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CN116672369A - 青春双歧杆菌在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用 - Google Patents

青春双歧杆菌在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用 Download PDF

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CN116672369A
CN116672369A CN202211236924.2A CN202211236924A CN116672369A CN 116672369 A CN116672369 A CN 116672369A CN 202211236924 A CN202211236924 A CN 202211236924A CN 116672369 A CN116672369 A CN 116672369A
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tumor
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陈淑洁
王良静
姒健敏
范丽娜
林义锋
戚亚东
王岚
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明属于益生菌技术领域，具体为青春双歧杆菌ATCC15703在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用。本发明通过青春双歧杆菌ATCC15703，既能通过增加结直肠癌中CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量，激活其Wnt通路进而促进GAS1分泌；又能通过增加肠道中巨噬细胞数量，激活TLR2和YAP进而促进DCN分泌，多方面改善肿瘤微环境。青春双歧杆菌ATCC15703的抑癌效果显著，抑癌机制明确，可作为益生菌在临床上单独或与免疫检查点抑制剂联合应用，为预防或治疗结直肠癌提供了一种新策略。

Description

青春双歧杆菌在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用
技术领域
本发明属于益生菌技术领域，具体为青春双歧杆菌ATCC15703在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用。
背景技术
我国是结直肠癌高发国家，结直肠癌的发病率在所有的肿瘤中排第二位，死亡率排第五位，严重危害国人健康。结直肠癌主要由遗传因素和环境因素引起，已有许多的临床研究发现肠道菌群与结直肠癌的发生发展高度相关。目前结直肠癌的临床治疗方案副作用强，价格昂贵，效率低下，对我国医疗造成严重的负担，因此探索一种高效低廉的防治方法迫在眉睫。
益生菌是当摄取适当数量后，对食用者的身体健康能发挥有益作用的活的微生物，是肠道微环境的重要组成部分。一般认为益生菌通过参与宿主代谢、维持肠道屏障完整和调节宿主免疫等方式抑制结直肠癌的发生发展。然而目前大多研究只停留在肠道菌群与结直肠癌的相关性，并未明确鉴定出其中的关键菌株及作用机制。因此，筛选一株能够明确抑制结直肠癌的菌株，可以将其与现有临床治疗手段相结合，制备预防和/或治疗结直肠癌产品，以达到更好预防和/或治疗目的。
青春双歧杆菌是成人正常肠道中一种完全厌氧的革兰氏阳性菌，能自主繁殖，维持肠内菌群平衡，调节人体肠道稳态。青春双歧杆菌在食品以及药品中存在一定应用，如改善急慢性腹泻、便秘、炎症性肠病以及延缓衰老等。
发明内容
本发明第一个目的在于，提供青春双歧杆菌ATCC15703在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用。
青春双歧杆菌ATCC15703是从成人肠道中分离出来的全基因组测序型菌株，是来自ATCC的青春双歧杆菌的标准菌株。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：所述青春双歧杆菌ATCC15703具有如下性能：
(1)增加CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量；
(2)促进CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1的分泌；
(3)增加巨噬细胞的数量；
