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CN116694551A - 诱导性成熟肝脏细胞及其制备的方法 - Google Patents

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CN116694551A CN202210174171.0A CN202210174171A CN116694551A CN 116694551 A CN116694551 A CN 116694551A CN 202210174171 A CN202210174171 A CN 202210174171A CN 116694551 A CN116694551 A CN 116694551A
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Abstract

本发明涉及用于制备并诱导产生诱导性成熟肝脏细胞的组合物，制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，以及产生的诱导性成熟肝脏细胞。

Description

诱导性成熟肝脏细胞及其制备的方法
技术领域
本发明涉及用于制备并诱导产生诱导性成熟肝脏细胞的组合物，制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，以及诱导产生的诱导性成熟肝脏细胞。
背景技术
原代肝脏细胞在肝脏疾病的科学研究和临床治疗中发挥着重要的作用。例如，肝脏细胞可以通过疾病模型的构建用于发病机制的研究和相关药物的筛选；肝脏细胞的移植可以治疗慢性肝脏疾病和缓解晚期肝衰竭等。目前，原代肝脏细胞主要的获取方式是从供肝中分离细胞，但是由于供肝数量有限和原代肝脏细胞在体外较难培养等因素，肝脏细胞资源的获取给科研和临床中的应用带来了严重阻碍。
诱导性肝脏细胞的出现为解决这个瓶颈带来了巨大的希望。在2003年，MelissaK.Carpenter课题组率先在体外成功地将人源胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)分化为表达肝脏标记基因的诱导性肝脏细胞(Lakshmi Rambhatla，2003b Generation ofHepatocyte-Like Cells From Human Embryonic Stem Cells.Cell Transplantation，12，1-11.)。随着人源诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的出现，利用诱导性多能干细胞诱导肝脏细胞的方法也很快被构建出来(Song et al.，2009Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotentstem cells.Cell Res 19，1233-1242.10.1038/cr.2009.107.；Takahashi et al.，2007Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors.Cell 131，861-872.10.1016/j.cell.2007.11.019.)。此外，还有研究通过转分化的方式将成纤维细胞直接诱导为肝脏细胞(Du et al.，2014 Human hepatocytes withdrug metabolic function induced from fibroblasts by lineagereprogramming.Cell Stem Cell 14,394-403.10.1016/j.stem.2014.01.008；Huang etal.,2014 Direct reprogramming of human fibroblasts to functional andexpandable hepatocytes.Cell Stem Cell 14,370-384.10.1016/j.stem.2014.01.003.；Zhu et al.,2014 Mouse liver repopulation with hepatocytes generated fromhuman fibroblasts.Nature 508,93-97.10.1038/nature13020.)
近年来，虽然体外诱导肝脏细胞的技术在不断更新和完善，但是目前得到的诱导肝脏细胞只获得了原代肝脏细胞的部分特征，这类诱导肝脏细胞更类似于胎肝细胞而不是成熟的原代肝脏细胞(Baxteretal.,2015 Phenotypic and functional analyses showstem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adulthepatocytes.J Hepatol 62,581-589.10.1016/j.jhep.2014.10.016.)。
从形态上来看，人源原代肝脏细胞相对比较立体，细胞中呈现出清晰的细胞核，部分细胞呈双核，细胞核比较小且核质比相对较低。而现有技术中诱导的肝脏细胞虽然呈肝脏细胞所特有的多角形，但是细胞相对贴壁而不立体，细胞中基本看不到清晰的细胞核，含有双核的细胞极少，核质比也远大于原代肝脏细胞。
在基因表达方面，现有技术诱导的肝脏细胞中一系列与肝脏代谢相关的重要蛋白酶都没有显著表达，例如CYP3A4，CYP2C9等。
在功能方面，现有技术中诱导的肝脏细胞虽然具有白蛋白分泌能力，但是每24小时每百万个细胞的分泌量在2-5μg左右，而高质量原代肝脏细胞的分泌能力可以达到10μg以上(Zhu etal.,2014Mouse liver repopulation with hepatocytes generated fromhuman fibroblasts.Nature 508,93-97.10.1038/nature13020.)。此外，现有技术中诱导肝脏代谢的CYP450代谢能力和尿素合成的能力也与原代肝脏细胞相差较远。另外，现有技术中的诱导性肝脏细胞仍然缺失肝脏极性；在体内重建方面，当将现有技术中的诱导性肝脏细胞移植到慢性肝脏损伤的小鼠模型体内时，血液中检测到人源白蛋白所需要的时间相对较长，且血液中检测到的白蛋白最高的浓度仅有约几百纳克每毫升，这说明白蛋白分泌能力较低，同时诱导性肝脏细胞在体内的重建率不到1％。而原代肝脏细胞在慢性肝脏损伤小鼠体内白蛋白的分泌能力可以达到1mg/ml以上，体内重建效率可以达到90％以上(Zhanget al.，2018 In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with EfficientLiver Repopulation Capacity.Cell Stem Cell 23，806-819e804.10.1016/j.stem.2018.10.018.)。此外，在慢性肝损小鼠体内嵌合的诱导性肝脏细胞因为不能迁移而主要在肝门静脉附近发生嵌合(Wang et a).，2019 Human ESC-derived expandablehepatic organoids enable therapeutic liver repopulation andpathophysiological modeling of alcoholic liver injury.Cell Res 29，1009-1026.10.1038/s41422-019-0242-8.；Yan et al.，2017 Human embryonic stem cell-derived hepatoblasts are an optimal lineage stage for hepatitis Cvirusinfection.Hepatology 66，717-735.10.1002/hep.29134.)；而原代肝脏细胞可以从肝门静脉处迁移至肝实质区域，继而再生增殖。此外相比于原代肝脏细胞，再生后的诱导肝脏细胞与原代肝脏细胞还存在一定程度的差异。上述各项研究结果说明，现有技术中的诱导性肝脏细胞还是一种不成熟的状态，功能与原代肝脏细胞相比仍相差较大。
本发明旨在建立一种利用组合物制备在形态结构，基因表达，细胞功能等方面接近或不低于原代肝脏细胞的诱导性成熟肝脏细胞。
发明内容
该发明内容中提供的本发明实施方式仅意在示例性的并意在提供本文所公开的选择性实施方式的概述。发明内容(其为示例性的和选择性的)并不限制任何权利要求的范围，并非提供在本文中公开或考虑的本发明实施方式的整个范围，且不应解释为限制或约束本公开内容或任何请求保护的本发明实施方式的范围。除非明确地排除，本文公开和考虑的本发明实施方式的其他特征、目的和优势可以与任何其他实施方式组合。
发明人令人惊讶地发现，通过采用特定的化合物组合作为用于诱导诱导性不成熟肝脏细胞的基础培养基的添加剂，可以将诱导性不成熟肝脏细胞分化为诱导性成熟肝脏细胞，该诱导方法有效，能够得到与原代肝脏细胞类似的诱导性成熟肝脏细胞。因此，
在一个方面，本发明提供了一种第一组合物，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；以及(e)TGF-beta信号通路抑制剂。优选地，在一些实施方式中，所述第一组合物进一步包含：(f)p38 MAPK抑制剂。
在另一方面，本发明还提供了一种第一试剂盒，(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；(e)TGF-beta信号通路抑制剂；以及相应的使用说明。优选地，在一些实施方式中，所述第一试剂盒进一步包含：(f)p38 MAPK抑制剂。
在又一个方面，本发明还提供了一种第一培养基，(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；以(e)TGF-beta信号通路抑制剂；以及基础培养基，优选地所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E等培养基，更优选地，基础培养基是HCM。优选地，在一些实施方式中，所述第一培养基进一步包含：(f)p38 MAPK抑制剂。
在一个方面，本发明还提供了一种第二组合物，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；以及(d)TGF-beta信号通路抑制剂。
在另一方面，本发明还提供了一种第二试剂盒，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；以及(d)TGF-beta信号通路抑制剂；以及相应的使用说明。
在又一个方面，本发明还提供了一种第二培养基，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；以及(d)TGF-beta信号通路抑制剂；以及基础培养基，优选地所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E等培养基，更优选地，基础培养基是William’E。优选地，在一些实施方式中，所述第二培养基包含相对于第二培养基总体积的0.05％～20体积％的血清，优选1体积％。
在一方面，本发明还提供了第一组合物、第一试剂盒、第一培养基、第二组合物、第二试剂盒、第二培养基在用于制备诱导性成熟肝脏细胞中的用途。
在一些实施方式中，HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂选自Mocetinostat(MGCD0103)、Abexinostat(PCI-24781)、Fimepinostat(CUDC-907)、ITSA-1、Vorinostat(SAHA)、MS-275、Panobinostat(LBH589)、Quisinostat、FK228、SB939、Trichostatin A(TSA)等。优选地，在一些实施方式中，HDAC(组蛋白去乙酰化酶)抑制剂是MS-275。
在一些实施方式中，类固醇类化合物选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等。优选地，在一些实施方式中，类固醇类化合物是地塞米松。
在一些实施方式中，Notch信号通路抑制剂选自IMR-1、RO4929097、Semagacestat(LY450139)、Avagacestat(BMS-708163)、Dibenzazepine(YO-01027)、Crenigacestat(LY3039478)、Compound E、DAPT等。优选地，在一些实施方式中，Notch信号通路抑制剂是Compound E。
在一些实施方式中，MEK抑制剂选自SeluMetinib(AZD6244)、Trametinib(GSK1120212)、PD0325901、U0126-ETOH、U0126、PD184352(CI-1040)等。优选地，在一些实施方式中，MEK抑制剂是PD0325901。
在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂选自SD-208、LY2109761、BIBF-0775、A83-01、SB431542等。优选地，在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01。
在一些实施方式中，所述p38 MAPK抑制剂选自SB202190(FHPI)、SB203580、TAK-715、Doramapimod(BIRB 796)等。优选地，在一些实施方式中，p38 MAPK抑制剂是SB203580。
在一些实施方式中，所述cAMP激活剂选自Forskolin、8-Br-cAMP等。优选地，在一些实施方式中，cAMP激活剂是Forskolin。
在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂选自Y-27632、Thiazovivin、GSK429286A、RKI-1447、AT13148等。优选地，在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y-27632。
在一些实施方式中，所述培养基包含基础培养基。
在一些实施方式中，所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E等培养基。
