CN116650705B

CN116650705B - 一种自凝胶化粉末及其应用

Info

Publication number: CN116650705B
Application number: CN202310371394.0A
Authority: CN
Inventors: 马庆明; 孙文韬; 赵文彬; 孙勇; 李瑞真
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2023-04-10
Filing date: 2023-04-10
Publication date: 2025-03-14
Anticipated expiration: 2043-04-10
Also published as: CN116650705A

Abstract

本发明提供了一种自凝胶化粉末及应用，本发明提供的自凝胶化粉末，通过将A溶液、B溶液和烷基化壳聚糖溶液混合得到混合溶液，然后将混合溶液冻干，研磨得到自凝胶化粉末；其中，所述A溶液包括聚二烯二甲基氯化铵溶液和聚乙烯亚胺溶液；所述B溶液包括聚苯乙烯磺酸钠溶液和聚丙烯酸溶液。其中，本发明通过选择烷基化壳聚糖为原料，并选择特定的A溶液和B溶液，将所述三种溶液均匀混合，冻干，得到自凝胶粉末，通过实验结果表明，本发明提供的冻干粉末止血效果强，凝胶化转化时间短，且具有良好的机械强度。

Description

一种自凝胶化粉末及其应用

技术领域

本发明涉及医用生物材料技术领域，尤其涉及一种原位形成的自凝胶化粉末及其应用。

背景技术

伤口愈合是创伤后身体自发启动的生理过程在维持皮肤完整性方面发挥着重要作用。它通常包括四个连续且重叠的生理过程，包括止血、炎症、再生和重塑。伤口愈合不当可能导致增生性瘢痕和溃疡，甚至导致感染和死亡。近年来，对伤口愈合的干预在生物材料、组织工程等医疗保健领域引起了广泛关注。因此，理想的伤口愈合治疗材料应具有卓越的促凝血能力和抗菌能力，以及良好的细胞增殖效果，使其能够参与四个阶段中的每一阶段。近年来，开发了各种用于伤口治疗的功能材料，包括多孔海绵、微/纳米水凝胶颗粒、生物相容性水凝胶、合成纤维和脂质体等。

迄今为止，常用的传统伤口治疗材料或多或少都有一定的缺陷，比如在伤口保湿方面，常规的纱布、止血粉等作用不佳。并且一些贴敷类材料应用时具有一定的皮肤刺激性。

聚乙烯亚胺(PEI)和聚丙烯酸(PAA)是常见的阳离子聚合物和阴离子聚合物。PEI/PAA吸收水分时可以通过物理交联作用快速形成粘性水凝胶，不仅可以吸收血液，还可以在伤口处形成相对稳定的物理屏障，并且具有良好的柔韧性。可以给伤口提供一个的湿润环境，有助于伤口的止血，是较为理想的伤口敷料。聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)能够在聚合物水凝胶骨架中原位形成纳米颗粒，该纳米颗粒和聚合物基质之间具有非共价相互作用，可以同时增强聚合物材料的拉伸强度和拉伸韧性，使凝胶抵抗血压能力明显增强。但是，目前公开的凝胶类伤口愈合材料止血效果较差。因此，提供一种不仅机械强度好而且止血效果好的伤口愈合材料具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种自凝胶化粉末及其应用，本方面提供的自凝胶粉末止血效果好，且机械强度好。

与现有技术相比，本发明提供了一种自凝胶化粉末及应用，本发明提供的自凝胶化粉末，通过将A溶液、B溶液和烷基化壳聚糖(ACS)溶液混合得到混合溶液，然后将混合溶液冻干，研磨得到自凝胶化粉末；其中，所述A溶液包括聚二烯二甲基氯化铵溶液和聚乙烯亚胺溶液；所述B溶液包括聚苯乙烯磺酸钠溶液和聚丙烯酸溶液。其中，本发明通过选择烷基化壳聚糖为原料，并选择特定的A溶液和B溶液，将所述三种溶液均匀混合，冻干，得到自凝胶粉末，通过实验结果表明，本发明提供的冻干粉末止血效果强，凝胶化转化时间短，且具有良好的机械强度。

