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CN116687976A - 硅酸钙活化EPCs源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用 - Google Patents

硅酸钙活化EPCs源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用 Download PDF

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CN116687976A
CN116687976A CN202211090811.6A CN202211090811A CN116687976A CN 116687976 A CN116687976 A CN 116687976A CN 202211090811 A CN202211090811 A CN 202211090811A CN 116687976 A CN116687976 A CN 116687976A
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CN
China
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calcium silicate
endothelial progenitor
microsphere
cells
progenitor cells
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CN202211090811.6A
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区彩文
常江
余彬
腾尹彤
陈国钦
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Dongguan Peoples Hospital
Original Assignee
Dongguan Peoples Hospital
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Publication date
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用。本发明所述硅酸钙能够促进内皮祖细胞生长因子的表达及内皮祖细胞的增殖，内皮祖细胞含量的增加进而引起其外泌体含量的增加。将硅酸钙处理后的内皮祖细胞产生的外泌体包载在甲基丙烯酰化明胶形成凝胶微球，该凝胶微球可激活心肌中的内皮细胞以形成新的血管，同时将循环中的内皮祖细胞大量募集到缺血区域，使内皮祖细胞通过分化替代和旁分泌的方式支持内皮细胞，双管齐下治疗心血管疾病。

Description

硅酸钙活化EPCs源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及硅酸钙活化EPC源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
背景技术
心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是人类主要的死亡原因之一。在过去的二十年中，移植具有再生潜力的干/祖细胞已被证明是治疗CVD的有效方法。近年来，为了验证干细胞再生疗法能否在临床上发挥疗效并且在临床实践中常规应用，研究人员在多种临床试验中评估了不同干细胞群体的安全性和有效性(Fisher S A，Zhang H，Doree C，etal.Stem cell treatment for acute myocardial infarction[J].The Cochranedatabase of systematic reviews，2015，9):Cd006536)，尽管初步实验结果令人鼓舞，但随后的大型随机对照试验却表明，单独使用干/祖细胞移植在心脏功能修复方面仅显示出有限的改善能力以导致治疗心血管疾病的效果不佳。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有干/祖细胞移植的方法治疗心血管疾病效果不佳的缺陷和不足，提供一种硅酸钙活化EPCs源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
本发明的目的是提供一种凝胶微球。
本发明的另一目的是提供一种凝胶微球的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种凝胶微球在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
