CN116694535B - 一种戊糖乳杆菌w19及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戊糖乳杆菌W19，其保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2022年4月20日；保藏编号为CCTCC NO：M 2022432；分类学命名为戊糖乳杆菌Lactobacillus pentasus W19。该菌株具有明显抑制变异链球菌生长的作用，将其应用于抑制变异链球菌生长中，能够为预防或治疗龋齿提供新的研究方向。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种戊糖乳杆菌W19及其应用。
背景技术
变异链球菌属于革兰氏阳性、兼性厌氧细菌，是口腔生物膜内常见细菌。研究发现，变异链球菌是一种重要的口腔致龋菌，其生长环境是口腔内牙菌斑。口腔牙菌斑是一个由将近500种微生物体组成的复杂的生物膜群体，由嵌入覆盖牙齿表面的聚合物基质中的多种细菌和真菌组成。生物膜中的细菌细胞表现出低代谢活性、强耐药性以及由细胞信号传导或跨物种互惠保护引起的特定表型变化。
使用抗生素药物是现在比较主流的治疗龋齿的方法，但长期使用抗生素会导致口腔中微生物系统失衡、细菌耐药性增强。根除致龋结构的另一种方法主要是使用非特异性机械去除方法，例如刷牙和使用牙线，或使用漱口水处理；氟化物洗剂也可以用于预防龋齿。但是这些传统的治疗方法基本都会破坏口腔生态平衡。
有益菌是一种有益于人体健康的重要微生物，同时也存在于人的口腔中，有益菌在保持口腔健康、预防口腔疾病、维持口腔微生态平衡等方面都起到了重要作用。另外，有益菌可以在一定程度上抑制主要的致龋齿菌——变异链球菌的活性，从而减小龋齿等发生率。比如目前已有专利公开植物乳杆菌CCFM8724对变异链球菌具有抑制作用，同时维持一个健康的口腔菌群，因此利用有益菌的抑菌特性来抑制变异链球菌，同时又不破坏口腔中的微生态环境，是一种很有前景的预防和治疗龋齿的方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一株抑制变异链球菌的戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentasus）W19，从而为预防龋齿提供新思路。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种戊糖乳杆菌，命名为W19；已保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2022年4月20日 ；保藏编号为CCTCC NO：M 2022432；分类学命名为戊糖乳杆菌Lactobacillus pentasusW19。
在一些实施例中，上述戊糖乳杆菌W19具有耐酸耐胆盐特性。
第二方面，本发明提供了上述戊糖乳杆菌W19在制备用于预防或治疗口腔龋齿的产品中的应用。
在一些实施例中，上述产品中包含戊糖乳杆菌W19的活菌株或干菌株。
在一些实施例中，上述产品包括食品、食品添加剂和药品。
第三方面，本发明提供了上述戊糖乳杆菌W19在抑制变异链球菌生长中的应用。
第四方面，本发明提供了一种抑制变异链球菌生长的方法，其包括将上述戊糖乳杆菌W19的发酵产物添加到变异链球菌培养基中。
具体地，该方法包括将戊糖乳杆菌W19接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24-48h，离心后获得发酵产物，然后将发酵产物添加至含有变异链球菌的培养基中。
在一些实施例中，上述戊糖乳杆菌W19与变异链球菌的菌浓比为：（0.5-1）:1。
第五方面，本发明提供了上述戊糖乳杆菌W19在制备调节口腔菌群平衡的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选出一株戊糖乳杆菌具有耐酸耐胆盐特性，能够明显抑制变异链球菌生长，而变异链球菌是造成人类龋齿的主要致病细菌，因此可以将其应用于预防或治疗龋齿。并且，由于该戊糖乳杆菌W19来源于可食用的乳酸菌片剂中，所以将其应用于预防或治疗龋齿时，还能起到调节口腔菌群平衡的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentasus）W19无菌发酵产物对变异链球菌（Streptococcus mutans）生长的抑制活性。
图2为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentasus）W19无菌发酵产物对变异链球菌（Streptococcus mutans）生产胞外多糖的抑制活性。
图3为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentasus）W19耐胆盐耐酸的益生性能。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例中采用的变异链球菌为变异链球菌UA159，由四川大学华西口腔医学院提供。
以下实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉8 g/L，酵母提取物4 g/L，葡萄糖20 g/L，无水山梨醇单油酸酯1 ml/L，磷酸氢二钾2 g/L，三水醋酸钠5 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，七水硫酸镁 0.2 g/L，四水硫酸锰 0.05 g/L。121℃灭菌15 min。
