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CN116650717B - 自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶及其制备方法 - Google Patents

自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶及其制备方法

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CN116650717B CN202310462609.XA CN202310462609A CN116650717B CN 116650717 B CN116650717 B CN 116650717B CN 202310462609 A CN202310462609 A CN 202310462609A CN 116650717 B CN116650717 B CN 116650717B
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Abstract

本发明适用于生物医学工程材料技术领域，提供了自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶及其制备方法，将聚乙烯醇（PVA）与生物活性玻璃（BAG）粒子相结合，互穿到海藻酸钠（SA）网络中，形成互穿网络，得到可注射双网络结构复合水凝胶。本发明使得水凝胶易于注射，以适应形状不规则的骨缺损修复。水凝胶中各组分按质量分数的最优组成为：海藻酸钠6%、聚乙烯醇10%和生物活性玻璃6%，海藻酸钠溶胶与生物活性玻璃/聚乙烯醇水溶胶的最优配比为2:1，在最优组成和最优配比下，水凝胶注射后成胶时间小于3.5min，抗压强度“自提升”2300%，满足不规则形状骨缺损部位在骨整合阶段所需的力学性能。

Description

自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程材料技术领域，尤其涉及自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶及其制备方法。
背景技术
骨缺损一般由创伤、感染和肿瘤切除引起，导致局部功能障碍，甚至影响患者生活质量，通常需要进行骨重建。可注射的骨填充材料在骨科手术中是必不可少的，特别是对不规则骨丢失的重建。到目前为止，临床使用的设备，即可注射骨水泥，并不是很理想的治疗各种骨科损伤。例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)增强在许多情况下是不推荐的，因为它没有成骨诱导性和生物可吸收性。另一方面，人工骨颗粒主要由羟基磷灰石(HCA)、磷酸三钙或生物活性玻璃(BAG)制成，具有较高的生物活性和生物降解性。然而，这些材料在外科应用中面临着严重的问题，因为粉末填充物在机械上不稳定，而硬水泥太脆。聚乙二醇具有生物相容性，并具有原位形成的能力，然而，聚乙二醇水凝胶通常缺乏在体内条件下复制负重系统的力学性能，如在骨再生应用中遇到的。这些缺点限制了它们在骨修复方面的应用。因此，人们对界面灵活、结构坚韧、与金属固定物可能具有高亲和力的成骨生物材料寄予厚望。
可注射水凝胶是通过物理作用或化学反应在原位凝胶过程中形成的，在治疗皮肤损伤和其他组织缺损方面显示出作为药物载体和植入物的优势。然而，水凝胶太过柔软，不能作为承重组织的支架，与大块凝胶相比，可注射水凝胶的弱点更加明显。虽然近年来已经报道了几种性能优良的双网络水凝胶，但其可注射性在生理条件范围内并不令人满意。聚乙烯醇(PVA)水凝胶因其良好的水溶性、固有的无毒性和化学稳定性而被广泛选择作为组织工程应用的支架材料。但是，PVA由于缺乏与周围组织的结合强度，很难与周围组织结合。因此，为了提高水凝胶的生物活性和生物相容性，海藻酸钠(SA)因具有生物活性、无毒、水溶性、生物相容性、非免疫原性和生物降解性等优点，被采用作为组织工程应用的组合材料。尽管它们有很多优点，但这些水凝胶的机械性能不足以承受身体某些部位(如关节)可能发生的某些负载。
近年来的研究表明，生物活性玻璃(BAG)因其优异的生物活性被广泛应用于骨骼组织工程支架。它的骨再生能力是众所周知的，它可以矿化成表面的羟基磷灰石(HCA)，并与活骨形成紧密的化学键。因此，为了改善这些性能，加入BAG无机颗粒。同时有研究表明，58S纳米生物活性玻璃的离子浸提液,可以通过激活丝裂原激活蛋白酶通路中的ERK1/2和p38通路,上调Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶、骨钙素、I型胶原等成骨相关基因和蛋白的表达，表现出比传统45S5生物活性玻璃更好的成骨诱导性。典型的骨结构是双连续的无机网络和有机网络，水(20-30％v/v)和细胞分散在基质中，其抗压能力极强。受此启发，假设在位错理论中，如果无机粒子，即使是微米大小的粒子，能够与聚合物链结合，它们可能会形成一个连续相，以抵抗基体中的压缩力。