本发明的上述目通过以下技术方案实现：
本发明保护一种硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用，所述硅酸钙活化的方法包括如下步骤：
将内皮祖细胞放入含有硅酸钙的培养基中30～38℃，培养40～50小时。
优选地，所述硅酸钙的浓度为0.7～50mg/mL。
优选地，所述硅酸钙促进内皮祖细胞增殖和内皮祖细胞生长因子的表达。
更优选地，所述内皮祖细胞生长因子为HGF、VEGF、IGF-1、SDF-1、eNOS中的一种或多种。
本发明进一步保护一种凝胶微球，包括上所述应用中的硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体和水凝胶。
优选地，所述凝胶微球的直径为25～35μm。
本发明进一步保护一种凝胶微球的制备方法，包括如下步骤：
S1.将内皮祖细胞消化后接种培养，待细胞长至65～75％时更换培养基为含有硅酸钙的培养基继续在30～38℃下培养40～50小时，取上清离心，将所得沉淀重悬得硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体；
S2.将凝胶因子、光引发剂、水混合均匀，加入步骤S1所得硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体，混合均匀，得水相；
S3.将步骤S2所得水相与矿物油混合，并在紫外光照射下发生交联固化，即得。
优选地，在步骤S1中，所述培养在含5～7％CO2的细胞培养箱中培养。
优选地，在步骤S1中，所述离心为梯度离心。
具体的，所述梯度离心为：300g离心10～15分钟以除去活细胞，2000g离心10～15分钟以除去死细胞，10000g离心30～35min除去细胞碎片，随后将细胞上清转移至超高速离心机专用离心管中，100000g离心70～80分钟后将上清倒掉，使用PBS重悬底部沉淀，再次使用100000g离心70～80分钟，使用200ul PBS将底部沉淀重悬。
优选地，在步骤S2中，所述凝胶因子为甲基丙烯酰化明胶或PEGDA中的一种或两种。
优选地，在步骤S2中，所述溶剂、凝胶因子及光引发剂的质量比为1:(1～2):(0.04～0.1)。
优选地，在步骤S2中，所述硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体的终浓度为1～2mg/ml。
优选地，在步骤S2中，所述水相中加入适量异硫氰酸荧光素(FITC)，标记绿色荧光，方便观察微球形态。
优选地，在步骤S3中，所述水相与矿物油(油相)混合的方法为：将水相及油相管分别接入微流控压力泵中，在单镜头反光式取景照相机下观察成球大小及速度，调整水相及油相溶液的流速。
优选地，在步骤S3中，所述凝胶微球使用前在1500～1800rpm离心5～8min，小心吸走矿物油，加入适量PBS重悬。
本发明进一步保护一种凝胶微球在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
优选地，所述心血管疾病为心肌梗死、无症状心肌缺血、心绞痛、缺血性心力衰竭中的一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
本发明所述硅酸钙能够促进内皮祖细胞生长因子的表达及内皮祖细胞的增殖，内皮祖细胞含量的增加进而引起其外泌体含量的增加。将硅酸钙处理后的内皮祖细胞产生的外泌体包载在甲基丙烯酰化明胶形成凝胶微球，该凝胶微球可激活心肌中的内皮细胞以形成新的血管，同时将循环中的内皮祖细胞大量募集到缺血区域，使内皮祖细胞通过分化替代和旁分泌的方式支持内皮细胞，双管齐下治疗心血管疾病。
附图说明
图1为含不同浓度CS的培养基对EPCs增殖的影响图。
图2为在含1/256、1/128、1/64CS的培养基中分别培养第2、4天EPCs中促血管生成基因的表达情况图，*p<0.05 vs control，n＝3。
图3为凝胶微球包封外泌体的制备原理示意图和形貌图，A为制备原理示意图，B为光学显微镜下的凝胶微球，比例尺＝100μm，C为扫描电镜(SEM)下凝胶微球的微观形态，比例尺＝10μm，D为共聚焦显微镜下包裹外泌体微球的三维荧光图像，微球(FITC标记，绿色)，外泌体(PKH26标记，红色)。
图4为凝胶微球在体外持续释放1，7，14，21天的荧光显微镜图像(比例尺＝200μm)，单个微球放大图(比例尺＝50μm)及其荧光强度3D曲面图。
图5为用荧光分光度计检测的外泌体在凝胶微球中的释放曲线。
图6为凝胶微球分别在小鼠心梗周边区持续释放1，7，14，21天的共聚焦荧光显微镜图像，PKH26-EXO(红色)，DAPI(蓝色)，比例尺＝50μm，n＝5。