在另一方面，本发明提供了一种制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在本文所述的培养基中培养诱导性不成熟肝脏细胞，由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。在一些实施方式中，所述方法包括步骤(a)在本文所述的第一培养基中培养诱导性不成熟肝脏细胞。由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。优选地，在一些实施方式中，所述方法进一步包括在本文所述的第二培养基中培养所述步骤(a)所得的细胞，由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。
在一些实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞由多能干细胞制备得到；优选地，在一些实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞通过本文所述的方法由多能干细胞制备得到。优选地，在一些实施方式中，所述多能干细胞选自胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在一些实施方式中，本发明提供了一种诱导性成熟肝脏细胞，其具有以下一种或多种特征：
(a)诱导性成熟肝脏细胞显示出原代肝脏细胞的典型形态特征；
(b)相对于诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞选自以下的一种或多种肝脏细胞标志物的转录或蛋白表达增加：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1；
(c)相对于诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录或蛋白表达减少：AFP；
(d)相对于诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞选自以下的一种或多种肝脏细胞的功能增加：白蛋白分泌能力、尿素合成能力、肝脏细胞极性、CYP代谢酶活力、移植存活率、体内重建率；和
(e)相对于原代肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞选自以下的一种或多种肝脏细胞的功能接近或不低于原代肝脏细胞：白蛋白分泌能力、尿素合成能力、肝脏细胞极性、CYP代谢酶活力、移植存活率、体内重建率；
优选地，在一些实施方式中，所述诱导性成熟肝脏细胞可通过根据本文所述的方法制备。
在一些方面，本文提供了一种诱导性成熟肝脏细胞，其可通过根据本文所述的方法制备。
在另一方面，本发明提供了一种类器官，其产生自本文所述的诱导性成熟肝脏细胞。
在另一方面，本发明提供了一种组织，其产生自本文所述的诱导性成熟肝脏细胞，优选所述组织是肝脏。
在一些方面，本发明提供了一种本文公开的诱导性成熟肝脏细胞在制备用于肝脏细胞移植的细胞、构建肝脏相关疾病模型、肝脏疾病相关药物筛选与鉴定，药物肝脏毒性筛选与鉴定，体外构建肝脏器官(含3D打印肝脏器官)中的用途。
在一些方面，本发明提供了一种筛选用于治疗疾病的物质的体外方法，其包括使本文公开的诱导性成熟肝脏细胞、类器官或组织与待筛选物质接触。
在一些实施方式中，本文所述诱导性不成熟肝脏细胞可由本领域常规方法制备得到，包括但不限于如(Zhu et al.,2014Mouse liver repopulation with hepatocytesgenerated from human fibroblasts.Nature508,93-97.10.1038/nature13020)中所描述的方法，所述诱导性不成熟肝脏细胞在本领域中亦被称为“f-iHep”、“iHep”等。在一些现有技术中，诱导性不成熟肝脏细胞也被称为“诱导性肝脏细胞”。优选地，所述诱导性不成熟肝脏细胞可由本文所述方法制备得到。
在另一个方面，本发明提供了一种培养物，其包含本文所述的培养基和诱导过程中产生的细胞。在一些实施方式中，所述培养物包含本文所述的培养基和诱导性成熟肝脏细胞。
在一些方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含HEM-1培养基和HEM-2培养基，其中所述HEM-1培养基包含ROCK抑制剂、肝脏细胞生长因子(HGF)、抑瘤素M(oncostatinM,OSM)、类固醇类化合物、Notch信号通路抑制剂、TGF-beta信号通路抑制剂和基础培养基；优选地，所述基础培养基是去除表皮细胞生长因子(EGF)的HCM培养基。所述HEM-2培养基包含肝脏细胞生长因子(HGF)、抑瘤素M(oncostatinM,OSM)、类固醇类化合物、Notch信号通路抑制剂、TGF-beta信号通路抑制剂和基础培养基；优选地，所述基础培养基是去除表皮细胞生长因子(EGF)的HCM培养基。在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂是Y-27632；所述类固醇类化合物是地塞米松；所述Notch信号通路抑制剂是Compound E；所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01。优选地，在一些实施方式中，所述HEM-1培养基和HEM-2培养基包含选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E的基础培养基；更优选地，在一些实施方式中，所述基础培养基是HCM培养基。
在一些方面，本发明提供了一种扩增诱导性不成熟肝脏细胞的方法，其中包括使诱导性不成熟肝脏细胞接触本发明的HEM-1培养基或HEM-2培养基。在一些实施方式中，所述扩增诱导性不成熟肝脏细胞的方法包括使诱导性不成熟肝脏细胞接触HEM-1培养基，之后使诱导性不成熟肝脏细胞接触HEM-2培养基。
在一些方面，本发明提供了一种HEM-1培养基和HEM-2培养基在用于扩增诱导性不成熟肝脏细胞的用途。
通过本文所述的方法获得的诱导性成熟肝脏细胞可以体外长期(例如：3个月以上)扩增培养后，仍然维持关键的肝脏细胞功能和形态。
附图说明
图1：诱导性成熟肝脏细胞的形态特征。细胞1(诱导性不成熟肝脏细胞)：由多能性干细胞诱导得到的诱导性不成熟肝脏细胞；细胞2(5C培养基)：诱导性不成熟肝脏细胞经5C培养基处理15天后，呈现的细胞形态；细胞2(6C培养基)：诱导性不成熟肝脏细胞经6C培养基处理15天后，呈现的细胞形态；细胞3(4C培养基)：细胞1(诱导性不成熟肝脏细胞)经6C培养基处理之后，又经4C培养基处理30天后，呈现的细胞形态。
图2：诱导性成熟肝脏细胞高表达一系列肝脏细胞成熟相关的标记基因。A)成熟肝脏细胞相关基因的mRNA表达水平，利用RT-qPCR的方法对诱导第一阶段的细胞1(诱导性不成熟肝脏肝细胞)，诱导第二阶段的对照组细胞2对照(DMSO)和细胞2(6C培养基)，以及诱导第三阶段的对照组细胞3对照(DMSO)和细胞3(4C培养基)中成熟相关的一系列基因进行mRNA表达水平的鉴定；B)成熟肝脏细胞相关基因的蛋白水平表达，通过免疫荧光的方法，对细胞3(诱导性成熟肝脏细胞)中成熟相关基因CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4的蛋白表达进行鉴定验证。
图3：诱导性成熟肝脏细胞具有肝脏细胞极性且其一系列肝脏相关功能也得到显著提升。A)利用CDF荧光检测细胞1(诱导性不成熟肝脏细胞)，细胞2(6C培养基)以及细胞3(4C培养基)的肝脏极性；B)利用酶联免疫吸附实验鉴定细胞1(诱导性不成熟肝脏细胞)、细胞2(6C培养基)和细胞3(4C培养基)分泌白蛋白的能力；C)诱导肝脏细胞合成尿素能力的鉴定；D)利用化学发光实验鉴定不同诱导细胞中CYP1A2和CYP3A4代谢酶的活力。
图4：诱导性成熟肝脏细胞可以在慢性肝脏损伤小鼠FRG体内重建迁移并缓解和改善小鼠的肝脏损伤情况和存活率。A)原代肝脏细胞，细胞2(6C培养基)，以及细胞3(4C培养基)在移植到FRG小鼠体内后，小鼠血液中人源白蛋白的含量(HSA，human serum albumin)，其中纵坐标为小鼠血液中人源白蛋白的浓度，横坐标为移植后的天数；B)移植6个月后，小鼠肝脏中FAH基因的表达，对移植后存活6个月以上的小鼠的肝脏进行组织免疫荧光染色，其中红色的区域代表人源FAH阳性的区域，蓝色为DAPI；C)FRG小鼠移植细胞后的存活情况，其中纵坐标代表存活的百分比，横坐标代表移植后的天数；D)移植细胞后FRG小鼠中AST和ALT的情况。
图5：使用HEM-1培养基和HEM-2培养基扩增细胞1(诱导性不成熟肝脏细胞)。A)细胞1(D0)，以及细胞1传代扩增后第3天(D3)和第7天(D7)的细胞形态；B)细胞1(D0)，以及细胞1传代扩增后第1天(D1)第3天(D3)和第7天(D7)中肝脏相关基因的mRNA表达；C)免疫荧光检测扩增后细胞1(D7)中肝脏相关基因的蛋白表达；D)细胞1扩增前(D0)和扩增后(D7)的白蛋白分泌能力；E)细胞1扩增前(D0)和扩增后(D7)的尿素合成能力；F)细胞1扩增前(D0)和扩增后(D7)的CYP3A4的代谢能力；G)细胞1扩增后(D7)的ORO，Bodipy，PAS和ICG的检测。
具体实施方式
一个或多个本发明实施方式的详细内容在本文的附图、权利要求书和说明书中进行了阐述。除非明确地排除，本文公开和考虑的本发明实施方式的其他特征、目的和优势可以与任何其他实施方式组合。
A.概述
除非另有特别指出，否则本发明的实施将采用在本领域技术内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学、细胞生物学、干细胞方案、细胞培养和转基因生物学的常规方法，其中许多在下文描述用于举例说明的目的。这样的技术在文献中充分说明。参见例如Sambrook,et al,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(3rd Edition,2001)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)；Maniatis et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008)；Short Protocols in Molecular Biology:A CompendiμM ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRLPress,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology(Academic Press,New York,1991)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,Ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Animal CellCulture(R.Freshney,Ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Fire et al.,RNA Interference Technology:From Basic Science to DrugDevelopment(Cambridge University Press,Cambridge,2005)；Schepers,RNAInterference in Practice(Wiley-VCH,2005)；Engelke,RNA Interference(RNAi):TheNuts&Bolts of siRNA Technology(DNA Press,2003)；Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology；HμManPress,Totowa,NJ,2004)；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technologyand Application(CRC,2004)；Clarke and Sanseau,microRNA:Biology,Function&Expression(Nuts&Bolts series；DNA Press,2006)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Harlow and Lane,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,VolμMes I-IV(D.M.Weir andC.Blackwell,eds.,1986)；Riott,Essential Immunology,6th Edition,(BlackwellScientific Publications,Oxford,1988)；Embryonic Stem Cells:Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2002)；EmbryonicStem Cell Protocols:VolμMe I:Isolation and Characterization(Methods inMolecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006)；Embryonic Stem Cell Protocols:VolμMe II:Differentiation Models(Methods in Molecular Biology)(KurstadTurksen,Ed.,2006)；HμMan Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in MolecularBiology)(Kursad Turksen Ed.,2006)；Mesenchymal Stem Cells:Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney,andBruce A.Bunnell Eds.,2008)；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods inMolecular Medicine)(Christopher A.Klug,and Craig T.Jordan Eds.,2001)；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(KevinD.Bunting Ed.,2008)Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology)(Leslie P.Weiner Ed.,2008)；Hogan et ah,Methods ofManipulating the Mouse Embyro(2nd Edition,1994)；Nagy et al,Methods ofManipulating the Mouse Embryo(3rd Edition,2002),和The Zebrafish book.A guidefor the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),4th Ed.,(Univ.of OregonPress,Eugene,OR,2000)。
