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CN116670149A - 一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法 - Google Patents

一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法 Download PDF

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CN116670149A
CN116670149A CN202180088127.1A CN202180088127A CN116670149A CN 116670149 A CN116670149 A CN 116670149A CN 202180088127 A CN202180088127 A CN 202180088127A CN 116670149 A CN116670149 A CN 116670149A
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CN
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陈志立
陶铜强
谭保锋
张鑫
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Jiangsu Genscript Biotech Co Ltd
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Jiangsu Genscript Biotech Co Ltd
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Abstract

一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法，属于化学制药和精细化工制备技术领域。包括以下步骤：(1)以树脂A为载体，采用固相合成策略得到树脂肽，(2)切割树脂后得到全保护肽，(3)在TCFH/碱缩合体系下与对氯苯硫酚发生酯化反应生成对氯苯硫酯，(4)脱除保护基后，得到肽硫酯，(5)进一步环化得到首尾环肽。硫酯肽与首尾酰胺环肽的制备提供了一条简单适普性广、收率高的技术路线，在化学制药和精细化工制备技术具有广泛的应用。

Description

一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月28日提交的申请号为202011579916.9的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及化学制药和精细化工制备技术领域，具体涉及一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法。
背景技术
天然环肽在药理学研究中起着重要作用，与直链肽相比，其对蛋白酶的抵性强并且构象柔韧性降低。天然环肽已达到药物的稳定性，效能和选择性标准，如许多天然环肽如万古霉素，环孢菌素A和罗米地辛之类的药物已被开发为药物。然而，有些直链肽位阻大，活性低，不易环化，而肽硫酯是一种高活性的化合物，能够高收率得到环肽，而且可以环合困难的首尾环肽。
1994年，Kent小组用固相方法直接合成C端为硫代羧酸的多肽，随后用苄溴或由Ellman′s试剂将其转变为硫酯。然而，反应步骤较多，试剂比较昂贵，不适宜大量生产。(Dawson P E,Muir T W,Kent S B.Synthesis of proteins by native chemical ligation.Science,1994,266,776-779.)
2001年，Hilvert课题组开发了一种固相合成肽硫酯的方法，羧丙基磺酰胺作为连接分子，由Fmoc化学完成多肽合成后，用碘乙氰或三甲硅基偶氮甲烷(TMS 2CHN 2)对磺酰胺进行烷基化，再用硫醇将其从树脂上切下并使用LiBr/THF进行硫酯化，经TFA脱去侧链保护基得到非保护的多肽硫酯。然而，肽硫酯的合成步骤多，操作复杂，反应条件苛刻，并且反应试剂不易昂贵，收率低。(Quaderer R and Hilvert D.Improved Synthesis of C-Terminal Peptide Thioesters on“Safety-Catch”Resins Using LiBr/THF.Org Lett.2001,3,3181—3184)
2009年，Houghten小组以“易挥发”的硫酯硅胶作为的固相载体，依次合成直链肽，最后在HF裂解下，得到肽硫酯，最后在乙腈和1.5M咪唑水溶液的混合物中高产率得到首尾环化产物。然而，硫酯硅胶载体不常用，并且还用到强腐蚀性的HF。(Li Y M,Yongye A and Houghten R A.Synthesis of Cyclic Peptides through Direct Aminolysis of Peptide Thioesters Catalyzed by Imidazole in Aqueous Organic Solutions.J.Comb.Chem.2009,11,1066–1072.)
2014年，Eberle小组开发了在PyBop催化下，对氯苯硫酚与C端为羧酸的全保护的多肽偶联得到肽硫酯，然后脱除保护基，在碱的催化下合成其首尾环。然而，用PyBop合成肽硫酯，收率较低，不易纯化。(Agrigento P,Albericio F and Eberle M. Facile and Mild Synthesis of Linear and Cyclic Peptides via Thioesters.Org.Lett.2014,16,3922-3925.)