图7为凝胶微球对细胞毒性试验结果图，A为小鼠急性心肌梗死后7天心脏组织巨噬细胞CD68免疫荧光染色图片，CD68(绿色)，DAPI(蓝色)，B为每组高倍镜视野下CD68阳性细胞数量统计图。
图8为Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心脏功能的影响结果图，A为心梗后第21天各组M型超声图片，B为心梗后第21天各组EF值，C为心梗后第21天各组FS值，*p<0.05 vsPBS组，n＝5。
图9为Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心脏室壁厚度及纤维化程度的影响结果图，A为心梗后第21天各组心脏Masson染色图片，B为各组左室室壁存活心肌面积和梗死壁厚度，C为相对疤痕大小，D为梗死范围的统计分析，*p<0.05vs PBS组，n＝5。
图10为Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心肌细胞凋亡的影响结果图，A为梗塞边缘区域中各组TUNEL染色的代表性免疫组织化学图片，总细胞核(DAPI染色，蓝色)和TUNEL阳性细胞核(棕黄色)，B为TUNEL阳性心肌细胞的定量分析，*p<0.05 vs PBS组，n＝5，比例尺＝50μm。
图11为Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心肌细胞肥大的影响的结果图，A为心梗边缘区心肌细胞麦胚凝集素染色免疫荧光图片，B为心梗边缘区心肌细胞横截面积测量图，*p<0.05 vs PBS组，n＝5，比例尺＝50μm。
图12为Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后血管新生的影响结果图，A为心梗后21天各组心梗周边区的小动脉免疫荧光染色图片，α-SMA(绿色)，DAPI(蓝色)，B为图A的数据统计图，C为心梗后21天各组心梗周边区毛细血管免疫荧光染色图片，CD31(红色)，DAPI(蓝色)，D为图C的数据统计图，*p<0.05vs PBS组，n＝5，比例尺＝50μm。
图13为Microsphere+CS-EPC-EXO对内源性EPCs的募集结果图，A为心梗后7天各组心梗周边区的EPCs(CD34+/VEGFR2+)免疫荧光染色图片，CD34+(红色)，VEGFR2+(绿色)，DAPI(蓝色)，CD34+/VEGFR2+(橙色)，B为每组高倍镜视野下CD34+/VEFGFR2+共定位阳性细胞数量统计，*p<0.05vsPBS组，n＝5，比例尺＝50μm。
图14为Microsphere+CS-EPC-EXO对外源性EPCs的募集结果图，A为心梗后7天各组心梗周边区的DiO-EPC和毛细血管免疫荧光染色图片，PKH26-EXO(红色)，DiO-EPC(绿色)，CD31(白色)，DAPI(蓝色)，B为每组20倍镜视野下DiO-EPC细胞数量统计，C为每组20倍镜视野下心梗周边区毛细血管数量统计，CD31(白色)，*p<0.05vsPBS组，n＝5，比例尺＝100μm。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
小鼠骨髓源性EPCs的提取：取4周龄SPF级健康C57/BL小鼠(雌雄不限)，颈椎脱臼法处死，将其置于75％酒精中浸泡15min。无菌条件下(超净工作台内)去除小鼠四肢皮肤，分离肌肉组织，剪下胫骨、股骨、肱骨，并置于预冷生理盐水中，用预冷的生理盐水冲洗骨髓腔，直至骨髓腔从粉红色变成白色。取1支无菌离心管，轻轻加入FICOLL淋巴细胞分离液，将混匀的骨髓液轻轻滴加于FICOLL淋巴细胞分离液上(淋巴细胞分离液:骨髓液＝1:1)，以2000r/min离心20分钟，离心后可见明显分层，位于中间的薄薄云雾层细胞即为单个核细胞，小心用吸管吸出，加入另一无菌离心管中，同时加入等体积PBS液，混匀，1000r/min离心5分钟，同样条件重复洗涤两遍，收集沉淀细胞，加入EGM-2全培养液重悬细胞，移入培养瓶中，放入饱和湿度，37℃，5％CO2的细胞培养箱培养。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1硅酸钙(CS)对EPCs成血管能力的检测
含有硅酸钙的培养基的制备
1)取2g CS于离心管中，加入10ml EGM-2培养基(含有10％的无外泌体胎牛血清(FBS))，在37℃、300转/分摇床上24摇晃24小时。
2)将混悬液置于离心机中5000rpm/分离心10分钟，用注射器小心收集上清。
3)在超净台中，将上述收集的上清用0.22um滤器过滤至无菌离心管中，即可得到含有硅酸钙200mg/mL的培养基，4℃保存备用。
4)将等体积EGM-2培养基加入上述含有硅酸钙的培养基得到1/2CS浓度(100mg/mL)的含有硅酸钙的培养基，依次梯度稀释制备1/4、1/64、1/128、1/256CS浓度(50～0.78125mg/mL)
