CN116687932B

CN116687932B - ((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯的医药用途

Info

Publication number: CN116687932B
Application number: CN202210183739.5A
Authority: CN
Inventors: 钟武; 胡志红; 王曼丽; 王倩然; 曹瑞源; 李松
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN116687932A

Abstract

本发明涉及((3‑氨甲酰‑5‑氟吡嗪‑2‑基)氧基)甲基异丁酸酯、其几何异构体、药物上可接受的盐、溶剂化物或水合物的医药用途，特别是用于治疗布尼亚病毒目的病毒引起的疾病或感染的用途。

Description

((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯的医药用途

技术领域

本发明涉及((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯(Isobutyric acid3-carbamoyl-5-fluoro-pyrazin-2-yloxymethyl ester)、其几何异构体、药物上可接受的盐、溶剂化物或水合物的医药用途，特别是用于治疗布尼亚病毒目的病毒，例如克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)，引起的疾病或感染的用途。

背景技术

克里米亚-刚果出血热(CCHF)是一种广泛流行于非洲、亚洲和欧洲等地区的急性传染病，以发热、胃肠道出血、鼻出血、呕血、休克为主要特征，病死率可达50％，CCHF致病病原体为克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)。克里米亚-刚果出血热病毒属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)，内罗病毒科(Nairoviridae)，正内罗病毒属(Orthonairovirus)蜱传病毒。CCHF患者临床症状广泛，典型的病程经历四个阶段：潜伏期、出血前期、出血期和恢复期。潜伏期时间长短与接触途径、病毒载量等因素相关；潜伏期之后，出血前阶段表现为发热疾病，患者伴有严重头痛、恶心、腹泻、肌肉酸痛、畏光等症状当患者进入出血阶段，机体会依次出现瘀点、大面积瘀斑及大量出血，9％～50％的病例在该阶段死亡。除了这些表征，研究还发现CCHF在发病的同时伴随着严重的肝、神经系统，呼吸系统以及心脏的损伤等病变。目前没有上市的抗克里米亚-刚果出血热的药物和疫苗，严重威胁着人类健康。

发明内容

((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯(以下简称式I所示化合物或化合物I)的结构式如式I所示，

本发明人令人惊讶地发现式I所示化合物((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯能够抑制克里米亚-刚果出血热病毒在细胞中的复制，可在微摩尔级浓度下降低克里米亚-刚果出血热病毒感染的细胞的病毒核酸载量水平，并且对克里米亚-刚果出血热病毒感染的小鼠具有显著的保护作用，可用于治疗克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病，如单纯性感染、发热、头痛、肌肉疼痛、呕吐、胃肠道出血、鼻出血、呕血、休克等。

本发明涉及式I所示的化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物在制备用于治疗布尼亚病毒目病毒引起的疾病或感染的药物中的用途。

本发明还涉及式I所示的化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物在制备作为布尼亚病毒目病毒抑制剂的药物中的用途。

本发明还涉及式I所示的化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物在制备用于抑制布尼亚病毒目病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的药物中的用途。

本发明还涉及药物组合物在制备用于治疗布尼亚病毒目病毒引起的疾病或感染的药物中的用途，其中所述药物组合物包含式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物。

本发明还涉及药物组合物在制备作为布尼亚病毒目病毒抑制剂的药物中的用途，其中所述药物组合物包含式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物。

本发明还涉及药物组合物在制备用于抑制布尼亚病毒目病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖的药物中的用途，其中所述药物组合物包含式I所示化合物、其几何异构体、其药盐上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物。

本发明还涉及所述包含所述的式I所示化合物、其几何异构体或其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物的药物组合物或所述式I所示化合物、其几何异构体或其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物在制备用于治疗出血热(包括单纯性感染、发热、头痛、肌肉疼痛、呕吐、胃肠道出血、鼻出血、呕血、休克等)的药物中的用途。

本发明还涉及一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防疾病或感染的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的所述包含所述的式I所示化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物的药物组合物或所述的式I所示化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物，其中所述的疾病或感染包括布尼亚病毒目病毒引起的疾病或感染。