附图说明

图1为本发明实施例1制备所得烷基化壳聚糖的红外图谱；

图2为本发明实施例3制备所得的不同比例的聚乙烯亚胺溶液和聚丙烯酸溶液的水凝胶模量测试图；

图3为本发明实施例5制备所得的不同烷基化壳聚糖含量的水凝胶模量测试图；

图4为本发明实施例5制备所得的不同烷基化壳聚糖含量的水凝胶黏度测试图；

图5为本发明实施例7制备所得不同聚二烯二甲基氯化铵、聚苯乙烯磺酸钠含量的水凝胶模量测试图；

图6为本发明实施例7制备所得的不同聚二烯二甲基氯化铵、聚苯乙烯磺酸钠含量的水凝胶黏度测试图；

图7为含不同烷基化壳聚糖的原位自凝胶化粉末的凝胶转化时间；

图8为水凝胶合成示意图；

图9为本发明实施例11制备所得的原位形成的自凝胶化粉末的图像和扫描电镜图像；

图10为制备所得自凝胶化粉末及其成分的溶血率结果；

图11为制备所得自凝胶化粉末及其成分的细胞增殖率结果；

图12为制备所得自凝胶化粉末及其成分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率；

图13为制备所得自凝胶化粉末及其成分的体外凝血时间；

图14为制备所得自凝胶化粉末及其成分的体外凝血实物图；

图15为制备所得自凝胶化粉末及其成分的大鼠伤口愈合模型实验结果。

具体实施方式

本发明提供了一种自凝胶化粉末，通过将A溶液、B溶液和烷基化壳聚糖溶液混合得到混合溶液，然后将混合溶液冻干，研磨得到自凝胶化粉末；

其中，所述A溶液包括聚二烯二甲基氯化铵溶液和聚乙烯亚胺溶液；

所述B溶液包括聚苯乙烯磺酸钠溶液和聚丙烯酸溶液。

按照本发明，所述烷基化壳聚糖优选为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖、十六烷基化壳聚糖和十八烷基化壳聚糖中的一种或几种，更优选为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖、十六烷基化壳聚糖或十八烷基化壳聚糖，最优选为十二烷基化壳聚糖；所述烷基化壳聚糖溶液的初始浓度为0.2wt％～1wt％，更优选为0.4wt％～0.8wt％，最优选为0.6wt％；在所述混合溶液中，所述烷基化壳聚糖溶液优选占总体积的8～15％，更优选为10～13％；

本发明中，所述烷基化壳聚糖的制备方法优选包括以下步骤：

提供壳聚糖溶液；

将十二醛、十四醛、十六醛、十八醛分别滴加进所述各组壳聚糖溶液中，在酸性条件下进行缩合反应，得到四组亚胺化壳聚糖；

将所述四组亚胺化壳聚糖与还原剂混合进行还原反应，得到长链烷基化壳聚糖。

在本发明中，所述各组壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度优选为10.0g/L；所述壳聚糖溶液中优选包括壳聚糖、乙酸溶液和乙醇。所述乙酸溶液的浓度优选为2wt％；所述乙酸溶液与乙醇的体积比优选为1:1。

得到壳聚糖溶液后，本发明将十二～十八醛滴加进所述各组壳聚糖溶液中进行缩合反应，得到不同亚胺化壳聚糖。在本发明中，所述酸性条件由乙酸溶液提供。所述滴加时壳聚糖溶液的温度优选为45℃；所述滴加优选为逐滴滴加。所述四种脂肪醛和壳聚糖的比例按照脂肪醛中醛基和壳聚糖中氨基的摩尔比计算，优选为0.125～0.5:1，更优选为0.125:1、0.25:1或0.5:1。所述缩合反应的时间优选为4h。

所述缩合反应后，本发明优选将反应液冷却至室温，得到亚胺化壳聚糖。

得到四组亚胺化壳聚糖后，本发明将所述亚胺化壳聚糖与还原剂混合进行还原反应，得到四组长链烷基化壳聚糖。在本发明中，所述缩合反应的反应液不进行后处理，直接与还原剂混合。在本发明中，所述还原剂优选为硼氢化钠，所述硼氢化钠与脂肪醛中醛基的摩尔比优选为3:1。在本发明中，所述还原剂优选以还原剂溶液的形式使用，所述混合优选为将所述还原剂溶液滴入四组亚胺化壳聚糖中。所述还原反应的温度优选为室温；所述还原反应的时间优选为3h。

在本发明中，壳聚糖与脂肪醛缩合得到亚胺化壳聚糖，再经硼氢化钠还原，得到烷基化壳聚糖。

所述还原反应后，本发明优选将得到的还原反应产物进行后处理，得到长链烷基化壳聚糖。在本发明中，所述后处理优选包括以下步骤：

调节所述还原反应产物的pH值至10，析出固体；

将所述固体离心洗涤，得到中性固体；

将所述中性固体溶解于醋酸溶液中，得到溶液低温保存后加压抽滤，得到除杂固体；

将所述除杂固体的pH值调至10，离心分离沉淀；

将所述沉淀水洗至中性后冷冻干燥，得到四组长链烷基化壳聚糖。

本发明优选向所述还原反应产物中加入氢氧化钠溶液调节pH值，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为4wt％。

