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CN116694581A - 哈维氏弧菌噬菌体v-ydf132的冻干保护剂及其保藏方法 - Google Patents

哈维氏弧菌噬菌体v-ydf132的冻干保护剂及其保藏方法 Download PDF

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frozen
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魏京广
康绍珠
秦启伟
张路豪
廖嘉明
许竹青
刘少丽
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South China Agricultural University
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South China Agricultural University
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    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
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Abstract

本发明公开了一种哈维氏弧菌噬菌体V‑YDF132的冻干保护剂及其保藏方法。它含有菊糖，脱脂奶粉，明胶，L‑谷氨酸钠和水。是将上述冻干保护剂与噬菌体V‑YDF132溶液混合，先冷冻至固状待冷冻样品，再经冷冻干燥后得到噬菌体V‑YDF132冻干粉制剂。噬菌体的保藏方法多种多样，不同的噬菌体其最佳保藏方式不一。本发明通过筛选制备不同的噬菌体冻干保护剂以及探究其对噬菌体冷冻干燥后的保护效果，旨在为噬菌体保存奠定基础。筛选获得的冻干保护剂配方P9与噬菌体V‑YDF132制备的噬菌体粉制剂对保存条件要求低，能够长期保存不丧失生物活性。

Description

哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂及其保藏方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂及其保藏方法。
背景技术
近年来，噬菌体作为一种新的抗菌手段，受到国内外研究人员的高度关注。噬菌体在养殖业、农业和食品业等均做出了诸多贡献，具有广阔的应用前景。噬菌体的活性容易受到外界环境影响，因此噬菌体的保藏尤为重要。目前国内外关于噬菌体的实用保藏方法主要分为悬液法、冻液法和干燥法。每种噬菌体的性质各不相同，若保藏方法不当会造成极大损失。
悬液法是指将噬菌体原液或加入保护剂进行直接保藏，使噬菌体维持液态形式，保护剂可以加入甘油、氯仿、SM缓冲液和氯化钙等。有报道发现将苏云金杆菌噬菌体CP-51培养液保藏于室温，发现噬菌体的活性远高于保藏4℃。此外，谢慧君(2003)向大肠杆菌噬菌体富集液中加入甘油，发现在4℃下保藏1个月效果最佳。黎尔纳(2016)等人发现在3种木糖氧化无色杆菌噬菌体中加入氯仿，采用悬液法可保藏16个月之久。另外，多例报道证明向噬菌体原液中添加SM缓冲液可有效保藏噬菌体。
冻液法是指在-20℃及以下的低温冷冻条件中保藏噬菌体。保藏温度各不相同，可以是干冰(-70℃)、超低温冰箱(-80℃)以及液氮(-196℃)等方式进行保藏，可加入保护剂如甘油或脱脂奶粉等防止噬菌体在冷冻过程中失活。Wagner(2017)研究发现向13个噬菌体悬浮液中加入15％的甘油，在-80℃下储存长达4年，噬菌体的效价基本没有变化。Hubálek(2003)报道了各种浓度的DMSO都可用作保护剂来使用。
干燥法主要分为冷冻干燥法、真空干燥法和喷雾干燥法。冷冻干燥法(简称冻干法)是利用冰晶升华的原理，将液体冻结，然后利用负压升华，除去水后形成粉末状。为防止噬菌体在冷冻过程中失活，可以加入各种冷冻保护剂，如胰蛋白胨、脱脂牛奶和明胶等。冻干后的噬菌体可以在不同温度下保藏。近年来的研究表明，通过冷冻干燥制备的噬菌体粉剂具备热稳定性和pH稳定性，又可提高噬菌体在长期储存中的稳定性(El et al.,2018)。Charles(1959)报道了以脱脂牛奶作为保护剂，葡萄球菌噬菌体冻干后在4℃和-20℃保藏中8个月，噬菌体仍然能维持较高的活性。真空干燥法的原理是保持噬菌体不冻结而在高度真空下减压干燥。若干燥后密封保藏得当，噬菌体将会长期保持原始的效价和活力，目前常用的保护剂有脱脂奶粉、糖类、乳清粉和明胶等。同时有研究发现将分枝杆菌噬菌体进行真空干燥，在4℃和室温下保藏28周，其噬菌体的效价仅下降1个数量级，且在4℃环境中的保藏效果优于室温保藏。喷雾干燥法使用传统的双流体喷嘴，产生干粉状或颗粒状的噬菌体产品。Matinkhoo(2011)等报道了将单种噬菌体或噬菌体鸡尾酒进行喷雾干燥，制成的噬菌体干粉效价仅减少0.4～0.8个数量级。
综上所述，噬菌体的保藏方法多种多样，不同的噬菌体其最佳保藏方式不一，因此筛选出适合的保藏方式对后续的实际应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种对保存条件要求低，能够长期保存不丧失生物活性的哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂。
本发明的哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂，其含有菊糖，脱脂奶粉，明胶，L-谷氨酸钠和水。
优选，所述的哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂是每100ml含菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水。
本发明的第二个目的是提供一种哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的保藏方法，是将上述冻干保护剂与噬菌体V-YDF132溶液混合，先冷冻至固状待冷冻样品，再经冷冻干燥后得到噬菌体V-YDF132冻干粉制剂。
优选，所述的将冻干保护剂与噬菌体V-YDF132溶液混合是按照体积比1:2混合。
优选，所述的噬菌体V-YDF132溶液，其浓度为6.5×108PFU/mL。
优选，所述的先冷冻至固状待冷冻样品，再经冷冻干燥后得到噬菌体V-YDF132冻干粉制剂是混合溶液在-80℃进行预冷冻处理12h成固状待冷冻样品，开启CHRSIT冷冻干燥机制冷功能，待冷阱温度降到-40℃以下；将已凝固的待冷冻样品放入冷冻干燥机，冷冻干燥机开启抽真空模式，冷阱内气压达到0.37mbar，冷冻干燥18～24h后即成哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132冻干粉制剂。
噬菌体的保藏方法多种多样，不同的噬菌体其最佳保藏方式不一。本发明通过筛选制备不同的噬菌体冻干保护剂以及探究其对噬菌体冷冻干燥后的保护效果，旨在为噬菌体保存奠定基础。筛选获得的冻干保护剂配方P9与噬菌体V-YDF132制备的噬菌体粉制剂对保存条件要求低，能够长期保存不丧失生物活性。
本发明的烈性哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132，于2022年7月05日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62599-B1。该噬菌体公开于专利申请号CN202210886269.9，发明名称一种哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132及其应用的专利中。