因此，简洁高效的肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法仍然有待开发。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成方法。在廉价易得的偶联试剂TCFH的催化下，对氯苯硫酚与N端Boc保护的全保护肽发生酯化反应，得到一系列高产率、高纯度肽硫酯，最后在碱的作用下，得到首尾酰胺环肽。
本发明提供一种简捷的肽硫酯及其首尾酰胺环肽的合成，合成路线如下：
其中peptide为肽链，PG 1为肽链侧链上的所有的保护基；PG 2为肽链N端的保护基。
下面更具体地描述本发明的制备方法。然而，应理解，本发明并不同限于以下所给出的具体反应条件(如溶剂、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等)。
本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种简捷的肽硫酯的合成方法。
为解决的第一个技术问题，本发明采取的技术方案是：一种简捷的肽硫酯的合成方法。包括如下步骤：
(1)树脂肽B的制备：以树脂A为载体，采用固相合成按照目标序列从C端到N端的顺序依次偶联相应氨基酸，得到树脂肽B；
(2)全保护肽C的制备：使用第一切割试剂将步骤(1)中得到的树脂肽B中的树脂切割，得到全保护肽C；
(3)全保护肽硫酯D的制备：在溶剂中，偶联剂TCFH和碱的作用下，将步骤(2)中得到的全保护肽C与对氯苯硫酚发生酯化反应，得到全保护肽硫酯D；
(4)肽硫酯E的制备：在第二切割试剂的作用下，脱除步骤(3)中得到的全保护肽硫酯D的保护基得到肽硫酯E；
其中peptide为肽链，PG 1为肽链侧链上的所有的保护基；PG 2为肽链N端的保护基。
在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，所述PG 2为Boc，所述肽链为直链，所述树脂肽B的合成方式为所述偶联的最后一个氨基酸为Boc保护的氨基酸或以二碳酸二叔丁酯进行所述肽链的N端Boc保护。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述第一切割试剂为本领域常规切割试剂，如体积分数为1％TFA/DCM溶液，体积比为1:2:7的三氟乙醇、乙酸和DCM的混合溶液等。
在本发明的一些实施例中，所述第一切割试剂为三氟异丙醇的二氯甲烷溶液，所述三氟异丙醇在二氯甲烷中的体积分数为10％-90％，所述切割的次数为1-5次，所述切割的每次切割时间为0.5h-6h。优选的，所述三氟异丙醇在二氯甲烷中的体积分数为33％；所述切割的次数为3次，所述切割的每次切割时间为1h。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述碱选自DIPEA或NMI中的至少一种；所述全保护肽C、对氯苯硫酚、TCFH和碱的摩尔比为1:1-2:1-3:2-5；优选的，所述碱为NMI，所述全保护肽C、对氯苯硫酚、TCFH和碱的摩尔比为1:1.2:1.5:4。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述溶剂为DMF、DMSO或DMA中的一种或多种；所述全保护肽C在所述溶剂中的浓度为0.01M-0.2M；优选的，所述溶剂为DMF，优选的，所述全保护肽C在所述溶剂DMF中的浓度为0.01-0.2M；更优选的，为0.1M。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，所述偶联反应的时间为4h-24h；优选的，为16-24h；更优选的，为16h。
在本发明的一些实施例中，所述偶联反应的温度为20℃-100℃；优选的，为25-50℃；更优选的，为30℃。
在本发明的一些实施例中，步骤(4)中，所述第二切割试剂为EDT、苯酚、茴香硫醚或H 2O中的一种或多种与TFA的混合液；优选的，所述第二切割试剂为TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的混合液；所述混合液中TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的体积比为50-95:1-12.5:1-12.5:1-12.5:1-12.5；优选的，为87.5:5:2.5:2.5:2.5。