在本发明中，所述离心洗涤优选为甲醇洗三次和乙醇洗三次，最后水洗至中性；

得到中性固体后，本发明优选将所述中性固体溶解在浓度为2wt％的醋酸溶液中；所述低温保存的温度优选为4℃；所述低温保存的时间优选为30min。

在本发明中，调节所述除杂固体的pH值优选为将所述除杂固体加入至氢氧化钠溶液中，调节pH值＝10。

通过本申请实验研究发现，本发明提供的壳聚糖，在壳聚糖侧链的氨基上引入长链烷基的碳链，可以嵌入细胞膜中，形成一种壳聚糖-血细胞凝胶网络结构，增强了粉末的止血效果。

按照本发明，A溶液中，所述聚乙烯亚胺溶液的初始浓度为5～8wt％，更优选为6～7wt％；所述聚二烯二甲基氯化铵溶液的初始浓度优选为7～12wt％，更优选为8～10wt％。

按照本发明，B溶液中，所述聚丙烯酸溶液的初始浓度优选为5～8wt％，更优选为6～7wt％；所述聚苯乙烯磺酸钠溶液的初始浓度为9～12wt％，更优选为10～11wt％，最优选为10.3～10.5wt％。

按照本发明，所述混合溶液中，所述加入的聚二烯二甲基氯化铵溶液优选占总体积的3～7％，更优选为5～6％，所述加入的聚乙烯亚胺溶液优选占总体积的38～42％，更优选为40％～41％；所述加入的聚苯乙烯磺酸钠溶液优选占总体积的3～7％，更优选为5～6％，所述聚丙烯酸溶液优选占总体积的38～42％，更优选为40％～41％。本发明中，加入的聚乙烯亚胺溶液和加入的聚丙烯酸溶液的体积比优选为(3～7)：(7～3)，优选为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3，更优选为5:5；加入的聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)溶液与加入的聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液的体积比优选为1:1。

按照本发明，所述聚乙烯亚胺(PEI)的重均分子量优选为65000～75000，更优选为70000；聚丙烯酸(PAA)重均分子量优选为230000～250000，更优选为240000；聚二烯二甲基氯化铵(PDDA)重均分子量优选为80000～150000，更优选为100000；聚苯乙烯磺酸钠(PSS)重均分子量优选为65000～75000，更优选为70000。

本发明还提供了一种本申请所述的自凝胶化粉末在制备伤口治疗材料中的应用。本发明提供的自凝胶化粉末制备的伤口治疗材料具有很好的止血效果，且机械性能好。

需要指出的是，本发明中的“初始浓度”是指混合溶液以前，配置的各个原料的溶液浓度。本申请中混合溶液中各溶液的体积比，是指各个一定浓度的含有该物质的溶液在混合溶液中的比例。本发明中，溶液中未特别说明溶剂的，溶剂均为水。

本发明提供的自凝胶化粉末，通过将A溶液、B溶液和烷基化壳聚糖溶液混合得到混合溶液，然后将混合溶液冻干，研磨得到自凝胶化粉末；其中，所述A溶液包括PDDA和PEI，；所述B溶液包括PAA和PSS。其中，本发明通过选择烷基化壳聚糖溶液为原料，并选择特定的A溶液和B溶液，将所述三种溶液均匀混合，冻干，得到自凝胶粉末，通过实验发现，本发明提供的烷基化壳聚糖在壳聚糖侧链的氨基上引入长链烷基的碳链，该长碳链与细胞膜的磷脂双分子层极性相近，因此可以嵌入细胞膜中，形成一种壳聚糖-血细胞凝胶网络结构，增强了粉末的止血效果。同时，本发明添加的PDDA和PSS，能够在聚合物骨架交点处形成纳米粒，因此所制备的凝胶化粉末得到的水凝胶具有良好的机械强度；且本申请的产品形态为自凝胶化粉末，其便于携带，具有很好的市场应用前景。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的原料：PEI购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，PDDA购买于上海麦克林生化科技股份有限公司，重均分子量为100000-200000；PAA购买于北京百灵威科技有限公司，重均分子量为240000，PSS购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000。

实施例1

制备十二～十八烷基化壳聚糖。

1、准确称量四组CS粉末2.0g，加入100mL2wt％的乙酸溶液中，待壳聚糖溶解后再加入100mL的乙醇，放入35℃水浴锅中，搅拌混匀得到壳聚糖溶液；

2、取十二～十八醛，按照-NH₂：-CHO＝1：0.125的摩尔比例，分别逐滴滴加进四组壳聚糖溶液中，搅拌反应4h后，冷却至室温；

3、准确称量NaBH₃，按照0.1g/mL的浓度用纯水中溶解后，以NaBH₃：-CHO＝3：1的摩尔比例，在步骤2得到的反应液不断搅拌中将NaBH₃溶液缓慢滴入，室温下搅拌反应3h；