哈维氏弧菌YDF132保藏在华南农业大学海洋学院水生生物医学系实验室，其也公开于专利申请号CN202210886269.9，发明名称一种哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132及其应用的专利中，本申请人保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1为噬菌体V-YDF132与冻干保护剂制备的冻干粉制剂。
图2为噬菌体V-YDF132冻干粉制剂在37℃(a)和4℃(b)下的噬菌体效价测定。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
一、实验方法
1噬菌体V-YDF132的制备
噬菌体冻干剂中的噬菌体为噬菌体裂解液。参考《分子克隆实验指南第三版》中描述的方法，对噬菌体原液进行扩大培养，具体操作方法略有改动。取处于对数期的哈维氏弧菌YDF132 500μL加入到500mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养；加入50mL噬菌体V-YDF132溶液继续在摇床培养至混合液完全变为澄清；将混合液在4℃下，以4000rpm离心10min，使用0.22μm滤膜过滤上清液得到噬菌体YDF132液。在噬菌体YDF132液中加入至终浓度为1μg/mL的Rnase A酶和Dnase I酶，于室温放置30min；加入固态NaCl至终浓度为1M，待NaCl溶解后冰浴1h；在4℃，8300rpm离心10min后，测定上清液体积；加入固体聚乙二醇(PEG8000)至终浓度为10％(w/v)，溶解后置于冰水混合物中过夜；次日在4℃下，12,000rpm高速离心15min，离心后的沉淀使用SM缓冲液清洗3次，加入SM缓冲液重悬沉淀。采用双层平板法测定扩大培养后的重悬液噬菌体效价。
2噬菌体V-YDF132冻干保护剂的制备
噬菌体冻干粉制剂是由噬菌体和冻干保护剂的混合溶液经冻干处理形成的冻干混合物；其中，在所述混合溶液中，每100mL冻干保护剂按质量份由以下成分组成:
1、蔗糖30g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水。
2、海藻糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水。
3、菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水。
按照上述三种冻干保护剂各组分重量进行称取，混合均匀，高压灭菌，即得。其中，高压条件为115℃灭菌30min。将含噬菌体YDF132的溶液(浓度为6.5×108PFU/mL)与每种冻干保护剂分别按比例体积比7:1、4:1、2:1混合，制备成9种混合溶液，即该试验的9种不同配方：
P1：蔗糖30g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:7混合。
P2：蔗糖30g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:4混合。
P3：蔗糖30g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:2混合。
P4：海藻糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:7混合。
P5：海藻糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:4混合。
P6：海藻糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:2混合。
P7：菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:7混合。
P8：菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:4混合。
P9：菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水；与噬菌体溶液按体积比1:2混合。
混合溶液在-80℃进行预冷冻处理12h成固状待冷冻样品。开启CHRSIT冷冻干燥机制冷功能，待冷阱温度降到-40℃以下；将已凝固的待冷冻样品放入冷冻干燥机，冷冻干燥机开启抽真空模式，冷阱内气压达到0.37mbar，冷冻干燥18～24h后即成哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132冻干粉制剂。
3噬菌体V-YDF132最佳冻干保护剂的筛选
冻干完成后，立马测定9种冻干粉中的噬菌体效价。噬菌体冻干粉测定效价的方法为取0.1g冻干粉溶解于1mL SM缓冲液中，待其完全溶解后采用双层平板法测定噬菌体效价，宿主菌是哈维氏弧菌YDF132。具体是预先分别配制含2％和1％琼脂的底层TCBS培养基和上层TCBS培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到45℃以下，加有较浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培养基上铺平待凝，然后在37℃下保温。经约10小时后即可对噬菌斑计数。将冻干粉放置在37℃恒温培养箱中，每隔7天记录9种冻干粉中的噬菌体效价。根据噬菌体冻干前，冻干后以及放置在37℃环境中的存活情况来确定最佳的冻干保护剂。同时，将最佳冻干粉制剂放置在4℃环境中，每隔3个月记录冻干粉中的噬菌体效价。
二、实验结果
1哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132冻干保护剂的制备
将具有生物活性的噬菌体与一种冻干保护剂混合后，进行冻干处理，形成噬菌体冻干粉制剂。在制剂过程中，控制冻干保护剂与噬菌体的含量比例非常重要，以确保保护剂能够有效地保护噬菌体。本研究中的九种冻干保护剂与噬菌体形成的混合溶液，在进行冻干处理后均制备成为9种冻干粉制剂(P1～P9)，如图1所示，因此可以顺利进行下一步最佳冻干保护剂的筛选。
2哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的最佳冻干保护剂
上述的冻干粉制剂通过在37℃和4℃下进行保存处理，定期进行噬菌体效价测定的方法确定九种冻干粉制剂中的最佳冻干保护剂。其中冻干保护剂配方P9与噬菌体V-YDF132制备的噬菌体冻干粉制剂在冻干前的噬菌体效价为1×108.633PFU/mL，冻干后的冻干粉制剂中的噬菌体效价为1×108.123PFU/mL，仅下降0.51个滴度；在37℃环境中保存21天后冻干粉制剂中的噬菌体效价为1×107.226PFU/mL，与冻干后的噬菌体效价相比下降了0.897个滴度(图2a)；在4℃保存9个月后冻干粉制剂中的噬菌体效价为1×107.616PFU/mL，下降了0.511个滴度，噬菌体存活率为93.7％(图2b)。上述结果说明冻干保护剂配方P9与噬菌体V-YDF132制备的噬菌体粉制剂对保存条件要求低，能够长期保存不丧失生物活性。
P9：菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水提高了噬菌体冻干粉制剂的运输和储存便利性，提高了噬菌体冻干粉制剂实际应用性。