硅酸钙对EPCs成血管能力的检测
MTS检测细胞的增殖能力
1)选择生长状态良好的EPCs，使用适量胰酶消化重悬后计数，将细胞稀释至2×104个/mL，以每孔100ul重新接种至96孔板，共8组，每组5个复孔，放入37℃培养箱培养。
2)待细胞贴壁伸展后，将原培养基弃去，分别加入含不同浓度(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256(0.78125～100mg/mL))含有硅酸钙的培养基，其中一组为不含CS的EGM-2培养基，做为阴性对照。
3)培养2天后取出96孔板，弃去含有硅酸钙的培养基，使用PBS洗去残留液体，分别加入100ul含10％MTS溶液的EGM-2培养基，在37℃培养箱中孵育3小时。
4)3小时后，使用酶标仪检测各孔在490mm波长处的吸收光，观察各孔细胞的增殖情况。
结果如图1所示，含有硅酸钙的培养基对EPCs无毒性作用，1/4～1/256CS浓度均可明显促进内皮祖细胞增殖，与不含有CS的培养基中培养的EPC相比具有显著差异。其中，含有1/64、1/128、1/256CS的培养基对EPCs增殖能力的促进尤为显著。
实时荧光定量PCR检测硅酸钙对EPCs生长因子的影响
1)提取RNA
将使用不同含有硅酸钙的培养基培养的细胞分别培养2、4天，弃去原培养液，用PBS将残留培养液及死细胞洗净，每皿(35mm)加入1ml TrizolRNA提取液，冰上裂解5min，吹打后转移至1.5mlEP管中。
加入1/5Trizol体积的氯仿(200ul)，充分混匀后冰上静置10min，1200g、4度离心15min。离心后吸取上清(400ml)至新的EP管中，注意不要吸到中层和下层，加入500ul异丙醇，混匀后静置10min，12000g、4度离心15min。
离心后弃上清，加入1ml75％无水乙醇，注意需吹起沉淀至悬浮状态，7500g、4度离心10min，离心后弃上清，静置使无水乙醇自然挥发，加入20ul无酶水溶解沉淀，混匀后用紫外分光度计测定RNA浓度，于冰上备用。
2)RNA逆转录
根据表1配置逆转录反应液，将配好的逆转录反应液混匀后放入蛋白核酸测定仪中，37℃反应15min，85℃反应5s，之后降温至4℃，反应完成后即可得cDNA，用无酶水稀释10倍后于-20℃保存备用。
表1配置逆转录反应液的成分及其含量
3)PCR反应
根据表2配置PCR反应液，引物序列如表3，在PCR八连管中加入反应液和引物序列，离心后上清上机，设置反应参数：升温至95℃预热30s，进入PCR循环，95℃持续5s，降温至60℃持续30s，持续40个循环后，生成溶解曲线：95℃15s，55℃45s，95℃15s，运行结束后以GAPDH为内参分析数据，数据采用SPSS20.0软件处理分析，多组间比较采用ANOVA分析，两组间样本比较采用独立样本t检验，p<0.05定义为有统计学差异，数据以均数±标准差表示。
表2配置PCR反应液的成分及其含量
表3引物序列：小鼠来源
结果如图2所示，与不含有CS的培养基相比，含有1/64、1/128、1/256CS的培养基可以显著促进EPCs中HGF、VEGF、IGF-1、SDF-1、eNOS的表达，其中1/128的CS浓度对EPCs生长因子的促进最为显著。以上结果表明，含有1/128CS的培养基对EPCs具有最佳的促血管生成作用，因此被选作后续研究的最适浓度。
实施例2凝胶微球(Microsphere+CS-EPC-EXO)的制备
外泌体(EXO)的提取：
将生长状态良好的EPCs消化后接种于10cm直径的培养皿，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞长至70％，弃原培养基，用PBS洗涤三遍，根据分组，更换培养基为含有1/128CS的培养基，继续培养48小时(不含有CS的作为对照Microsphere+EPC-EXO)，48小时后取各祖细胞上清，使用超高速梯度离心法提取外泌体，300g离心10分钟以除去活细胞，2000g离心10分钟以除去死细胞，10000g离心30min除去细胞碎片，随后将细胞上清转移至超高速离心机专用离心管中，100000g离心70分钟后将上清倒掉，使用PBS重悬底部沉淀，再次使用100000g离心70分钟，使用200ul PBS将底部沉淀重悬，即可得到外泌体，所得外泌体用PKH26染色，即可得到带红色荧光基团的外泌体(PKH26-EXO)，立即使用或-80℃保存。
凝胶微球(Microsphere+CS-EPC-EXO)的制备
制备水相溶液，将5％PEG和5％甲基丙烯酰化明胶(GelMA)及0.2％光引发剂(lap)按比例混合，加入PKH26染色后的外泌体后外泌体浓度为1mg/ml，水相中可加入适量异硫氰酸荧光素(FITC)，标记绿色荧光，方便观察微球形态，将水相及油相管分别接入微流控压力泵中，在单镜头反光式取景照相机下观察成球大小及速度，调整水相及油相溶液的流速，用手持紫外灯在芯片出口处照射，使液滴发生紫外光交联反应，固化滴落后收集于EP管中。