4、在步骤3反应所得溶液中加入4wt％的NaOH溶液至pH＝10，析出产物，以8000rad/min的转速离心洗涤，依次用甲醇洗三次、乙醇洗三次，水洗至中性；

5、将步骤4所得产物溶解在2wt％醋酸中，充分溶解后，放入4℃保存30min，减压抽滤滤去杂质，加入4wt％的NaOH溶液搅拌至pH＝10，以8000rad/min的转速离心分离沉淀，沉淀水洗至中性；

6、步骤5将所得产物进行冷冻干燥30h，得到四组不同的烷基化壳聚糖，命名为ACS-1、ACS-2、ACS-3、ACS-4。

实施例2

通过红外光谱测定实施例1得到的烷基化壳聚糖：采用KBr压片法，将制备所得烷基化壳聚糖与溴化钾粉末混合，研成细腻粉末，使用压片机制成半透明的薄片，将其放入红外光谱仪器中进行测试，扫描范围为4000～400cm^-1。壳聚糖和烷基壳聚糖的红外光谱图如1所示，图1为本发明实施例1制备所得烷基化壳聚糖的红外图谱；图1中黑色谱图表示壳聚糖，红色谱图为制备得到的烷基化壳聚糖，由图可以看出，与壳聚糖相比，烷基化后1590cm^-1处表征壳聚糖氨基的特征峰消失，说明在N位上发生了取代反应；此外，1461cm^-1处出现了新的吸收峰说明壳聚糖分子内已引入-CH₂-和-CH₃基团。以上结果说明接枝反应确实发生在壳聚糖的氨基上，得到的产物是烷基化壳聚糖。

实施例3

研究聚乙烯亚胺(PEI)溶液和聚丙烯酸(PAA)溶液的比例对凝胶强度的影响。制备PEI/PAA水凝胶，其中PEI溶液和PAA溶液的体积比为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3，PEI购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，PAA购买于北京百灵威科技有限公司，重均分子量为240000。

1、分别配置35mL、30mL、25mL、20mL、15mL5wt％的PEI溶液，置于不同烧杯中。

2、分别配置15mL、20mL、25mL、30mL、35mL 5wt％的PAA溶液置于不同离心管中。

3、将磁子放置于盛有PEI溶液的烧杯中，将该烧杯放置在磁力搅拌器上。

4、启动磁力搅拌器，按PEI溶液和PAA溶液3:7、4:6、5:5、6:4、7:3的体积比，稳定后缓慢倒入对应的PAA溶液，使二者均匀混合，制备具有一定强度的水凝胶。

5、水凝胶收集至不同玻璃皿内，用保鲜膜密封，置于-20℃冷冻过夜。

6、将用来密封的保鲜膜扎孔，进行-60℃的冷冻干燥，冷冻干燥总计30h。

7、将冷冻干燥后的干凝胶转移至研钵，研磨成细粉状。

实施例4

按照实施例3的技术方案制备得到5组不同体积比的PEI/PAA凝胶粉末。

通过流变仪测定实施例3得到的PEI/PAA凝胶粉末：采用Kinexus型流变仪，选择20mm直径的平板来进行各组粉末模量的测定。每组各取0.2g粉末，加1ml蒸馏水，去除未吸收的水，置于测试平板上。选择模量测试程序，在固定应变为1.0％、频率为1.000Hz条件下，平板间隔0.8mm，设置温度为37℃，进行测试，测定五组产物各自的储存模量(G’)和损失模量(G”)。结果如图2所示，图2为本发明实施例3制备所得的不同比例的PEI溶液和PAA溶液的水凝胶模量测试图；

从图中可以看出，在PEI溶液和PAA溶液体积比为5:5时，形成的水凝胶具有最高的储存模量，有最优的机械性能。

实施例5

研究烷基化壳聚糖的含量对凝胶止血能力和机械强度的影响。其中烷基化壳聚糖的浓度设为0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.8wt％、1.0wt％，体积占总体系10％。PDDA溶液浓度固定为8wt％和PSS溶液浓度固定为10.3wt％，在总体系中各占5％。PEI购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，PDDA购买于上海麦克林生化科技股份有限公司，重均分子量为100000-200000；PAA购买于北京百灵威科技有限公司，重均分子量为240000，PSS购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，烷基化壳聚糖为实施例1所制备的十二烷基化壳聚糖。