(4)促进巨噬细胞分泌DCN。
作为本发明的一种优选技术方案：所述产品为药品、保健食品和食品；
所述药品包括药物载体和/或药学上可接受的辅料；
所述药品或保健食品的剂型包括丸剂、片剂、散剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、注射剂、口服液、灌肠剂或管饲制剂；
所食品包括特医食品、固体饮料、膳食纤维、乳制品、豆制品、糕点类或动物饲料。
本发明第二个目的在于，提供青春双歧杆菌ATCC15703在免疫检查点抑制剂增敏剂制备中的应用。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用如下技术方案：
作为本发明的一种优选技术方案：所述免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
具体地，经青春双歧杆菌ATCC15703所制备的增敏剂口服，抗PD-1抗体注射。
本发明第三个目的在于，提供青春双歧杆菌ATCC15703在TLR2表达促进剂、YAP表达促进剂、GAS1表达促进剂或DCN分泌促进剂制备中的应用。
本发明第四个目的在于，提供青春双歧杆菌ATCC15703在增加CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量和/或促进CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1的分泌方面的应用。
本发明还有一个目的在于，提供青春双歧杆菌ATCC15703在增加巨噬细胞的数量和/或促进巨噬细胞分泌DCN方面的应用。
本发明至少具有如下优点及有益效果：
(1)、青春双歧杆菌ATCC15703从多方面改善肿瘤微环境，具有显著的抑制结直肠癌生长作用，目前尚无相关文献和专利报道，可作为当今有限益生菌治疗手段的有益补充；
(2)、青春双歧杆菌ATCC15703既能通过增加结直肠癌中CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量，激活其Wnt通路进而促进GAS1分泌，又能通过增加肠道中巨噬细胞数量，激活TLR2和YAP进而促进DCN分泌，抑癌机制明确，信号通路清晰，在临床上合理应用可有效避免或减轻副反应；
(3)、青春双歧杆菌ATCC15703以CD143+肿瘤相关纤维细胞和DCN+肿瘤相关巨噬细胞为下游重要靶点，其中CD143+肿瘤相关纤维细胞和DCN+肿瘤相关巨噬细胞均被首次定义，CD143+肿瘤相关纤维细胞通过激活wnt信号通路上调GAS1的表达，进而抑制结直肠癌；DCN+肿瘤相关巨噬细胞通过TLR2/YAP轴上调DCN的表达，进而抑制结直肠癌。本发明为今后探究肿瘤微环境提供了新线索和新思路。
附图说明
图1为实施例1中青春双歧杆菌ATCC15703在小鼠AOM-DSS肿瘤模型中的抑癌作用。
图2为实施例2中青春双歧杆菌ATCC15703增加CD143+肿瘤相关成纤维细胞数量；图中，A为单细胞测序数据tSNE降维肿瘤相关成纤维细胞；B为来源于青春双歧杆菌ATCC15703或PBS组的5种肿瘤相关成纤维细胞亚群构成；C为western检测体外PBS、青春双歧杆菌ATCC15703以及大肠杆菌处理的肿瘤相关成纤维细胞CD143的表达水平；D为青春双歧杆菌ATCC15703处理的肿瘤相关成纤维细胞在皮下瘤模型中的肿瘤大小统计图。
图3为实施例3中青春双歧杆菌ATCC15703通过上调CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1表达抑制肿瘤生长；图中，A为单细胞测序数据中CD143+以及CD143-肿瘤相关成纤维细胞GAS1的表达水平；B为western检测体外PBS、青春双歧杆菌ATCC15703以及大肠杆菌处理的肿瘤相关成纤维细胞GAS1的表达水平；C为过表达GAS1的肿瘤相关成纤维细胞在皮下瘤模型中肿瘤大小统计图。
图4为实施例4中青春双歧杆菌ATCC15703通过增加AOM-DSS肿瘤模型小鼠肠道巨噬细胞的数量抑制肿瘤生长。图中，A为流式细胞术检测发现青春双歧杆菌ATCC15703增加AOM-DSS肿瘤模型小鼠肠道巨噬细胞的数量；B为青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞在皮下瘤模型中的肿瘤大小统计图。
图5为实施例5中青春双歧杆菌ATCC15703通过上调巨噬细胞中DCN的分泌抑制肿瘤生长；图中，A为青春双歧杆菌ATCC15703增加巨噬细胞DCN的分泌；B为青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞通过上调DCN发挥抑癌作用；C为在巨噬细胞系Raw264.7上构建稳转敲除DCN的细胞系，随后进行是否敲低DCN条件下青春双歧杆菌ATCC15703体内抑癌作用的验证。
