CN116659997A

CN116659997A - 测定试样的制备方法及试样制备装置

Info

Publication number: CN116659997A
Application number: CN202310170485.8A
Authority: CN
Inventors: 新和之; 玛丽莎·马顿; 佐佐木悠人; 正见圭一郎; 山口美悠
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2023-02-27
Publication date: 2023-08-29
Also published as: CN116660003A; JP2023125975A

Abstract

本发明提供容易自动化且对测定对象细胞的信号影响少的、从血液样本制备试样的测定试样的制备方法。该测定试样的制备方法具备：使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞；让去除了红细胞的血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应。

Description

测定试样的制备方法及试样制备装置

技术领域

本发明涉及一种从血液样本制备试样的测定试样的制备方法及试样制备装置。

背景技术

为了分析血液中所含的白细胞，广泛使用流式细胞仪进行分析。例如，通过标记抗体对血液中所含测定对象细胞的细胞表面抗原、细胞内抗原进行免疫染色，并通过流式细胞仪的光学测定检测已被免疫染色了的细胞。要从血液样本制备如上流式细胞仪分析用的试样时，需要去除血液中的红细胞。专利文献1中公开了通过密度梯度离心分离从血液回收PBMC（外周血单个核细胞），染色回收的PBMC的细胞表面抗原和细胞内抗原，并通过流式细胞仪测定已被染色的试样来鉴别调节T细胞。专利文献2中公开了制备供流式细胞仪分析的试样的方法。专利文献2中公开了染色血液细胞的工序、用溶解剂溶解红细胞的工序及对已被染色的血液细胞进行固定化的工序。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特表2014－528697号公报；

专利文献2：专利第6170511号公报。

发明内容

发明要解决的技术问题

像专利文献1公开的那样通过离心分离回收PBMC的方法作为去除红细胞的方法被普遍使用，但只取出离心分离后在离心管的中间形成的PBMC层的操作需要将吸移管前端插入到PBMC层，用吸移管只吸移PBMC，不吸移PBMC以外的层的手动操作，难以自动化。另外，专利文献2的使用溶解剂的方法虽容易自动化，但溶解剂可能会直接或间接影响蛋白质表达量，从细胞获得的信号可能会发生变化。因此，在例如像专利文献1所公开的调节T细胞那样的稀有细胞中可能会导致检测性能降低。因此，人们希望有容易自动化且对信号的影响（测定结果的变动）少的、从血液样本制备试样的测定试样的制备方法及试样制备装置。

本发明致力于实现容易自动化且对测定对象细胞的信号影响少的、从血液样本制备试样的测定试样的制备方法及试样制备装置。

解决技术问题的技术手段

为达成上述目的，第1发明所涉及的测定试样的制备方法具备：使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞；让去除了红细胞的血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应。

如上所述，第1发明所涉及的测定试样的制备方法使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞。由此，能够将红细胞与和红细胞结合了的固相一起去除，因此容易实现去除红细胞的处理的自动化。另外，与通过溶解剂来溶解并去除红细胞时不同，能够降低对测定对象细胞的信号的影响（测定结果的变动）。

如图2所示，第2发明所涉及的试样制备装置是让血液样本和试剂反应来制备测定试样的试样制备装置（100），其具备：使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞的第1处理部（20）、让去除了红细胞的血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应的第2处理部（30）。

如上所述，第2发明所涉及的试样制备装置具备使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞的第1处理部（20）。由此，能够将红细胞与和红细胞结合了的固相一起去除，因此容易实现去除红细胞的处理的自动化。另外，与通过溶解剂来溶解并去除红细胞时不同，能够降低对测定对象细胞的信号的影响（测定结果的变动）。

发明效果

根据本发明，能够实现容易自动化且对测定对象细胞的信号的影响少的、测定试样的制备方法及试样制备装置。

附图说明

图1为试样制备装置的从血液样本去除红细胞的第1例～第3例的概略示图；

图2为试样制备装置的结构例的概要的示意图；

图3为试样制备装置的处理流程的概略示图；

图4为用于说明试样制备处理的具体例的图；

图5为试样制备装置的移送反应容器时架的移动情况的示图；

图6为试样制备装置的分装样本时架的移动情况的示图；

图7为试样制备装置的通过第1处理部进行处理时架的移动情况的示图；

图8为试样制备装置的通过第1处理部进行处理后架的移动情况的示图；

图9为实施例及比较例的Teff细胞的检测结果的示图；

图10为实施例及比较例的Treg细胞的检测结果的示图；

图11为实施例的对分部分离为淋巴细胞的细胞中CD4表达量大的T细胞进行划分的散点图；

图12为比较例的对划分为淋巴细胞的细胞中CD4表达量大的T细胞进行划分的散点图；

图13为实施例的对CD4＋T细胞中CD62L表达量低的细胞（CD4+/CD62L^Low T细胞）进行划分的柱状图；

图14为比较例的对CD4＋T细胞中CD62L表达量低的细胞（CD4+/CD62L^Low T细胞）进行划分的柱状图；

图15为实施例的对CD4＋T细胞中CD25及FOXP3的表达量高的T细胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T细胞）进行划分的散点图；

图16为比较例的对CD4＋T细胞中CD25及FOXP3的表达量高的T细胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T细胞）进行划分的散点图。

具体实施方式

本实施方式的测定试样的制备方法（以下也称作“本实施方式的制备方法”）包括使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞、让去除了红细胞的所述血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应。根据本实施方式的制备方法，制备红细胞被去除、且特定细胞被免疫染色了的测定试样。

通过本实施方式的方法制备的测定试样是血液样本中所含细胞被免疫染色了的测定试样，是尤其适合流式细胞仪测定的测定试样。血液样本例如是来源于生物体的样本，例如是采自受检体的全血。受检体主要是人，但也可以是人以外的其他动物。