本发明还涉及一种在有需要的哺乳动物中抑制布尼亚病毒目病毒复制或繁殖的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的所述包含所述的式I所示化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物的药物组合物或所述的式I所示化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物。

本发明还涉及药物组合物在制备用于治疗布尼亚病毒特别是克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病或感染(例如单纯性感染、发热、头痛、肌肉疼痛、呕吐、胃肠道出血、鼻出血、呕血、休克等)的药物中的用途，其中所述药物组合物包含所述的式I所示化合物、其几何异构体或其药物上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。

本发明还涉及式I所示的化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物，其用于治疗布尼亚病毒目病毒引起的疾病或感染。

本发明还涉及式I所示的化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物，其用作布尼亚病毒目病毒抑制剂。

本发明还涉及式I所示的化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物，其用于抑制布尼亚病毒目病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖。

本发明还涉及药物组合物，其用于治疗布尼亚病毒目病毒引起的疾病或感染，其中所述药物组合物包含所述的式I所示化合物、其几何异构体、其药物上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物。

本发明还涉及药物组合物，其用作布尼亚病毒目病毒抑制剂，其中所述药物组合物包含式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。

本发明还涉及药物组合物，其用于抑制布尼亚病毒目病毒在细胞(例如哺乳动物细胞)中复制或繁殖，其中所述药物组合物包含式I所示化合物、其几何异构体、其药盐上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。

在某些实施方案中，本发明式I所示化合物的药学上可接受的盐包括其无机或有机酸盐，以及无机或有机碱盐，本发明涉及上述盐的所有形式，包括但不限于：钠盐，钾盐，钙盐，锂盐，葡甲胺盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢腆酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐等。

在某些实施方案中，本发明所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

在某些实施方案中，本发明所述的药物组合物为固体制剂、注射剂、外用制剂、喷剂、液体制剂或复方制剂。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒为内罗病毒科病毒。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒为正内罗病毒属病毒。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒为克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒引起的疾病为布尼亚病毒目病毒引起的出血热。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒引起的疾病为内罗病毒科病毒引起的出血热。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒引起的疾病为正内罗病毒属病毒引起的出血热。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒引起的疾病为克里米亚-刚果出血热病毒引起的出血热。

在某些实施方案中，本发明所述的布尼亚病毒目病毒引起的疾病为布尼亚病毒目病毒引起的单纯性感染、发热、头痛、肌肉疼痛、呕吐、胃肠道出血、鼻出血、呕血或休克。

在某些实施方案中，本发明所述布尼亚病毒目病毒引起的疾病为克里米亚-刚果出血热。

在某些实施方案中，本发明所述布尼亚病毒目病毒引起的疾病为克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病。

在某些实施方案中，本发明所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，例如是人、猫、狗或猪。

本发明中，术语“治疗有效量”或“预防有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物(例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期)、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。

另外需要指出，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，药物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。这里优选使用剂量介于0.001-1000mg/kg体重/天。

本发明所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。

根据本发明，所述的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、阴道用药、局部用药、非肠道用药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入、或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内用药方式。

当口服用药时，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂一般使用的载体包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬质酸镁。胶囊制剂一般使用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当直肠用药时，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物一般可制成栓剂的形式，其通过将药物与一种适宜的非刺激性赋形剂混合而制得。该赋形剂在室温下呈现固体状态，而在直肠温度下熔化释出药物。该类赋形剂包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物可根据不同的患面或器官制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当眼部局部施用时，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。此外对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。

当皮肤局部施用时，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。这里软膏即可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

当下肠道局部施用时，所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物可制成如上所述的直肠栓剂制剂或适宜的灌肠制剂形式，另外也可使用局部透皮贴剂。

所述式I所示化合物、其几何异构体、其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其水合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液，或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

附图说明

图1示出了化合物I体外抗CCHFV的效果，其中A显示了化合物I抗CCHFV初筛结果；B示出了化合物I的EC₅₀及CC₅₀；

图2示出了化合物I能有效抑制CCHFV的体内感染，其中A示出了小鼠体重变化曲线及存活率；B示出了小鼠组织中病毒拷贝数检测结果；C示出了EIDD-2801无法抑制CCHFV的体内感染；