图6为实施例6中青春双歧杆菌ATCC15703通过TLR2/YAP轴上调巨噬细胞DCN的分泌；图中，A为western检测PBS、青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞TLR2、YAP以及DCN的表达；B为western检测TLR2抑制剂Cu-CPT22处理前后TLR2、YAP以及DCN水平；C为western检测YAP抑制剂维替泊芬处理前后TLR2、YAP以及DCN水平。
图7为实施例7中青春双歧杆菌ATCC15703增加抗PD-1抗体免疫治疗的效果。
具体实施方式
参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。
实施例1：青春双歧杆菌ATCC15703体内抑制结直肠癌生长
将6周雄性C57BL/6小鼠，随机分为3组，每组9只。小鼠自由饮用含2mg/mL链霉素的饮水1周初步清除肠道菌群，有利于移植菌定植。肠道菌群清除后，三组分别予PBS、大肠杆菌和青春双歧杆菌ATCC15703灌胃，剂量为1×109CFU/只小鼠，灌胃量200μL，每天一次。腹腔注射AOM，剂量为10mg/kg，并予三轮2.5％DSS自由饮水五天，每轮间隔14天。造模过程关注小鼠体重改变、粪便成型度、便血以及脱肛情况。造模结束后，统计结直肠肿瘤的数量及大小。
结果如图1所示，补充青春双歧杆菌ATCC15703能够显著减少AOM-DSS模型小鼠肠道肿瘤的数量，降低肿瘤负荷。
实施例2：青春双歧杆菌ATCC15703通过增加肿瘤中CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量抑制肿瘤生长
按照实施例1所用方法造模，将AOM-DSS炎癌模型小鼠肠道肿瘤利用IV型胶原酶消化解离成为单细胞，单细胞转录组测序检测其中每个细胞转录水平。采取tSNE降维方式，将得到的全部细胞转录水平矩阵投射到二维平面，并且根据每一类群得到的marker基因，结合线上数据库及公认细胞marker基因对得到的二维点图进行归类分群。采用上述相同方式将肿瘤成纤维细胞进行更进一步降维分析，得到C1-C5群肿瘤相关成纤维细胞，比较青春双歧杆菌ATCC15703组和PBS组各亚群肿瘤相关成纤维细胞的构成，发现青春双歧杆菌ATCC15703显著增加肿瘤中C4亚群，进一步明确C4亚群的marker基因为CD143，而后通过流式细胞术以及western验证单细胞测序的结果。
随后在皮下瘤模型中验证CD143+成纤维细胞的抑癌功能。将来自结直肠癌患者的肿瘤相关成纤维细胞与青春双歧杆菌ATCC15703(MOI＝10:1)一起孵育48小时，然后用PBS洗涤3次。随后将PBS或者青春双歧杆菌ATCC15703处理的肿瘤相关成纤维细胞与3×106HCT-116细胞混合注射至裸鼠皮下(每只小鼠100μL)。注射7天后，每两天监测肿瘤体积，计算公式如下：体积＝0.54×L×W2，其中L为最长直径，W为最短直径。在终末期，记录肿瘤重量。
结果如图2所示，补充青春双歧杆菌ATCC15703增加肿瘤中CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量并且青春双歧杆菌ATCC15703处理的肿瘤相关成纤维细胞能够在体内抑制HCT-116细胞的肿瘤生长。
实施例3：青春双歧杆菌ATCC15703通过上调CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1的表达抑制肿瘤生长
分析单细胞转录组测序数据中CD143+肿瘤相关成纤维细胞以及CD143-肿瘤相关成纤维细胞转录组水平差异。于体外将新鲜的肿瘤或正常结肠组织切成直径为2mm的小块，随后接种在含有DMEM培养基(培养基含20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素)的培养瓶中。将培养瓶倒置并在37℃、5％CO2下保持4小时，而后将培养瓶翻转。贴壁细胞在含有20％FBS的DMEM培养基中连续培养约3至4周。每三天更换一次培养基。随后将青春双歧杆菌ATCC15703按照MOI＝1:100加入到纯化的肿瘤相关成纤维细胞中，培养24h后提取其蛋白质，利用western检测肿瘤相关成纤维细胞中GAS1的表达。
