5-4D基因在种子萌发中的基因功能，以期对采用现代生物技术培育高效种子萌发速率的品种具有重要的指导意义。
本发明提供了一种调控植物萌发速率的ShN/AINV5-4D基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：
ATGGGAATCGCGGAGGTGGCTCTCCACACCATGCCGGGGGCGCTCACCACCCACTCCCCGGCATCC
ATTCTGTCCCTCAGGGCAGTCGCTAGGAGGAGGAACAGGAACACCAATGCGGTGCCCAACGTCAG
GGCACTGCAAGGCCTCCTAAGGATCCCGAGGCTGAGGTCCGTCAGGCGGCTGTGCCAGCGGATCG
ATGACCTTGCGAGGGTCACAGAGGGGAACGGGACTTGGGTCAAGGATGCCATGAATAGCGCCGGC
CAGGTTCTTGGCGACGTCAGCGTGCCTGGTCAGGCTGTAGGTGGCAATGGTGGTCTAAATGGGAGT
GCTGCCAAGCCTCCACCTCAAAGGCGGAAGTCCTCATCGGTTGAGGATGAGGCCTGGGAACTTCTG
CAAGAGTCAATGGTTTACTATTGTGGTAGTCCTGTTGGGACCATTGCAGCCAACGATCCAAATGACA
GTGACCCGGTGAACTACGATCAGGTGTTTATTCGGGACTTCATACCATCCGGCATTGCTTTTCTACTG
AAGGGGGAATATGAAATTGTGCGTAATTTCATTCTACACACCCTTCAGCTTCAGAGCTGGGAGAAG
ACAATGGACTGCCATAGTCCAGGTCAAGGTTTAATGCCCGCCAGCTTCAAAGTGCGGACAATTCCG
CTTGATGGTGATGAGGATGCAACTGAGGAAGTCTTGGATCCTGATTTTGGGGAGGCCGCAATAGGC
CGCGTGGCACCTGTTGATTCAGGTCTATGGTGGATCATATTGCTTAGGGCATATGGAAAATGTTCAGG
GGATCTGTCAGTACAGGAGAGAATTGATGTCCAGACTGGAATGAAAATGATTCTGAAGCTTTGTTTA
GCTGATGGTTTCGACATGTTCCCTACATTACTCGTAACTGATGGTTCATGCATGATTGATCGTCGAAT
GGGAATCCATGGGCATCCACTTGAAATTCAGGCACTCTTCTATTCAGCCCTCTTGTGTGCGCGTGAG
ATGTTGACTCCAGAAGACGGATCAGCTGACTTAATCCGCGCCCTGAACAATAGACTTATTGCACTGT
CCTTTCATATCAGGGAGTACTACTGGCTTGACATGCAAAAATTGAATGAGATATATCGATATAAAACA
GAAGAATATTCTTATGATGCTGTGAACAAGTTCAACATATACCCCGATCAGATTTCTCCATGGCTTGT
TGAGTGGATACCTCCTAAGGGGGGTTACTTTATTGGAAACCTCCAGCCAGCTCATATGGACTTCCGA
TTCTTTTCACTGGGAAATTTATGGTCAATAGTAAGCAGCTTGGCAACAACTCATCAGTCACATGCCA
TTTTAGATCTTATTGAGTCTAAATGGTCTGATTTAGTGGCAGAGATGCCACTGAAGATATGCTATCCT
GCTCTTGAGAACCAGGAATGGAAGATCATCACAGGGAGTGACCCTAAAAACACGCCTTGGTCGTAC
CACAATGGAGGATCCTGGCCAACATTACTGTGGCAGCTCACTGTGGCATGCATCAAGATGAACAGA
CCAGAGCTTGCAGCCAAAGCTATAGAAGTAGCTGAGAGGCGTATTGCTACAGACAAATGGCCTGAA
TACTACGACACCAAGAAAGCACGCTTCATTGGGAAACAGGCACGGCTGTACCAAACGTGGTCTATT
GCTGGGTTCCTAGTAGCCAAGCTACTGATAGAAAAACCAGACGCTGCTAGGATTCTGTGGAACGAT
GAGGATGCAGAAATCCTTAATGCTTTGAGCACAAACAGAAAACGGGGCAAGAAAGTGTTGAAGAAAACATACATTGTGTGA。
本发明还提供了一种所述ShN/AINV5-4D基因编码的蛋白质，所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
MGIAEVALHTMPGALTTHSPASILSLRAVARRRNRNTNAVPNVRALQGLLRIPRLRSVRRLCQRIDDLARVTEGNGTWVKDAMNSAGQVLGDVSVPGQAVGGNGGLNGSAAKPPPQRRKSSSVEDEAWELLQESMVYYCGSPVGTIAANDPNDSDPVNYDQVFIRDFIPSGIAFLLKGEYEIVRNFILHTLQLQSWEKTMDCHSPGQGLMPASFKVRTIPLDGDEDATEEVLDPDFGEAAIGRVAPVDSGLWWIILLRAYGKCSGDLSVQERIDVQTGMKMILKLCLADGFDMFPTLLVTDGSCMIDRRMGIHGHPLEIQALFYSALLCAREMLTPEDGSADLIRALNNRLIALSFHIREYYWLDMQKLNEIYRYKTEEYSYDAVNKFNIYPDQISPWLVEWIPPKGGYFIGNLQPAHMDFRFFSLGNLWSIVSSLATTHQSHAILDLIESKWSDLVAEMPLKICYPALENQEWKIITGSDPKNTPWSYHNGGSWPTLLWQLTVACIKMNRPELAAKAIEVAERRIATDKWPEYYDTKKARFIGKQARLYQTWSIAGFLVAKLLIEKPDAARILWNDEDAEILNALSTNRKRGKKVLKKTYIV*。