发明内容
本发明的目的在于提供自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶及其制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，所述水凝胶包括如下质量分数的组分：海藻酸钠4-6％、聚乙烯醇10-15％和生物活性玻璃4-6％；所述海藻酸钠溶胶与生物活性玻璃/聚乙烯醇水溶胶的最优配比为2:1；所述生物活性玻璃为采用溶胶-凝胶法制备的58S纳米生物活性玻璃，58S纳米生物活性玻璃的化学组分摩尔百分比为58％SiO2,33％CaO和9％P2O5；
其中，所述海藻酸钠在物理作用下形成具有凝血效果的第一重水凝胶网络，所述生物活性玻璃互穿聚乙烯醇形成第二重生物活性凝胶网络，第一重水凝胶网络和第二重生物活性凝胶网络之间以生物活性玻璃中的Ca2+作为交联剂化学交联形成。
进一步的，所述水凝胶中各组分按质量分数的最优组成为：6％海藻酸钠、10％聚乙烯醇和6％生物活性玻璃。
进一步的，所述海藻酸钠水溶胶的制备方法为：将海藻酸钠溶于去离子水中，室温下用磁力搅拌器搅拌至溶解，静置至排空气泡，得到海藻酸钠水溶胶。
进一步的，所述海藻酸钠水溶胶的制备方法中，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为30-60min，静置时间为6-12h。
进一步的，所述聚乙烯醇水溶胶的制备方法为：将聚乙烯醇溶于去离子水，加热至溶解，搅拌至排空气泡，得到聚乙烯醇水溶胶。
进一步的，所述聚乙烯醇水溶胶的制备方法中，加热温度为大于90℃，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间不低于6h。
进一步的，含所述生物活性玻璃水溶胶的制备方法为：将生物活性玻璃加入到聚乙烯醇溶液中，于室温搅拌至溶解，得到含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶。
进一步的，含所述生物活性玻璃水溶胶的制备方法中，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为30-60min。
自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶与海藻酸钠水溶胶分别装入双注射器中，同时注射入模具中，于室温搅拌并混合均匀，静置反应，得到自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶。
进一步的，所述海藻酸钠水溶胶与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的配比为1:1-3:1，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为0-1min，静置时间为3.5-14.5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的可注射双网络水凝胶，制作工艺简单，各组分比例经优化设计使其适于注射应用，同时良好的流变性能使其能适应不同形状的骨缺损。
(2)本发明的可注射双网络水凝胶体系中，聚乙烯醇形成连续的胶体网络，而不是仅分散在连续相的海藻酸网络中，因此从凝胶网络结构上互穿的双网络提高了水凝胶的力学强度。
(3)本发明的可注射双网络水凝胶体系中，富含生物活性玻璃，可与体液发生离子交换生成羟基磷灰石，进一步实现了抗压强度的显著自增强，最优组成和最优配比水凝胶经注射后成胶时间小于3.5min，在模拟体液中浸泡0-14天可逐渐实现抗压强度显著自增强效果，抗压强度“自提升”2300％，可满足不规则形状骨缺损部位在骨整合阶段所需的力学性能。
(4)本发明的可注射双网络水凝胶，由有机-无机复合修复材料组成，不仅具备类似细胞外水凝胶态基质的高含水率凝胶网络，而且含有钙、磷等离子，其凝胶网络内酸碱性由生物活性玻璃溶出的弱碱性离子调节，满足了成骨细胞增殖分化的微环境。
(5)本发明的可注射双网络水凝胶具有良好的生物相容性，能富集由矿化释放的钙、磷离子和微量元素，能促进成骨性细胞分化和碱性磷酸酶活化。
(6)本发明的可注射双网络水凝胶，克服了现有用于骨缺损的组织工程支架欠缺的一些问题，多种物质复合，保持了原物质的优点，解决了单一原有材料性能的不足。
(7)本发明的可注射双网络水凝胶能富集由矿化释放的钙、磷离子和微量元素，对骨内微损伤、骨折和骨缺损具有快速诱导骨再生并促进骨修复的功效，同时具有较好的凝血能力，提高了骨修复效果，为骨缺损的治疗提供了新思路。