本文引用的所有公开文件、专利和专利申请通过引入全文并入本文。
B.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了下述术语。
冠词"一个/一种(a/an)"和"该/所述(the)"在本文中用于指一个/一种或超过一个/一种(即至少一个/一种)所述冠词的语法对象。例如，"要素"意指一个/一种要素或超过一个/一种要素。
替代(例如"或")的使用应理解为意指替代方案中任一、两者或其任何组合。
术语"和/或"应理解为意指替代方案中任一或两者。
如本文使用的，术语"约"或"大约”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，改变多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语"约"或"大约”是指围绕参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。
如本文使用的，术语"基本上(substantially/essentially)”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，是约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语"基本上相同”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。
如本文使用的，术语"基本上不含"当用于描述组合物例如细胞群或培养基时，指不含指定物质，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含指定物质的组合物，或如通过常规手段测量是无法检测的。类似含义可应用于术语"不存在"，当指不存在组合物的特定物质或组分时。
如本文使用的，术语"可观的”是指通过一种或多种标准方法可容易地检测到的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。术语"不可观的(not-appreciable)"和"不可观的(notappreciable)"以及等价方式是指通过标准方法无法容易地检测到或无法检测到的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。在一个实施方式中，如果事件以小于5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％或更少的次数发生，则它是不可观的。
在本说明书全文，除非上下文另有要求，否则术语"包含"，“包括”、“含有”和“具有”应理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素组。在特定实施方式中，术语"术语"包含"，“包括”、“含有”和“具有”同义使用。
"由……组成"意指包括但限于在短语"由……组成"后的任何。因此，短语"由……组成”是指示所列出的要素是需要的或强制性的，并且没有其他要素是可以存在的。
"基本上由……组成"意指包括在短语"基本上由……组成"后列出的任何要素，并且限于不干扰或贡献于所列出的要素的公开内容中指定的活动或动作的其他要素。因此，短语"基本上由……组成”是指示所列出的要素是需要的或强制性的，但没有其他要素是任选的，并且取决于它们是否影响所列出的要素的活动或动作而可以存在或不存在。
在本说明书全文，提到"一个实施方式"、"实施方式"、"特定实施方式"、"相关实施方式"、"某个实施方式"、"另外的实施方式"或"进一步的实施方式"或其组合意指与所述实施方式结合描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，前述短语在本说明书全文的各个地方的出现不一定全部指相同实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合。
术语"离体"一般指在生物体外发生的活动，例如在生物体外的人工环境中在活组织中或活组织上完成的实验或测量，优选伴随天然条件的最低限度改变。在特定实施方式中，"离体"程序涉及从生物体中获得的活细胞或组织，在实验室仪器中培养，通常在无菌条件下，且通常为数小时或高达约24小时，但包括高达48或72小时，取决于环境。在某些实施方式中，可收集且冷冻这样的组织或细胞，随后解冻用于离体处理。使用活细胞或组织的持续长于数天的组织培养实验或程序通常视为"体外"，尽管在某些实施方式中，该术语可与离体互换使用。
术语"体内"一般指在生物体内发生的活动。
如本文使用的，术语"多能干细胞"是指具有形成机体或躯体(即胚体)的所有谱系能力的细胞。例如，胚胎干细胞是能够形成来自三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)各自的细胞的一类多能干细胞。在一些方面，多能干细胞可以是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
如在本文中所使用的，"培养物"意指在培养基中生长并且任选传代的细胞群体。细胞培养物可以是原代培养物(例如，尚未被传代的培养物)或者可以是传代或继代培养物(例如，已经传代培养或传代一次或多次的细胞群体)。
如本文使用的，"基因表达"或“基因转录”是指生物样品(例如成熟肝脏细胞/不成熟肝脏细胞或包含成熟肝脏细胞/不成熟肝脏细胞的细胞群)中的基因的表达/转录和/或表达/转录模式的相对水平。在特定实施方式中，成熟肝脏细胞是诱导性成熟肝脏细胞。在特定实施方式中，不成熟肝脏细胞是诱导性不成熟肝脏细胞。
如本文使用的，"蛋白表达"是指生物样品(例如成熟肝脏细胞/不成熟肝脏细胞或包含成熟肝脏细胞/不成熟肝脏细胞的细胞群)中的蛋白的表达和/或表达模式的相对水平。在特定实施方式中，成熟肝脏细胞是诱导性成熟肝脏细胞。在特定实施方式中，不成熟肝脏细胞是诱导性不成熟肝脏细胞。
本文涵盖本领域可用的用于检测表征本发明细胞的基因的表达/转录的任何方法。如本文使用的，术语"检测表达/转录"意指测定基因的RNA转录物或其表达产物的数量或存在。用于检测基因的表达/转录的方法，即基因表达/转录谱分析，包括基于多核苷酸的杂交分析的方法、基于多核苷酸的测序的方法、免疫组织化学方法、和基于蛋白质组学的方法。所述方法一般检测感兴趣的基因的表达/转录产物(例如mRNA)。在一些实施方式中，使用基于PCR的方法例如逆转录PCR(RT-PCR)(Weis等人，TIG8:263-64，1992)，以及基于阵列的方法例如微阵列(Schena等人，Science270:467-70，1995)。
本文涵盖本领域可用的用于检测表征本发明细胞的蛋白表达的任何方法。如本文使用的，“检测蛋白表达”意指测定基因编码的蛋白质的数量或存在。用于检测蛋白表达的方法，包括基于蛋白质印迹法、免疫荧光、流式细胞仪、蛋白质质谱的方法。
"贴壁"是指在适当培养基的存在下，细胞附着至容器，例如细胞附着至无菌塑料(或涂布塑料)细胞培养皿或烧瓶。某些类别的细胞在培养中无法维持或不生长，除非它们贴壁至细胞培养容器。某些类别的细胞("非贴壁细胞")在培养中维持和/或增殖而无需贴壁。
"培养(culture)"或"细胞培养"是指在体外环境中的细胞的维持、生长和/或分化。"细胞培养基"、"培养基"、"培养介质"、"介质"、"补充物"和"培养基补充物”是指培养细胞培养物的营养组合物。
"培养物(culture)"或"细胞培养物"是指被培养的物质如细胞，和/或其中存在有被培养的物质如细胞的培养基。
"培养(cultivate)"是指在组织或机体外，例如在无菌塑料(或经涂覆塑料)细胞培养皿或烧瓶中的细胞的维持、繁殖(生长)(扩增)和/或分化。"培养"可利用培养基作为营养素、激素和/或帮助使细胞繁殖和/或维持细胞的其他因子的来源。
如本文使用的，"解离的"细胞是指已经从其他细胞或表面(例如培养板表面)基本上分开或者纯化的细胞。例如，细胞可通过机械或酶促方法从动物或组织解离。或者，体外聚集的细胞可以被酶促地或机械地彼此解离，例如通过解离成簇、单细胞或单细胞和簇的混合物的悬浮液。在另外一个可替代实施方式中，贴壁细胞从培养板或其他表面解离。解离因此可涉及破坏细胞与细胞外基质(ECM)和基底(例如培养表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
如本文使用的，术语"富集(enrich)"是指增加组合物例如细胞组合物中的指定组分的量，并且当用于描述细胞的组合物例如细胞群时，"富集的"是指与富集前细胞群中的这样的组分的比例相比较，具有按比例增加的量的指定组分的细胞群。例如，组合物例如细胞群可就靶细胞类型(即具有指定特征的细胞)而言进行富集，因此与富集前细胞群中存在的靶细胞的比例相比较，具有增加的比例或百分比的靶细胞类型。细胞群可通过本领域已知的细胞选择和分选方法就靶细胞类型进行富集。在一些实施方式中，细胞群通过分选或选择方法进行富集。在一个特定实施方式中，就靶细胞群进行富集的方法使细胞群就靶细胞群而言富集至少约20％，从而意指富集的细胞群包含比细胞群被富集前细胞群中按比例多约20％的靶细胞类型。在一个实施方式中，就靶细胞群富集的方法使细胞群就靶细胞群而言按比例富集至少约30+％、40+％、50+％、60+％、70+％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，或至少约98％，或在特定实施方式中，约99％。
基因组稳定性是指细胞忠实复制DNA且维持DNA复制过程的完整性的能力。如本文使用的，术语"基因组稳定的细胞"和"具有基因组稳定性的细胞"是指显示出一定频率的突变和染色体异常(例如易位、非整倍体、拷贝数变异和重复)的细胞，所述频率基本上类似于相对于正常人体细胞的突变和染色体异常的频率。
"成分”是指可用于细胞培养基中以维持和/或促进细胞生长和/或分化的任何化合物或其他材料，无论其来源是化学还是生物的。术语"组分"、"营养素"和"成分"可互换使用。用于细胞培养基的常规成分可包括但不限于氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等等。促进和/或维持离体或体外细胞培养的其他成分可通过本领域普通技术人员根据期望效果的需要而加以选择。
"分离(isolate)"是指使组合物或材料与其天然环境分开且收集，例如个体细胞或细胞培养物与组织或机体的分开。在一个方面，细胞群或组合物基本上不含其在自然界中可与之结合的细胞和材料。就靶细胞群而言，"分离的"或"纯化的"或"基本上纯的"是指就构成总细胞群的靶细胞而言，至少约50％、至少约75％、至少约85％、至少约90％，并且在特定实施方式中，至少约95％纯的细胞群。细胞群或组合物的纯度可通过本领域众所周知的适当方法进行评价。例如，基本上纯的肝脏细胞群是指就构成总细胞群的肝脏细胞而言，至少约50％、至少约75％、至少约85％、至少约90％，并且在特定实施方式中，至少约95％，并且在某些实施方式中，约98％纯的细胞群。
"传代(passage)"是指当细胞已增殖至所需程度时，将细胞细分且铺板到多个细胞培养表面或容器内的动作。在一些实施方式中，"传代"是指将细胞细分、稀释且铺板。当细胞从原代培养表面或容器传代到后续组的表面或容器时，后续培养在本文中可被称为"继代培养"或"第一次传代"等。每个细分和铺板到新培养容器内的动作被视为一次传代。
"铺板(plating)"是指将一个或多个细胞置于培养容器内，使得细胞贴壁至细胞培养容器且在细胞培养容器上铺展。
"增殖"是指一个细胞分裂成两个基本上等同的细胞或者细胞群数量增加(例如，以进行复制)的性质。
"繁殖"或"扩增"是指使组织或机体外的细胞例如在无菌容器例如塑料(或经涂覆塑料)细胞培养皿或烧瓶中生长(例如经由细胞增殖来复制)。
如在本文中所使用的术语“诱导性多能干细胞”(iPSC)是通过人工方式来源于非多能细胞的多能干细胞类型。
可以通过使用本领域技术人员已知的技术将充当细胞来源的适当的器官或组织分解来分离细胞。例如，可以将组织或器官机械分解和/或用消化酶和/或削弱相邻细胞之间连接的螯合剂处理，从而可以将组织分散以形成个体细胞的悬浮液，而没有可察觉的细胞损坏。可以通过将组织切碎并且用一种或多种酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等处理切碎的组织来完成酶解离。也可以通过多种方法完成机械破坏，包括但不限于使用粉碎机、搅拌机、筛、均化器、压力盒(pressure cell)、或声波器(insonator)。
通过从培养源中提取(例如，通过密度梯度离心和/或流式细胞仪)，可以得到基本上纯化的肝脏细胞群体。纯度可以通过任何适当的方法进行测量。例如，通过流式细胞仪(例如，FACS分析)，可以将肝脏细胞99％-100％纯化。例如，通过使用与肝脏细胞上的标记结合的分子(例如，抗体、抗体衍生物、配体或Fc-肽融合分子)并且从而对结合分子的细胞进行阳性选择(即，阳性选择)，可以将肝脏细胞分离。阳性选择方法的其他实例包括优先促进在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的希望的细胞类型的生长的方法。备选地，通过使用与在希望的细胞类型上不存在、但是在不希望的细胞类型上存在的标记结合的分子，可以从希望的细胞中移除含有这样的标记的不希望的细胞(即，阴性选择)。其他阴性选择方法包括优先杀伤在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的不希望的细胞类型或抑制其生长。因此，通过使用阴性选择、阳性选择、或它们的组合，可以制备干细胞的富集群体。
用于分离的过程可以包括磁性分离，使用涂布有抗体的磁珠，亲和色谱，与单克隆抗体连接的细胞毒性剂，或与单克隆抗体结合使用的这样的试剂，例如补体和细胞毒素，以及使用附着至固体基质(例如，平板)的抗体的“淘选”，或其他方便的技术。提供准确分离的技术包括荧光活化的细胞分选器，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、和阻抗通道。抗体可以与标记如允许直接分离的磁珠、可以利用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白移除的生物素、或可以与荧光活化的细胞分选器一起使用的荧光染料缀合，以允许特定细胞类型的容易的分离。可以采用对诱导的多能干细胞的活力不过度地有害的任何技术。