血液样本至少包括测定对象细胞和红细胞。测定对象细胞例如是白细胞，更具体而言是淋巴细胞。进一步具体而言是T细胞。进一步具体而言，测定对象细胞是T细胞中的调节性T细胞（以下也称作Treg细胞）及效应T细胞(以下也称作Teff细胞)。如后所述，对Treg细胞及Teff细胞特异性表达的细胞表面抗原及细胞内抗原进行免疫染色，并获取通过流式细胞术获得的荧光信号，由此将上述Treg细胞及Teff细胞相互区分计数。

从Treg细胞及Teff细胞以外的细胞发出的信号成为阻碍准确分类计数的噪声。尤其是血液样本中大量包括的红细胞的噪声大，因此在通过流式细胞术进行测定前需要去除红细胞。

一直以来，为了去除血液样本中所含红细胞，广泛使用溶解剂。溶解剂例如一般使用氯化铵（ammonium chloride）、表面活性剂。这些溶解剂便宜，仅通过与血液样本混合就能去除红细胞，因此易于制备，因此也广泛用于制备用于测定CD4、CD25之类的一般的抗原标记的测定试样。但是，发明人们商讨得知在测定特定的细胞表面抗原及细胞内抗原时，若使用一直以来的使用溶解剂的红细胞去除方法，在测定对象细胞、尤其是后述实施例中所述Treg细胞及Teff细胞的测定中，对荧光信号会有影响。且发明人们进一步研究得知通过使用能够与红细胞结合的固相来去除红细胞，由此代替使用溶解剂去除红细胞，能够降低对荧光信号的影响。以下，对本实施方式所涉及的测定试样的制备方法进行详述。

＜红细胞去除＞

能够与红细胞结合的固相例如是能够通过与血液样本接触来捕捉、吸附在血液样本中悬浮的红细胞的固相。能够与红细胞结合的固相与红细胞特异性结合，且不与测定对象细胞、例如白细胞结合。为了与红细胞特异性结合，优选在固相的表面固定化有能够与红细胞结合的抗体。能够与红细胞结合的抗体例如优选为能够通过抗原抗体反应与红细胞的表面抗原结合的抗体（以下也称作红细胞捕捉抗体），例如能列举出CD235a抗体、CD55抗体等。能够与红细胞特异性结合的抗体尤其优选CD235a抗体。另外，若要去除来源于小鼠的血液中所含红细胞，也可使用TER―119抗体。

将红细胞捕捉抗体固定化于固相表面的方法例如优选使用亲和素或链霉亲和素与生物素的相互作用。例如，能够通过让生物素化的红细胞捕捉抗体和结合有链霉亲和素的固相反应来在固相表面将红细胞捕捉抗体固定化。红细胞捕捉抗体可以在预先固定化于固相的状态下与血液样本混合，也可以将红细胞捕捉抗体和固相分别分开与血液样本混合，并在血液样本中将红细胞捕捉抗体固定化于固相。

固相优选为粒子。通过将粒子用作固相，能够通过向血液样本添加粒子来将红细胞吸附于粒子表面。粒子在血液样本中会分散，由此能够高效吸附红细胞，在这一点上是有利的。以下将作为固相的粒子称作固相粒子。

参照图1说明使用固相粒子时的红细胞去除的例子。使用固相粒子时的红细胞去除方法的例子能够列举出（A）BF（Bound·Free）分离法、（B）过滤法及（C）凝集法。

对BF分离法进行说明。在BF分离法中，使用磁性粒子作为固相粒子。如图1所示，在第1工序中，向血液样本添加表面固定化有红细胞捕捉抗体的磁性粒子。血液样本和磁性粒子的混合物优选被搅拌，磁性粒子分散在血液样本中。在第2工序中，血液样本中的红细胞吸附于磁性粒子的表面。在第3工序中，通过磁铁使磁性粒子由于磁力而聚集。例如，如图1所示，将磁铁M配置于收纳有血液样本和磁性粒子的混合物的容器附近（在图1的例子中为侧面），将分散在容器内的磁性粒子定位于容器的内侧面。由此在容器内分离红细胞。在第4工序中，分取磁性粒子由于磁力而聚集了的状态的容器内的液体中不含红细胞的部分、例如上清液。由此，从血液样本分离红细胞。

为了使磁性粒子由于磁力而聚集而将磁铁M配置于容器侧面的时间优选1分钟以上，更优选5分钟以上。配置磁铁M的位置只要是容器附近、能够提供足够使容器内的磁性粒子定位的磁力、且能够避开包括已被定位的磁性粒子在内的复合物通过吸取吸移上清液的位置即可，例如是容器侧面或底面。将磁铁M配置于容器附近的第3工序能够通过使磁铁M和容器相对移动来实现。例如，可以让包括磁性粒子的容器靠近磁铁M，也可以让磁铁M靠近容器。

在BF分离法中，使得磁性粒子在容器侧面由于磁力而聚集，由此能够在液相内分离红细胞，因此有易于操作的优点。

接着，对过滤法进行说明。在过滤法中，与BF分离法的第1及第2工序同样地，向血液样本添加固相粒子，红细胞吸附于固相粒子的表面。在第3工序中，向具备过滤器F的柱分装包括吸附有红细胞的固相粒子的血液样本。过滤器F包括具有容许对象细胞、例如白细胞通过、但固相粒子无法通过的大小的孔径的多孔构件。向过滤器的上侧面分装血液样本后，血液样本由过滤器F过滤，对象细胞通过过滤器F，吸附了红细胞的固相粒子由过滤器F捕获。由此，从包括对象细胞的血液样本分离红细胞。