取部分微球于细胞皿中，在光镜下观察微球的粒径大小、成形状态及分散情况，调整流速直至微球直径为30μm。
使用前将微球用1500rpm离心5min，小心吸走矿物油，加入适量PBS重悬备用(制备原理图如图3A所示)。
Microsphere+CS-EPC-EXO的表征
光镜：取适量微球于细胞皿中，在光镜下观察微球的粒径大小、成形状态及分散情况，拍照记录。
SEM：用超CO2全自动临界点干燥仪器处理微球后，制样喷金，用SEM观察微球的粒径大小、成形状态及分散情况，拍照记录。
共聚焦显微镜三维成像：取适量Microsphere+CS-EPC-EXO于共聚焦皿中，使用共聚焦显微镜三维成像模式扫描微球，观察微球粒径大小、成形状态及外泌体分布情况。
如图3B～3D所示，本发明使用微流控技术制备出粒径约30微米、分散性良好、能够包裹外泌体的GelMA-PEG微球。
实施例3凝胶微球(Microsphere+CS-EPC-EXO)缓释能力的实施例
(1)外泌体在体外的释放实验：
1.镜下观察法：离心后除去矿物油，用PBS重悬后，取适量Microsphere+CS-EPC-EXO于共聚焦皿中，避光放置于37℃孵箱，分别于第1、7、14、21天用荧光显微镜观察微球内荧光强度，判断Microsphere+CS-EPC-EXO的持续释放情况，用ImageJ软件进行荧光强度量化分析，绘制3D曲面图像。
如图4中的荧光图像所示，Microsphere+CS-EPC-EXO的荧光强度随释放时间的增加而降低，但在释放21天时仍可看到较多微弱红光，表明Microsphere+CS-EPC-EXO在体外能持续释放外泌体至少21天。
2.荧光分光度计检测法：
a.将含有50ug/ml PKH26染色后外泌体的水凝胶(Microsphere)悬浮于400ul的PBS中，避光放置在37℃培养箱中，分别在第2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22天收集200ul上清(注意不要吸到微球)，每取一次上清，补充200ul PBS，直至第20天。
b.取上清中50ug/ml PKH26-EXO进行梯度稀释，稀释为50、25、12.5、6.25、3.625、1.8125ug/ml；
c.用荧光分光度计分别测量荧光强度，制作标准曲线，计算累积释放浓度。
如图5所示，在16天内，Microsphere+CS-EPC-EXO保持线性释放趋势，随后开始缓慢释放，至21天，Microsphere+CS-EPC-EXO的释放量达到72.7％。
(2)外泌体在体内的释放实验：
将已标记PKH26的被微球包裹(Microsphere+CS-EPC-EXO组)或不包裹(EXO组)的两组外泌体(1mg/ml)分别注射到小鼠心梗边缘区，分别在第1、7、14、21处死小鼠，将心脏取出，浸泡在生理盐水中，挤出心脏中的残留血液，OCT包埋后放入恒温冰冻切片机中切片，切片完成后，用PBS浸泡冰冻切片复温10min，加入适量DAPI染色液覆盖心脏组织，室温下放置5min，用PBS洗三次后用抗荧光淬灭剂封片，于共聚焦显微镜下观察不同时间段心脏切片中的PKH26荧光信号来比较两组的保留率。
如图6所示，在梗死的心脏中，两组外泌体的保留率逐渐降低，在注射21天后未检测到单独注射外泌体组的荧光信号，但在Microsphere+CS-EPC-EXO组的心脏切片中却仍有部分PKH26荧光信号存在，说明凝胶微球能有效延长外泌体在梗死后心脏的保留时间，提高外泌体的体内滞留率。
实施例4 Microsphere(不含外泌体的空白水凝胶)的体内毒性检测
将PBS与Microsphere分别注入小鼠心梗边缘区，7天后处死小鼠，将心脏取出，对心脏组织冰冻切片处理后进行免疫荧光染色，最后在共聚焦显微镜下观察拍照。
如图7所示：PBS与Microsphere两组之间巨噬细胞的染色情况相似(图7A)，数量无统计学差异(图7B)。表明GelMA-PEG微球未引起心脏局部的炎症反应，对细胞没有毒性作用，且具有良好的生物相容性，可以作为外泌体载体于体内应用。
实施例5 Microsphere+CS-EPC-EXO对急性心肌梗死(AMI)后改善心功能的作用影响
体内实验分组：假手术组(Sham)，PBS组，Microsphere+EPC-EXO组，Microsphere+CS-EPC-EXO组。