在特定实施方式中，给定的培养条件引起的标志物的转录或蛋白表达的增加或减少的，可以是与适当的对照相比，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000％或更多的增加或减少。
检测标志基因的转录的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，标志基因的转录可由RT-qPCR(Reverse transcription Quantitative polymerase chain reaction)方法测定。优选地，使用本文公开的方法检测标志基因的转录。
检测标志基因的蛋白表达的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，标志基因的蛋白表达可以通过蛋白质免疫印迹，免疫荧光，流式细胞仪方法进行检测。在一些实施方式中，标志基因的蛋白表达可以通过免疫荧光的方法进行检测。
本文所述的“原代肝脏细胞的典型形态特征”是指细胞具有原代肝脏细胞所特有的多角形，且细胞相对立体，同时细胞核清晰，部分细胞呈双核，细胞直径一般约15-25μM，优选约20μM。
本文所述的“白蛋白分泌能力”是指可通过任何本领域常规的方法测定的每24小时每百万个细胞的白蛋白分泌量。在一些实施方式中，测定方法是酶联免疫吸附检测方法。在一些实施方式中，所述白蛋白分泌能力由本文公开的方法测定。
本文所述的“尿素合成能力”是指可通过任何本领域常规的方法测定的每24小时每百万个细胞的合成尿素的相对量。在一些实施方式中，所述尿素合成能力由本文公开的方法测定。
本文所述的“CYP代谢酶的活力”是指可通过任何本领域常规的方法测定的细胞中CYP代谢酶的活力。所述CYP代谢酶是指细胞色素P450酶系统家族成员，其包括但不限于CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1。在一些实施方式中，所述CYP代谢酶的活力由本文公开的方法测定。
本文所述的“肝脏极性”、“细胞极性”或“肝脏细胞极性”主要体现在肝脏细胞的形态结构和功能等方面。从形态上来看，肝脏细胞膜分为3个不同的区域，即基底膜，侧膜和胆小管区；从功能上看，基底膜与肝血窦相连接，可以直接进行物质交换，侧膜主要用于相邻细胞的连接，而胆小管区则主要用于胆管的分泌(Treyer,2013)。肝脏细胞极性可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，测定方法是细胞染色方法，优选地，用于细胞染色的染料包括但不限于使用CDFDA(5-(和-6)-羧基-2’,7’-二氯荧光素(CDFDA))。在一些实施方式中，所述“肝脏极性”、“细胞极性”或“肝脏细胞极性”由本文公开的方法测定。
如本文所述的“移植存活率”是指将肝脏细胞(如诱导性成熟肝脏细胞、原代肝脏细胞或诱导性不成熟肝脏细胞)移植到肝脏损伤模型后的模式生物的存活率，所述存活率是指在一定时间后，存活的模式生物的数量与实验初始时的模式生物的比值。其可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，所述模式生物是小鼠。在一些实施方式中，所述小鼠模型是FRG小鼠模型(如Grompe M,Strom S.Mice with humanlivers.Gastroenterology.2013Dec；145(6):1209-14.doi:10.1053/j.gastro.2013.09.009.Epub 2013Sep 13.PMID:24042096中所描述的)。在一些实施方式中，所述存活率由本文公开的方法测定。
如本文所述的“体内重建率”是指将肝脏细胞(如诱导性成熟肝脏细胞、原代肝脏细胞或诱导性不成熟肝脏细胞)移植到肝脏损伤模型后的模式生物的肝脏重建率，其是指移植细胞来源的细胞数占组织中所有细胞数量的百分比，其可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，所述模式生物是小鼠。所述测定方法包括但不限于通过免疫荧光染色、免疫组织化学的方式进行测定。在一些实施方式中，所述体内重建率由本文公开的方法测定。
如本文所述的“肝脏内迁移能力”是指通过肝门静脉移植的肝脏细胞可以在肝实质区域迁移，其可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，所述测定方法是是免疫组化或者免疫组织荧光。在一些实施方式中，所述“肝脏内迁移能力”由本文公开的方法测定。
如本文所述的“人源白蛋白信号”是指移植入小鼠体内的人源肝脏细胞(原代肝脏细胞，诱导不成熟肝脏细胞，诱导成熟肝脏)表达人源白蛋白的量。。在一些实施方式中，所述测定方法是酶联免疫吸附。在一些实施方式中，所述“人源白蛋白信号”由本文公开的方法测定。
如本文所述的“人源白蛋白起峰时间”是指按照1∶100比例稀释后，小鼠血液中人源白蛋白的量达到酶联免疫吸附实验检测的最低限(300ng/ml)所需要的时间，其可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，所述测定方法是酶联免疫吸附。在一些实施方式中，所述“人源白蛋白起峰时间”由本文公开的方法测定。
如本文所述的“细胞增殖速度”是指在一定时间范围内，移植细胞在小鼠体内增长的数量，其可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，所述测定方法是酶联免疫吸附实验、免疫组化，和免疫组织荧光实验。在一些实施方式中，所述“细胞增殖速度”由本文公开的方法测定。
如本文所述的“增殖细胞质量”是指在小鼠体内增殖后的细胞中表达关键肝脏细胞的能力。其可通过任何本领域常规方法进行测定。在一些实施方式中，所述测定方法是酶联免疫吸附，免疫组织荧光或者免疫组化。在一些实施方式中，所述“细胞增殖速度”由本文公开的方法测定。
C.细胞
1.原料细胞
本文所述的“原料细胞”是指可以用于制备获得诱导性不成熟肝脏细胞的细胞。所述原料细胞包括多能干细胞胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、成纤维细胞、脂肪源性干细胞(ADSC)、神经源性干细胞、血细胞、棘突细胞、肠上皮细胞和其他非肝脏细胞的体细胞。优选地，在一些实施方式中，所述原料细胞是多能干细胞(如：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞)。更优选地，在一些实施方式中，所述原料细胞是胚胎细胞或诱导性多能干细胞。
适用于特定实施方式的原料细胞可来源于基本上任何合适的来源，就细胞类型或分化状态而言可以是异质或同质的。优选地，在一些实施方式中，合适的所述原料细胞在来源方面可以是哺乳动物，例如来自啮齿类动物、猫、犬、猪、山羊、绵羊、马、牛，或灵长类动物，例如人。在一个实施方式中，所述原料细胞是人细胞。
2.诱导性不成熟肝脏细胞
本文所述的术语“诱导性不成熟肝脏细胞”是指一种经诱导得到的不成熟的肝脏细胞，其是非天然存在的。在一些实施方式中，在形态上，诱导性不成熟肝脏细胞虽然具有原代肝脏细胞所特有的多角形，但是相对于原代肝脏细胞，诱导性不成熟肝脏细胞在体外培养条件下更为贴壁而不立体，细胞中基本没有清晰的细胞核，在部分呈现细胞核的细胞中，其核质比也相对较高。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞的选自以下的一种或多种肝脏细胞标志物的转录或蛋白表达：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1，是原代肝脏细胞的1％、0.1％、0.01％、0.001％或更少，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，相对于诱导性不成熟肝脏细胞，诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录或蛋白表达减少：AFP。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录或蛋白表达：AFP，是原代肝脏细胞的100倍、1000倍、1000倍或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞不具有原代肝脏细胞的细胞极性。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞的尿素合成能力是原代肝脏细胞的25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％或更低，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞的下述一种或多种代谢酶的活性：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1，是原代肝脏细胞的10％、5％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％或更低，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞每24小时每百万个细胞的白蛋白分泌量至多约为8μg，更优选地约7μg、6μg、5μg、4μg、3μg、2μg、1μg、0.5μg、0.2μg、0.1μg、0.05μg、0.02μg、0.01μg、0.001μg、0.0001μg或更少，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞的移植存活率是原代肝脏细胞的10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.01％或更低、或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞的体内重建率是原代肝脏细胞的5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.01％或更低、或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞可以由原料细胞制备得到。在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞可用于制备诱导性成熟肝脏细胞。
诱导性不成熟肝脏细胞可由本领域已知的常规方法制备得到。在一些实施方式中，诱导性不成熟肝脏细胞的制备方法如(Zhu et al.,2014Mouse liver repopulationwith hepatocytes generated from human fibroblasts.Nature 508,93-97.10.1038/nature13020.)中所描述的，其全部内容通过引入全文并入本文。在一些优选的实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞可以由本发明公开的方法制备得到。在一些实施方式中，由本领域已知的制备诱导性不成熟肝脏细胞的常规方法制备得到的细胞是诱导性不成熟肝脏细胞。
所述诱导性不成熟肝脏细胞在本领域中亦被称为“f-iHep”、“iHep”。在一些现有技术中，诱导性不成熟肝脏细胞也被称为“诱导性肝脏细胞”。
适用于特定实施方式的诱导性不成熟肝脏细胞可来源于基本上任何合适的来源，就细胞类型或分化状态而言可以是异质或同质的。优选地，在一些实施方式中，合适的所述诱导性不成熟肝脏细胞在来源方面可以是哺乳动物，例如来自啮齿类动物、猫、犬、猪、山羊、绵羊、马、牛，或灵长类动物，例如人。在一个实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞是人细胞。
3.诱导性成熟肝脏细胞
本文所述的术语“诱导性成熟肝脏细胞”是指经诱导得到的成熟的肝脏细胞。其是非天然存在的。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞可由本文所述的方法或培养平台制备得到。
在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞原代肝脏细胞的典型形态特征。
在一些实施方式中，相对于诱导性不成熟肝脏细胞，诱导性成熟肝脏细胞的选自以下的一种或多种肝脏细胞标志物的转录和/或蛋白表达增加：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1；在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的选自以下的一种和/或多种肝脏细胞标志物的转录或蛋白表达：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1，是诱导性不成熟肝脏细胞的10倍、20倍、30倍、100倍、1000倍或更高，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的选自以下的一种或多种肝脏细胞标志物的转录或蛋白表达：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1，是原代肝脏细胞的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％或150％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，相对于诱导性不成熟肝脏细胞，诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录或蛋白表达减少：AFP。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录和/或蛋白表达：AFP，是诱导性不成熟肝脏细胞的10％、9％、8％、5％、3％、1％、0.1％、0.01％或更低，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录和/或蛋白表达：AFP，是原代肝脏细胞的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，相对于诱导性不成熟肝脏细胞，诱导性成熟肝脏细胞具有细胞极性。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的细胞极性接近、不低于或与原代肝脏细胞相同。