而在过滤法中，图示了使用过滤器F的例子，但也可使用磁珠柱代替过滤器。使用磁珠柱时，向柱填充表面固定化有红细胞捕捉抗体的固相粒子，将血液样本注入柱。血液样本通过固相粒子之间的间隙时，血液样本中所含红细胞吸附于固相粒子表面。

接着，对凝集法进行说明。在凝集法中，与BF分离法的第1及第2工序同样地，向血液样本添加固相粒子。红细胞吸附于固相粒子的表面，由此红细胞和固相粒子形成凝块（Clump）。在第3工序中，包括吸附有红细胞的固相粒子的血液样本静置规定时间。由红细胞和固相粒子形成的凝块由于自重沉降至容器底部。在该状态下，分取包括对象细胞的上清液，由此从血液样本分离红细胞。

在凝集法中，优选选择易于与红细胞形成凝块的固相粒子，例如优选使用胶乳粒子。

＜免疫染色＞

像上述那样去除了红细胞的血液样本中所含细胞会被免疫染色。在免疫染色中，例如通过混合包括能够与对象细胞的目标抗原结合的标记抗体的抗体试剂和血液样本，由此目标抗原被标记。

标记抗体例如是被与照射具有特定中心波长的激发光相应地产生特定波长的荧光信号的标记分子修饰的抗体。

通过免疫染色标记的抗原数量无特别限定，可以为1种，也可以为复数种。同时染色复数种抗原时，通过混合包括标记为发出互不相同的荧光信号的复数个标记抗体的混合试剂和血液样本，能够染色复数个目标抗原。

抗原的种类可以是表达于细胞表面的抗原，也可以是表达于细胞内的抗原，也可以是这些的组合。组合抗原的种类能够按照目标抗原进行变更。例如，在后述实施例中，以Treg细胞及Teff细胞为目标细胞。Teff细胞能够作为CD4抗原阳性的T细胞（CD4＋T细胞）中、CD62L抗原为低表达的细胞进行鉴别。另外，Treg细胞能够作为CD4＋T细胞中、CD25抗原阳性且FOXP3抗原阳性的细胞进行鉴别。在该例中，能够作为细胞表面抗原对CD4、CD62L、CD25进行免疫染色，且作为细胞内抗原对FOXP3进行免疫染色。

发明人们商讨发现上述例示的抗原中，CD62L、CD25、FOXP3在为了去除血液样本中所含红细胞通过溶解剂进行了处理时，荧光信号会降低。这应是因为溶解剂对细胞有影响，由此细胞表面及细胞内的抗原受到刺激或者受到损伤而导致。对此，代替溶解剂，采用使用能够与红细胞结合的固相去除红细胞的方法后，确认到能够降低对上述抗原的信号的影响。

通过免疫染色对细胞表面抗原（例如CD4、CD62L、CD25）和细胞内抗原（例如FOXP3）进行染色时，优选包括以下工序：将包括与细胞表面抗原特异性结合的标记抗体的第1抗体试剂、包括与细胞内抗原特异性结合的标记抗体的第2抗体试剂与血液样本混合。还优选与血液样本混合的顺序为第1抗体试剂、第2抗体试剂的顺序。血液样本在通过第1抗体试剂染色细胞表面抗原后，添加第2抗体试剂前，优选与固定化剂及膜穿透剂混合。标记抗体之类的大分子无法穿透细胞膜进入细胞内部，因此膜穿透剂容许标记抗体穿过细胞膜进入细胞内。固定化剂穿过由膜穿透剂处理了的细胞膜，进行固定化，使得细胞内抗原、即蛋白质不会扩散。

＜流式细胞仪的测定＞

被免疫染色的测定试样供于流式细胞仪的测定。流式细胞仪通过流式细胞术从被免疫染色的细胞获取光学信号、例如荧光信号，并基于荧光信号分析细胞。

以下说明通过流式细胞仪测定通过上述方法去除了红细胞、且细胞被免疫染色了的测定试样时的Treg细胞及Teff细胞的分类计数方法。

首先，从血液样本中所含白细胞对淋巴细胞进行分类。淋巴细胞例如根据基于前向散射光强度及侧向散射光强度的参数进行分类。

接着，分类淋巴细胞中、带有规定值以上的CD4＋信号的细胞。具体而言，特定从与CD4抗原结合的标记抗体发出的荧光信号为规定值以上的细胞。为了提高分类性能，除了与CD4对应的荧光信号，还例如将散射光强度、更优选侧向散射光强度作为参数进行组合。

分类CD4＋细胞中、CD62L为低表达的细胞（CD62L^low）。具体而言，特定从与CD62L抗原结合的标记抗体发出的荧光信号为规定值以下的细胞。若以从与CD62L抗原结合的标记抗体发出的荧光信号强度为横轴，以与强度对应的细胞的计数数量为纵轴制成柱状图，会描绘出在荧光信号的高值侧出现CD62L高表达的细胞的峰值，在低值侧出现CD62L低表达的细胞的峰值的、所谓的双峰柱状图。相较于相当于上述2个峰值之间的谷底的部分而言在荧光信号的低值侧绘制的细胞特定为CD62L^low。

分类CD4＋细胞中、FOXP3＋且CD25＋的细胞。具体而言，特定从与FOXP3抗原结合的标记抗体发出的荧光信号（FOXP3信号）为规定值以上、且从与CD25抗原结合的标记抗体发出的荧光信号（CD25信号）为规定值以上的细胞。若制成以FOXP3信号强度为第1轴、以CD25信号强度为第2轴的二维分布图，会获得分别就2个信号分为规定值以上的区域和不足规定值的区域的4个象限。其中，FOXP3信号为规定值以上且CD25信号为规定值以上的象限中绘制的细胞特定为FOXP3＋且CD25＋的细胞。由此求出血液中的Treg细胞及Teff细胞的数量及比例。血液中的Treg细胞的比例及Teff细胞的比例已知对免疫检查点抑制剂（纳武单抗（Nivolumab））的药效预测有效。