将成纤维细胞系NIH/3T3利用Cas9技术过表达GAS1，然后与3×106MC38细胞(MOI＝10:1)混合注射(每只小鼠100μL)到裸鼠皮下。植入7天后，每2天监测肿瘤体积，计算公式如下：体积＝0.54×L×W2，其中L为最长直径，W为最短直径。在终末期，记录肿瘤重量。
结果如图3所示，补充青春双歧杆菌ATCC15703在体内以及体外能够增加CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1的表达。过表达GAS1的肿瘤相关成纤维细胞能够在体内抑制MC38细胞的肿瘤生长。
实施例4：青春双歧杆菌ATCC15703通过增加肠道中巨噬细胞的数量抑制肿瘤生长
在冰上取PBS、青春双歧杆菌ATCC15703或者大肠杆菌灌胃的AOM-DSS小鼠结肠组织，去除脂肪组织和系膜，置于预冷1640培养基中，纵向切开，用1640培养基清洗2-3遍，洗去黏液，各组截取肠道位置及长度尽量保持一致(3cm左右)。将肠道剪成5-6小段，每段长约0.5cm，放入37℃预热的肠上皮消化液中(肠上皮分离液配方：D-Hanks溶液+5％灭活FBS+1mM DTT+5mM EDTA)置于摇床上，37℃，150rpm，孵育20-30min，剧烈震荡，倒出液体于吸水纸上，用镊子将肠道夹入新的离心管，加入1640培养基，充分震荡洗涤2-3次。随后将肠段剪碎成1mm左右碎片，收集到新的管子中，加入5mL固有层消化液(固有层消化液配方：Hanks溶液+5％灭活FBS+1mg/mL四型胶原酶)，置于37℃摇床中，200rpm 30min。结束后用300目滤膜过滤入15mL离心管，700g，5min离心弃上清。而后调整细胞浓度：将收集的单细胞悬液用PBS将细胞数调至2×107/mL。每个样本取50μL细胞悬液加入0.3μL死活抗体后混匀，避光4℃敷育30min，加入150μL FACS buffer终止染色，700g 5min离心，弃上清，50μLPBS重悬。配制抗体预混液(FVS 510(564406)、Alexa Fluor 700-CD45(560510)、BV421-F4/80(565411)、AF488-CD11b(557672)和PECPCY5.5-CD3(551163))，每样本加入适量抗体混匀，避光4℃孵育染色30min，加入150μL PBS终止，700g 5min离心，弃上清，用150μL PBS洗涤1次，适当体积重悬上机。
接着我们利用皮下瘤模型验证青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞的功能。用人源巨噬细胞细胞系THP-1，适宜密度铺10cm培养皿后用200nM的佛波酯刺激分化成熟。而后均匀的将适量巨噬细胞铺在6孔板中，细胞贴壁后，将青春双歧杆菌ATCC15703以MOI＝100:1加入到巨噬细胞中共培养24h。而后将PBS或者青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞与3×106HCT-116细胞混合注射至裸鼠皮下(每只小鼠100μL)。注射7天后，每两天监测肿瘤体积，计算公式如下：体积＝0.54×L×W2，其中L为最长直径，W为最短直径。在终末期，记录肿瘤重量。
结果如图4所示，流式细胞术发现青春双歧杆菌ATCC15703增加AOM-DSS模型小鼠肠道中巨噬细胞的数量并且青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞能够在体内抑制HCT-116的肿瘤生长。
实施例5：青春双歧杆菌ATCC15703通过上调巨噬细胞中DCN的分泌抑制肿瘤生长
颈部脱臼法处死C57BL/6小鼠，然后移至超净台，剥离小鼠双侧股骨及胫腓骨。在10cm皿中加入2-3mL培养基(含双抗)，剪去股骨及胫骨两端，暴露骨髓腔，用1mL注射器吸取培养基，在10cm皿中反复冲洗骨髓腔，冲出其内骨髓细胞。用70μm滤器过滤冲出的细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清。用含1％青链霉素、10％FBS和25ng/mL M-CSF的DMEM培养基重悬细胞，培养5天诱导分化。通过流式细胞术鉴定提取的巨噬细胞数量以及纯度。均匀的将适量巨噬细胞铺在6孔板中，细胞贴壁后，将含双抗的培养基换成无抗含10％FBS的DMEM培养基。将青春双歧杆菌ATCC15703以MOI＝100:1加入到巨噬细胞中共培养24h，而后收集巨噬细胞的RNA，送转录组测序。将体外转录组测序的差异基因与体内单细胞测序的差异基因取交集，发现DCN表达上调最为明显，随后利用western检测青春双歧杆菌ATCC15703处理后巨噬细胞DCN表达以验证相关测序数据。