图3示出了低剂量化合物I能有效抑制CCHFV的体内感染，其中A示出了小鼠体重变化曲线及存活率；B示出了小鼠组织中病毒拷贝数检测结果；

图4示出了延迟给药化合物I能有效抑制CCHFV的体内感染，其中A示出了小鼠体重变化曲线及存活率；B示出了小鼠组织中病毒拷贝数检测结果；C示出了小鼠肝脏及脾脏病理变化；

图5示出了化合物I的¹H-NMR谱图；

图6示出了化合物I的¹³C-NMR谱图；

图7示出了化合物I的HRMS谱图。

具体实施方式

下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。

下面实施例用到的化合物I(式I所示化合物，((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯)通过以下方法合成获得。

在氮气保护下，将T-705(1.57g，10mmol)溶于无水乙腈(10mL)中，溶液在室温搅拌15min后，滴加入三乙胺(3.03g，30mmol)，并将反应液降温至-20℃，随后滴入溴甲基异丁酸酯(3.41g，25mmol)。反应液继续在-20℃下反应24h后，将反应液倾倒入冷水(100mL)中，混合物采用二氯甲烷萃取三次，合并的有机相分别采用1N盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤两次后，采用硫酸钠干燥过夜。将干燥后的有机相浓缩至干，经硅胶拌样后采用Flash柱层析进行分离纯化(二氯甲烷/甲醇洗脱)得到目标产物化合物I。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ(ppm)8.19(d，J＝8.0Hz，1H，pyrazine H)，7.37(brs，1H，CONH₂)，6.21(s，2H，CH₂)，6.18-6.05(brs，1H，CONH₂)，2.58(dt，J＝14.0，7.0Hz，1H，CH)，1.16(d，J＝4.0Hz，6H，CH3).¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ176.09(O＝C-O)，163.08(O＝C-NH₂)，154.90(C-F，¹J_C-F＝247Hz)，154.50(C-F，⁴J_C-F＝2Hz)，132.19(C-C-F，J_C-C-F＝41Hz)，129.20(C-F，³J_C-F＝7Hz)，82.83(CH₂)，33.88(CH)，8.72(CH₃).HRMS(ESI⁺)m/z[M+H]⁺calculated for C₁₀H₁₂FN₃O₄：258.0885；found：258.0893.HRMS(ESI⁺)m/z[M+Na]⁺calculated for C₁₀H₁₂FN₃NaO₄：280.0710；found：280.0713.

化合物I的¹H-NMR、¹³C-NMR、HRMS普通如图5-7所示。

实施例1：化合物I降低克里米亚-刚果出血热病毒核酸载量实验

所有CCHFV感染实验均在BLS-3实验室进行。

1.材料和方法

1.1受试化合物：化合物I用DMSO配成100mM母液。实验时用细胞培养液(含2％FBS的MEM培养基)稀释成实验所需的浓度。

1.2细胞：Vero E6细胞(ATCC编号：1586)为非洲绿猴肾细胞，由中国科学院武汉病毒研究所传代保存。

1.3病毒：CCHFV YL16070分离株(GenBank登录号：KY354082)由中国科学院武汉病毒研究所分离传代培养。

1.4试剂、实验用品及仪器：

1.4.1试剂：minimum Eagle’s medium(MEM)培养基，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，美国GIBCO公司产品；碳酸氢钠，国药集团产品；青霉素、链霉素和卡那霉素：均为华北制药厂产品。

1.4.2实验用品及仪器：培养瓶，美国Corning公司产品；培养板96孔板，美国Corning公司产品；二氧化碳孵箱，美国Thermo公司产品；

1.4.3细胞培养液及试剂配制：MEM培养液100ml：含胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)10％，青霉素，链霉素和卡那霉素各100U/ml，NaHCO₃ 5％。细胞消化液：0.25％胰酶，用Hanks液配制，0.02％EDTA。