在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的尿素合成能力是诱导性不成熟肝脏细胞的1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、、3.2倍、3.4倍、3.6倍、3.8倍、4.0倍、4.2倍、4.4倍、4.6倍、4.8倍、5.0倍、5.2倍、5.4倍、5.6倍、5.8倍、6.0倍或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的尿素合成能力是原代肝脏细胞的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的下述一种或多种代谢酶的活性：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1，是诱导性不成熟肝脏细胞的10倍、100倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、500000倍或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的下述一种或多种代谢酶的活性：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1，是原代肝脏细胞的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，所述诱导性成熟肝脏细胞每24小时每百万个细胞的白蛋白分泌量至少约为8μg，更优选地至少约9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的移植存活率是诱导性不成熟肝脏细胞的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的移植存活率是原代肝脏细胞的50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的体内重建率是诱导性不成熟肝脏细胞的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍或更多，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。在一些实施方式中，诱导性成熟肝脏细胞的体内重建率是原代肝脏细胞的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
如前所述，根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞可以通过以上特征中的一种或多种进行表征。该等表征可以使用本文所述或者本领域技术人员熟知的任一方法进行。在一些实施方式中，该等表征使用本文所述的方法进行。在一些实施方式中，该等表征使用本文实施例所述的方法进行。
为了进一步探索诱导性成熟肝脏细胞的分子生物学特征，还可以利用转录组测序(RNA-seq)分析与诱导性不成熟肝脏细胞相比获得的诱导性不成熟肝脏细胞的转录水平的变化。这可以包括分析成熟肝脏细胞标志基因在诱导性不成熟肝脏细胞和诱导性成熟肝脏细胞中的富集情况(GSEA分析)。经分析发现成熟肝脏细胞标志基因的特异表达可以在根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞中显著富集。
可以通过聚类分析来分析起始使用的诱导性不成熟肝脏细胞和根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞与原代肝脏细胞的全转录组水平的相似性。
可以通过全转录组的主成分分析(PCA)，确认根据诱导性成熟肝脏细胞接近于原代肝脏细胞。
可以发现，原代肝脏细胞标志基因集可以在根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞中显著富集。
可以使用显微镜对获得的诱导性成熟肝脏细胞进行观察，由此可以判断诱导性成熟肝脏细胞的形态。可以发现，根据本发明获得的诱导性成熟肝脏细胞的形态与原代肝脏细胞一致，细胞之间的极性清晰且细胞核质比明显缩小，部分细胞呈现出双核的形态。
在一些特定实施方式中，可使用本文考虑的组合物和方法进行培养、解离和传代一个或多个细胞。在一些实施方式中，使用本文考虑的组合物和方法进行培养、解离和传代单细胞。在一些实施方式中，使用本文考虑的组合物和方法进行培养、解离和传代细胞群或多个细胞。
D.可用于诱导产生诱导性成熟肝脏细胞的培养平台
细胞建库、疾病建模和细胞疗法等应用已对制备高质量的诱导性成熟肝脏细胞提出了持续增加的需求。本发明提供了可用于诱导产生诱导性成熟肝脏细胞的培养平台，其采用特定的组合物。
本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中的具体化合物的量可以发生变化，可以根据具体培养条件进行优化，包括所用具体分子和组合、在培养基中培养的细胞的类型，以及具体应用。
在另一个方面，本发明提供了一种第一组合物，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；以及(e)TGF-beta信号通路抑制剂。优选地，在一些实施方式中，所述第一组合物进一步包含：(f)p38 MAPK抑制剂。
在一个方面，本发明提供了一种第一试剂盒，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；以及(e)TGF-beta信号通路抑制剂。优选地，在一些实施方式中，所述第一试剂盒进一步包含：(f)p38 MAPK抑制剂。
在另一个方面，本发明提供了一种第二组合物，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；以及(c)TGF-beta信号通路抑制剂。
在一个方面，本发明提供了一种第二试剂盒，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；以及(c)TGF-beta信号通路抑制剂。
1.HDAC抑制剂
HDAC(组蛋白去乙酰化酶，histone deacetylase)抑制剂可以是能够抑制HDAC的各种各样的物质。HDAC抑制剂包括，但不限于，Mocetinostat(MGCD0103)、Abexinostat(PCI-24781)、Fimepinostat(CUDC-907)、ITSA-1、Vorinostat(SAHA)、MS-275、Panobinostat(LBH589)、Quisinostat、FK228、SB939、Trichostatin A(TSA)。优选地，在一些实施方式中，HDAC抑制剂是MS-275，如下式所示
2.类固醇类化合物
类固醇类化合物是指由四环结构的甾族化合物衍生出来的各种各样的物质。类固醇类化合物包括，但不限于，泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松。优选地，在一些实施方式中，类固醇类化合物是地塞米松，如下式所示
3.Notch信号通路抑制剂
Notch信号通路抑制剂可以是能够抑制Notch信号通路的各种各样的物质。Notch信号通路抑制剂包括，但不限于，IMR-1、RO4929097、Semagacestat(LY450139)、Avagacestat(BMS-708163)、Dibenzazepine(YO-01027)、Crenigacestat(LY3039478)、Compound E、DAPT。优选地，在一些实施方式中，Notch信号通路抑制剂、Compound E，如下式所示
4.MEK抑制剂
MEK抑制剂可以是能够抑制MEK的各种各样的物质。MEK抑制剂包括，但不限于，SeluMetinib(AZD6244)、Trametinib(GSK1120212)、PD0325901、U0126-ETOH、PD184352(CI-1040)。优选地，在一些实施方式中，MEK抑制剂是PD0325901，如下式所示
5.TGF-beta信号通路抑制剂
TGF-beta信号通路抑制剂可以是能够抑制ALK的各种各样的物质。TGF-beta信号通路抑制剂包括，但不限于，SD-208、LY2109761、BIBF-0775、A83-01、SB431542。优选地，在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01，如下式所示
6.p38 MAPK抑制剂
p38 MAPK抑制剂可以是能够抑制p38 MAPK的各种各样的物质。p38 MAPK抑制剂包括，但不限于，SB202190(FHPI)、SB203580、TAK-715、Doramapimod(BIRB 796)。优选地，在一些实施方式中，p38 MAPK抑制剂是SB203580，如下式所示
7.cAMP激活剂
cAMP激活剂可以是能够激活cAMP的各种各样的物质。示例性cAMP激活剂包括，但不限于，Forskolin、8-Br-cAMP。优选地，在一些实施方式中，cAMP激活剂是Forskolin，如下式所示
8.ROCK抑制剂
cAMP激活剂可以是能够抑制ROCK的各种各样的物质。示例性ROCK抑制剂包括，但不限于，Y-27632、Thiazovivin、GSK429286A、RKI-1447、AT13148。优选地，在一些实施方式中，ROCK抑制剂是Y-27632，如下式所示
9.组分的量
第一组合物
在一些实施方式中，HDAC抑制剂以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，HDAC抑制剂以0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。优选地，HDAC抑制剂以0.01-1μM，优选0.1-1μM，更优选1.0μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述HDAC抑制剂是MS-275，其以0.2μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。
在一些实施方式中，类固醇类化合物以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，类固醇类化合物以0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0μM或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。优选地，类固醇类化合物以0.1-4.0μM，优选0.2-2.0μM，更优选0.1μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述类固醇类化合物是地塞米松，其以0.1μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。
在一些实施方式中，Notch信号通路抑制剂以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，Notch信号通路抑制剂以0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。优选地，Notch信号通路抑制剂以0.1-4.0μM，优选0.2-2.0μM，更优选0.1μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述Notch信号通路抑制剂是Compound E，其以0.1μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。
在一些实施方式中，MEK抑制剂以足以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，MEK抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。优选地，MEK抑制剂以0.05-5μM，优选0.1-2μM，更优选1.0μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述MEK抑制剂是PD0325901，其以1.0μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。
在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂以足以单独或与其他物质来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。优选地，TGF-beta信号通路抑制剂以0.05-5μM，优选0.1-2μM，更优选0.5μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01，其以0.5μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。
在一些实施方式中，p38 MAPK抑制剂以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，p38 MAPK抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。优选地，p38 MAPK抑制剂以1.0-50.0μM，优选2.0-40.0μM，更优选30.0μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述p38 MAPK抑制剂是SB203580，其以30.0μM的浓度存在于本发明的第一培养基或培养物中。
优选地，在一些实施方式中，所述第一组合物中，所述HDAC抑制剂是MS-275、所述类固醇类化合物是地塞米松、所述Notch信号通路抑制剂是Compound E、所述MEK抑制剂是PD0325901、所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01。更优选地，在一些实施方式中，MS-275在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.2μM，地塞米松在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.1μM，Compound E在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.1μM，PD0325901在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为1.0μM，A83-01在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.2μM。