具体而言，将CD4＋且CD62L^low的细胞相对于淋巴细胞的比例作为％Teff求出，将CD4＋且FOXP3＋且CD25＋的细胞相对于淋巴细胞的比例作为％Treg求出，代入以下公式（1），由此能够求出药效预测的指标。

指标＝［％Teff］²／［％Treg］・・・（1）

例如，通过将该指标和按照经验设定的临界值进行比较，能够将患者分层为纳武单抗的应答组和非应答组。根据本发明所涉及的试样制备方法，能够以高精度检测来自Treg细胞及Teff细胞的荧光信号，获得准确的计数结果。

＜预处理装置的自动化＞

本实施方式的测定试样的制备方法具有能够降低对对象细胞的荧光信号的影响的优点，且还具有容易自动化的优点。以下，对使用磁性粒子作为能够与红细胞结合的固相时的测定试样制备的自动化的例子进行说明。

［试样制备装置的概要］

参照图2，说明一实施方式所涉及的试样制备装置100的概要。

如图2所示，试样制备装置100具备第1处理部20和第2处理部30。第1处理部20进行使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞的处理。第2处理部30进行让去除了红细胞的血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应的处理。

第1处理部20具备安放处理容器11的架10a、安放反应容器12的架10b、安放收纳有血液样本的样本容器13的架10c。第1处理部20具备让架10a、10b、10c分别向横向（X1及X2方向）移动的第1移动部15、第2移动部16及第3移动部17。

试样制备装置100具备第1分装部41和容器移送部42。第1分装部41及容器移送部42被共通的移送轴43支撑且能够向Y方向移动。第1分装部41具备吸移管41a。第1分装部41使用吸移管41a向处理容器11分装样本容器13中收纳的血液样本。容器移送部42具备能够相互接近及远离的一对手部42a。容器移送部42通过手部42a夹持反应容器12，并在架10b和第2处理部30之间移送反应容器12。

试样制备装置100具备搅拌血液样本的搅拌部50。搅拌部50从架10c取出样本容器13并进行翻倒搅拌，由此搅拌样本容器13内的血液样本。

试样制备装置100具备第2分装部60。第2分装部60由移送轴61以能够向横向（X1及X2方向）移动的方式支撑。移送轴61由移送轴62以能够向Y方向移动的方式支撑。由此，第2分装部60在装置内能够在水平方向移动。第2分装部60具备吸移管60a。第2分装部60使用吸移管60a从处理容器11吸移上清液，并将其分装至反应容器12。且第2分装部60将后述试剂设置部70a及70b中设置的试剂分装至第1处理部20的处理容器11或第2处理部30内的反应容器12。

试样制备装置100具备试剂设置部70a及试剂设置部70b。试剂设置部70a包括保冷库，冷却安放试剂。试剂设置部70b在常温状态下安放试剂。

试样制备装置100具备喷嘴清洗部80。喷嘴清洗部80清洗第2分装部60的喷嘴。

试样制备装置100具备控制装置各部的控制部90。控制部90具备处理器及存储部。处理器例如由CPU构成。存储部可包括内存及存储器。处理器通过执行存储部中存储的程序来作为试样制备装置100的控制部90发挥功能。

第1处理部20在与第1移动部15相邻的位置具备磁铁21。更具体而言，磁铁21设于在通过第1移动部15使安放处理容器11的架10a移动至原点（最右侧（X2侧））时，与架10a安放的处理容器11的侧面相邻的位置。在图2的例子中磁铁21为永磁铁，也可以为电磁铁。

第2处理部30是离心分离部，其能够在圆周方向安放复数个作为离心管的反应容器12，能够通过以轴为中心高速旋转对安放的反应容器12内的试样进行离心分离。第2处理部30包括高速旋转的转子31和在转子31的外周部设有复数个的保持器部32。保持器部32例如具有筒状形状，能够在内部收容反应容器12。且保持器部32在转子31停止时，将反应容器12以其开口向上方的姿势进行安放。

［测定试样的制备方法的概略］

参照图3，说明试样制备装置100的测定试样的制备方法的概略。

第1分装部41向架10a安放的处理容器11分装架10c安放的样本容器13中收纳的血液样本的一部分。第2分装部60向分装了血液样本的处理容器11分装包括已被生物素化的抗红细胞抗体的试剂。另外，架10b通过容器移送部42向第2处理部30移送反应容器12。

第2分装部60向分装了血液样本的处理容器11分装包括作为固相的链霉亲和素结合磁性粒子的试剂。链霉亲和素结合磁性粒子和已被生物素化的抗红细胞抗体反应并结合，由此在处理容器11内形成包括红细胞和固相的复合物。第1移动部15使得处理容器11位于磁铁21的侧方，由此使得复合物集中于处理容器11的侧方。

第2分装部60从复合物集中于侧方的处理容器11吸移上清液，并将其分装至第2处理部30的反应容器12。由此从复合物所含红细胞分离包括测定对象细胞的上清液。

第2分装部60向分装了血液样本的反应容器12分装抗体试剂。抗体试剂是包括与白细胞的细胞表面抗原结合的标记抗体（例如与CD4、CD25、CD62L结合的标记抗体）的抗体混合试剂。试样中的白细胞和抗体试剂反应后，第2处理部30对反应容器12内的试样进行离心分离。通过离心分离，白细胞沉降至反应容器12的底部。第2分装部60吸移并去除离心分离后的试样的上清液。由此，与标记抗体反应了的白细胞留在反应容器12内，去除包括未反应的抗体成分的上清液。