本发明要解决的第二个技术问题是：提供一种首尾酰胺环肽的合成方法。
为解决第二个技术问题，本发明提供的技术方案是：一种首尾酰胺环肽的合成方法。
包括如下步骤：
(1)如本发明前述方法制备得到肽硫酯E；
(2)在碱的作用下，将步骤(1)制备得到的肽硫酯E在溶剂中环化得到首尾酰胺环肽F；
其中peptide为肽链。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述碱为DIPEA、DBU、咪唑或NMI中的一种或多种；所述肽硫酯E与碱的摩尔比为1:2-5。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)中，所述溶剂为DMF、DMSO或DCM中的一种或多种；所述肽硫酯E在所述溶剂中的浓度为0.001M-0.01M。
优选的，步骤(2)中，所述碱为DIPEA；所述肽硫酯E与碱的摩尔比为1:3；所述溶剂为DMF，所述肽硫酯E在所述溶剂中的浓度为0.0025M。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
术语“环肽”、“首尾酰胺环肽”和“首尾环肽”均指N端与C端以酰胺键呈环状的多肽。
术语“固相合成”是指将反应物连接在一个不溶性的固相载体上的一种合成方法。
用于定义肽的命名原则是本领域中常用的，其中N-末端的氨基出现在左侧并且C-末端的竣基出现在右侧。关于天然氨基酸是指发现于蛋白质中的天然存在的氨基酸之一，即，Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys，Me、Phe、Tyr、Pro、Trp和His。
其中氨基酸具有异构体形式；除非另有指示，它是指所表示的L形式的氨基酸。
连字符或者因括号后的后缀"-OH"和"-NH 2"分别是指多肽或氨基酸的游离酸和酰胺形式。例如：Fmoc-Val-OH指N端Fmoc保护的Val氨基酸的游离酸形式。NH 2-peptide指肽链端N端氨基酸为酰胺形式。
肽的化学合成中常使用适宜的保护基保护各种氨基酸部分的反应性侧链基团，这将阻止在该位置发生化学反应，直至最后保护基被除去时。本发明中“全保护肽”指所有的活性侧链均被保护基保护起来的多肽。本发明中“全保护肽硫酯”指所有的活性侧链均被保护基保护起来的肽硫酯。另外，当整体在羧基上反应时，也常见对氨基酸或其片段的α氨基的保护，然后通过选择性除去α氨基保护基，使其在该位置上发生随后的反应。 虽然已经公开了有关固相合成方法的特定保护基，但应注意到，每种氨基酸都可通过常用于溶液相合成中的各种氨基酸的保护基进行保护。
固相合成法通过将保护的α-氨基酸偶联到适宜的树脂上从肽的C-末端开始。这类原料可如下制备：将α-氨基-保护的氨基酸通过酯键连接到对苄氧基苄醇(Wang)树脂或2-Cl-Trt树脂上，或者通过Fmoc-Linker间的酰胺键连接到二苯甲胺(BHA)树脂上。本发明中采用的是Fmoc固相合成策略。
在多肽合成过程中，第一个氨基酸与树脂的连接反应与后续氨基酸的接入有所不同，特别是其接入的取代度高低直接关系到后续做肽长短的选择，本发明中选用了市售的预装了第一个氨基酸的多肽合成用预装树脂。例如：购置吉尔生化公司的Fmoc-Ala-2-Cl-Trt树脂和Fmoc-Gly-2-Cl-Trt树脂等。
有益效果：
本发明提供了一种高效简捷的缩合体系合成肽硫酯。
本发明提供的肽硫酯活性高，可以环合困难的首尾酰胺环肽，适普性广。
本发明合成首尾酰胺环肽的方法，操作简单，首尾酰胺环肽收率高，低成本，适普性广。
附图说明
通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明：
图1为化合物F1MS图谱；
图2为化合物F1的HPLC图谱；
图3为化合物F2的MS图谱；
图4为化合物F2的HPLC图谱；
图5为化合物F3的MS图谱；
图6为化合物F3的HPLC图谱。
具体实施方式