优选地，在一些实施方式中，所述第一组合物中进一步包含p38MAPK抑制剂。优选地，在一些实施方式中，所述HDAC抑制剂是MS-275、所述类固醇类化合物是地塞米松、所述Notch信号通路抑制剂是Compound E、所述MEK抑制剂是PD0325901、所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01、所述p38 MAPK抑制剂是SB203580。更优选地，在一些实施方式中，MS-275在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.2μM，地塞米松在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.1μM，Compound E在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.1μM，PD0325901在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为1.0μM，A83-01在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为0.5μM，SB203580在本发明的第一培养基或培养物中的浓度为30.0μM。
第二组合物
在一些实施方式中，cAMP激活剂以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，cAMP激活剂以0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。优选地，所述cAMP激活剂以1.0-50.0μM，优选10.0-40.0μM，更优选30.0μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述cAMP激活剂是Forskolin，其以30.0μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。
在一些实施方式中，ROCK抑制剂以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，ROCK抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、30.0、40.0、50.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。优选地，所述ROCK抑制剂以1.0-50.0μM，优选10.0-40.0μM，更优选10.0μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述ROCK抑制剂是Y-27632，其以10.0μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。
在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0μM或更高或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。优选地，所述TGF-beta信号通路抑制剂以0.05-5.0μM，优选0.1-2.0μM，更优选1.0μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01，其以1.0μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。
在一些实施方式中，类固醇类化合物以足以单独或与其他物质组合来诱导制备诱导性成熟肝脏细胞的量或浓度存在于本发明的组合物、试剂盒、培养基或培养物中。在一些实施方式中，类固醇类化合物以0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0μM或前述数值中的任意两者组成的范围的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。优选地，类固醇类化合物以0.1-4.0μM，优选0.2-2.0μM，更优选0.1μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。最优选地，在一个实施方式中，所述类固醇类化合物是地塞米松，其以0.1μM的浓度存在于本发明的第二培养基或培养物中。
在一些实施方式中，HDAC抑制剂有助于制备诱导性成熟肝脏细胞。优选地，所述HDAC抑制剂是MS-275。
在一些实施方式中，优选地，所述第二组合物中，所述cAMP激活剂是Forskolin、所述ROCK抑制剂是Y-27632、所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01、所述类固醇类化合物是地塞米松。更优选地，Forskolin在本发明的第二培养基或培养物中的浓度为30.0μM，Y-27632在本发明的第二培养基或培养物中的浓度为10.0μM，A83-01在本发明的第二培养基或培养物中的浓度为1.0μM，地塞米松在本发明的第二培养基或培养物中的浓度为0.1μM。
本文所述的部分物质的CAS号如下：
本领域技术人员能够理解，上述物质的相应的药学上可接受的盐也能够应用于本发明中，同时也在本发明的保护范围内。
E.培养基
在一个方面，本发明提供了一种第一培养基。在一个方面，本发明提供了一种第二培养基。在一些方面，本文所述的第一培养基和第二培养基可以用于制备本文所述的诱导性成熟肝脏细胞。
在一些实施方式中，本发明的培养基包含基础培养基。示例性基础培养基包括，但不限于，DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F 12、HCM和William’E。在一些实施方式中，所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E。所述基础培养基可以市售购买。
在一些方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含HEM-1培养基和HEM-2培养基，其中所述HEM-1培养基包含ROCK抑制剂、肝脏细胞生长因子(HGF)、抑瘤素M(oncostatinM,OSM)、类固醇类化合物、Notch信号通路抑制剂、TGF-beta信号通路抑制剂和去除表皮细胞生长因子(EGF)的HCM培养基；所述HEM-2培养基包含肝脏细胞生长因子(HGF)、抑瘤素M(oncostatinM,OSM)、类固醇类化合物、Notch信号通路抑制剂、TGF-beta信号通路抑制剂和去除表皮细胞生长因子(EGF)的HCM培养基。优选地，所述ROCK抑制剂是Y-27632；所述类固醇类化合物是地塞米松；所述Notch信号通路抑制剂是Compound E；所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01。优选地，在一些实施方式中，ROCK抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，存在于HEM-1培养基中。更优选地，在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂是Y-27632，且以10.0μM存在于HEM-1培养基中。优选地，在一些实施方式中，肝脏细胞生长因子以1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35ng/ml，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。更优选地，在一些实施方式中，所述肝脏细胞生长因子以20ng/ml存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。优选地，在一些实施方式中，抑瘤素M以1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35ng/ml，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。更优选地，在一些实施方式中，所述抑瘤素M以20ng/ml存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。优选地，在一些实施方式中，类固醇类化合物以0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。更优选地，在一些实施方式中，所述类固醇类化合物是地塞米松，且以0.1μM存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。优选地，在一些实施方式中，Notch信号通路抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。更优选地，在一些实施方式中，所述Notch信号通路抑制剂是Compound E，且以0.1μM存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。优选地，在一些实施方式中，TGF-beta信号通路抑制剂以0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。更优选地，在一些实施方式中，所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01，且以0.5μM存在于HEM-1培养基或HEM-2培养基中。
在一些实施方式中，如本文所述的培养基包含胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)，胎牛血清的含量可以根据本领域技术人员的知识进行常规调整。优选地，在一些实施方式中，如本文所述的第二培养基的胎牛血清的含量为培养基总体积的0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10.0％、11.0％、12.0％、13.0％、14.0％、15.0％、16.0％、17.0％、18.0％、19.0％、20.0％或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。优选地，在一些实施方式中，第二培养基中的胎牛血清的含量为第二培养基总体积的0.05％～10％，更优选地为1％。优选地，在一些实施方式中，所述第一培养基不含有血清。
在特定实施方式中，本发明的培养基含有细胞因子和/或生长因子。在特定实施方式中，本发明的培养基基本上不含或不含细胞因子和/或生长因子。在某些实施方式中，培养基含有一种或多种补充物，包括但不限于血清、提取物、生长因子、激素、细胞因子等等。在一些实施方式中，本文所述的培养基包含：青霉素/链霉素，非必需氨基酸，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺，烟酰胺，N-乙酰-L-半胱氨酸。
任何合适的容器或细胞培养容器均可用作基础培养基和/或细胞培养补充物中的细胞培养的支持物。在支持物上的基质涂层不是必要的。然而，用贴壁促进基质(例如胶原、纤连蛋白、含RGD多肽、明胶等等)涂布培养容器的表面促进细胞的附着，并且在特定实施方式中，可增强本文公开的培养基和补充物的效应。用于培养和传代细胞的合适基质是本领域已知的，并且包括但不限于玻连蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原、弹性蛋白、骨桥蛋白、天然存在的细胞系生产的基质的混合物例如MatrigelTM以及合成或人造表面例如聚胺单层和羧基封端单层。
F.细胞制备方法
在一个方面，本发明提供了一种制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，所述方法包括在培养基中培养诱导性不成熟肝脏细胞，由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。在一些实施方式中，所述培养基是本文所述的第一培养基和第二培养基。在一个方面，本发明提供了一种制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，所述制备方法包括使诱导性不成熟肝脏细胞与本文所述的第一组合物或第二组合物接触，由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。
在一些实施方式中，使用本文所述的第一组合物或第一培养基培养诱导性不成熟肝脏细胞，由此制备诱导性成熟肝脏细胞。在一些实施方式中，使用所述第一组合物、第一培养基培养诱导性不成熟肝脏细胞的培养时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。优选地，培养时间为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。更优选地，培养时间为6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。优选地，在一些实施方式中，进一步使用本文所述的第二组合物或第二培养基培养上述经第一组合物或第一培养基培养后的细胞，以获得诱导性成熟肝脏细胞。在一些实施方式中，使用所述第二组合物或第二培养基进行培养，培养时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、60、90、120天、150天、180天、270天、360天或更长，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。优选地，培养时间为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。更优选地，培养时间为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值。
在一些实施方式中，本发明的方法包括使用本文所述的方法在培养基中培养并诱导多能干细胞，由此制备所述的诱导性不成熟肝脏细胞。
用作本发明的方法的起始细胞是诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性不成熟肝脏细胞可以由如本文所述的各种各样的原料细胞制备得到。例如，可以由多能干细胞例如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞制备得到诱导性不成熟肝脏细胞。
在一些实施方式中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在一些实施方式中，所述方法包括将非多能性细胞重编程为多能干细胞。在一些实施方式中，所述非多能性细胞选自体细胞和/或成体干细胞。