第2分装部60向反应容器12内分装固定·穿透剂。通过固定·穿透剂，细胞膜内的蛋白质被固定化，且膜被穿透，使得容许标记抗体进入细胞膜内。与固定·穿透剂反应后，第2处理部30进行反应容器12内试样的离心分离。通过离心分离，白细胞沉降至反应容器12的底部。第2分装部60吸移并去除离心分离后的试样的上清液。由此，由固定·穿透剂处理了的白细胞留在反应容器12内，去除包括固定·穿透剂的上清液。

第2分装部60通过第2分装部60向反应容器12内分装抗体试剂。抗体试剂是包括与细胞内抗原结合的标记抗体（例如与FOXP3结合的标记抗体）的试剂。试样中的白细胞和抗体试剂反应后，第2处理部30对反应容器12内的试样进行离心分离。通过离心分离，白细胞沉降至反应容器12的底部。第2分装部60吸移并去除离心分离后的试样的上清液。由此，与标记抗体反应了的白细胞留在反应容器12内，去除包括未反应的抗体成分的上清液。

第2分装部60向反应容器12内分装缓冲物（例如磷酸缓冲液）。由此，制备测定试样。容器移送部42向架10b移送收纳有测定试样的反应容器12。

［试样制备装置的作业］

参照图4，对试样制备装置100进行的测定试样的作业进行说明。以下，第1移动部15、第2移动部16及第3移动部17对架10a～10c的移动也进一步参照图5～图8。

如图5所示，架10a、10b、10c分别能够安放复数个（例如6个）容器。架10a、10b、10c通过第1移动部15、第2移动部16及第3移动部17向X1方向及X2方向运送。在本实施方式中，说明第1移动部15、第2移动部16及第3移动部17一体地向X1方向及X2方向移动架的方式，但也可以为第1移动部15、第2移动部16及第3移动部17分别独立地移动架的方式。第1移动部15、第2移动部16及第3移动部17能够每按照与架安放的容器的间隔对应的距离，向X1方向及X2方向运送架10a、10b、10c。在图5～图8中，为了使得图示更易于理解各个容器的位置，图示了与容器间隔对应大小的格子。

〈样本分装处理〉

在样本分装处理之前，如图5（A）所示，由作业人员将空的处理容器11放置于架10a。且由作业人员将空的反应容器12放置于架10b。还由作业人员将收纳有血液样本的样本容器13放置于架10c。

在图4的步骤S201中，作为反应容器12的离心管从架10b向第2处理部30运送。如图5（B）所示，向X1方向移动架，使得最左侧的反应容器12位于位置P1。位置P1是从最右侧的位置起第12个格子的位置。在位置P1，通过容器移送部42取出反应容器12，并将其向第2处理部30移送。如图5（C）所示，向X1方向移动架，使得下一个反应容器12位于位置P1。然后，反应容器12被容器移送部42取出，并向第2处理部30依次移送。重复该处理，直到最后的反应容器12移动至位置P1，由容器移送部42移送至第2处理部30。

在步骤S202中，搅拌样本容器13内的血液样本。如图6（A）所示，通过第3移动部17向X2方向移动架，使得最左侧的样本容器13位于位置P2。位置P2是从最右侧的位置起第8个格子的位置。在位置P2，架10c的样本容器13被搅拌部50取出，并被翻倒搅拌。

在步骤S203中，从样本容器13吸移血液样本，并将其向架10a的处理容器11排出，分装血液样本。如图6（B）所示，向X1方向移动架，使得在步骤S202中搅拌的样本容器13位于位置P1。在位置P1，第1分装部41吸移样本容器13内的血液样本的一部分，并向架10a安放的处理容器11分装吸移的血液样本。如图6（C）所示，向X2方向移动架，使得下一个样本容器13位于位置P2。在位置P2，样本容器13被搅拌部50搅拌。重复该位置P2处的样本容器13的搅拌作业和紧接其后的位置P1处的血液样本的分装作业直到对所有样本容器13都已进行。图6（D）是对所有样本容器13都完成了搅拌和分装作业的状态的图。

〈BF分离处理〉

在步骤S204中，向排出有血液样本的处理容器11分装抗体。如图7（A）所示，向X2方向移动架，使得最左侧的处理容器11位于位置P3。在位置P3，第2分装部60向处理容器11分装已被生物素化的抗红细胞抗体。如图7（B）所示，向X1方向移动架，使得下一个处理容器11位于位置P3。然后，在位置P3，重复通过第2分装部60向处理容器11分装抗红细胞抗体的处理。

向所有处理容器11完成分装后，在步骤S205中，进行处理容器11内血液样本的搅拌。通过第1移动部15，架向X1方向及X2方向重复往复移动，搅拌处理容器11内的血液样本。之后，安放处理容器11的架10a静置规定时间（例如20分钟）。

在步骤S206中，向处理容器11分装缓冲液。第1移动部15让架10a移动，在位置P3，通过第2分装部60向各处理容器11内分装缓冲物。通过第1移动部15使架10a高速移动，搅拌处理容器11内的血液样本。之后静置。例如，作为缓冲液，分装BSA溶液、磷酸盐缓冲盐水（PBS）。并搅拌分装有缓冲液的血液样本。

在步骤S207中，向处理容器11分装磁性粒子。例如，作为磁性粒子，分装链霉亲和素结合磁性粒子。如图7（C）所示，向X1方向移动架，使得最左侧的处理容器11位于位置P3。在位置P3，通过第2分装部60向处理容器11分装作为固相的链霉亲和素结合磁性粒子。如图7（D）所示，向X1方向移动架，使得下一个处理容器11位于位置P3。然后，在位置P3，重复通过第2分装部60向处理容器11分装包括磁性粒子的固相的处理。