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得，常用化学试剂如表1所示：
表1常用化学试剂
本发明中使用的缩写具有本领域常规含义，对于各种常见氨基酸的单字符和三字符缩写按PureAppl.Chem.31,639-645(1 972)和40，277-290(1974)中所建议的而且符合37CFR～1.822C55FR 18245,1990年5月1日)和PCT规则(WIPüStandard ST.23:Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents)。本发明常用缩写及其含义如表2所示：
表2本发明常用缩写及其含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Boc 叔丁氧羰基
THF 四氢呋喃
PyBop 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HMPA 六甲基磷酰三胺
DMSO 二甲基亚砜
DMA 二甲基乙酰胺
Pip 六氢吡啶
A(Ala) 丙氨酸
R(Arg) 精氨酸
D(Asp) 门冬酰胺
C(Cys) 门冬氨酸
I(Ile) 异亮氨酸
M(Met) 甲硫氨酸
L(Leu) 亮氨酸
W(Trp) 色氨酸
G(Gly) 甘氨酸
除非另有说明，本发明实施例中的投料当量为摩尔当量，以eq表示，例如1eq，表示投料为一个摩尔当量。本发明浓度单位M为mol/L。
实施例1：首尾酰胺环肽F1(AIMAA)的合成与纯化
本实施例针对首尾酰胺环肽AIMAA的合成与纯化，这些氨基酸都采用Fmoc保护α-氨基进行固相合成，具体合成步骤如下：
(1)树脂肽B1的制备：称取1g Fmoc-Ala-2-Cl-Trt树脂，执行[操作A]，即：加入20％Pip/DMF脱除N端的Fmoc保护基团，在25℃下反应20min，反应后用DMF洗涤5次，利用茚三酮检测试剂检测，若为阳性表示反应完全。然后执行[操作B]，即：加入含1.5mmol DIC，1.5mmol HOBT，以及1.5mmol具有保护基团的氨基酸的混合溶液，浓度为0.5M，在25℃中，反应1小时结束后，用茚三酮检测为阴性，则说明反应完全，然后用工业DMF洗涤3次。后续以[操作A]、[操作B]交替进行，随着合成顺序的进行，只是在[操作B]中所加入的相应的氨基酸。直至连接到Ala，执行[操作A]，最后加入1.5mmol(Boc) 2O，1.5mmol DIPEA的二氯甲烷溶液，反应30min，以上反应即获得树脂肽B1，如下图所示。
(2)全保护肽C1的制备：向步骤(1)中得到的树脂肽B1中，加入体积分数为33％的三氟异丙醇二氯甲烷溶液作为第一切割试剂，切割3次，每次1h，将得到的产物冻干得到白色粉末全保护肽C1，理论分子为575.60，实际检测分子量为575.21。
(3)全保护肽硫酯D1的制备
步骤(2)中得到的全保护肽C1，取100mg，分别加入1.5eq TCFH，4eq NMI的DMF(0.1M)溶液，最后加入1.2eq对氯苯硫酚，30℃下反应16h后，HPLC检测，收率为82％，全保护肽硫酯D1优化实验如表3所示。
(4)肽硫酯E1的制备：
步骤(3)中得到的全保护肽硫酯D1加入5mL切割试剂(TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的混合液，体积比为87.5:5:2.5:2.5:2.5)，反应2h，乙醚沉降得到粗品肽硫酯，冻干得到肽硫酯粉末E1共80mg，收率为95％。
(5)首尾酰胺环肽F1的制备：
步骤(4)中得到的肽硫酯E1，取50mg，加入3.0eq DIPEA的DMF(0.0025M)溶液，反应12h，反应条件优化实验如表4所示。
将溶剂浓缩后，乙醚沉降得到粗品首尾酰胺环肽，用水/乙腈的混合液体溶解，用高效液相色谱装样进行分离提纯，流动相为H 2O/0.1TFA％，ACN/0.1％TFA，C18制备柱进行梯度洗脱色谱体系分离提纯，收集目标馏分。把收集的目标峰用分析性高效液相色谱检测纯度。合格的样品用液氮冻干，最后放入真空冷冻干燥机冻干，获得37mg，收率为82％，95％纯度的首尾酰胺环肽化合物F1。首尾酰胺环肽化合物F1的理论分子量为457.59，实际检测分子量为457.2；在220nm下检测，C18(4.6*250mm)5μm色谱柱，线性梯度从5％到65％，在25分钟内以1mL/min的速度在水(0.065％TFA)中的乙腈(0.05％TFA)，t R＝18.9min,Ms及HPLC图谱如图1和图2所示。