1、配置五组含22.5mL5wt％的PEI溶液，2.5mL8wt％的PDDA溶液的混合溶液作为溶液A置于烧杯中。

2、配置五组含22.5mL5wt％的PAA溶液，2.5mL 10.3wt％的PSS溶液的混合溶液作为溶液B置于离心管中。

3、配置0.2wt％、0.4wt％、0.6wt％、0.8wt％、1.0wt％的烷基化壳聚糖溶液各5mL，分别置于离心管中。

4、将磁子放置于盛有溶液A烧杯中，整体放置在磁力搅拌器上。

5、启动磁力搅拌器，稳定后同时缓慢倒入溶液B和对应的烷基化壳聚糖溶液，使三者均匀混合，制备具有一定强度的水凝胶。

6、水凝胶收集至玻璃皿内，用保鲜膜密封，置于-20℃冷冻过夜。

7、将用来密封的保鲜膜扎孔，进行-60℃的冷冻干燥，冷冻干燥总计30h。

8、将冷冻干燥后的干凝胶转移至研钵，研磨成细粉状。

实施例6

按照实施例5制备不同烷基化壳聚糖含量的凝胶粉末，通过流变仪测定实施例5得到的凝胶粉末的模量：采用Kinexus型流变仪，选择20mm直径的平板来进行各组粉末模量的测定。每组各取0.2g粉末，加1ml蒸馏水，去除未吸收的水，置于测试平板上。选择模量测试程序，在固定应变为1.0％、频率为1.000Hz条件下，平板间隔0.8mm，设置温度为37℃，进行测试，测定五组产物各自的储存模量(G’)和损失模量(G”)。结果如图3所示，图3为本发明实施例5制备所得的不同ACS含量的水凝胶模量测试图；从图中可以看出，在烷基化壳聚糖含量与水凝胶的储存模量(G’)成反比，表明随着ACS含量的增加，会降低所形成水凝胶的机械强度。

按照实施例5制备不同烷基化壳聚糖含量的凝胶粉末，通过拉力试验机测定实施例5得到的凝胶粉末的黏度应力：采用智能电子拉力试验机，选择拉伸强度实验模式，进行各组粉末黏度应力的测试。每组取0.4g粉末，制成长度为4cm，宽度为1cm，厚度为2mm的水凝胶长条。取洗去油脂的猪皮制成同样大小，将水凝胶的一端与猪皮外侧黏接，二者重叠成长条状，重叠部分面积为1cm²，将200g的重物压在水凝胶与猪皮的重叠处20min。随后通过拉力试验机进行测试，固定拉伸速度为25mm/min，直至水凝胶与猪皮被完全拉开，记录最大拉断力。黏度应力为最大拉断力除以水凝胶与猪皮之间的重叠面积。结果如图4所示，图4为本发明实施例5制备所得的不同烷基化壳聚糖含量的黏度测试图；结果显示，烷基化壳聚糖含量与水凝胶的黏度应力成正比，表明随着烷基化壳聚糖含量的增加，水凝胶对皮肤的黏附性随之增加。

结论：为了平衡水凝胶的机械强度、止血能力以及皮肤黏附性，选择0.6wt％作为烷基化壳聚糖溶液的最优浓度。

实施例7

研究PDDA、PSS的含量对凝胶止血能力和机械强度的影响。8wt％的PDDA溶液和10.3wt％的PSS溶液在总体系中各自占相同比例，共设定五组，分别是3％、4％、5％、6％、7％。PEI购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，PDDA购买于上海麦克林生化科技股份有限公司，重均分子量为100000-200000；PAA购买于北京百灵威科技有限公司，重均分子量为240000，PSS购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，烷基化壳聚糖为实施例1所制备的十二烷基化壳聚糖。

1、配置体积为21mL、20.5mL、20mL、19.5mL、19mL的五组5wt％的PEI溶液，分别与1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL的8wt％的PDDA溶液均匀混合，总计45mL，作为溶液A置于烧杯中。

2、配置体积为19mL、19.5mL、20mL、21.5mL、22mL的五组5wt％的PAA溶液，分别与1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL的10.3wt％的PSS溶液均匀混合，总计45mL，作为溶液B置于离心管中。

3、配置5mL0.6wt％的烷基化壳聚糖溶液五组，分别置于离心管中。

5、启动磁力搅拌器，稳定后同时缓慢倒入对应溶液B和烷基化壳聚糖溶液，使三者均匀混合，制备具有一定强度的水凝胶。

6、水凝胶收集至不同玻璃皿内，用保鲜膜密封，置于-20℃冷冻过夜。

8、将冷冻干燥后的干凝胶转移至研钵，研磨成细粉状。

实施例8

按照实施例7制备不同PDDA、PSS的含量的凝胶粉末，通过流变仪测定实施例7得到的凝胶粉末的模量：采用Kinexus型流变仪，选择20mm直径的平板来进行各组粉末模量的测定。每组各取0.2g粉末，加1ml蒸馏水，去除未吸收的水，置于测试平板上。选择模量测试程序，在固定应变为1.0％、频率为1.000Hz条件下，平板间隔0.8mm，设置温度为37℃，进行测试，测定五组产物各自的储存模量(G’)和损失模量(G”)。结果如图5所示，图5为本发明实施例7制备所得不同PDDA、PSS含量的水凝胶模量测试图；