1.5.实验方法：

1.5.1 Vero E6细胞培养：在长满细胞的培养瓶内加0.25％胰酶0.1ml，0.02％EDTA 5ml，37℃消化5分钟，弃消化液，加培养液轻轻吹打，1∶3传代，3天长满，供化合物I毒性试验及抑制实验用。

1.5.2细胞毒性实验

化合物I对细胞毒性的检测利用CCK-8试剂盒(Beyotime)测定。具体步骤如下：

①96孔板中接种约2×10⁴个Vero-E6(ATCC)细胞，37℃培养8小时。

②将化合物I的母液用细胞培养液(含2％FBS的MEM培养基)稀释到药物使用浓度，弃96孔板中原培养基，取100μL含化合物I的细胞培养液加入到细胞中，每个浓度做三个复孔。注意设置阴性对照(细胞孔中加含对应浓度DMSO而不含化合物I的细胞培养液)和空白对照(不含细胞，仅加DMSO和细胞培养液)。加药完毕，细胞37℃培养24小时。

③向待测孔中加入20μL CCK-8溶液(Beyotime)，轻轻混匀，不要产生气泡，37℃继续培养2小时。在酶标仪上读取OD450，计算细胞活性：

细胞活性(％)＝(A(化合物I处理组)-A(空白对照))/(A(阴性对照)-A(空白对照))×100％

1.5.3抗病毒实验：

①将Vero E6细胞接种到48孔板中，每孔约6×10⁴个细胞，待第二天实验。先将100μL含相应浓度化合物I的细胞培养液加入细胞板中，预处理细胞1小时，然后加入20μL稀释的病毒(MOI＝0.01)，置于培养箱孵育1小时。然后弃病毒培养液，用PBS洗去未感染的残留病毒，再用加入含相应浓度化合物I的细胞培养液，然后放37℃、5％CO₂孵化箱继续培养72h，细胞对照组加入终浓度0.5％DMSO的细胞培养液。

②RNA提取，采用TaKaRa公司生产的试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit，货号9766)，步骤如下：

1)取受试培养板的上清液100μL，加入无核酸酶EP管中，然后每孔加入321μL裂解液(100μL PBS，200μL buffer VGB，20μL proteinase K，1μL carrier RNA)，混匀后置于56℃消化30min；

2)所得混合液加200μL无水乙醇，混匀；

3)将上述混合液转入无RNA酶的离心柱中，12000rpm离心15s，弃废液；

4)加入500μL Buffer RW1，12000rpm离心15s，弃废液；

5)加入650μL Buffer RW2，12000rpm离心15s，弃废液；

6)加入650μL Buffer RW2，12000rpm离心2min，弃废液；

7)换新的无RNA酶的2ml收集管，12000rpm离心1min，使离心柱干燥；

8)换上新的1.5ml收集管，每管加入30μl不含RNA酶的水，12000rpm离心2min，洗脱液即含有相应的RNA。

③RNA反转录，步骤如下：

实验采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser，货号RR047Q)进行RNA反转录。首先进行gDNA去除：收集各实验组RNA样品，分别取3μL RNA进行反转录。向各实验组RNA中加入2μl 5×gDNA Eraser Buffer，用RNaseFree水补足反应体系至10μl，充分混匀，42℃水浴2min去除样品中可能存在的gDNA。然后进行逆转录：向所得样品中加入适量的酶和引物Mix及反应缓冲液，用RNase Free水补足体积至20μl，37℃水浴反应15min，之后投入85℃水中5s，既可转录得到cDNA。

④Real-time PCR。荧光定量PCR采用TB Green Premix(Takara，Cat#RR820A)混好反应体系，在StepOne Plus Real-time PCR仪(品牌：ABI)进行扩增反应和读数。计算原病毒液每毫升所含拷贝数。步骤如下：

1)首先建立标准品：将质粒pMT-S稀释成5×10⁸，5×10⁷，5×10⁶，5×10⁵，5×10⁴，5×10³和5×10²copies/μL。取2μL标准品或cDNA模板用于qPCR反应；