小鼠心梗模型建立：用1％戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔麻醉(0.1mL/20g)，麻醉后将小鼠头部及四肢固定，剔除胸部毛发，使用静脉留置针进行气管插管，插好后固定好留置针，连接小动物呼吸机，设置呼吸频率及潮气量。消毒后再小鼠左侧第3、4肋间剪开逐层剪开皮肤，分离肌肉，打开胸腔，暴露心脏。在心脏左心耳下缘2mm处用8/0带针缝合线结扎部分心肌，此时可见结扎线下方心肌变白，说明造模成功。用31G胰岛素注射器分别在心梗边缘区注射PBS、Microsphere+EPC-EXO、Microsphere+CS-EPC-EXO，每只小鼠注射两个点，每个点注射10ul。注射完成后使用5/0带针缝合线关闭胸腔，打好耳标，待小鼠恢复自主呼吸后拔出留置针管，置于温度适宜的理疗灯下12小时，待小鼠活动正常后转至动物饲养室饲养21天。后续实施例均以此模型进行实验。
心梗造模后21天，用小动物超声机对小鼠左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVFS)进行了测量。
如图8所示：Microsphere+CS-EPC-EXO的治疗效果更为显著(图8A)，与PBS组相比，Microsphere+EPC-EXO与Microsphere+CS-EPC-EXO组的EF和FS值明显较高(图8B和8C)，说明Microsphere+CS-EPC-EXO能有效改善小鼠心脏收缩功能。
实施例6 Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心脏室壁厚度及纤维化程度的影响
分组情况如实施例5。为了评估了心梗后各组治疗对左心室室壁厚度及纤维化程度的影响。我们在治疗第21天后，制作小鼠心脏石蜡切片，用Masson染色对各组切片进行染色，并使用倒置显微镜拍照，用Image J软件分析心室重构情况。
如图9所示：与PBS和Microsphere+EPC-EXO组相比，Microsphere+CS-EPC-EXO组心脏状态明显较好(图9A)，存活心肌面积和梗死壁厚度显著增加(图9B)，梗死心脏的纤维化区域(图9C)和疤痕大小(图9D)显着减少。这与心脏超声结果一致，说明CS-EPC-EXO可以有效防止不良左心室重塑并提高心脏功能。
实施例7 Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心肌细胞凋亡的影响
心肌梗死后心肌细胞的凋亡情况，是影响心梗后心室重构程度的重要因素之一。为了评估心梗边缘区心肌细胞的凋亡程度，我们在注射后21天后进行了体内TUNEL染色分析。对于需要CD34和VEGFR2荧光双标的切片，以羊抗兔647二抗标记VEGFR2，羊抗大鼠cy3二抗标记CD34。对于需要α-SMA或CD31荧光单标的切片，以羊抗兔Dylight488二抗标记α-SMA，羊抗兔cy3二抗或羊抗兔647二抗标记CD31。
数据统计方法：hiPS-CM细胞滞留数＝每个高倍镜视野下CM Dil阳性的细胞个数。小血管密度＝每个高倍镜视野下α-SMA染色阳性的血管环数量。毛细血管密度＝每个高倍镜视野下CD31染色阳性的血管环数量。内源性EPCs募集细胞数＝每个高倍镜视野下CD34染色阳性并能与VEGFR2染色阳性细胞重合的细胞个数。每张切片在心梗边缘区挑取5个视野拍照(400×)，取平均值分析。
如图10所示，在边界区，Microsphere+EPC-EXO、Microsphere+CS-EPC-EXO组的TUNEL阳性染色数量均明显减少(图10A)，且Microsphere+CS-EPC-EXO组的抗心肌凋亡能力更为显著(图10B)
实施例8 Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后心肌细胞肥大程度的影响
为了评估心梗边缘区细胞的肥大程度，我们采用了麦胚凝集素(WGA)染色对心肌细胞肥大程度进行定量分析，以假手术组心肌细胞的横截面积为参照对其他组边缘区心肌细胞肥大程度进行评估。
将10μg/mLWGA覆盖在心脏组织上，室温下静置染色30min，PBS清洗3次，每次5分钟，滴加封片剂后封片，在荧光显微镜下观察染色情况，在心梗周边区随机选择5个视野拍照(400×)，以Image J软件分析心肌细胞的横截面积，取视野下所有心肌细胞横截面积的平均值。
如图11所示：Sham组的心肌细胞大小均一，横截面积较小。其他组均出现了心肌细胞变大及排列错乱(图11A)。相比之下，Microsphere+CS-EPC-EXO组对于边缘区心肌细胞的肥大程度的改善作用最为明显(图11B)。表明Microsphere+CS-EPC-EXO能够有效抑制边缘区心肌细胞的肥大。
实施例9 Microsphere+CS-EPC-EXO对AMI后血管新生的影响
为了确定外泌体注射到梗塞的心肌中是否能促进缺血区血管新生，我们在心梗3周后取各组心脏切片分别进行α-SMA及CD31染色，前者是小动脉血管中层的标志物，后者是内皮细胞标志物，主要标记毛细血管。
如图12所示：与其他组相比，Microsphere+CS-EPC-EXO组在心梗周边区的小动脉及毛细血管数量均显着增加。说明Microsphere+CS-EPC-EXO能有效促进梗死边界区域的血管新生。