从图中可以看出，PDDA、PSS的含量与水凝胶的储存模量(G’)成正比，表明随着PDDA、PSS含量的增加，会增强所形成水凝胶的机械强度。

按照实施例7制备不同PDDA、PSS的含量的凝胶粉末，通过拉力试验机测定实施例7得到的凝胶粉末的黏度应力：采用智能电子拉力试验机，选择拉伸强度实验模式，进行各组粉末黏度应力的测试。每组取0.4g粉末，制成长度为4cm，宽度为1cm，厚度为2mm的水凝胶长条。取洗去油脂的猪皮制成同样大小，将水凝胶的一端与猪皮外侧黏接，二者重叠成长条状，重叠部分面积为1cm²，将200g的重物压在水凝胶与猪皮的重叠处20min。随后通过拉力试验机进行测试，固定拉伸速度为25mm/min，直至水凝胶与猪皮被完全拉开，记录最大拉断力。黏度应力为最大拉断力除以水凝胶与猪皮之间的重叠面积。结果如图6所示，图6为本发明实施例7制备所得的不同PDDA、PSS的含量的黏度测试图；结果显示，PDDA、PSS的含量与水凝胶的黏度应力成反比，表明随着PDDA、PSS的含量的增加，水凝胶对皮肤的黏附性减弱。

结论：结合机械性能测试结果和黏度测试结果，最终选择5％的PDDA、PSS体积占比为最优方案。

实施例9

根据例1～8的技术方案，制备四组内含不同烷基化壳聚糖原位形成的自凝胶化粉末，其中四种烷基化壳聚糖为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖、十六烷基化壳聚糖、十八烷基化壳聚糖。

其中PEI和PAA的浓度为5wt％，体积比为5:5，分别占总体系体积40％。不同烷基化壳聚糖的质量浓度为0.6wt％，占总体系体积10％；PDDA的质量浓度为8wt％、PSS浓度为10.3wt％，分别占总体系体积5％。PEI购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，PDDA购买于上海麦克林生化科技股份有限公司，重均分子量为100000-200000；PAA购买于北京百灵威科技有限公司，重均分子量为240000，PSS购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，烷基化壳聚糖为实施例1所制备的四种烷基化壳聚糖。

1、配置四组含22.5mL5wt％的PEI溶液，2.5mL8wt％的PDDA溶液的混合溶液作为溶液A置于烧杯中。

2、配置四组含22.5mL5wt％的PAA溶液，2.5mL 10.3wt％的PSS溶液的混合溶液作为溶液B置于离心管中。

3、将四组不同的烷基化壳聚糖溶液配置为5mL浓度为0.6wt％的溶液，分别置于离心管中。

8、将冷冻干燥后的干凝胶转移至研钵，研磨成细粉状。

实施例10

按照例9实施制备的四组内含不同烷基化壳聚糖的原位形成的自凝胶化粉末，测定其凝胶转化速度，分组为ACS-1、ACS-2、ACS-3、ACS-4。通过计时测定不同组的凝胶转变时间：每组各取1.0g粉末置于直径3.0mm的培养皿中，将粉末均匀铺平。用移液枪或一次性胶头滴管取适量生理盐水，加至盛有粉末的培养皿中，同时使用计时器精确计时。每组样品重复三次。

结果如表1和图7所示，图7为含不同烷基化壳聚糖的原位自凝胶化粉末的凝胶转化时间；从图及表中可以看出，由于烷基的疏水性质以及碳链的长度差别，十二烷基化壳聚糖组凝胶转化时间最快，快于已有的文献报道，十八烷基化壳聚糖凝胶转化时间最慢。

表1含不同烷基化壳聚糖的原位自凝胶化粉末的凝胶转化时间

结论：根据各组凝胶转化时间的测试结果，最终选择十二烷基化壳聚糖为最优方案。

实施例11

根据例1～10的技术方案，制备原位形成的自凝胶化粉末，如图8。图8为水凝胶合成示意图；其中PEI和PAA的浓度为5wt％，体积比为5:5；分别占总体系体积40％，烷基化壳聚糖的质量浓度为0.6wt％，占总体系体积10％；PDDA的质量浓度为8wt％、PSS浓度为10.3wt％，分别占总体系体积5％。PEI购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，PDDA购买于上海麦克林生化科技股份有限公司，重均分子量为100000-200000；PAA购买于北京百灵威科技有限公司，重均分子量为240000，PSS购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，重均分子量为70000，烷基化壳聚糖为实施例1所制备的十二烷基化壳聚糖。