实施例2首尾酰胺环肽F2(LWLLG)的合成与纯化
本实施例针对首尾酰胺环肽LWLLG的合成与纯化，这些氨基酸都采用Fmoc保护α-氨基进行固相合成，具体合成步骤如下：
(1)树脂肽B2的制备：
称取1g Fmoc-Gly-2-Cl-Trt树脂，执行[操作A]，即：加入20％Pip/DMF脱除N端的Fmoc保护基团，在25℃下反应20min，反应后用DMF洗涤5次，利用茚三酮检测试剂检测，若为阳性表示反应完全。然后执行[操作B]，即：加入含1.5mmol DIC，1.5mmol HOBT，以及1.5mmol具有保护基团的氨基酸的混合溶液，浓度为0.5M，在25℃中，反应1小时结束后，用茚三酮检测为阴性，则说明反应完全，然后用工业DMF洗涤3次。后续以[操作A]、[操作B]交替进行，随着合成顺序的进行，只是在[操作B]中所加入的相应的氨基酸。直至连接到Ala，执行[操作A]，最后一个氨基酸使用Boc-Leu-OH，执行[操作A]，以上反应即获得树脂肽B2，如下图所示。
(2)全保护肽C2的制备：
向步骤(1)中得到的树脂肽B2中，加入体积分数为33％的三氟异丙醇二氯甲烷溶液作为第一切割试剂，切割3次，每次1h，将得到的产物冻干得到白色粉末全保护肽C2，理论分子为800.75，实际检测分子量为800.4。
(3)全保护肽硫酯D2的制备
步骤(2)中得到的全保护肽C2，取100mg，分别加入1.5eq TCFH，4eq NMI的DMF(0.1M)溶液，最后加入1.2eq对氯苯硫酚，30℃下反应16h后，HPLC检测，收率为86％。
(4)肽硫酯E2的制备：
步骤(3)中得到的全保护肽硫酯D2，加入5mL切割试剂(TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的混合液，体积比为87.5:5:2.5:2.5:2.5)，反应2h，乙醚沉降得到粗品肽硫酯，冻干得到粉末肽硫酯E2：85mg，收率为94％。
(5)首尾酰胺环肽F2的制备：
步骤(4)中得到的肽硫酯E2，取50mg，加入3.0eq DIPEA的DMF(0.0025M)溶液，反应12h，将溶剂浓缩后，乙醚沉降得到粗品首尾酰胺环肽，用水/乙腈的混合液体溶解，用高效液相色谱装样进行分离提纯，流动相为H 2O/0.1TFA％，ACN/0.1％TFA，C18制备柱进行梯度洗脱色谱体系分离提纯，收集目标馏分。把收集的目标峰用分析性高效液相色谱检测纯度。合格的样品用液氮冻干，最后放入真空冷冻干燥机冻干，获得35mg,收率为78％，98.9％的纯度的首尾酰胺环肽化合物F2的理论分子量为582.74，实际检测分子量为582.3；在220nm下检测，C18(4.6*250mm)5μm色谱柱，线性梯度从5％到65％，在25分钟内以1mL/min的速度在水(0.065％TFA)中的乙腈(0.05％TFA)，tR＝20.89min,Ms及HPLC图谱如图3和图4所示。
实施例3首尾酰胺环肽的合成F3的合成与纯化
本实施例针对首尾酰胺环肽Gly{d-Leu}{d-Trp}{d-Leu}{d-Leu}的合成与纯化，这些氨基酸都采用Fmoc保护α-氨基进行固相合成，具体合成步骤如下：
(1)树脂肽B3的制备：
称取1g Fmoc-Gly-2-Cl-Trt树脂，执行[操作A]，即：加入20％Pip/DMF脱除N端的Fmoc保护基团，在25℃下反应20min，反应后用DMF洗涤5次，利用茚三酮检测试剂检测，若为阳性表示反应完全。然后执行[操作B]，即：加入含1.5mmol DIC，1.5mmol HOBT，以及1.5mmol具有保护基团的氨基酸的混合溶液，浓度为0.5M，在25℃中，反应1小时结束后，用茚三酮检测为阴性，则说明反应完全，然后用工业DMF洗涤3次。后续以[操作A]、[操作B]交替进行，随着合成顺序的进行，只是在[操作B]中所加入的相应的氨基酸。直至连接到Ala，执行[操作A]，最后加入1.5mmol(Boc) 2O,1.5mmol DIPEA的二氯甲烷溶液，反应30min，以上反应即获得树脂肽B3，如下图所示。