在步骤S208中，搅拌处理容器11内的血液样本进行反应。所需要的时间例如为5分钟。通过移动部15使架高速移动，搅拌处理容器11内的血液样本。之后静置。由此，在处理容器11内形成包括红细胞和固相的复合物。

在步骤S209中，进行集磁。如图7（E）所示，向X2方向移动架，使得各处理容器11位于位置P4。位置P4是从最右侧的方格起6个方格所对应的位置。磁铁21设于与位置P4相邻的位置。通过磁铁21，包括红细胞和固相的复合物在处理容器11的内侧面由于磁力而聚集。所需要的时间例如为10分钟。

在步骤S210中，吸移进行了集磁的处理容器11内的血液样本的上清液（例如700μL），并将其向第2处理部30的反应容器12排出并分装。如图8（A）所示，在位置P4通过第2分装部60从各处理容器11吸移上清液，并将其分装至移动到第2处理部30的各反应容器12。

在步骤S212中，对反应容器12内的试样进行离心分离。第2处理部30通过高速旋转转子31来让白细胞沉降到反应容器12的底部。

在步骤S213中，去除反应容器12内的上清液。第2分装部60吸移并去除通过离心分离使白细胞沉降了的反应容器12的上清液（例如600μL）。

在步骤S214中，搅拌反应容器12内的试样。通过步骤S212及S213，白细胞沉降在反应容器12的底部。为了让该沉降的白细胞分散，搅拌反应容器12。第2处理部30让转子31向一个方向重复加减速并让其旋转，由此搅拌反应容器12内的试样。

〈第1染色处理〉

在步骤S215中，向反应容器12分装抗体试剂。第2分装部60将包括CD25标记抗体、CD4标记抗体、CD62L标记抗体的混合试剂作为抗体试剂分装至安放于第2处理部30的反应容器12。

在步骤S216中，第2处理部30让转子31向一个方向重复加减速并让其旋转，由此搅拌反应容器12内的试样。规定时间例如为30分钟。

在步骤S217中，向反应容器12分装固定前样本用的清洗液。第2分装部60向反应容器12内分装作为清洗液的PBS。

在步骤S218中，第2处理部30让转子31向一个方向重复加减速并让其旋转，由此搅拌反应容器12内的试样。

在步骤S219中，第2处理部30让转子31向一个方向高速旋转，由此对反应容器12内的试样进行离心分离。由此，与抗体试剂反应了的白细胞沉降。

在步骤S220中，第2分装部60从反应容器12吸移并去除上清液。通过以上步骤，表面抗原CD25、CD4、CD62L分别被对应的标记物质染色。

〈细胞的固定及穿透处理〉

在步骤S221中，第2分装部60向反应容器12分装固定·穿透剂。

在步骤S222中，第2处理部30让转子31向一个方向重复加减速并让其旋转，由此搅拌反应容器12内的试样，进行反应。规定时间例如为30分钟。

在步骤S223中，第2分装部60向反应容器12分装固定后样本用的清洗液。

在步骤S224中，第2处理部30让转子31向一个方向重复加减速并让其旋转，由此搅拌反应容器12内的试样。

在步骤S225中，第2处理部30让转子31高速旋转，由此对反应容器12内的试样进行离心分离。

在步骤S226中，第2分装部60从反应容器12吸移并去除上清液。

在步骤S227～S230中，进行清洗液的分装、搅拌、离心分离及上清液的去除作业。即，重复样本的清洗处理。样本的清洗处理可以进行1次、2次、3次以上。通过以上步骤，对反应容器12中的细胞进行固定化处理及穿透处理。

〈第2染色处理〉

在步骤S231中，第2分装部60向反应容器12分装抗体试剂。例如，作为抗体试剂，分装包括抗FOXP3标记抗体的试剂。

在步骤S232中，第2处理部30让转子31向一个方向重复加减速并让其旋转，由此搅拌反应容器12内的试样进行反应。规定时间例如为30分钟。

在步骤S233中，第2分装部60向反应容器12分装固定后样本用的清洗液。在步骤S234～236中，与上述同样地，进行搅拌、离心分离、上清液的去除作业，在步骤S237～S240中，重复包括清洗液的分装、搅拌、离心分离及上清液的去除作业的样本的清洗处理。样本的清洗处理可以进行1次、2次、3次以上。通过以上步骤，反应容器12中的FOXP3被对应的标记物质染色。

〈容器返还〉

在步骤S241中，第2分装部60向反应容器12分装缓冲液。通过分装，调整反应容器12内的试样，使其成为适于供应给测定装置的规定液量、规定pH。例如，作为缓冲液，分装BSA溶液及PBS。

在步骤S242中，第2处理部30与上述同样地旋转转子并进行搅拌。

在步骤S243中，容器移送部42从转子31取出第2处理部30中安放的反应容器12，并将其放置于第2移动部16安放的架10b。所有反应容器12移送至架10b后，如图8（D）所示，通过移动部15～17向X2方向移动架，使其返回初始位置。由此，作业人员能够取出反应容器12。

通过以上步骤，试样制备装置100的试样制备完成。

＜分离法及溶血法的比较数据＞

通过以下实验通过本申请发明所涉及的分离法和比较例所涉及的溶血法比较对Treg细胞及Teff细胞的检测性能的影响。

（实施例（通过分离法制备试样））

将采到肝素采血管的全血样本分装至试管。向试管加入50μL的生物素化了的CD235a抗体并搅拌，在室温静置20分钟。向试管加入0．6mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。向试管加入200μL的链霉亲和素结合磁性粒子的含有液（Mojosort（注册商标））并搅拌，在室温静置5分钟。配置永久磁铁使其与试管的侧面相接，在室温静置10分钟，由此将红细胞－生物素化CD235a抗体－链霉亲和素结合磁性粒子的复合物集中于试管内壁。用吸移管采取试管内的溶液的上清液0．7mL，并将其分装至离心管。将离心管在室温以300G进行5分钟离心分离，去除上清液600μL，由此获得实施例的试样。

