CN116655760B - 亚麻基因LuWRI1a及在提高耐盐和耐旱性能中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了亚麻基因LuWRI1a及在提高植物耐盐和耐旱性能中的应用，属于基因工程技术领域，亚麻基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明通过基因工程手段，将该基因转化至农杆菌中，侵染亚麻的下胚轴，再对亚麻进行培养，获得的转基因株系在盐胁迫和干旱胁迫状态下长势良好，发现了该基因具备提高亚麻耐盐胁迫和干旱胁迫的功能，为耐逆性亚麻株系的构建提供了理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及亚麻基因LuWRI1a及在提高植物耐盐和耐旱性能中的应用。
背景技术
亚麻(Linum usitatissimum L.)是一年生的二倍体自花授粉植物，属于亚麻科亚麻属。亚麻是全球非常重要的油料作物，主要种植于印度，加拿大和中国。亚麻籽一般含有40％～50％的油脂，73％的多不饱和脂肪酸，其中α-亚麻酸(C18：3，ALA)含量高达50％，被用来作为食品原料有很高的营养价值。WRINKLED1最初是在拟南芥的wri1-1突变体中发现的转录因子，由于该突变体的表皮有皱纹，它被命名为WRINKLED1。
研究发现，在大豆、玉米和油菜等植物中过表达WRI的同源基因能显著提高转基因植株的种子含油量。我们在前期的研究中从亚麻中克隆了两个WRINKLED1基因，LuWRI1a和LuWRI1b。我们发现，过量表达LuWRI1a可以增加转基因亚麻种子的含油量，而不影响亚麻籽油的质量或种子产量。尽管WRI1基因在不同植物中的多种作用已经被证实，但WRI1基因是否可以提高植物耐逆性方面的功能却鲜有报道。
因此，如果开发WRI1基因的新功能，并将其应用于植物耐盐和耐干旱胁迫中是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种亚麻基因LuWRI1a提高植物耐盐和耐旱性能中的应用。采用农杆菌转化法，将亚麻的LuWRI1a基因过表达导入亚麻的外植体，获得3个LuWRI1a表达量较高的T3代纯合株系。利用NaCl和PEG-6000模拟盐处理和干旱处理分析转基因亚麻的耐盐耐旱能力，通过观察转基因亚麻的植株表型、测定相关生理指标以及分析逆境胁迫响应基因在转基因亚麻中的表达等研究，研究LuWRI1a基因在亚麻耐逆中的功能，为培育耐旱耐盐碱亚麻新品种提供理论基础和种质资源。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
亚麻基因LuWRI1a，其特征在于，所述亚麻基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
ATGAAATCGCCGCCGTCAAACGACAAGTCGACGACGAAGAACAACAAGAGGCAAAGGAAGATAATATCTCCTTCTTCATCTTCCTCATCCCTTTCTTCCCTCACTTCTAATTCCTCCTGCTCTTCCAATTCTTCCAACAATTCCTCTCCCCCATCTCCTTCTTGCTCCTGCTCTTCCTCCCCTTGCTCTTCCTGCGATCCCTCCGCTGTAATTGTTCACCCTCCTCCTCCTCCGCCGAATCATGAGGAGAAACCAGCTGCTCCACCCAAAGCCGCCAAACGACGGAGAAGAACCCAATCATCCAAGAAATTGACCAGCAACAACAATGGCGGCGATCACCCCCCTAAATCAAACGATGAAGACAAGATTGATGATCCCCTGCCTCCCCCCTCTGCACAAGGAAAACGAAGCTCTGCTTTCAGGGGTGTCACCAGGCATAGATGGACTGGAAGATTTGAAGCTCATCTGTGGGATAAAAGCTCCTGGAACAACATGCACAACAAGAAGGGTAGACAAGTGTATTTGGGGGCGTATGACGAAGAGGAAGCCGCTGCTCGGACTTACGACCTTGCTGCGTTGAAGTACTGGGGATCCGCCACCACCTTGAATTTCCCTGTAGAAGGGTACGAGAAGGAGATGGAGGAGATGAGTAAAGTGAGCAGAGAAGAGTACTTGGCTTCTCTCCGGCGCCGGAGCTCCGGCTTCTCCAGAGGCGTCTCTAAGTACCGCGGCGTCGCCAGGCATCACCATAATGGACGGTGGGAAGCAAGGATTGGAAGAGTGCTGGGGAACAAGTACCTCTACCTCGGCACTTTCAACACGCAGGAGGAGGCTGCAGAGGCGTATGACATGGCGGCACTAGAATACAGAGGAGCCAACGCTGTCACCAACTTCGACGTGGCCAATTACGTGGACCGCCTCAAGTCGAAAGGCGACCAATTCCTCCAGCCAATTTCTGACGTGGCAGCGGCTGAGGTGGCACCGGAAGATGATCAAGAAGCAGCTGAACTATACATCAACGACAATGCTGCCAAGTTAGAACCACTTCCCCTGCCCTCATCATCATCGTCGATCGAACAAGAGGCCGCTGAGGTGGCAATGATGATGGATATGCCTCTGCCACCGGAGATGCCTCCCACCACGACGACAACGACAAACAACGGTGGCAGCATGATGGAGCTTCTGGAGTTGGAGAATGATGGGAATTGGAGCTTCTGTTTCGAGTACCCGGAGGAGAACAACGCGGCCTCCTCGCAGCTGGCGTCGGAGGAGGGGTGCTGTATATTGCCGGAGTTGTTCGACGTGGATGGGGGAGGGTTCCAGCTGGAGGACATTGACTATTTGGTGTTTGACTCGTACCCGCCGCCGGTGGCGGTGGATGATGATGACGTGGGGAAGAGCGTGAAGGAGAAGTTGTTGTCCGAGGAGGATCTGTCAAGGTCTCCTTCTTGTTCAACAACAACATCGGTTTCTTGTAACTAA，如SEQ ID NO.1所示。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护由所述的亚麻基因LuWRI1a编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
MKSPPSNDKSTTKNNKRQRKIISPSSSSSSLSSLTSNSSCSSNSSNNSSPPSPSCSCSSSPCSSCDPSAVIVHPPPPPPNHEEKPAAPPKAAKRRRRTQSSKKLTSNNNGGDHPPKSNDEDKIDDPLPPPSAQGKRSSAFRGVTRHRWTGRFEAHLWDKSSWNNMHNKKGRQVYLGAYDEEEAAARTYDLAALKYWGSATTLNFPVEGYEKEMEEMSKVSREEYLASLRRRSSGFSRGVSKYRGVARHHHNGRWEARIGRVLGNKYLYLGTFNTQEEAAEAYDMAALEYRGANAVTNFDVANYVDRLKSKGDQFLQPISDVAAAEVAPEDDQEAAELYINDNAAKLEPLPLPSSSSSIEQEAAEVAMMMDMPLPPEMPPTTTTTTNNGGSMMELLELENDGNWSFCFEYPEENNAASSQLASEEGCCILPELFDVDGGGFQLEDIDYLVFDSYPPPVAVDDDDVGKSVKEKLLSEEDLSRSPSCSTTTSVSCN，如SEQ ID NO.2所示。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的亚麻基因LuWRI1a在构建生物材料中的应用，所述生物材料包括重组载体、重组菌株。
优选地，所述重组载体为pE101-LuWRI1a。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的亚麻基因LuWRI1a在提高亚麻耐盐和耐旱性能中的应用。
优选地，亚麻基因LuWRI1a上调LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED基因的表达，调控亚麻转基因植株的耐逆性。
优选地，亚麻基因LuWRI1a增强亚麻在盐胁迫和干旱胁迫下抗氧化酶的活性并且减轻对亚麻细胞膜造成的氧化损伤。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的亚麻基因LuWRI1a在构建耐盐和耐干旱胁迫的亚麻株系和分子育种中的应用。
优选地，亚麻株系的构建过程包括：以亚麻基因LuWRI1a构建重组载体pE101-LuWRI1a，将重组载体pE101-LuWRI1a转化至农杆菌中，得到重组菌株，最后以重组菌株侵染亚麻，获得耐盐胁迫和耐干旱胁迫的亚麻株系。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种耐盐和耐干旱胁迫的亚麻株系，由所述的方法构建得到。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开发现了亚麻基因LuWRI1a，并鉴定了该基因的功能，为亚麻抗逆植株的构建和分子育种提供了理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为转基因胡麻的获得的过程；A：农杆菌侵染亚麻下胚轴；B：下胚轴诱导形成不定芽；C：生根；D：转化苗移栽；
图2附图为转基因亚麻的分子鉴定结果图；A：LuWRI1a转基因亚麻的PCR检测，M：Marker DL2000；W：空白对照；1-24：转基因亚麻；B：转基因亚麻LuWRI1a的表达分析；WT：野生型对照(亚麻栽培品种陇亚10号)；OE-2，OE-20，OE-22：过表达亚麻株系；
图3附图为胁迫处理后野生型植株和转基因植株的表型；