(2)全保护肽C3的制备：
向步骤(1)中得到的树脂肽B3中，加入体积分数百分比为33％的三氟异丙醇二氯甲烷溶液作为第一切割试剂，切割3次，每次1h，将得到的产物冻干得到白色粉末全保护肽C3，理论分子为800.75，实际检测分子量为800.2。
(3)全保护肽硫酯D3的制备
步骤(2)中得到的全保护肽C3，取100mg，分别加入1.5eq TCFH，4eq NMI的DMF(0.1M)溶液，最后加入1.2eq对氯苯硫酚，30℃下反应16h后，HPLC检测，收率为79％。
(4)肽硫酯E3的制备：
步骤(3)中得到的全保护肽硫酯D3，加入5mL切割试剂(TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的混合液，体积比为87.5:5:2.5:2.5:2.5)，反应2h，乙醚沉降得到粗品肽硫酯，冻干得到粉末肽硫酯E3，82mg，收率为90％。
(5)首尾酰胺环肽F3的制备：
步骤(4)中得到的肽硫酯E3，取50mg，加入3.0eq DIPEA的DMF(0.0025M)溶液，反应12h，将溶剂浓缩后，乙醚沉降得到粗品首尾酰胺环肽，用水/乙腈的混合液体溶解，用高效液相色谱装样进行分离提纯，流动相为H 2O/0.1TFA％，ACN/0.1％TFA，C18制备柱进行梯度洗脱色谱体系分离提纯，收集目标馏分。把收集的目标峰用分析性高效液相色谱检测纯度。合格的样品用液氮冻干，最后放入真空冷冻干燥机冻干，获得30mg收率为75％，98.9％纯度的首尾酰胺环肽化合物F3。首尾酰胺环肽化合物F3的理论分子量为582.74，实际检测分子量为582.2；在220nm下检测，C18(4.6*250mm)5μm色谱柱，线性梯度从5％到65％在25分钟内以1mL/min的速度在水(0.065％TFA)中的乙腈(0.05％TFA)，t R＝22.13min,Ms及HPLC图谱如图5和图6所示。
实施例1中，步骤(3)的反应条件优化参考表3，表3中各标号含义如下：M为全保护肽C1:对氯苯硫酚:偶联试剂:碱的摩尔投料比。表中反应收率为粗产品的HPLC收率。
表3全保护肽硫酯D1的制备
实施例1中，步骤(5)的反应条件优化参考表4，表4中各标号含义如下：M为反应物和碱的摩尔投料比。表中反应收率为粗产品的HPLC收率。
表4首尾酰胺环肽F1的制备
反应编号 反应物 碱 M 溶剂 浓度 反应时间 反应收率
1 E1 DIPEA 1:3 DMF 0.005M 12h 75％
2 E1 DBU 1:3 DMF 0.005M 12h 62％
3 E1 NMI 1:3 DMF 0.005M 12h 70％
4 E1 DIPEA 1:2 DMF 0.005M 12h 64％
5 E1 DIPEA 1:5 DMF 0.005M 12h 68％
6 E1 DIPEA 1:3 DMF 0.0025M 12h 82％
7 E1 DIPEA 1:3 DMF 0.01M 12h 40％
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

Claims (16)

  1. 一种肽硫酯的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
    (1)树脂肽B的制备：以树脂A为载体，采用固相合成按照目标序列从C端到N端的顺序依次偶联相应氨基酸，得到树脂肽B；
    (2)全保护肽C的制备：使用第一切割试剂将步骤(1)中得到的树脂肽B中的树脂切割，得到全保护肽C；
    (3)全保护肽硫酯D的制备：在溶剂中，偶联剂TCFH和碱的作用下，将步骤(2)中得到的全保护肽C与对氯苯硫酚发生酯化反应，得到全保护肽硫酯D；
    (4)肽硫酯E的制备：在第二切割试剂的作用下，脱除步骤(3)中得到的全保护肽硫酯D的保护基得到肽硫酯E；