BHI液体培养基：小牛脑7.7 g/L，牛心9.8 g/L，示蛋白胨10 g/L，右旋糖2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钠2.5 g/L。121℃灭菌15 min。
BHI琼脂培养基：小牛脑7.7 g/L，牛心9.8 g/L，示蛋白胨10 g/L，右旋糖2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钠2.5 g/L，琼脂20g/L。121℃灭菌15 min。
实施例1
本实施例为戊糖乳杆菌W19的分离与鉴定
（1）戊糖乳杆菌的分离
1）将来源于泡菜的菌液接种于MRS液体培养基中进行扩大培养，将扩大培养后的菌液混匀后稀释至适当浓度，接种于加入3%碳酸钙的MRS固体培养基培养24 h。挑选菌落周围有透明圈的单菌落，将其接种于MRS液体培养基中培养。通过显微镜镜检、革兰氏染色筛选杆状、革兰氏阳性菌。
2）变异链球菌培养液的制备
将变异链球菌接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24h，制备得到培养液。
3）制备1）中微生物发酵产物的制备
将1）中筛选出的所有菌接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到培养液；将制备得到的培养液于10000 rpm下离心，获得上清液；上清液经0.45μm滤膜过滤，获得无菌发酵产物。
4）牛津杯法筛选
取200 μL的2）中菌液涂布于BHI平板上，在平板中适当位置放置牛津杯，取100 μL的3）中无菌发酵产物加入牛津杯中。平板于37℃培养24 h，筛选出抑菌圈最大的菌。
（1）戊糖乳杆菌的鉴定
对筛选出的菌进行16S rRNA鉴定，确定该菌属于戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus），其中16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
本实施例为戊糖乳杆菌W19及其发酵产物抑制变异链球菌的生长
（1）戊糖乳杆菌W19发酵产物的制备
将戊糖乳杆菌W19接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到培养液；将制备得到的培养液于10000 rpm下离心，获得上清液；上清液经0.45μm滤膜过滤，获得无菌发酵产物。
（2）变异链球菌培养液的制备
将变异链球菌接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24h，制备得到培养液。
（3）戊糖乳杆菌W19发酵产物的抑菌实验
1）20 mL 无菌BHI琼脂培养基倾注于培养皿中，待凝固后，取200μL（2）中制备得到的变异链球菌培养液涂布。
2）在平板上依次摆放4个无菌牛津杯；取100μL上述步骤 (1) 制备得到的戊糖乳杆菌W19无菌发酵产物分别加入到其中3个无菌牛津杯中，剩下的一个加入100 μL MRS液体培养基，用作空白对照。
3）在平板上依次摆放4个无菌牛津杯；取100μL上述步骤 (1) 制备得到的戊糖乳杆菌W19无菌发酵产物分别加入到其中3个无菌牛津杯中，剩下的一个加入100 μL 醋酸氯己定溶液，用作阳性对照。
4）将上述平板正放置于37℃恒温培养箱培养24 h。
通过测量抑菌圈直径验证戊糖乳杆菌W19发酵产物在抑菌活性中的应用，结果如表1所示。
5）将戊糖乳杆菌发酵上清液与变异链球菌共培养，考察戊糖乳杆菌W19发酵上清液对变异链球菌生长的影响。
6）检测方法：将变异链球菌按3%接种量接种到足够多的液体BHI液体培养基中，震荡均匀，吸取2 mL菌液于5 mL 无菌离心管中。
7）分别添加2 mL戊糖乳杆菌W19上清液，离心管密封，于37℃培养32 h，每4 h取出一定量培养液，在600 nm波长处测定其光密度值。绘制变异链球菌的生长曲线。以向2 mL变异链球菌菌液中添加2 mL无菌MRS培养基的变异链球菌生长曲线为对照组。结果如图1所示。
8）同时，将共培菌液稀释不同梯度点种于BHI平板上测定活菌数和存活率。绘制变异链球菌的生长曲线。以添加无菌的MRS培养基为对照。结果如图1所示。
表1 戊糖乳杆菌W19发酵产物的抑菌能力
图1与表1结果显示，采用本发明提供的戊糖乳杆菌W19发酵产物对变异链球菌的生长具有明显抑制作用。
实施例3
本实施例为戊糖乳杆菌W19发酵产物抑制变异链球菌的生物膜形成
（1）戊糖乳杆菌W19发酵产物的制备
将戊糖乳杆菌W19接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到培养液；将制备得到的培养液于10000rpm下离心，获得上清液；上清液经0.45μm滤膜过滤，获得无菌发酵产物。
（2）变异链球菌培养液的制备
将变异链球菌接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24h，制备得到培养液。
（3）戊糖乳杆菌W19发酵产物的抑制产膜实验
1）收集培养24 h后的变异链球菌液，按3%接种量接种于新鲜的BHI培养基中，震荡摇匀。
2）收集（1）中的戊糖乳杆菌发酵上清液。
3）将1）和2）的液体按1:1 (v/v)的量接种于96孔板中，培养24 h。
4）利用酶标仪测变异链球菌菌浓度，用结晶紫染色法在酶标仪下测OD492和OD595，通过两者评估乳酸菌对变异链球菌的成膜能力的影响。添加两个对照，分别为将2）中的液体替换为MRS液体培养基和将1）中液体替换为BHI液体培养基且将2）中液体替换为MRS液体培养基。