附图说明
图1为本发明制备的PVA/SA/BAG水凝胶的流变性能优化结果，其中PVA质量分数为10％，SA质量分数为6％。
图2为本发明实施例1制备的SA水溶胶和PVA/BAG水溶胶通过注射形成凝胶的示意图。
图3为本发明实施例2制备的PVA/SA/BAG水凝胶矿化的FTIR图。
图4为本发明实施例2制备的PVA/SA/BAG水凝胶矿化的XRD图。
图5为本发明实施例2制备的PVA/SA/BAG水凝胶矿化的力学强度示意图。
图6为本发明实施例3制备的PVA/SA/BAG水凝胶的体外凝血结果统计图。
图7为本发明实施例4制备的PVA/SA/BAG水凝胶的降解性示意图。
图8为本发明实施例1制备的PVA/SA/BAG水凝胶对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的细胞毒性结果示意图。
图9为本发明实施例1制备的PVA/SA/BAG水凝胶对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的ALP活性影响的结果统计图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，所述水凝胶包括如下质量分数的组分：海藻酸钠4-6％、聚乙烯醇10-15％和生物活性玻璃4-6％；所述海藻酸钠溶胶与生物活性玻璃/聚乙烯醇水溶胶的最优配比为2:1；所述生物活性玻璃为采用溶胶-凝胶法制备的58S纳米生物活性玻璃，58S纳米生物活性玻璃的化学组分摩尔百分比为58％SiO2,33％CaO和9％P2O5；
其中，所述海藻酸钠在物理作用下形成具有凝血效果的第一重水凝胶网络，所述生物活性玻璃互穿聚乙烯醇形成第二重生物活性凝胶网络，第一重水凝胶网络和第二重生物活性凝胶网络之间以生物活性玻璃中的Ca2+作为交联剂化学交联形成。
在本发明实施例中，优选地，在模拟体液中浸泡0-14d可逐渐实现抗压强度显著自增强效果，抗压强度“自提升”2300％；具有最优的凝血效果。
作为本发明的一种优选实施例，所述水凝胶中各组分按质量分数的最优组成为：6％海藻酸钠、10％聚乙烯醇和6％生物活性玻璃。
在本发明实施例中，优选地，最优组成和最优配比水凝胶经注射后成胶时间小于3.5min，在模拟体液中浸泡0-14天可逐渐实现抗压强度显著自增强效果，抗压强度“自提升”2300％，可满足不规则形状骨缺损部位在骨整合阶段所需的力学性能。
作为本发明的一种优选实施例，所述海藻酸钠水溶胶的制备方法为：将海藻酸钠溶于去离子水中，室温下用磁力搅拌器搅拌至溶解，静置至排空气泡，得到海藻酸钠水溶胶。
作为本发明的一种优选实施例，所述海藻酸钠水溶胶的制备方法中，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为30-60min，静置时间为6-12h。
在本发明实施例中，优选地，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为30min，静置时间为6h。
作为本发明的一种优选实施例，所述聚乙烯醇水溶胶的制备方法为：将聚乙烯醇溶于去离子水，加热至溶解，搅拌至排空气泡，得到聚乙烯醇水溶胶。
作为本发明的一种优选实施例，所述聚乙烯醇水溶胶的制备方法中，加热温度为大于90℃，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间不低于6h。
在本发明实施例中，优选地，加热温度为95℃，搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为6h。
作为本发明的一种优选实施例，含所述生物活性玻璃水溶胶的制备方法为：将生物活性玻璃加入到聚乙烯醇溶液中，于室温搅拌至溶解，得到含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶。
作为本发明的一种优选实施例，含所述生物活性玻璃水溶胶的制备方法中，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为30-60min。
自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶与海藻酸钠水溶胶分别装入双注射器中，同时注射入模具中，于室温搅拌并混合均匀，静置反应，得到自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶。
作为本发明的一种优选实施例，所述海藻酸钠水溶胶与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的配比为1:1-3:1，搅拌速率为200-400rpm/min，搅拌时间为0-1min，静置时间为3.5-14.5min。