图4附图为盐胁迫和干旱胁迫下转基因植株性状分析；A：株高；B：主根长；C：侧根数；D：叶片数；
图5附图为过表达LuWRI1a亚麻的酶活性测定图；
图6附图为胁迫处理下转基因亚麻逆境胁迫相关基因的表达分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中用到的试验材料
供试材料为亚麻品种(Linum usitatissimum)陇亚10号和LuWRI1a过表达T3代纯合转基因株系LuWRI1a-OX-X，种子由甘肃省农业科学院作物研究所亚麻研究室提供。挑选生长良好的转基因株系进行PCR鉴定阳性株系。
实施例1构建LuWRI1a过表达亚麻株系
通过农杆菌介导法转化亚麻品种陇亚10号，将包含重组质粒pE101-LuW RI1a的农杆菌GV3101侵染亚麻的下胚轴，见图1；在培养基中中进行培养，每2周更换一次培养基，直至获得完整植株。同时以非转基因“陇亚10号”(野生型)为阴性对照。挑选生长良好的再生植株进行PCR鉴定阳性株系。通过PCR鉴定筛选阳性植株，获得纯合转基因亚麻株系5个(图2A)。根据qRT-PCR的检测结果，选择表达量较高的3个不同的转基因株系OE-1、OE-2和OE-5进行下一步试验(图2B)，温室培养收获T1代种子，将T1代植株在花盆中于温室培养，通过筛选鉴定阳性植株，获得T2代种子。
上述引物序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20所示。
F：5′-CCACATGAAATCGCCGCCGTCAAACGAC-3′，如SEQ ID NO.19所示；
R：5′-CAAGAAACCGATGTTGTTGTTGA-3′，如SEQ ID NO.20所示。
实施例2转基因株系与野生型株系在逆境胁迫下生长状态的对比
采用盆栽法，盆高18cm，直径15cm，将进口的丹麦品质草炭土和蛭石按3：1的体积混合均匀，取适量混合营养土装入小花盆中。选取籽粒饱满、大小均匀的亚麻种子约15粒(T3代纯合系种子，对照组是野生型)，播种到花盆内，室温放置。用1/2Hogland营养液培养1个月，每隔3d浇灌100mL/次。光照强度为130μmol·m-2·s-1，光周期为16h/8h(光照/黑暗)，置于室温条件下培养4周，进行胁迫处理。试验设置4个处理，3次重复。挑选长势相同的幼苗进行如下处理：
(1)盐胁迫处理：用1/2Hoagland营养液配制200mmol·L-1NaCl营养液，每隔3d浇灌100mL；
(2)PEG-6000模拟干旱处理：用1/2Hoagland营养液配制25％PEG营养液，每隔3d浇灌100mL；
胁迫处理2周后，观察表型并测定相关生理指标。每个株系选取5株进行株高、根长、侧根数和叶片数的测定。结果见图3和图4，正常培养条件下，转基因株系的株高、主根长、侧根数和叶片数与野生型相比均无明显差异。在200mmol L-1NaCl胁迫下，野生型亚麻株高较低，叶片发黄，严重干枯，萎蔫程度较转基因株系严重，这表明过表达LuWRI1a基因亚麻的耐盐能力比野生型亚麻更强。PEG-6000胁迫处理后，野生型植株和转基因株系均未出现萎蔫，转基因株系叶片部分失绿，表型无明显差异(图3)。野生型植株的根系生长受到了抑制，侧根数目明显减少，转基因植株的平均侧根数与野生型植株相比差异显著(图4)，分别提高了36.36％、30.91％和23.63％。平均根长分别提高了9.46％，15.44％和8.63％，平均叶片数分别提高了18.07％、31.73％和9.64％；干旱胁迫处理两周后，转基因植株与对照相比无显著差异，平均主根长分别提高了3.08倍、5.17倍和负0.23倍，平均侧根数分别提高了25.9％，22.29％和22.89％，平均叶片数分别提高了5.5倍，6.88倍和4.59倍。转基因植株在盐胁迫和干旱胁迫处理后，相对株高、主根长度、侧根数目及叶片数均升高，且在盐胁迫处理后，转基因植株各指标均明显高于对照，表明过表达LuWRI1a的转基因株系对盐胁迫的耐受性更高。
此外，每组不同处理的材料随机挑选5株亚麻，剪取根部组织和地上组织，每个株系取3个重复。液氮速冻后于-80℃冰箱储存。
实施例3转基因株系与野生型株系在氧化歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)的含量中的对比
氧化歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)的含量是植物在抗逆性方面的重要生理指标。正常条件下，转基因植株的APX活性比野生型植株的高，CAT活性、SOD活性和MDA含量并无明显差异。盐胁迫和干旱胁迫后，三种抗氧化酶的活性都显著高于对照，而MDA含量都低于对照。