（细胞表面抗原的染色）

向试样添加CD4／CD25／CD62L的抗体混合试剂50μL，搅拌后在室温静置30分钟。抗体混合试剂包括FITC标记的CD4抗体、PE－Cy7标记的CD25抗体、APC标记的CD62L抗体。向与抗体混合试剂反应完成的试样添加1mL的PBS，并搅拌。将试样在室温以300G进行5分钟离心分离，去除上清液并搅拌。

（固定·膜穿透）

向离心分离后的试样加入0．5mL的固定／膜穿透剂（eBioscience Foxp3 /Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent、Invitrogen公司制）并搅拌，在室温静置30分钟。向试样加入1mL的清洗液（eBiosciencePermeabilization Buffer (10X)、Invitrogen公司制）并搅拌。将试样在室温以400G进行5分钟离心分离，去除上清液。向离心分离后的试样加入1mL的清洗液（同上）并搅拌，在室温以400G进行5分钟离心分离，去除上清液并搅拌。

（细胞内抗原的染色）

向获得的试样添加包括被PE标记的FOXP3抗体的抗体试剂50μL，在室温静置30分钟。向试样加入1mL的清洗液（eBioscience Permeabilization Buffer (10X)、Invitrogen公司制）并搅拌。将试样在室温以400G进行5分钟离心分离，去除上清液。向离心分离后的试样加入1mL的清洗液（同上）并搅拌，在室温以400G进行5分钟离心分离，去除上清液并搅拌。

（流式细胞仪的测定）

向试样添加包括0．5％BSA的0．3mL的PBS并搅拌。用市场销售的流式细胞仪FACSCanto II（Becton Dickinson公司制）测定获得的试样，对Teff细胞（CD62L^low且CD4＋的T细胞）和Treg细胞（CD25＋、Foxp3＋、且CD4＋的T细胞）进行分别计数。

（比较例（通过溶血法制备试样））

将采到肝素采血管的全血样本分装至离心管。向离心管加入2mL溶血剂（CyLyse；希森美康株式会社制）并在室温静置10分钟，由此将血液中的红细胞溶血。用漩涡混合器搅拌离心管后，向离心管加入2mL的PBS。将离心管在室温以300G进行5分钟离心分离，去除上清液。向离心管加入2mL的PBS，再次将离心管在室温以300G进行5分钟离心分离，去除上清液，获得比较例的试样。对比较例的试样进行与实施例同样的操作，通过流式细胞仪实施测定。

（对照实验）

用5mL液体培养基（10mM HEPES/PRMI-1640）稀释采到肝素采血管的5ml全血样本。将10mL的淋巴细胞分离用介质（Ficoll-Paque Plus、Cytiva公司制）加入50mL管。向该管加入稀释的全血样本并分层。按照Ficoll Paque Plus的说明书中记载的用法说明在管内进行PBMC的分离，使用CELLBANKER2（日本全药工业公司制）使得PBMC悬浮至1x10^6 cells/mL，用超低温冷冻器冻结。冻结处理后，将PBMC在24小时以后1周以内转移至液氮（液相下）。用10% FBS/RPMI1640清洗解冻的细胞后，添加10% FBS/RPMI1640使之成为1x10^6 cells/mL。将2mL的细胞悬浮液加入24孔板 (Corning公司制)，培养48小时。培养后，将细胞培养液移至15mL管，以400G进行5分钟离心分离，获得对照例的试样。对于对照例的试样，进行与实施例同样的操作，通过流式细胞仪实施测定。

（测定结果）

测定结果示于图9及图10。

如图9所示，在Teff细胞的检测性能中，实施例的通过分离法制备的测定用试样与对照实验的使用冻结PBMC的试样显示良好相关（相关系数＝0.9419）。且实施例与比较例（相关系数＝0.7064）相比在相关系数中显示显著高的值。

如图10所示，在Treg细胞的检测性能中，实施例的通过分离法制备的测定用试样与对照实验的使用冻结PBMC时的结果显示良好相关（相关系数＝0.8679）。且实施例与比较例（相关系数＝0.0065）相比在相关系数中显示显著高的值。

由上述结果可知，与溶血法相比，本发明所涉及的分离法对Teff细胞及Treg细胞两者显示高测定精度。还可知分离法与使用冻结PBMC制备试样时具有同等测定精度。

（来自标记的信号相关考察）

图11及图12是对划分为淋巴细胞的细胞中CD4表达量大的T细胞（CD4＋T细胞）进行划分的散点图。图11是实施例（分离法）的散点图，图12是比较例（溶血法）的散点图。CD4＋T细胞的计数结果在实施例（分离法）中为44．4％，而比较例（溶血法）中为43．0％，没有明显差异。

图13及图14是对CD4＋T细胞中CD62L表达量低的细胞（CD4+、CD62L^Low的T细胞）进行划分的、从同一样本获得的柱状图。图13是实施例（分离法）的柱状图，图14是比较例（溶血法）的柱状图。在该柱状图中，CD62L的荧光信号在规定的临界值范围内的作为CD4＋、CD62L^Low T细胞、即Teff细胞进行计数。在实施例（分离法）中，Teff细胞为8．48％，而在比较例（溶血法）中，Teff细胞为15．4％。在实施例（分离法）的柱状图中，CD62L^Low T细胞的峰值和CD62L表达量高的T细胞（CD62L^High T细胞）的峰值明显分开，在峰值间的谷间绘制的细胞少。另一方面，比较例（溶血法）的柱状图与实施例（分离法）的柱状图相比，CD62L^High T细胞的峰值有所下降，在2个峰值的谷间绘制的细胞数量较多。这应是因为在溶血法中CD62L的染色不充分，整体上荧光信号强度下降，导致CD62L表达量高的细胞（CD62L^High T细胞）向低值侧滑动。该数据表明在溶血法中，CD62L的信号整体降低。