在本发明实施例中，优选地，海藻酸钠水溶胶与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的配比为2:1。搅拌速率为200rpm/min，搅拌时间为1min，静置时间为3.5min。
经过各组分比例优化设计(如表1所示)，使其适于注射应用，同时经流变性能优化(如图1所示)使其能适应不同形状的骨缺损。
表1PVA/SA/BAG水凝胶制备的原料配比
实施例1
该实施例提供了一种基于海藻酸钠、聚乙烯醇和生物活性玻璃的双网络结构复合水凝胶。
所述水凝胶包括如下质量分数的组分：海藻酸钠6％、聚乙烯醇10％和生物活性玻璃6％，海藻酸钠与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的配比为2:1。PVA/BAG水凝胶的制备具体包括以下步骤：
S1：海藻酸钠水溶胶(SA)的制备
称量6g的海藻酸钠溶解在100mL去离子水中，室温下用磁力搅拌器，搅拌30min，搅拌速率200rpm/min，静置6h，排空气泡，得到含量为6％的海藻酸钠水溶胶。
S2：聚乙烯醇水溶胶(PVA)的制备
称量5g的聚乙烯醇溶解在50mL去离子中，95℃下加热搅拌6h至溶解并排空气泡，得到含量为10％的聚乙烯醇水溶胶。
S3：PVA/BAG水凝胶的制备
称量3g的生物活性玻璃(BAG)溶解在上述聚乙烯醇水溶胶中，于室温搅拌30min，搅拌速率200rpm/min，得到含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶，其中生物活性玻璃含量为6％，聚乙烯醇含量为10％。
S4：PVA/SA/BAG水凝胶的制备
将上述海藻酸钠溶胶与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶以2:1的比例，分别装入双注射器中，注射入模具中均匀混合1min，静置反应3.5min，得到自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶。
图2为制备的PVA/SA/BAG水凝胶通过注射器注射的示意图。其中，图2(a)显示SA水溶胶和PVA/BAG水溶胶具有优良的可注射性，图2(b)显示PVA/SA/BAG水凝胶能在3.5min形成凝胶。
实施例2
PVA/SA/BAG水凝胶的制备方法同实施例1，区别在于取1mL PVA/SA/BAG水凝胶浸泡在4mL模拟体液(SBF)中，于37℃摇床进行体外矿化反应。水凝胶矿化0-28d后取出，用去离子水和无水乙醇依次洗涤3次，然后真空冷冻干燥进一步表征。PVA/SA/BAG水凝胶的红外光谱(FTIR)、X射线衍射图谱照片(XRD)、力学强度分别如图3、图4和图5所示。
如图3所示，为PVA-SA-BAG水凝胶在SBF中浸泡0d、4d、7d、14d和28d后的FTIR光谱。在3000-3600cm-1范围内，显示的宽带为O-H的拉伸振动以及多糖、海藻酸盐分子间氢的拉伸振动。2926cm-1和2876cm-1处的两条吸收带是C-H对称和非对称拉伸振动。1411cm-1和1591cm-1处的两条吸收带分别为COO-的对称拉伸和不对称拉伸。与矿化0d的水凝胶相比，浸泡在模拟体液(SBF)中的FTIR光谱中出现了与羟基磷灰石相关的峰。矿化28d后，在FTIR光谱中观察到3个和PO4 3-官能团相关的特征振动吸收峰563cm-1、620cm-1和1035cm-1。随着矿化时间的增加，PO4 3-峰强度逐渐增强，PVA/SA/BAG水凝胶表面磷灰石持续形成。
如图4所示，为PVA/SA/BAG水凝胶在SBF中浸泡0d、4d、7d、14d和28d后的XRD图谱。当PVA/SA/BAG水凝胶在模拟体液(SBF)矿化0-28d时，水凝胶显示出几个新的特征衍射峰。通过晶相分析及与STANDARD HCA卡片对比发现，这些新衍射峰的位置与羟基磷灰石(HCA)晶体的特征峰位置一致，分别对应HCA晶体中～32°和～46°所对应的(211)和(222)晶面。当PVA/SA/BAG水凝胶在模拟体液中矿化时，显示有一个很宽的峰(2θ＝20°)，这是聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)交联的形成的新峰。随着矿化时间的增加，PVA/SA/BAG水凝胶的特征衍射峰强度逐渐增大，表明羟基磷灰石含量增加，结晶度进一步提高，这与SEM的结果基本一致。XRD实验证实了羟基磷灰石的形成是逐渐形成的，所得到的结果与文献报道的其他含生物活性玻璃的水凝胶结果一致。PVA/SA/BAG水凝胶对应的衍射峰都是尖峰，与骨骼的晶体结构相似，能够诱导骨缺损修复。