    其中peptide为肽链，PG 1为肽链侧链上的所有的保护基；PG 2为肽链N端的保护基。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PG 2为Boc，所述肽链为直链，所述树脂肽B的合成方式为所述偶联的最后一个氨基酸为Boc保护的氨基酸或以二碳酸二叔丁酯进行所述肽链的N端Boc保护。
  3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一切割试剂为三氟异丙醇的二氯甲烷溶液，所述三氟异丙醇在二氯甲烷中的体积分数为10％-90％，所述切割的次数为1-5次，所述切割的每次切割时间为0.5h-6h。
  4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述三氟异丙醇在二氯甲烷中的体积分数为33％；所述切割的次数为3次，所述切割的每次切割时间为1h。
  5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碱选自DIPEA或NMI中的至少一种；所述全保护肽C、对氯苯硫酚、TCFH和碱的摩尔比为1:1-2:1-3:2-5。
  6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱为NMI，所述全保护肽C、对氯苯硫酚、TCFH和碱的摩尔比为1:1.2:1.5:4。
  7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述溶剂为DMF、DMSO或DMA中的一种或多种；所述全保护肽C在所述溶剂中的浓度为0.01M-0.2M。
  8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述溶剂为DMF，所述全保护肽C在所述溶剂中的浓度为0.01-0.2M；优选的，为0.1M。
  9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述偶联反应的时间为4h-24h；优选的，为16-24h；更优选的，为16h。
  10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为20℃-100℃；优选的，为25-50℃；更优选的，为30℃。
  11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述第二切割试剂为EDT、苯酚、茴香硫醚或H 2O中的一种或多种与TFA的混合液。
  12. 根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第二切割试剂为TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的混合液，所述混合液中TFA、EDT、苯酚、茴香硫醚和H 2O的体积比为50-95:1-12.5:1-12.5:1-12.5:1-12.5；优选的，为87.5:5:2.5:2.5:2.5。
  13. 一种首尾酰胺环肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
    (1)如权利要求1-12任一所述方法制备得到肽硫酯E；
    (2)在碱的作用下，将步骤(1)制备得到的肽硫酯E在溶剂中环化得到首尾酰胺环肽F；
    其中peptide为肽链。
  14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱为DIPEA、DBU、咪唑或NMI中的一种或多种，所述肽硫酯E与碱的摩尔比为1:2-5。
  15. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶剂为DMF、DMSO或DCM中的一种或多种；所述肽硫酯E在所述溶剂中的浓度为0.001M-0.01M。
  16. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱为DIPEA；所述肽硫酯E与碱的摩尔比为1:3；所述溶剂为DMF，所述肽硫酯E在所述溶剂中的浓度为0.0025M。
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