在一些实施方式中，所述将非多能性细胞重编程为多能干细胞包括在所述非多能性细胞内表达选自Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc中的一种或多种重编程因子。
到目前为止，还没有关于扩增诱导性不成熟肝脏细胞的方法的报道。
在一些方面，本发明提供了一种扩增诱导性不成熟肝脏细胞的方法，其包括使用本发明的HEM-1培养基或HEM-2接触本文所述的诱导性不成熟肝脏细胞。优选地，诱导性不成熟肝脏细胞通过本文所述的方法制备得到。优选地，使用本发明的HEM-1培养基培养诱导性不成熟肝脏细胞1天后，再使用HEM-2培养基连续培养7天。更优选地，每两天进行换液(即更新培养基)。
在一些实施方式中，根据本发明提供的发明扩增诱导性不成熟肝脏细胞可使得所述诱导性不成熟肝脏细胞维持其分化状态。在一些实施方式中，根据本发明提供的发明扩增诱导性不成熟肝脏细胞可使得所述诱导性不成熟肝脏细胞每7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或1天，或者任意前述值作为端点构成的范围或其中的任意值，扩增一倍。
G.培养物
在一个方面，本发明提供了一种培养物，其包含本文所述的培养基和诱导性成熟肝脏细胞。在一些实施方式中，所述培养基包含本文所述的第一培养基、第二培养基。
包含在本文所述的培养物中的细胞可以是如本文所述的各种各样的细胞。例如，所述细胞可以是用于本文所述的培养或诱导的起始细胞如诱导性不成熟肝脏细胞、原料细胞如多能干细胞(如：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞)。或者，所述细胞可以是本文所述的培养或诱导产生的中间细胞或最终细胞。所述中间细胞可以是具有不同于起始细胞和最终细胞的各种各样发育潜能的细胞。所述最终细胞可以是如本文所述的诱导性成熟肝脏细胞。
在一些实施方式中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
在一些实施方式中，根据本发明的培养物包含本文所述的培养基和多能干细胞。
在一些实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞由多能干细胞制备获得。在一些实施方式中，所述多能干细胞是胚胎干细胞。在一些实施方式中，所述多能干细胞是诱导性多能干细胞。
优选地，在一些实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞可通过本文所述的方法制备。
在一些实施方式中，所述多能干细胞可以由本领域已知的方法获得。在一些实施方式中，所述诱导性不成熟肝脏细胞可以由本领域已知的方法获得。
H.应用
根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞可以用于科研、产业和临床上期望的各种各样的用途。例如，制备用于肝脏细胞移植的细胞、构建肝脏相关疾病模型、肝脏疾病相关药物筛选与鉴定，药物肝脏毒性筛选与鉴定，体外构建肝脏器官(含3D打印肝脏器官)或其他潜在科研、治疗和诊断应用。
根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞可以用于诱导产生类器官(organoid)。所述类器官可用于构建疾病模型、移植治疗或其他潜在科研、治疗和诊断应用。在一个方面，本发明提供了一种类器官，其产生自本文所述的诱导性成熟肝脏细胞。所述类器官可以是包括但不限于肝脏。
根据本发明的诱导性成熟肝脏细胞可以用于诱导产生组织(tissue)，例如3D打印肝脏。所述组织可用于制备用于肝脏细胞移植的细胞、构建肝脏相关疾病模型、肝脏疾病相关药物筛选与鉴定，药物肝脏毒性筛选与鉴定，体外构建肝脏器官(含3D打印肝脏器官)或其他潜在科研、治疗和诊断应用。在一个方面，本发明提供了一种组织，其产生自本文所述的诱导性成熟肝脏细胞。所述组织包括但不限于肝脏。
本说明书中引用的所有公开文件、专利申请和授权专利以引用的方式并入本文，如同每个个体公开文件、专利申请或授权专利特别且各自指出以引用的方式并入。
尽管本发明已通过举例说明和例子略微详细地进行描述用于明确理解的目的，但对于本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的教导，可对其作出某些改变和修饰，而不背离所附权利要求的精神或范围。提供下述实施例仅作为例子而不是限制。本领域技术人员容易认识到可改变或修饰以获得基本上相似的结果的各种非关键参数。
实施例
以下实施例作为例子提供，不限制本发明的范围。本领域技术人员容易认识到可改变或修饰以获得基本上相似的结果的各种非关键参数。
以下实施例中使用的培养基组成如表1
实施例1：诱导性成熟肝脏细胞的诱导与产生
在37℃，5％CO2的培养箱中，用mTeSR(STEMCELL，5850)将胚胎干细胞H9(Wicell)培养于被Matrigel(Corning，354248)处理过的细胞培养皿中，待细胞生长至相对于培养孔底面积的密度为90％时准备进行分化。去掉培养皿中原有的培养基，然后用DPBS(Invitrogen，14190367)润洗一次。加入D1培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时。
去掉D1培养基并加入D2培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时。
去掉D2培养基并加入D3培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养72小时，得到内胚层细胞。
去掉D3培养基，并加入HDM培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养96小时，期间培养48小时的时候进行一次换液，由此将内胚层细胞分化为肝干细胞。
之后，通过以下步骤将得到的肝干细胞分化为细胞1：去掉HDM培养基，并加入HCM诱导培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养10-14天，期间每48小时进行一次换液，由此得到细胞1。
将上述所得的细胞1用AccutaseTM(STEMCELL)在37℃消化3分钟，之后将其传代(传代比例为1∶4)到被Matrigel处理过的培养皿中。使用如下培养基1和培养基2在37℃，5％CO2的培养箱中对得到的细胞1进行培养和扩增。使用培养基1培养1天，之后换用培养基2培养7天，期间每48小时换液一次。
去掉HEM培养基，并加入5C培养基或6C培养基，在37℃，5％CO2的培养箱中培养10～15天，期间每48小时换液一次，由此得到细胞2。
结果如图1所示，经5C培养基或6C培养基培养得到的细胞2呈现出原代肝脏细胞的典型形态特征。细胞之间的极性变得清晰，而且细胞的核质比变得小，部分细胞呈现出了双核。
进一步使用经6C培养基培养得到的细胞2，去掉6C培养基，使用如下4C培养基在37℃，5％CO2的培养箱中继续培养35天，期间每48小时换液一次，由此得到细胞3。
结果如图1所示，细胞3呈现出了与原代肝脏细胞相一致的形态特征。与细胞1相比，细胞3之间的极性变得更加清晰，而且细胞的核质比变得越来越小，部分细胞呈现出了双核。
本实施例1中的细胞1属于本发明所述的诱导性不成熟肝脏细胞。实施例中的细胞2和细胞3属于本发明所述的诱导性成熟肝脏细胞。本实施例1中的培养基1属于本发明所述的HEM-1培养基。培养基2属于本发明所述的HEM-2培养基。本实施例1中的5C培养基和6C培养基均属于本发明所述的第一培养基，4C培养基属于本发明所述的第二培养基。
实施例2：测定诱导性成熟肝脏细胞中肝脏成熟相关标记基因的表达
收取实施例1中的细胞1(作为对照)、细胞2和细胞3。以及收取经DMSO平行处理的细胞1(即细胞2对照(DMSO)和细胞3对照(DMSO))作为对照，然后使用Trizol试剂盒(Gibico)，按照试剂盒中的方法分别提取总mRNA。之后利用RT-qPCR方法(Bio-rad)检测所有收取的mRNA中的肝脏成熟相关基因的表达。首先按照Axcygen mRNA提取试剂盒(AP-MN-250)提取细胞中的总RNA；之后利用Bio-Rad的iScript cDNA synthesis试剂盒(1708890)将1μg-2μg的mRNA反转为cDNA；然后利用Bio-Rad的SYBR Green Supermix(1708882AP)在Biorad的C1000仪器上展开qRT-PCR实验。实验中所用到的引物如下表(表1)所示。
表1：RT-qPCR引物序列
“*”所标注的引物选自已经发表的文献(Zhu et al.，2014 Mouse liverrepopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts.Nature 508，93-97.10.1038/nature13020.)。
结果如图2A所示。通过RT-qPCR的实验结果可以看出，相对于细胞1，细胞2和细胞3的CYP 1A2基因和CYP3A4基因的表达有了近30倍和近100倍的提高，酪氨酸代谢相关的TAT基因的表达也有了近100倍的提升。此外，细胞2和细胞3的胆酸代谢相关基因CYP7A1和白蛋白(ALB)基因的表达增加，细胞2和细胞3的胎肝相关的AFP基因的表达降低。
发明人还通过免疫荧光的方法检测了成熟相关标记基因的表达，所用的免疫荧光检测方法如下：用DPBS将上述细胞1、细胞2和细胞3的润洗三遍，之后利用4％的多聚甲醛(sigma，P6148)将细胞在室温固定30分钟；去掉4％的多聚甲醛，加入0.1％Triton-100(0.1体积％的Triton-100溶于PBS中)室温处理30分钟；之后去掉0.1％的Triton-100，并加入3.5％的BSA处理2小时；用封闭液(含有3重量％的BSA的PBS溶液)稀释一抗抗体(此处即抗白蛋白抗体(Bethyl，A80-129A)、抗HNF4alph抗体(Cell Signaling Technology，3113s)、抗AFP抗体(Cell Signaling Technology，4448)、抗CK18抗体(Abcam，ab82254)、抗CYP1A2抗体(BIO-RAD，AHP622Z)、抗CYP3A4抗体(BIO-RAD，AHP610Z)、抗CYP2D6抗体(Sigma-Aldrich，AV41675)和抗CYP29抗体(BIO-RAD，AHP617Z)，并在4℃条件下孵育过夜，其中抗白蛋白抗体的稀释比例为1∶3000，抗HNF4alpha抗体、抗AFP抗体、抗CK18抗体、抗CYP1A2抗体、抗CYP3A4抗体、抗CYP2D6抗体和抗CYP29抗体稀释比例为1∶1000；洗去一抗，用封闭液润洗三遍，每次15分钟；加入二抗(donky anti-rabbit 555/donky anti-goat488(1∶1000，invitrogen))，室温孵育2小时；去掉二抗，DPBS润洗三遍，加入DAPI(Roche)对细胞核进行染色，之后利用荧光显微镜(Leica)观察染色的效果。
结果如图2B所示，细胞2和细胞3可以表达多个与肝脏成熟相关的标记基因。
本实施例2中的细胞1属于本发明所述的诱导性不成熟肝脏细胞。实施例中的细胞2和细胞3属于本发明所述的诱导性成熟肝脏细胞。
实施例3对诱导性成熟肝脏细胞的肝脏极性和功能的分析
发明人进一步对实施例1中获得细胞1(作为对照)、细胞2和细胞3的肝脏极性以及肝脏相关功能进行了测试，实验方法如下：利用20μM的CDFDA(5-(和-6)-羧基-2’，7’-二氯荧光素(sigma，21884)对细胞1、细胞2和细胞3染色30分钟后，用HBSS(Gibico)清洗3遍，之后在荧光显微镜下观察。以此，测定细胞的肝脏极性。
利用CYP450活性检测试剂盒(Luciferin-IPA，V8421和V9001)，按照该试剂盒中所述的方法，对细胞中的CYP1A2和CYP3A4活性进行检测。利用ALB ELISA检测试剂盒(E80-129；Bethyl)和尿素检测试剂盒(BioAssay Systems)，按照该试剂盒中所述的方法，检测细胞分泌白蛋白和合成尿素的能力。
结果如图3所示，相比于细胞1，细胞2和细胞3的细胞极性具有显著提升，并与原代肝脏细胞的极性相近(图3A，从图3A中可以看出，细胞2和细胞3中的荧光染料能够在细胞内流动转运，即能够从细胞的一侧运输到细胞的另一侧；而细胞1中的荧光染料则没有表现出流动性，这说明细胞2和细胞3的细胞极性相对于细胞2和细胞3具有显著改善)。相比于细胞1，细胞2和细胞3的CYP1A2和CYP3A4代谢酶活力具有显著提升(图3D)。细胞2和细胞3的白蛋白分泌能力分别达到了10μg/1百万细胞/24小时以上和20μg/1百万细胞/24小时，接近甚至超过原代肝脏细胞的白蛋白分泌能力(图3B)。相比于细胞1，细胞2和细胞3的尿素合成能力也有了显著提升，接近了已报道的原代肝脏细胞水平(图3C)。
本实施例3中的细胞1属于本发明所述的诱导性不成熟肝脏细胞。实施例中的细胞2和细胞3属于本发明所述的诱导性成熟肝脏细胞。
实施例4诱导性成熟肝脏细胞在慢性肝脏损伤小鼠FRG模型中的体内重建率，并诱 导性成熟肝脏细胞能够有效缓解和改善小鼠的肝脏损伤情况和存活率
发明人还测试了实施例1中获得的细胞1，、细胞2和细胞3在肝伤小鼠FRG(如Grompe M，Strom S.Mice with hμMan livers.Gastroenterology.2013Dec；145(6)：1209-14.doi：10.1053/j.gastro.2013.09.009.Epub 2013Sep 13.PMID：24042096中所描述的)中的体内重建率和对该小鼠的肝脏损伤改善情况和存活率的影响。
实验方案如下：该模型小鼠在饲养条件下，需将尼替西农(Nitisinone，selleck，S5325，CAS号为104206-65-7)以16mg/ml的浓度添加到日常的饮用水中。移植前1天，停止在饮用水中添加尼替西农，同时给小鼠注射Ad-uPA(Yecuris，20-0029)病毒，注射量为每克小鼠的体重注射5*107pfu的Ad-uPA病毒。24小时之后，在异氟烷的麻醉下，在腹部左侧切口，脾内注射肝脏细胞。
其中，12只小鼠接受了成人原代肝脏细胞注射，用量为每只小鼠50万细胞。13只小鼠接受了细胞1注射，21只小鼠接受了细胞2注射，12只小鼠接受了细胞3注射，用量均为每只小鼠100万细胞。
移植术后，当小鼠体重下降20％时，小鼠接受3-4天的NTBC治疗。之后，监测小鼠的状态，记录小鼠的死亡天数。
结果如图4C所示。相比于细胞1，细胞2和细胞3移植后小鼠的存活率显著升高，并与成人原代肝脏细胞移植后的存活率基本相同。