如图5所示，为PVA/SA/BAG水凝胶在SBF中浸泡0d、4d、7d、14d后的压缩性能。随着矿化时间的增加，PVA/SA/BAG水凝胶的抗压强度呈现显著自增强效果。当PVA/SA/BAG水凝胶在模拟体液(SBF)中矿化矿化0d时，水凝胶无法承受500g的重量，凝胶高度可忽略不计(为便于计算，记录为0.1cm)；矿化4d时，水凝胶能承受1000g的重量，凝胶高度为2.1cm。矿化14d时，水凝胶能承受大于1000g的重量，凝胶高度为2.4cm。因此，PVA/SA/BAG水凝胶具有“活性”，在模拟体液(SBF)体外矿化过程中表现出显著“自增强”现象，抗压强度自提升2300％。
实施例3
PVA/SA/BAG水凝胶的制备方法同实施例1，区别在于制备不同BAG含量的PVA/SA/BAG水凝胶，其中PVA含量为10％，SA含量为6％，BAG含量为4-6％。将商用无机生物活性骨移植代用物(IBBGS)和各配比的PVA/SA/BAG水凝胶切成相同体积放入烧杯中，以空白烧杯作为对照组。首先，将0.1mL全血滴到每个样本的表面，对照组直接将等量的血液滴入到烧杯中，然后加入20μL 0.2mol/L CaCl2溶液进行凝血测定。所有烧杯在37℃下孵育5min。随后，在每个烧杯中加入25mL蒸馏水，游离的红细胞在水中发生溶血。用紫外法测定每个烧杯中的溶液，记录在540nm处的吸光度。以对照组溶液吸光度为参考值。凝血指数(BCI)计算公式:
如图6所示，为PVA/SA/BAG水凝胶的体外凝血结果统计图。当PVA/SA/BAG水凝胶含10％PVA、6％SA和4-6％BAG时，不同BAG含量组的BCI值差异不显著，且均低于对照组；当PVA/SA/BAG水凝胶含10％PVA、6％SA和6％BAG时，水凝胶的BCI值为63.41±1.45，明显低于商用IBBGS(88.88±1.56)，进一步说明PVA/SA/BAG水凝胶具有良好的止血能力。PVA/SA/BAG水凝胶的吸附能力和多孔结构为血细胞粘附聚集提供了更多的活性位点，有利于血栓的形成，包裹在血块中的红细胞不易在水中被破坏。
实施例4
PVA/SA/BAG水凝胶的制备方法同实施例1，区别在于首先对真空冷冻干燥后的水凝胶质量进行称重，记录初始质量；然后，将水凝胶浸入SBF溶液中，置于37℃下50rpm/min的摇床中。水凝胶矿化0-28d后取出，用去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥后称量，记录剩余质量。剩余质量百分比按以下公式计算：
如图7所示，为PVA/SA/BAG水凝胶在SBF中浸泡0d、4d、7d、14d和28d后的降解性能。当PVA/SA/BAG水凝胶在模拟体液(SBF)中浸泡0-7d时，水凝胶的剩余质量比逐渐增加。这是由于水凝胶表面生成了羟基磷灰石(HCA)，不仅增加了水凝胶的质量，还在一定程度上减缓了水凝胶的降解。水凝胶在模拟体液(SBF)中浸泡7-28d时，水凝胶的剩余质量比逐渐减小，这是由于随着浸泡时间的延长，水凝胶的降解速率大于羟基磷灰石的生成速率。当水凝胶在模拟体液(SBF)中浸泡28d时，水凝胶的降解率为28.3％。
实施例5
利用CCK-8检测细胞活性的方法来评价实施例1制备的PVA-SA-BAG水凝胶浸提液对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的细胞毒性作用。具体操作步骤如下：首先将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)以5000个/孔的密度接种于96孔板中，然后将其置于CO2培养箱中培养贴壁过夜。随后，吸出原有培养基，换上含PVA/SA/BAG水凝胶浸提液的完全培养基，每个浓度设置5个平行重复。在培养箱中分别培养1d、4d、7d，培养后用PBS将细胞洗涤一次后并向各孔中加入100μL的新鲜培养基(含有10％ CCK-8)。置于培养箱中孵育1h，最后使用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度。
如图8所示，为PVA/SA/BAG水凝胶对MC3T3-E1细胞增殖的影响。当水凝胶与MC3T3-E1细胞共培养1d、4d、7d，随着培养时间的增加，MC3T3-E1细胞的增殖率逐渐增加，与对照组相比差异不显著(P<0.05)，表明PVA/SA/BAG水凝胶对MC3T3-E1细胞无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。因此，PVA/SA/BAG水凝胶材料具有优良的生物相容性，能够用作安全的凝胶载体用于骨缺损的治疗。
实施例6