实施例10 Microsphere+CS-EPC-EXO对外源性EPC的募集
对内源性EPCs的募集
研究表明，SDF-1是趋化造血干/祖细胞在骨髓和循环血液间迁移的关键因子，在调控内皮祖细胞的迁移和归巢方面扮演着重要的角色。体外实验证明，CS-EPC-EXO在自身携带高表达的SDF-1因子的同时，还能通过转移丰富的miR-126a-3p促进内皮细胞分泌SDF-1
我们使用CD34、VEFGFR2两种EPC标志物对各组治疗7天的心脏切片进行共定位染色，定量分析心梗周边区EPCs的数量，评估不同外泌体对EPC的募集情况。如图13所示，Microsphere+CS-EPC-EXO组治疗后的心脏中EPC的数量最多，说明CS-EPC-EXO能够有效募集循环中的EPCs至缺血组织。
对外源性EPCs的募集
由于目前尚未发现EPCs的特异性单一标记或标记组合。因此，在许多研究中，对于EPCs的表面标记认定仍有争议。EPC最常用的标记包括CD34，VEGFR-2和CD133，它们通常以双重(CD34+/VEGFR2+，CD133+/VEGFR2+)或三重(CD34+/CD133+/VEGFR2+)组合标记鉴定。为了进一步验证Microsphere+CS-EPC-EXO在体内募集EPCs的能力，我们将从小鼠骨髓提取出的EPCs用DiO荧光染色标记，在心梗造模1小时后通过尾静脉注入裸鼠体内，7天后取材切片，在共聚焦下观察不同外泌体对DiO-EPCs的募集能力，同时，通过CD31染色观察EPCs归巢和血管修复的相关性。
结果如图14所示：相对于其他两组，Microsphere+CS-EPC-EXO组心梗周边区DiO-EPCs归巢数量明显增加，毛细血管密度明显增多，部分血管可见DiO-EPCs嵌入。证明Microsphere+CS-EPC-EXO可有效提高心肌缺血区域对EPCs的募集能力，进一步证实了Microsphere+CS-EPC-EXO的促血管生成能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体在制备治疗心血管疾病药物中的应用，其特征在于，所述硅酸钙活化的方法包括如下步骤：
将内皮祖细胞放入含有硅酸钙的培养基中30～38℃，培养40～50小时。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述硅酸钙的浓度为0.7～50mg/mL。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述硅酸钙促进内皮祖细胞增殖和内皮祖细胞生长因子的表达。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述内皮祖细胞生长因子为HGF、VEGF、IGF-1、SDF-1、eNOS中的一种或多种。
5.一种凝胶微球，其特征在于，包括权利要求1～4任一所述应用中的硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体和水凝胶。
6.根据权利要求5所述凝胶微球，其特征在于，所述凝胶微球的直径为25～35μm。
7.权利要求5或6所述凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将内皮祖细胞消化后接种培养，待细胞长至65～75％时更换培养基为含有硅酸钙的培养基继续在30～38℃下培养40～50小时，取上清离心，将所得沉淀重悬得硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体；
S2.将凝胶因子、光引发剂、水混合均匀，加入步骤S1所得硅酸钙活化内皮祖细胞源性外泌体，混合均匀，得水相；
S3.将步骤S2所得水相与矿物油混合，并在紫外光照射下发生交联固化，即得。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述凝胶因子为甲基丙烯酰化明胶或PEGDA中的一种或两种。
9.权利要求5或6所述凝胶微球及权利要求7或8所述方法制备的凝胶微球在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
10.根据权利要求1或9所述应用，其特征在于，所述心血管疾病为心肌梗死、无症状心肌缺血、心绞痛、缺血性心力衰竭中的一种或多种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116966154A (zh) * 2023-09-12 2023-10-31 常州市第二人民医院 一种用于修复退变核髓的载药微球及其制备方法

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