此外，通过Cobas的501仪器，并按照仪器说明书测定谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的血液表达量。
结果如图4D所示。相比于细胞1，细胞2和细胞3移植后小鼠的谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的血液表达量显著降低。
发明人还通过免疫组织荧光的方法测试了移植后小鼠肝脏的体内重建率，实验方案如下：将组织石蜡包埋后，按照5μm的厚度对其进行切片。切片后的样本用二甲苯脱蜡3次，每次5分钟；之后使用下列试剂进行梯度复水：100％乙醇，100％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，各5分钟。之后使用去离子水浸泡1分钟；然后用pH＝6.0的柠檬酸钠进行抗原修复，之后浸泡在PBS中备用；在样品周围用ImmunoPen画圈，用3％的BSA-PBS室温孵育封闭20分钟，之后用PBS洗3次；加一抗，其中ALB(Bethyl，A80-229A)，CYP1A2(BIO-RAD，AHP622Z)，CYP3A4(BIO-RAD，AHP610Z)均按照1∶1000的比例稀释，将切片放在湿盒内，封好，4度过夜；PBS洗三次，每次5分钟；加二抗驴抗羊488IgG(invitrogen，1∶1000)和驴抗兔555IgG(Invitrogen，1∶1000)，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。DAPI(1∶3000)染色10min，之后用中性树脂封片保存，之后镜下观察。
结果如图4B所示，细胞3具有与原代肝脏细胞类似的体内重建率。同时，从图4B中能够看出，移植后的原代肝脏细胞与细胞3均能够均匀分布在肝脏实质中，而非仅仅主要集中在肝门静脉处，由此说明细胞3具有优异的肝脏内迁移能力。
发明人还通过ALB ELISA检测试剂盒(E80-129；Bethyl)，按照试剂盒中所述方法，检测移植后不同天数的小鼠血液中的白蛋白浓度，由此测定人源白蛋白起峰时间。
结果如图4A所示，细胞3移植后，小鼠血液中的白蛋白浓度的升高速度与原代肝脏细胞移植后基本相同，人源白蛋白起峰时间与原代肝脏细胞移植后基本相同。
本实施例4中的细胞1属于本发明所述的诱导性不成熟肝脏细胞。实施例中的细胞2和细胞3属于本发明所述的诱导性成熟肝脏细胞。
实施例5使用HEM-1培养基和HEM-2培养基扩增诱导性不成熟肝脏细胞
发明人还测试了使用本发明的HEM培养基扩增实施例1所得的细胞1。具体扩增方法如下：在第0天消化细胞后，使用培养基1培养细胞24小时，所述培养基1的组成为，在去除EGF因子的HCM培养基(Lonza，3198)中加入10μM Y-27632(Selleck，S6390)、20ng/ml肝脏细胞生长因子(HGF)(Peprotech，100-39H)、20ng/ml抑瘤素M(OSM)(Peprotech，300-10)、0.1μM地塞米松(Gibco，D4902)、0.5μM A83-01(Tocris，2939)、0.1μM Compound E(Tocris，6476/1)。
之后，即第1天同一时间，进行换液，将培养基替换为培养基2，所述培养基2的组成为在去除EGF因子的HCM培养基(LonZa，3198)中加入20ng/ml肝脏细胞生长因子(HGF)(Peprotech，100-39H)、20ng/ml抑瘤素M(OSM)(Peprotech，300-10)、0.1μM地塞米松(Gibco，D4902)、0.5μM A83-01(Tocris，2939)、0.1μM Compound E(Tocris，6476/1)。扩增时每两天使用培养基2换液一次。
结果如图5所示，可以看出，此方法能够有效地扩增细胞1。由此扩增得到的第7天的细胞1，通过显微镜观察，其细胞的形态与第0天的细胞基本上相同(图5A)。
通过实施例2中记载的方法对第7天(D7)与第0天(D0)的细胞1中的mRNA进行检测，结果如图5B所示，肝脏细胞相关标志物的mRNA表达水平在第0天和第7天时基本相同。
通过实施例3记载的方法对第7天(D7)与第0天(D0)的细胞1的白蛋白分泌能力进行检测，结果如图5D所示，两者白蛋白分泌能力基本相同。
通过实施例3记载的方法对第7天(D7)与第0天(D0)的细胞1的尿素合成能力进行检测，结果如图5E所示，两者的尿素合成能力基本相同。
通过实施例3记载的方法对第7天(D7)与第0天(D0)的细胞1的CYP3A4活性进行检测，结果如图5F所示，两者的CYP3A4活性基本相同。
通过实施例2记载免疫荧光染色方法，对第7天(D7)细胞1中的一系列肝脏相关标志物的蛋白表达情况进行检测，结果如图5C所示，肝脏相关的标志物仍然显著表达。
通过使用试剂盒Periodic acid-Schiff(Sigma-Aldrich)、试剂盒BODIPY493/503(Life Technologies)以及试剂盒Oil Red O，(Sigma-Aldrich)，试剂盒ICG(Aladdin)对第7天(D7)细胞1合成糖原，合成脂滴，以及细胞吸收能力方面进行检测，结果如图5G所示，细胞1具有肝脏所特有的合成糖原，合成脂滴以及吸收的功能/性质。
本实施例5中的细胞1属于本发明所述的诱导性不成熟肝脏细胞。本实施例5中的培养基1属于本发明所述的HEM-1培养基，培养基2属于本发明所述的HEM-2培养基。

Claims (31)

1.一种第一组合物，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；以及(e)TGF-beta信号通路抑制剂；
优选地，所述第一组合物进一步包含(f)p38 MAPK抑制剂。
2.一种第一试剂盒，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；(e)TGF-beta信号通路抑制剂；以及相应的使用说明；
优选地，所述第一试剂盒进一步包含(f)p38 MAPK抑制剂。
3.一种第一培养基，其包含：(a)HDAC抑制剂；(b)类固醇类化合物；(c)Notch信号通路抑制剂；(d)MEK抑制剂；(e)TGF-beta信号通路抑制剂；以及基础培养基，优选地所述基础培养基选自DMEM、Knockout DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E等培养基；
优选地，所述第一试剂盒进一步包含(f)p38 MAPK抑制剂。
4.一种第二组合物，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物以及(d)TGF-beta信号通路抑制剂。
5.一种第二试剂盒，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；(d)TGF-beta信号通路抑制剂；以及相应的使用说明。
6.一种第二培养基，其包含：(a)cAMP激活剂；(b)ROCK抑制剂；(c)类固醇类化合物；(d)TGF-beta信号通路抑制剂；以及基础培养基，优选地所述基础培养基选自DMEM、KnockoutDMEM、RPMI 1640、DMEM/F12、HCM和William’E等培养基。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述HDAC抑制剂选自Mocetinostat(MGCD0103)、Abexinostat(PCI-24781)、Fimepinostat(CUDC-907)、ITSA-1、Vorinostat(SAHA)、MS-275、Panobinostat(LBH589)、Quisinostat、FK228、SB939、Trichostatin A(TSA)等；优选地，所述HDAC抑制剂是MS-275。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述类固醇类化合物选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等；优选地，所述类固醇类化合物是地塞米松。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述Notch信号通路抑制剂选自IMR-1、RO4929097、Semagacestat(LY450139)、Avagacestat(BMS-708163)、Dibenzazepine(YO-01027)、Crenigacestat(LY3039478)、Compound E、DAPT等；优选地，所述Notch信号通路抑制剂是Compound E。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述MEK抑制剂选自SeluMetinib(AZD6244)、Trametinib(GSK1120212)、PD0325901、U0126、U0126-ETOH、PD184352(CI-1040)等；优选地，所述MEK抑制剂是PD0325901。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述TGF-beta信号通路抑制剂选自SD-208、LY2109761、BIBF-0775、A83-01、SB431542等；优选地，所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述p38 MAPK抑制剂选自SB202190(FHPI)、SB203580、TAK-715、Doramapimod(BIRB 796)等；优选地，所述p38 MAPK抑制剂是SB203580。
13.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述cAMP激活剂选自Forskolin、8-Br-cAMP等；优选地，所述cAMP激活剂是Forskolin。
14.根据权利要求4-6中任一项所述的组合物、试剂盒或培养基，其中所述ROCK抑制剂选自Y-27632、Thiazovivin、GSK429286A、RKI-1447、AT13148等；优选地，所述ROCK抑制剂是Y-27632。
15.前述任一项权利要求所述的组合物、试剂盒或培养基在用于制备诱导性成熟肝脏细胞中的用途。
16.根据权利要求6所述的第二培养基，其还包含相对于第一培养基总体积的0.05％～20体积％的血清，优选1体积％。
17.一种制备诱导性成熟肝脏细胞的方法，所述方法包括以下步骤
(a)在根据前述任一项权利要求所述的第一培养基中培养诱导性不成熟肝脏细胞；
由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包含以下步骤
(b)在根据前述任一项权利要求所述的第二培养基中进一步培养步骤(a)所得的细胞；
由此制备所述诱导性成熟肝脏细胞。
19.根据权利要求17-18任一项所述的方法，其中所述诱导性不成熟肝脏细胞由多能干细胞制备得到；优选地所述诱导性不成熟肝脏细胞通过本文所述的方法由多能干细胞制备得到。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多能干细胞选自胚胎干细胞或诱导性多能干细胞。
21.一种诱导性成熟肝脏细胞，其具有以下一种或多种特征：
(a)诱导性成熟肝脏细胞显示出原代肝脏细胞的典型形态特征；
(b)相对于诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞选自以下的一种或多种肝脏细胞标志物的转录或蛋白表达增加：CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP7A1；
(c)相对于诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞的以下标志物的转录或蛋白表达减少：AFP；
(d)相对于诱导性不成熟肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞选自以下的一种或多种肝脏细胞的功能增加：白蛋白分泌能力、尿素合成能力、肝脏细胞极性、CYP代谢酶活力、移植存活率、体内重建率；和
(e)相对于原代肝脏细胞，所述诱导性成熟肝脏细胞选自以下的一种或多种肝脏细胞的功能接近或不低于原代肝脏细胞：白蛋白分泌能力、尿素合成能力、肝脏细胞极性、CYP代谢酶活力、移植存活率、体内重建率；
优选地，所述诱导性成熟肝脏细胞可通过根据权利要求17-20中任一项所述的方法制备。
22.一种诱导性成熟肝脏细胞，其可通过根据权利要求17-20中任一项所述的方法制备。
23.一种类器官，其产生自权利要求21-22中任一项所述的诱导性成熟肝脏细胞。
24.一种组织，其产生自权利要求21-22中任一项所述的诱导性成熟肝脏细胞，优选所述组织是肝脏。
25.根据权利要求21-22中任一项所述的诱导性成熟肝脏细胞，其在制备用于肝脏细胞移植的细胞、构建肝脏相关疾病模型、肝脏疾病相关药物筛选与鉴定，药物肝脏毒性筛选与鉴定，体外构建肝脏器官(含3D打印肝脏器官)中的用途。
26.一种筛选用于治疗疾病的物质的体外方法，其包括使权利要求21-22所述的诱导性成熟肝脏细胞，权利要求23所述的类器官或权利要求24所述的组织与待筛选物质接触。
27.一种试剂盒，其包含HEM-1培养基和HEM-2培养基，其中所述HEM-1培养基包含ROCK抑制剂、肝脏细胞生长因子(HGF)、抑瘤素M(oncostatinM,OSM)、类固醇类化合物、Notch信号通路抑制剂、TGF-beta信号通路抑制剂和基础培养基；所述HEM-2培养基包含肝脏细胞生长因子(HGF)、抑瘤素M(oncostatinM,OSM)、类固醇类化合物、Notch信号通路抑制剂、TGF-beta信号通路抑制剂和基础培养基；
优选地，所述HEM-1培养基和HEM-2培养基包含基础培养基；更优选地，所述基础培养基是去除表皮细胞生长因子(EGF)的HCM培养基。
28.根据权利要求27所述的培养基，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632；所述类固醇类化合物是地塞米松；所述Notch信号通路抑制剂是Compound E；所述TGF-beta信号通路抑制剂是A83-01。
29.一种扩增诱导性不成熟肝脏细胞的方法，其中包括使诱导性不成熟肝脏细胞接触根据权利要求27或28所述的培养基。
30.根据权利要求29所述的方法，其中包括使诱导性不成熟肝脏细胞接触根据权利要求27或28所述的HEM-1培养基，之后使诱导性不成熟肝脏细胞接触根据权利要求27或28所述的HEM-2培养基。
31.根据权利要求27或28所述的培养基，其在用于扩增诱导性不成熟肝脏细胞的用途。
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