成骨细胞分泌的碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞的重要检测指标之一，检测成骨细胞的ALP活性可反应成骨细胞的分化情况。MC3T3-E1细胞以5×104cells/cm2的密度接种于6孔板中，在含有或不含有PVA/SA/BAG浸提液的分化培养基中诱导培养7d和14d经0.25％胰酶消化后收取细胞。使用ALP试剂盒按照制造商的说明测量细胞裂解物中的ALP活性。将收集的细胞用PBS洗涤1-2次，每孔中加入200μL的TritonX-100的试剂裂解细胞30min(用显微镜观察细胞的破碎情况)。使用BCA蛋白质测定试剂盒测量细胞裂解物中的蛋白质浓度。ALP活性检测实验具体操作如表2所示：
表2ALP活性检测程序
根据蛋白质浓度按照说明书计算将ALP活性标准化。每组设置三个平行重复。
ALP活性作为早期成骨分化的标志物来探索PVA/SA/BAG水凝胶的诱导分化能力。在第7d和14d测量了PVA/SA/BAG水凝胶对MC3T3-E1细胞的ALP活性的影响。如图9所示，培养7d时，PVA/SA/BAG水凝胶组的ALP染色区域明显大于对照组。培养14d时，ALP染色区域明显增加，说明MC3T3-E1细胞进一步分化。PVA/SA/BAG水凝胶组培养7d、14d的ALP活性均显著高于对照组(P<0.0001)，并在14d时ALP活性达到最大。以上结果表明，PVA/SA/BAG水凝胶能促进MC3T3-E1细胞分化，并在14d时ALP活性达到最高。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (9)

1.自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括如下质量分数的组分：6%海藻酸钠、10%聚乙烯醇和6%生物活性玻璃；所述海藻酸钠水溶胶与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的配比为2:1；所述生物活性玻璃为采用溶胶-凝胶法制备的58S纳米生物活性玻璃，58S纳米生物活性玻璃的化学组分摩尔百分比为58%SiO2, 33%CaO和9%P2O5；
其中，所述海藻酸钠在物理作用下形成具有凝血效果的第一重水凝胶网络，所述生物活性玻璃互穿聚乙烯醇形成第二重生物活性凝胶网络，第一重水凝胶网络和第二重生物活性凝胶网络之间以生物活性玻璃中的Ca2+作为交联剂化学交联形成。
2.根据权利要求1所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述海藻酸钠水溶胶的制备方法为：将海藻酸钠溶于去离子水中，室温下用磁力搅拌器搅拌至溶解，静置至排空气泡，得到海藻酸钠水溶胶。
3.根据权利要求2所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述海藻酸钠水溶胶的制备方法中，搅拌速率为200-400 rpm，搅拌时间为30-60 min，静置时间为6-12 h。
4.根据权利要求1所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述聚乙烯醇水溶胶的制备方法为：将聚乙烯醇溶于去离子水，加热至溶解，搅拌至排空气泡，得到聚乙烯醇水溶胶。
5.根据权利要求4所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述聚乙烯醇水溶胶的制备方法中，加热温度为大于90℃，搅拌速率为200-400 rpm，搅拌时间不低于6h。
6.根据权利要求1所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的制备方法为：将生物活性玻璃加入到聚乙烯醇溶液中，于室温搅拌至溶解，得到含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶。
7.根据权利要求6所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶，其特征在于，所述含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的制备方法中，搅拌速率为200-400 rpm，搅拌时间为30-60 min。
8.根据权利要求1-7任一所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶与海藻酸钠水溶胶分别装入双注射器中，同时注射入模具中，于室温搅拌并混合均匀，静置反应，得到自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶。
9.根据权利要求8所述的自增强促进骨再生的可注射双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠水溶胶与含生物活性玻璃的聚乙烯醇水溶胶的配比为2:1，搅拌速率为200-400 rpm，搅拌时间为0-1 min，静置时间为3.5-14.5 min。
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