2)实验过程中所用引物序列如下(均为5’-3’方向表示)：

S-qF：TCAAGTGGAGGAAGGACATAGG

S-qR：TCCACATGTTCACGGCTCACTGGG

3)反应程序如下：

预变性：95℃5分钟；

循环参数：95℃15秒，54℃15秒，72℃30秒。共40个循环。

2.结果

2.1化合物I对Vero E6细胞的毒性

细胞毒性结果显示，化合物I的CC₅₀为242.50μM(表1)。

表1.化合物I的细胞毒性实验结果

2.2化合物I的抗病毒活性

抗病毒实验的结果显示，化合物I在有效浓度下能够显著抑制CCHFV YL16070株病毒感染上清中病毒基因组的复制(表2)。

表2.化合物I的抗CCHFV YL16070株的效果评价结果

2.3计算其EC₅₀和CC₅₀

公式：细胞活性(％)＝(A(药物处理组)-A(空白对照))/(A(阴性对照)-A(空白对照))×100％

在病毒感染复数MOI＝0.01的条件下：

化合物I对CCHFV YL16070株的抗病毒效果为：

EC₅₀＝8.08μM，CC₅₀＝101.4μM，SI＝12.55。

在初步药物筛选中，用IFA对感染细胞进行染色。结果显示，化合物I在体外20μM时显著抑制了CCHFV的感染(图1中的A)。经计算，化合物I的EC₅₀值为8.08±2.47μM，CC₅₀值为101.4μM，SI为12.55(图1中的B)。

实施例2：化合物I保护克里米亚-刚果出血热病毒感染小鼠免于死亡的实验

2.1体内实验设计

所有动物实验均使用C57BL/6J背景的I型IFN受体敲除(IFNAR^-/-)小鼠。12-18周龄的雄性或雌性小鼠通过腹腔注射(IP)感染CCHFV(3000或5000 TCID₅₀)。小鼠以IP给药方式给予不同剂量的化合物I或EIDD-2801(购自翰香生物科技公司，货号BCP32744)，每日1次，对照组给予类似的溶剂注射。每天监测小鼠的体重和临床症状。当老鼠体重减轻超过20％，对触摸刺激无反应，爬行困难时，用异氟烷麻醉剂对其实施安乐死。对照组死亡后，处死药物治疗组小鼠，并采集小鼠器官组织(肝、脾)进行进一步的病毒载量测定和病理分析。

2.2实验结果

IFNAR^-/-每只小鼠通过腹腔注射3000 TCID₅₀ CCHFV。小鼠腹腔注射化合物I的剂量为300mg/kg，对照组小鼠腹腔注射生理盐水。从攻毒当天连续给药8天，每天一次。结果显示，对照组出现严重的体重减轻，而化合物I治疗组仅出现轻微的体重减轻或体重波动(图2中的A)。对照组在第7天死亡率为80％(6/8)，而化合物I治疗组显示出100％的保护(图2中的A)。300mg/kg化合物I治疗后肝脏和脾脏的病毒载量减少了约5log10 copies/g RNA(P＜0.001)(图2B)。剂量为150mg/kg的化合物I具有类似的效果。EIDD-2801无法抑制CCHFV的体内感染(图2中的C)。此次实验CCHFV感染小鼠组织中病毒拷贝数的结果见表3。

表3.CCHFV感染小鼠组织中病毒拷贝数(Copies/g tissue)

为了更详细地表征化合物I的保护作用，将病毒感染剂量增加到5000 TCID₅₀，同时减少药物剂量。与3000 TCID₅₀病毒感染时相似，对照组的存活率为14％(1/7)(图3中的A)。化合物I在150mg/kg或更低剂量75mg/kg时有效地保护小鼠的体重减轻，小鼠存活率为100％。病毒载量检测显示，化合物I的两种剂量治疗均显著降低了CCHFV在肝脏和脾脏中的复制(图3中的B)。因此，低剂量(75mg/kg)的化合物I有效地保护IFNAR^-/-小鼠免受致命的CCHFV攻击。此次实验CCHFV感染小鼠组织中病毒拷贝数的结果见表4。

表4.CCHFV感染小鼠组织中病毒拷贝数(Copies/g tissue)

为了评估化合物I的延迟治疗是否也提供了有效的保护，CCHFV攻毒小鼠24或48小时后，给药化合物I(150mg/kg)，每天一次，直到实验结束。对于24小时的治疗组，化合物I完全保护小鼠免受致命的CCHFV感染(图4中的A)。化合物I处理的小鼠肝脏和脾脏病毒载量的平均值也显著降低(图4中的B)。然而，当给药时间为攻毒后48小时，化合物I处理组的生存率为71％(5/7)(图4中的A)。化合物I处理组的小鼠组织在48小时的病毒拷贝数均显著下降(图4中的B)。这些数据表明，150mg/kg剂量下，延迟24小时给药化合物I对感染CCHFV的小鼠具有完全的保护作用。此次实验CCHFV感染小鼠组织中病毒拷贝数的结果见表5。