1、配置5wt％的PEI溶液，8wt％的PDDA溶液，均匀混合作为溶液A置于烧杯中。

2、配置5wt％的PAA溶液，10.3wt％的PSS溶液，均匀混合作为溶液B置于离心管中。

3、配置0.6wt％的烷基化壳聚糖溶液，分别置于离心管中。

4、将磁子放入盛有混合溶液A的烧杯中，整体放置在磁力搅拌器上，启动磁力搅拌器，稳定后，缓缓倒入混合溶液B和烷基化壳聚糖溶液，使三者混合均匀，形成水凝胶。

5、水凝胶收集至玻璃皿内，用保鲜膜密封，置于-20℃冷冻过夜。

7、将冷冻干燥后的干凝胶转移至研钵，研磨成细粉状。

本发明通过拍摄粉末实物与SEM图像观察其实物形态及内部结构，结果如图9所示，图9为本发明实施例11制备所得的原位形成的自凝胶化粉末的图像和扫描电镜图像；其中，图9中左图为凝胶粉末图像，右图为扫描电子显微镜图像，由图9可以看出，本发明制备的自凝胶化粉末外观较细腻，能够被研磨成较细粉末，并且内部具有疏松的多孔结构，吸湿性能较好。

测试例

1、原位形成的自凝胶化粉末的安全性评价

1.1、溶血率实验：将抗凝全血在4℃以3000rpm转速离心10min，除去上层血浆与淡黄色部分后，用PBS将底层红细胞清洗至上层溶液无颜色。之后，用PBS配制成体积分数为2％的红细胞悬浮液。分别取2mgPEI/PAA凝胶粉末、ACS粉末、PEI/PAA/ACS凝胶粉末、(PEI/PDDA)/(PAA/PSS)/ACS凝胶粉末置于4个EP管中，各加1ml PBS，37℃摇床恒温浸泡24h后，将浸出液取出备用。将500μL此2wt％的红细胞悬浮液分别与等体积的PBS(阴性对照)和去离子水(阳性对照)以及4组浸出液混匀后，37℃下温育2h。将温育后的样品和红细胞混合液在3000rpm转速下离心5min，采集上清液，用酶标仪检测570nm处吸光度，并重复测试三次，根据如下公式计算各组溶血率。

式中，Hemolysis为溶血率；Abs、Abs₀、Abs_l分别为4组样品、PBS、去离子水与红细胞反应后的吸光值。

实验结果如表1和图10所示，图10为制备所得自凝胶化粉末及其成分的溶血率结果；ACS粉末与制备所得的自凝胶粉末的溶血率均<2.5％，符合国家药包材标准YBB00032003-2015溶血检查法的规定(样品溶血率应不超过5％)。

表2本发明实施例制备得到的自凝胶粉末及其成分的溶血率测试结果

1.2、细胞毒性实验：采用小鼠成纤维细胞L929共培养进行MTT测定。首先用DMEM培养基配置样品浸提液，取PEI/PAA凝胶粉末、ACS粉末、PEI/PAA/ACS凝胶粉末、(PEI/PDDA)/(PAA/PSS)/ACS凝胶粉末各2mg，4组样品经24h紫外照射消毒后，各加1mLDMEM培养基37℃浸泡24h。将浸出液取出，用0.45μm滤膜过滤灭菌后，取500μL加入等体积含20％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基。将L929细胞用0.25wt％胰酶37℃消化1min后，用培养基重悬细胞，将细胞密度调整为5×10⁴个/mL，每孔加入100μLL929细胞接种在96孔板中，放入含体积浓度5％ CO₂、温度为37℃的培养箱中培养24h；24h后，在培养基分别加入100μL样品浸提液，同时设置正常培养对照组，放入CO₂培养箱中继续培养48h；48h后，取一部分细胞，吸弃原培养液，分别将100μL无菌培养基和10μL无菌的MTT溶液加入96孔板中，放入培养箱中继续培养4h；吸弃MTT和培养基，加入SDS裂解液使沉淀重复溶解后，用酶标仪测定490nm处的吸光度，根据下列公式计算各组细胞增殖率。

式中，RGR为细胞相对增殖率；A₀为溶剂对照组吸光度值；A₁为正常培养对照组吸光值；A₂为实验组吸光度值。

细胞增殖率实验结果如表2和图11所示，图11为制备所得自凝胶化粉末及其成分的细胞增殖率结果；PEI/PAA凝胶粉末、ACS粉末、PEI/PAA/ACS凝胶粉末、(PEI/PDDA)/(PAA/PSS)/ACS凝胶粉末4组细胞增殖率均大于80％，细胞毒性分级均为1级。结果表明，PEI/PAA凝胶粉末、ACS粉末、PEI/PAA/ACS凝胶粉末、(PEI/PDDA)/(PAA/PSS)/ACS凝胶粉末均表现出良好的生物相容性。