图15及图16是对CD4＋T细胞中CD25及FOXP3的表达量高的T细胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T细胞）进行划分的、从同一样本获得的散点图。图15是实施例（分离法）的散点图，图16是比较例（溶血法）的散点图。将分别就与CD25对应的荧光信号强度（横轴）及与FOXP3对应的荧光信号强度（纵轴），显示高于规定临界值的值的细胞鉴别为CD25+/FOXP3＋T细胞、即Treg细胞（在Q2区域内的细胞）。在实施例（分离法）中，划分到Q2的Treg细胞为3．88％，而在比较例（溶血法）中为1．94％。比较例（溶血法）的散点图与实施例（分离法）的散点图相比，Q3中所含细胞数量有所增加。即，在溶血法中，在纵轴方向细胞的绘制有所下降，因此表明FOXP3的信号整体降低。

（变形例）

本次公开的实施方式在所有点上均为例示，绝无限制性。本发明的范围不由上述实施方式的说明所示，而由权利要求书所示，且包括与权利要求书均等意义及范围内的所有变更。

编号说明

10a：处理容器移送部、10b：反应容器供应部、10c样本放置部、11：处理容器、12：反应容器、13：样本容器、20：第1处理部、30：第2处理部、41：第1分装部、42：容器移送部、60：第2分装部、100：试样制备装置

Claims

1.一种测定试样的制备方法，其具备：

使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞；

让去除了红细胞的所述血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应。

2.根据权利要求1所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

从所述血液样本去除红细胞包括：形成包括红细胞和所述固相的复合物，并分离形成的所述复合物和所述血液样本的上清液。

3.根据权利要求2所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

所述复合物中，红细胞和所述固相介由对红细胞及所述固相具有结合力的结合物质结合。

4.根据权利要求3所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

形成包括红细胞和所述固相的所述复合物包括：通过让所述血液样本、所述结合物质、所述固相接触来形成所述复合物。

5.根据权利要求3所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

所述结合物质包括能够与所述红细胞结合的抗体。

6.根据权利要求2～5其中任意一项所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

所述固相具有磁性粒子，

从所述血液样本去除红细胞包括：通过磁铁使所述复合物由于磁力而聚集并吸移所述血液样本的上清液。

7.根据权利要求2～5其中任意一项所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

从所述血液样本去除红细胞包括：通过过滤器滤出形成的所述复合物，由此分离所述血液样本的上清液。

8.根据权利要求2～5其中任意一项所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

从所述血液样本去除红细胞包括:通过离心分离让形成的所述复合物沉降来分离所述血液样本的上清液。

9.根据权利要求1～5其中任意一项所述的测定试样的制备方法，其特征在于：

让去除了红细胞的所述血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应包括：对所述血液样本进行离心分离。

10.一种试样制备装置，其是让血液样本和试剂反应来制备测定试样的试样制备装置，其具备：

使用能够与红细胞结合的固相从血液样本去除红细胞的第1处理部；

让去除了红细胞的所述血液样本和对细胞进行免疫染色的试剂反应的第2处理部。

11.根据权利要求10所述的试样制备装置，其特征在于：

所述第1处理部包括分离部，该分离部形成包括红细胞和所述固相的复合物，并分离形成的所述复合物和所述血液样本的上清液。

12.根据权利要求11所述的试样制备装置，其特征在于：

13.根据权利要求12所述的试样制备装置，其特征在于：

所述第1处理部通过让所述血液样本、所述结合物质、所述固相接触来形成所述复合物。

14.根据权利要求12所述的试样制备装置，其特征在于：

所述结合物质包括能够与所述红细胞结合的抗体。

15.根据权利要求11～14其中任意一项所述的试样制备装置，其特征在于：

所述固相具有磁性粒子，

所述第1处理部包括使所述复合物由于磁力而聚集的磁铁，通过所述磁铁使所述复合物由于磁力而聚集并吸移所述血液样本的上清液来分离所述复合物和所述血液样本的上清液。

16.根据权利要求11～14其中任意一项所述的试样制备装置，其特征在于：

所述第1处理部包括滤出形成的所述复合物来分离所述血液样本的上清液的过滤器。

17.根据权利要求11～14其中任意一项所述的试样制备装置，其特征在于：

所述第1处理部包括通过离心分离让形成的所述复合物沉降来分离所述血液样本的上清液的第2离心分离部。

18.根据权利要求10～14其中任意一项所述的试样制备装置，其特征在于：

所述第2处理部包括对所述血液样本进行离心分离的第1离心分离部。

19.根据权利要求10～14其中任意一项所述的试样制备装置，还具备：

供收纳有所述血液样本的样本容器载置的样本放置部；

供收纳在所述第2处理部中使之反应的所述血液样本的反应容器载置的反应容器供应部；

用于在所述反应容器供应部和所述第2处理部之间移送所述反应容器的容器移送部；

用于从所述样本容器向收纳在所述第1处理部中进行处理的所述血液样本的处理容器分装所述血液样本的第1分装部；

用于向所述第1处理部的所述处理容器或所述第2处理部内的所述反应容器分装在试剂设置部设置的试剂的第2分装部。

20.根据权利要求19所述的试样制备装置，其特征在于：

所述第2分装部从所述处理容器吸移上清液，并将其分装至所述第2处理部内的所述反应容器。