所述ShN/AINV5-4D基因编码蛋白定位于细胞叶绿体，叶绿体是植物光合作用过程中重要的细胞器。ShN/AINV5-4D可能在叶绿体光合作用过程发挥作用，该基因可提高拟南芥种子的萌发速率，所述ShN/AINV5-4D基因及其生物材料可用于种质资源改良，提高拟南芥的种子萌发率。
本发明还提供了一种含有所述ShN/AINV5-4D基因的生物材料。所述的生物材料为重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
所述的重组表达载体可用现有的植物表达载体进行构建，例如可以是双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用ShN/AINV5-4D基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用ShN/AINV5-4D基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
携带有所述ShN/AINV5-4D基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
所述的表达盒尤其是指含有所述ShN/AINV5-4D基因的表达盒。
所述的转基因细胞系尤其是指人工构建的稳定表达所述ShN/AINV5-4D基因，或所述ShN/AINV5-4D基因编码蛋白的转基因细胞系。
所述的重组菌尤其是指使用ShN/AINV5-4D基因构建的大肠杆菌或农杆菌。
本发明还提供了一种用于扩增所述ShN/AINV5-4D基因的引物，该引物序列如SEQID NO.3-4所示，具体为：
F:CTCCCCTTGCTCCGTGGATCCATGGGAATCGCGGAGGTGG；(下划线为同源重组序列)；
R:GTCCTTGTAGTCAGAAGGCCTCACAATGTATGTTTTCTTCAACACTTTCTTGCC(下划线为同源重组序列)。
进一步地，本发明还保护所述ShN/AINV5-4D基因、所述ShN/AINV5-4D基因编码的蛋白或含有该基因的所述生物材料在植物种子萌发调控中的应用。所述生物材料是指含有所述ShN/AINV5-4D基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。
进一步地，本发明还保护所述ShN/AINV5-4D基因、所述ShN/AINV5-4D基因编码的蛋白和含有该基因的所述生物材料在植物种质资源改良中的应用。所述生物材料是指含有所述ShN/AINV5-4D基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。
进一步地，本发明还保护所述ShN/AINV5-4D基因、所述ShN/AINV5-4D基因编码的蛋白或含有该基因的所述生物材料在植物育种中的应用，所述育种的目的为培育高种子萌发速率的植物品种。所述生物材料是指含有所述ShN/AINV5-4D基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。
本发明前期通过拟南芥突变体筛选得到一个种子延迟萌发的突变体Atinve，利用农杆菌GV3101将基因ShN/AINV5-4D通过遗传转化转入拟南芥突变体Atinve中进行基因功能验证，得到回补株系#1、#8、#16这3个株系，通过种子萌发试验发现，ShN/AINV5-4D能够促进种子萌发，提高种子的萌发速率。
附图说明
图1是甘蔗ShN/AINV5-4D基因克隆。
图2是转基因拟南芥ShN/AINV5-4D基因PCR鉴定。
图3是转基因拟南芥Bar基因PCR鉴定。
图4是转基因拟南芥株系#1、#8、#16与野生型株系和突变体Atinve的种子萌发速率比较。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、甘蔗ShN/AINV5-4D基因的CDS序列
甘蔗ShN/AINV5-4D基因的CDS序列采用同源克隆的方法，根据水稻的OsN/AINV5序列，设计正向引物(5'-CTCCCCTTGCTCCGTGGATCCATGGGAATCGCGGAGGTGG-3')和反向引物(5'-GTCCTTGTAGTCAGAAGGCCTCACAATGTATGTTTTCTTCAACACTTTCTTGCC-3')，以甘蔗cDNA为模板，进行目的基因ShN/AINV5-4D的扩增，使用的试剂为Max DNA Polymerase(TaKaRa Code No.R045A)。PCR扩增反应体系及反应条件，见表1。
表1
取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，结果显示扩增产物条带单一、长度在1812bp左右，与目标产物长度相符，表明PCR扩增成功，获得了目标长度的PCR产物。对PCR产物进行测序，获得甘蔗ShN/AINV5-4D基因的cDNA序列，即本发明所述ShN/AINV5-4D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、甘蔗ShN/AINV5-4D基因编码的氨基酸序列
根据甘蔗ShN/AINV5-4D基因的全长cDNA序列，采用Snapgene软件转换为氨基酸序列，经测定，共编码603个氨基酸，即本发明所述的ShN/AINV5-4D基因的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3、表达载体的构建
将PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行电泳，采用胶回收试剂盒进行切胶回收后与表达载体pCB302(本实验室保存，文献引用“Nannan Zhang,et al.,EngineeringArtificial MicroRNAs for Multiplex Gene Silencing and Simplified TransgenicScreen,Plant Physiology,Volume 178,Issue 3,November 2018,Pages 989-1001,https://doi.org/10.1104/pp.18.00828”)线性化之后进行同源重组载体连接，具体操作参照南京诺唯赞生物科技股份有限公司试剂产品ClonExpress II One Step Cloning Kit(C112)。
取10μL同源同组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后涂在卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养12小时，进行菌液PCR鉴定。挑取10个单菌落进行PCR鉴定。鉴定引物如下：
正向引物35S PPDK-F(5'-GTCACGTAGTAAGCAGCTCTCGG-3')和目的基因反向引物(5'-ATCGTAGTTCACTGGGTCACTG-3')。
PCR扩增反应体系及反应条件，见表2。
表2
取上述PCR产物5μL在1％的琼脂凝胶电泳中检测目的条带为530bp左右的片段。取3-5个阳性条带对应的菌液，取100μL送样进行测序，保存测序正确的菌液进行质粒提取，将质粒转染至农杆菌GV3101准备进行遗传转化。
4、拟南芥的遗传转化及纯合株系筛选
(1)选取拟南芥花苞最多且角果较少时为最佳转化时期。
(2)挑取带有相应表达载体的农杆菌单菌落在相应抗性的LB液体培养基中放摇床中摇至饱和状态。
(3)收集菌体去上清后用重悬液稀释至OD值约为0.8。
(4)加Silwet-77至终浓度为质量分数0.02％～0.05％，混匀。
(5)将植株花苞浸泡在转化液中，浸沾2min左右，将转染后植株黑暗中放16～24h后，正常的光照培养后收获T1代转基因植株种子。
(6)经过连续两代的筛选得到T3代纯合株系，分别为#1、#8、#16。
5、转基因拟南芥PCR鉴定
将成活的转基因拟南芥使用枪头写上序号进行标记，剪取拟南芥叶片提取转基因DNA，使用特异性引物进行PCR鉴定，其中，目的基因ShN/AINV5-4D的鉴定引物为：正向引物35S PPDK-F(5'-GTCACGTAGTAAGCAGCTCTCGG-3')和目的基因反向引物(5'-ATCGTAGTTCACTGGGTCACTG-3')。Bar基因的鉴定引物为：
Bar-F:5'-ACAAGCACGGTCAACTTCC-3'，Bar-R:5'-CTTCAGCAGGTGGGTGTAG-3'。将PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行检测，结果如图2、图3所示。
由图2-3可知，转基因株系#1、#8、#16均能扩增出特异性目的片段和抗性基因(Bar基因)，证明目的载体已经成功整合到拟南芥基因组中。
6、转基因拟南芥萌发试验
将获得的拟南芥Atinve突变体(Gene ID：At5g22510，SALK_138953)回补纯合株系#1、#8、#16与野生型拟南芥WT、Atinve突变体种子(购自TAIR网站
https://www.arabidopsis.org/)种植在MS培养基中，在正常生长条件下进行种子萌发试验，并统计拟南芥在24h、32h、40h、48h时的种子萌发率。
如图4所示，在24h的时候，突变体Atinve的萌发率为46.1％，WT的萌发率为70.4％，转基因拟南芥#1、#8、#16的萌发率分别为79.3％、76.7％、78.0％，方差分析结果显示P值均小于0.01，差异极显著；
在32h的时候，突变体Atinve的萌发率为68.9％，WT的萌发率为86.7％，转基因拟南芥#1、#8、#16的萌发率分别为92.5％、92.2％、91.4％，方差分析结果显示P值均小于0.01，差异极显著；
在40h的时候，突变体Atinve的萌发率为73.4％，WT的萌发率为92.5％，转基因拟南芥#1、#8、#16的萌发率分别为94.1％、93.6％、92.8％，方差分析结果显示P值均小于0.01，差异极显著；
在48h的时候，突变体Atinve的萌发率为79.0％，WT的萌发率为93.2％，转基因拟南芥#1、#8、#16的萌发率分别为94.6％、94.2％、93.3％，方差分析结果显示差异不显著，但是拟南芥突变体Atinve的萌发率依旧小于WT及回补株系#1、#8、#16的萌发率。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.ShN/AINV5-4D基因或其编码蛋白或含有该基因的生物材料在促进拟南芥种子萌发中的应用，所述ShN/AINV5-4D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.ShN/AINV5-4D基因或其编码蛋白或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用，所述育种的目的为培育高种子萌发速率的植物品种，所述植物为拟南芥，所述ShN/AINV5-4D基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物材料为重组表达载体、表达盒或重组菌。
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Molecular cloning, structure, phylogeny and expression analysis of the invertase gene family in sugarcane;Liming Wang;BMC Plant Biology;20171231;第2017卷(第17期);1-20 *

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