表3本发明实施例制备得到的自凝胶化粉末及其成分的细胞增殖率测试结果

1.3、抗菌性能评价：选择金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两种不同的模型菌进行抑菌试验。首先，将材料与5mL的细菌悬浮液(1×10⁴CFU/mL)在无菌管内混匀，37℃摇床孵育24h；将孵育后的细菌悬液稀释10⁶倍涂布于固体琼脂糖培养基表面，置于37℃培养箱24h，通过计数固体琼脂糖培养基上的菌落，记录存活细菌数。以没有经过任何处理的细菌为对照组，计算抑菌率，实验结果如表4和图12所示：阳性药物壳聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果明显，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为94.64％和98.26％；改进后的烷基化壳聚糖也表现出良好的抗菌效果，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为86.51％和93.66％；PEI/PAA凝胶粉末本身并无杀菌效果，但由于粉末本身具有吸水性，改变了细菌的生存环境，使细菌的增长速度有所减缓，菌落数低于其他组别；添加了烷基化壳聚糖的凝胶粉末均表现出优秀的抗菌效果，抗菌率高达99％。

表4本发明实施例制备得到的自凝胶化粉末及其成分的抑菌性能测试结果

1.4、止血愈合效果评价

体外凝血实验：取5mg的样品放入96孔板中，加入100μL抗凝血，加入10μLCaCl₂溶液(浓度为0.2mol/L)，同时开始计时，每隔30s用移液枪吸取PBS冲洗，观察凝血情况，直至血液完全凝固，多次冲洗也无变化时，记录为全血凝固时间。每个样品重复3次，以未添加样品的血液为对照组。体外凝血实验结果如表4和图13、14所示，图13为制备所得自凝胶化粉末及其成分的体外凝血时间；图14为制备所得自凝胶化粉末及其成分的体外凝血实物图。与空白相比，本发明制备所得PEI/PAA凝胶粉末、ACS粉末、PEI/PAA/ACS凝胶粉末、(PEI/PDDA)/(PAA/PSS)/ACS凝胶粉末与沸石粉相比凝血效果确有提高。

表5本发明实施例制备得到的自凝胶化粉末及其成分的体外凝血测试结果

1.5、伤口愈合效果评价

伤口愈合效果评价：将20只SD大鼠随机分为4组，适应性培养一周。使用10％水合氯醛，按照0.3mL/100g的剂量将大鼠麻醉后，固定在手术台上，用脱毛膏清理大鼠背部毛发，经75％的酒精消毒后，用直径为10毫米的活检取样器制作SD大鼠的背侧创面模型。在创口表面涂抹所制备的菌液，将不同粉末贴敷在创面进行治疗，以PBS作为对照组。在第0、2、4、7和10天时，观察并拍照记录每组创伤愈合的状况。实验结果如图15所示，与PBS组相较，PEI/PAA粉末组处理的伤口愈合程度无显著增强，而经PEI/PAA/ACS凝胶粉末与(PEI/PDDA)/(PAA/PSS)/ACS凝胶粉末处理的伤口面积在同时间段内有明显减少，愈合程度增强。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种自凝胶化粉末，通过将A溶液、B溶液和烷基化壳聚糖溶液混合得到混合溶液，然后将混合溶液冻干，研磨得到自凝胶化粉末；

所述B溶液包括聚苯乙烯磺酸钠溶液和聚丙烯酸溶液；

所述聚乙烯亚胺溶液的初始浓度为5～8wt％，所述聚二烯二甲基氯化铵溶液的初始浓度为7～12wt％；

所述混合溶液中，所述聚二烯二甲基氯化铵溶液占总体积的3～7％，所述聚乙烯亚胺溶液占总体积的38～42％；

所述聚丙烯酸溶液的初始浓度为5～8wt％，所述聚苯乙烯磺酸钠溶液的初始浓度为9～12wt％；

所述混合溶液中，所述聚苯乙烯磺酸钠溶液占总体积的3～7％，所述聚丙烯酸溶液占总体积的38～42％；

所述烷基化壳聚糖为十二烷基化壳聚糖、十四烷基化壳聚糖、十六烷基化壳聚糖和十八烷基化壳聚糖中的一种或几种；

所述烷基化壳聚糖溶液的初始浓度为0.2wt％～1wt％；

所述混合溶液中，所述烷基化壳聚糖溶液占总体积的8～15％。

2.根据权利要求1所述的自凝胶化粉末，其特征在于，所述聚丙烯酸溶液的初始浓度为6～7wt％，所述聚苯乙烯磺酸钠溶液的初始浓度为10～11wt％。

3.一种权利要求1～2任意一项所述的自凝胶化粉末在制备伤口治疗材料中的应用。