表2 戊糖乳杆菌W19上清液对变异链球菌成膜能力的影响
| 类别 | W19 | 变异链球菌 | W19上清液抑制 |
| OD492 | 1.894 | 4.658 | 2.571 |
| OD595 | 4.314 | 11.291 | 6.314 |
结果如表2所示，本发明提供的戊糖乳杆菌W19发酵产物对变异链球菌生物膜的形成具有明显抑制作用。
实施例4
本实施例为戊糖乳杆菌W19发酵产物抑制变异链球菌的胞外多糖形成
（1）戊糖乳杆菌W19发酵产物的制备
将戊糖乳杆菌W19接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到培养液；将制备得到的培养液于10000 rpm下离心，获得上清液；上清液经0.45 μm滤膜过滤，获得无菌发酵产物。
（2）变异链球菌培养液的制备
将变异链球菌接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于BHI液体培养基中，于37℃静置培养24h，制备得到培养液。
（3）戊糖乳杆菌W19发酵产物的抑制胞外多糖实验
1）将（2）中的变异链球菌按3%接种量接种到新鲜的BHI培养基中，向其中加入等体积的培养24 h的乳酸菌发酵上清液，37℃培养24 h。
2）取10 mL离心后的共培液，向其中加入0.5 mL 80%（w/v）TCA，沉淀30 min，4℃，10000 rpm离心5 min，取上清液并加入3倍体积无水乙醇，4℃保藏过夜。
3）在4℃，10000 rpm离心10 min，收集沉淀，用10 mL蒸馏水溶解沉淀。取1 mL样品，加入1 mL苯酚和5 mL浓H2SO4，用苯酮-硫酸法测定样品中的胞外多糖的含量，用葡萄糖做标准曲线，从而求得胞外多糖含量。空白对照为将（1）中液体替换为等体积的MRS液体培养基。
结果如图2所示。本发明提供的戊糖乳杆菌W19发酵产物对变异链球菌胞外多糖的形成具有明显抑制作用。
实施例4
本实施例为戊糖乳杆菌W19的抗胆盐与抗酸能力
（1）戊糖乳杆菌W19培养液的制备
将戊糖乳杆菌W19接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到种子液；将制备得到的种子液以3% (v/v)的接种量，接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24 h，制备得到培养液。
（2）戊糖乳杆菌W19的抗酸与抗胆盐实验
1）酸胁迫实验：收集培养24 h后的戊糖乳杆菌菌体，10000 rpm，4℃离心5 min，弃上清，将菌体重悬于等体积的pH 2.5的MRS液体培养基中，胁迫培养8 h，每2 h取样，再重悬于等体积的MRS液体培养基，取100 μL重悬液，稀释不同梯度点种于MRS平板上测定活菌数和存活率。
2）胆盐胁迫实验：收集培养24 h后的戊糖乳杆菌菌体，10000 rpm，4℃离心5 min，倒掉原有培养基，将菌体重悬于等体积的含1.6%胆盐的MRS液体培养基中，共胁迫培养4 h，每1 h取样，菌悬液重悬于等体积的MRS液体培养基，取100 μL重悬液，稀释不同梯度点种于MRS平板上测定活菌数和存活率。
结果如图3所示。本发明提供的戊糖乳杆菌W19具有良好的抗酸抗胆盐性能，更易于在口腔中定植。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentasus） W19在制备用于预防或治疗口腔龋齿的产品中的应用，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M 2022432；所述戊糖乳杆菌W19具有耐酸耐胆盐特性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品中包含戊糖乳杆菌W19的活菌株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括药品。
4.一种戊糖乳杆菌W19在抑制变异链球菌（Streptococcus mutans）生长中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断治疗为目的的，所述戊糖乳杆菌W19的保藏编号为CCTCCNO：M 2022432。
5.一种抑制变异链球菌（Streptococcus mutans）生长的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断治疗为目的的，包括将戊糖乳杆菌W19的发酵产物添加到变异链球菌培养基中，所述戊糖乳杆菌W19的保藏编号为CCTCC NO：M 2022432，所述发酵产物是培养液离心后的上清液再经过滤获得的。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述戊糖乳杆菌W19接种于MRS液体培养基中，于37℃下静置培养24-48h，离心后获得发酵产物，然后将所述发酵产物添加至含有变异链球菌的培养基中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述戊糖乳杆菌W19与变异链球菌的菌浓比为（0.5-1）：1。
8.一种戊糖乳杆菌W19在制备调节口腔菌群平衡的产品中的应用，其保藏编号为CCTCCNO：M 2022432。
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