表5.CCHFV感染小鼠组织中病毒拷贝数(Copies/g tissue)

对对照组和24h药物处理组小鼠的肝脏和脾脏组织进行病理学观察。组织病理学分析显示，对照组肝、脾损伤明显(图4中的C)。感染CCHFV的小鼠肝脏出现广泛的凝固性坏死，周围有成纤维细胞增生，肝细胞多灶性点状坏死和水肿(图4中的C)。此外，肝窦单核细胞/淋巴细胞浸润明显增加。感染小鼠脾脏白髓和红髓界限模糊，脾窦单核细胞明显增多(图4中的C)。化合物I治疗组仅有少量肝细胞坏死，炎症反应轻微，脾脏白髓和红髓结构较为正常和清晰。同样，在对照组中，通过IFA检测到肝脏和脾脏中丰富的CCHFV NP蛋白，而在化合物I治疗组中，病毒蛋白几乎未检测到(图4中的C)。因此，化合物I能有效保护小鼠免受病毒感染和组织损伤。

综上，化合物I能够有效抑制克里米亚-刚果出血热病毒CCHFV，并能够高效的治疗克里米亚-刚果出血热病毒CCHFV感染引起的疾病、显著提高感染后的存活率。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> ((3-氨甲酰-5-氟吡嗪-2-基)氧基)甲基异丁酸酯的医药用途

<130> IDC220073

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 1

tcaagtggag gaaggacata gg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

tccacatgtt cacggctcac tggg 24

Claims

1.式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病或感染的药物中的用途，其中所述的克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病为克里米亚-刚果出血热病毒引起的出血热，

2.药物组合物在制备用于治疗克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病或感染的药物中的用途，其中所述药物组合物包含式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐，所述的克里米亚-刚果出血热病毒引起的疾病为克里米亚-刚果出血热病毒引起的出血热，

3.权利要求2所述的用途，其中所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

4.权利要求2或3所述的用途，其中所述药物组合物为固体制剂或液体制剂。

5.权利要求2或3所述的用途，其中所述药物组合物为注射剂、外用制剂或喷剂。

6.权利要求2或3所述的用途，其中所述药物组合物为复方制剂。

7.药物组合物在制备作为克里米亚-刚果出血热病毒抑制剂的药物中的用途，其中所述药物组合物包含式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐，

8.权利要求7所述的用途，其中所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

9.权利要求7或8所述的用途，其中所述药物组合物为固体制剂或液体制剂。

10.权利要求7或8所述的用途，其中所述药物组合物为注射剂、外用制剂或喷剂。

11.权利要求7或8所述的用途，其中所述药物组合物为复方制剂。

12.药物组合物在制备用于抑制克里米亚-刚果出血热病毒在细胞中复制或繁殖的药物中的用途，其中所述药物组合物包含式Ⅰ所示化合物或其药盐上可接受的盐，

13.权利要求12所述的用途，其中所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

14.权利要求12或13所述的用途，其中所述药物组合物为固体制剂或液体制剂。

15.权利要求12或13所述的用途，其中所述药物组合物为注射剂、外用制剂或喷剂。

16.权利要求12或13所述的用途，其中所述药物组合物为复方制剂。

17.权利要求12所述的用途，其中所述细胞为哺乳动物细胞。

18.式I所示的化合物或其药物学上可接受的盐在制备作为克里米亚-刚果出血热病毒抑制剂的药物中的用途，

19.式I所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制克里米亚-刚果出血热病毒在细胞中复制或繁殖的药物中的用途，

20.权利要求19所述的用途，其中所述细胞为哺乳动物细胞。

21.权利要求17或20的用途，其中所述哺乳动物为牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或灵长类动物。

22.权利要求17或20的用途，其中所述哺乳动物为人、猫、狗或猪。