进一步利用Cas9技术在鼠源Raw264.7细胞系中敲除DCN基因，而后按实施例4所示方法与HCT-116细胞共注射至裸鼠皮下，检测肿瘤大小及重量。
结果如图5所示，青春双歧杆菌ATCC15703在体内及体外增加巨噬细胞DCN的分泌，并且敲除DCN基因后的巨噬细胞与青春双歧杆菌ATCC15703共处理无法在体内抑制HCT-116皮下瘤的生长。
实施例6：青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞通过TLR2和YAP上调DCN的表达
按照实例5中所示共培养的方式，发现青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞TLR2和YAP上调，而后在青春双歧杆菌ATCC15703与巨噬细胞共培养的过程中分别加入了TLR2抑制剂Cu-CPT22与YAP抑制剂维替泊芬，利用western检测巨噬细胞TLR2、YAP以及DCN的表达。
结果如图6所示，青春双歧杆菌ATCC15703处理的巨噬细胞通过TLR2/YAP轴上调DCN的分泌。
实施例7：青春双歧杆菌ATCC15703增敏抗PD-1抗体在结直肠癌中的治疗作用
将6周雄性C57BL/6小鼠，随机分为4组，每组10只分别为PBS+isotype组、PBS+抗PD-1抗体组、青春双歧杆菌ATCC15703+isotype组、青春双歧杆菌ATCC15703组+抗PD-1抗体组。PBS为青春双歧杆菌ATCC15703溶剂，为无青春双歧杆菌ATCC15703的溶剂对照，isotype为与抗PD-1抗体相同来源的抗体，但其无抗PD-1活性，为抗PD-1抗体的阴性同型对照。小鼠造模前自由饮用含2mg/mL甲硝唑、2mg/mL青霉素、2mg/mL链霉素和1mg/mL万古霉素的饮水，1周初步清除肠道菌群，有利于移植菌定植。
肠道菌群清除后，青春双歧杆菌+isotype组、青春双歧杆菌+抗PD-1抗体组给予青春双歧杆菌灌胃，剩余两组PBS灌胃，剂量为1×109CFU/只小鼠，灌胃量200μL，每天一次。灌胃7天后，将2×107的MC38细胞注射至小鼠皮下(每只小鼠100μL)。注射10天后，给PBS组和青春双歧杆菌ATCC15703组腹腔注射IgG Isotype或者腹腔注射抗PD-1抗体(100μg每只)每隔两天打一针，每两天监测肿瘤体积，计算公式如下：体积＝0.54×L×W2，其中L为最长直径，W为最短直径。三针PD-1治疗后隔天终止实验，记录并统计肿瘤重量。
结果如图7所示，青春双歧杆菌ATCC15703+抗PD-1抗体组肿瘤大小明显小于PBS+抗PD-1抗体组，青春双歧杆菌ATCC15703显著增加PD-1的治疗作用。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.青春双歧杆菌ATCC15703在预防和/或治疗结直肠癌产品制备中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青春双歧杆菌ATCC15703具有如下性能：
(1)增加CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量；
(2)促进CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1的分泌；
(3)增加巨噬细胞的数量；
(4)促进巨噬细胞分泌DCN。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药品、保健食品和食品；
所述药品包括药物载体和/或药学上可接受的辅料；
所述药品或保健食品的剂型包括丸剂、片剂、散剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、注射剂、口服液、灌肠剂或管饲制剂；
所食品包括特医食品、固体饮料、膳食纤维、乳制品、豆制品、糕点类或动物饲料。
4.青春双歧杆菌ATCC15703在免疫检查点抑制剂增敏剂制备中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述免疫检查点抑制剂为抗PD-1抗体。
6.青春双歧杆菌ATCC15703在TLR2表达促进剂、YAP表达促进剂、GAS1表达促进剂或DCN分泌促进剂制备中的应用。
7.青春双歧杆菌ATCC15703在增加CD143+肿瘤相关成纤维细胞的数量和/或促进CD143+肿瘤相关成纤维细胞GAS1的分泌方面的应用。
8.青春双歧杆菌ATCC15703在增加巨噬细胞的数量和/或促进巨噬细胞分泌DCN方面的应用。
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