Claims (6)

1.一种哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂，其特征在于，含有菊糖，脱脂奶粉，明胶，L-谷氨酸钠和水。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述的哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的冻干保护剂是每100ml含菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，L-谷氨酸钠0.25g，余量为纯化水。
3.一种哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132的保藏方法，其特征在于，是将权利要求1或2的冻干保护剂与噬菌体V-YDF132溶液混合，先冷冻至固状待冷冻样品，再经冷冻干燥后得到噬菌体V-YDF132冻干粉制剂。
4.根据权利要求3所述的保藏方法，其特征在于，所述的将冻干保护剂与噬菌体V-YDF132溶液混合是按照体积比1:2混合。
5.根据权利要求3或4所述的保藏方法，其特征在于，所述的噬菌体V-YDF132溶液，其浓度为6.5×108PFU/mL。
6.根据权利要求3所述的保藏方法，其特征在于，所述的先冷冻至固状待冷冻样品，再经冷冻干燥后得到噬菌体V-YDF132冻干粉制剂是混合溶液在-80℃进行预冷冻处理12h成固状待冷冻样品，开启CHRSIT冷冻干燥机制冷功能，待冷阱温度降到-40℃以下；将已凝固的待冷冻样品放入冷冻干燥机，冷冻干燥机开启抽真空模式，冷阱内气压达到0.37mbar，冷冻干燥18～24h后即成哈维氏弧菌噬菌体V-YDF132冻干粉制剂。
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