盐胁迫处理后，野生型亚麻的SOD活性为109.73U·g-1，转基因亚麻的SOD酶活性分别为134.90、138.83和129.11U·g-1，比野生型提高了0.23倍、0.27倍和0.18倍(图5A)；野生型亚麻的CAT酶活性为36.80U·g-1，转基因亚麻的CAT酶活性分别为45.30、53.38和42.32U·g-1，比野生型提高了0.23倍、0.45倍和0.15倍(图5B)；野生型亚麻的APX酶活性为29.07U·g-1，转基因亚麻的APX酶活性分别为41.85、41.91和40.67U·g-1，比野生型提高了0.44倍、0.44倍和0.40倍(图5C)；野生型亚麻的MDA含量为75.50nmol·g-1，转基因亚麻的MDA含量分别为66.33、60.79和63.0nmol·g-1，比野生型亚麻降低了0.12倍、0.19倍和0.17倍(图5D)。
干旱胁迫处理后，野生型亚麻的SOD活性为109.71U·g-1，转基因亚麻的SOD酶活性分别为134.40、146.28和122.86U·g-1，比野生型提高了0.22倍、0.33倍和0.12倍(图5A)；野生型亚麻的CAT酶活性为36.22U·g-1，转基因亚麻的CAT酶活性分别为39.76、37.81和43.53U·g-1，比野生型提高了0.10倍、0.04倍和0.20倍(图5B)；野生型亚麻的APX酶活性为32.24U·g-1，转基因亚麻的APX酶活性分别为41.96、42.59和38.59U·g-1，比野生型提高了0.30倍、0.32倍和0.20倍(图5C)；野生型亚麻的MDA含量为71.85nmol·g-1，转基因亚麻的MDA含量分别为39.15、40.18和40.38nmol·g-1，比野生型亚麻降低0.46倍、0.44倍和0.44倍(图5D)。结果表明，过表达LuWRI1a能够增强在盐胁迫和干旱胁迫下抗氧化酶的活性并且减轻对亚麻细胞膜造成的氧化损伤。
实施例4逆境胁迫响应基因在转基因亚麻中的表达分析
为了研究LuWRI1a在逆境胁迫反应中可能的分子机制，分析了4个非生物胁迫响应基因LuAREB2(ABA-responsive element binding)、LuDREB2(dehydration-responsiveelement binding)、LuLEA(late embryogenesis-abundan t protein)和LuNCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)在野生型亚麻和转基因亚麻中的表达水平。
引物合成
根据NCBI上公布的亚麻陇亚10号基因组序列，利用Primer5.0设计荧光定量引物。以甘油醛-3-磷酸(GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydroge nase)为内参基因。所有引物由上海生物化工公司合成(表1)。
表1实时荧光定量PCR引物
通过实时荧光定量(qRT-PCR)分析表明，在盐胁迫和干旱胁迫的处理下，逆境胁迫相关基因均上调表达(图6)。LuAREB2在正常和逆境胁迫条件下，转基因植株中的表达量均显著高于野生型(图6A)。正常条件下，LuDREB2在野生型和转基因植株中的表达量没有明显差异，在盐胁迫和干旱胁迫处理后，基因表达量较对照显著上调(图6B)。LuLEA5在正常条件和盐胁迫处理后，转基因植株中的表达量均显著高于野生型，但在干旱胁迫处理后，株系间差异不显著(图6C)。正常条件下，LuNCED较对照无明显差异，在盐胁迫和干旱胁迫处理后，基因的表达量较对照略上调，但株系间差异不显著(图6D)。结果表明，在逆境胁迫下，尤其是在盐胁迫下，转基因植株中LuWRI1a通过上调LuAREB2、LuDREB2、LuLEA和LuNCED等逆境胁迫响应基因的表达，来参与调控亚麻转基因植株的耐逆性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.亚麻基因LuWRI1a在提高亚麻耐盐和耐旱性能中的应用，其特征在于，所述亚麻基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述亚麻基因LuWRI1a编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，亚麻基因LuWRI1a上调LuAREB2、LuDREB2、 LuLEA和LuNCED基因的表达，调控亚麻转基因植株的耐逆性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，亚麻基因LuWRI1a增强亚麻在盐胁迫和干旱胁迫下抗氧化酶的活性并且减轻对亚麻细胞膜造成的氧化损伤。
4.亚麻基因LuWRI1a在构建耐盐胁迫和耐干旱胁迫的亚麻株系和分子育种中的应用，其特征在于，所述亚麻基因LuWRI1a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述亚麻基因LuWRI1a编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，亚麻株系的构建过程包括：以所述亚麻基因LuWRI1a构建重组载体pE101-LuWRI1a，将重组载体pE101-LuWRI1a转化至农杆菌中，得到重组菌株，最后以重组菌株侵染亚麻，获得耐盐胁迫和耐干旱胁迫的亚麻株系。
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