CN116640859B - 奶山羊trib3基因单核苷酸多态性标记在乳成分性状早期选择中的应用 - Google Patents
奶山羊trib3基因单核苷酸多态性标记在乳成分性状早期选择中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性标记在乳成分性状早期选择中的应用。以奶山羊全基因组DNA为模板，利用PCR扩增奶山羊TRIB3基因部分片段，通过测序技术分析TRIB3基因突变位点g.59957364G>A的基因型。根据其不同基因型与乳成分性状关联分析结果，该突变位点具有与奶山羊乳成分性状显著关联的单核苷酸多态性标记，可用于快速建立羊乳品质优良的奶山羊遗传资源种群，有利于对乳成分性状优势奶山羊群体进行早期选择及加快良种选育进程。
Description
技术领域
本发明属于畜禽品种改良与分子育种领域，涉及TRIB3基因单核苷酸多态性的分型检测及其在奶山羊所分泌羊乳的乳成分性状早期选择中的应用。
背景技术
分子遗传学的进步促进了DNA标记在动物遗传育种中的发展和应用。标记辅助选择技术有效解决了传统育种方法中许多经济性状难以测量、遗传力较低的问题，在早期进行选育时具有明显的优势。单核苷酸多态性(SNP)为基因组DNA序列中单个核苷酸(A/T/C/G)的替换引起的多态性。SNP是所有生物体中最丰富的遗传变异，包含了个体间90％以上的差异，因此，SNPs是种群研究和基因组定位的最佳遗传变异资源，利用SNP标记进行基因组选择是一种强有力的遗传选择工具。与其他DNA标记相比，SNPs具有稳定的遗传性、更适合作为长期选择标记；与其他类型的变异相比，SNPs普遍存在并可以在在感兴趣的位点附近提供更多的潜在标记。此外，大多数SNP标记位于DNA的编码区，可以直接影响编码蛋白质的功能。
Tribbles(TRIBs)基因家族是在果蝇体内最早发现的一类编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样蛋白的基因，是诱导细胞凋亡、抑制有丝分裂的核基因。TRIB3基因位于奶山羊13号染色体，全长11440bp，具有4个外显子和3个内含子。通过蛋白质序列分析表明，TRIB3蛋白具有中心激酶样结构域、N-末端和C-末端蛋白结合结构域，在功能上被认定为是一种调节蛋白，其通过泛素化或蛋白酶体降解从而调节其他蛋白的活性。TRIB3基因存在广泛，在多种生物的不同器官与组织中皆有分布，在哺乳动物中表达水平高且在不同组织器官中具有显著差异。TRIB3蛋白作用于细胞内的代谢过程大多通过激烈抑制Akt磷酸化活性、影响胰岛素途径、抑制脂代谢及糖代谢等主要功能机制。
乳脂的合成和分泌过程主要分为脂肪酸的从头合成、甘油三酯的合成、脂滴的形成及脂滴包装后的分泌。酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成过程中的限速酶，而TRIB3蛋白可以加速ACC的泛素化，从而减少细胞内游离脂肪酸的合成，有研究表明TRIB3蛋白广泛表达于多种哺乳动物乳腺组织细胞中，并在乳腺合成乳脂方面发挥重要作用。然而，仅通过TRIB3基因本身的生物学功能无法预测羊乳品质，难以实现优良个体的早期选择。并且羊乳的主要成分不仅包括乳脂，还包括乳蛋白、非脂乳固形物、乳糖等，其品质并不是仅决定于所含乳脂的水平，单纯过高的乳脂水平从风味、加工难度以及食用健康安全角度看并不完全适应现有的乳品质改良和发展目标。目前，国内外尚未见报道奶山羊TRIB3基因的多态性与奶山羊乳成分性状的遗传相关性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性标记在乳成分性状早期选择中的应用，通过快速建立羊乳品质优良的奶山羊遗传资源种群，有利于对乳成分性状优势奶山羊群体进行早期选择及加快良种选育进程。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：
以待测奶山羊个体的离体生物材料所含DNA(例如萨能奶山羊、西农萨能奶山羊个体基因组DNA)为模板，利用PCR扩增包含TRIB3基因单核苷酸多态性位点的部分片段，然后鉴定该单核苷酸多态性位点的基因型(例如将扩增产物测序分析，根据测序结果进行位点基因分型)，所述单核苷酸多态性位点为山羊TRIB3基因第59957364位突变位点NC_030820.1:g.59957364G>A(即所述单核苷酸多态性位点位于chr13:59957364，在奶山羊群体中存在G-A突变)。
优选的，所述PCR的引物对为：
上游引物：5’-CCGAGTAGCCTGACTTCA-3’
下游引物：5’-GTGATGCTCATGGAGATGG-3’。
优选的，所述PCR采用的反应程序为：95.0℃预变性4min；94.0℃变性30s，60.0℃退火30s，进行34个循环；72.0℃延伸30～60s；72.0℃终延伸10min。
上述检测奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性的方法在奶山羊分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，所述山羊TRIB3基因第59957364位突变位点NC_030820.1:g.59957364G>A的AA基因型为提高奶山羊乳成分性状的DNA标记。
优选的，在萨能奶山羊或西农萨能奶山羊中，具有AA基因型的个体在乳蛋白率(即乳蛋白水平)这个乳成分性状上显著优于具有GG基因型、AG基因型的个体。
一种检测奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括用于对奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性位点进行扩增的试剂，所述试剂包括上述PCR的引物对、对扩增产物分离纯化及测序的其他试剂。
本发明的有益效果体现于：
本发明根据对奶山羊TRIB3基因的SNP位点(g.59957364G>A位点)与奶山羊乳成分性状进行关联分析的结果，通过检测奶山羊TRIB3基因SNP位点(g.59957364G>A位点)存在的作为提高奶山羊乳成分性状(例如乳蛋白率)的分子标记(SNP标记)，可在乳成分性状早期选择中应用，以快速建立优良产奶性状的奶山羊遗传资源群体。
进一步的，本发明以奶山羊基因组DNA为模板，通过PCR的引物对扩增和直接测序，可以简便、准确地检测奶山羊TRIB3基因编码区第2外显子SNP位点(g.59957364G>A位点)在奶山羊(例如西农萨能奶山羊)群体中的不同基因型。
附图说明
图1为西农萨能奶山羊TRIB3基因第2外显子附近区域PCR产物电泳图(含g.59957364G>A位点)。
图2为西农萨能奶山羊TRIB3基因片段(含g.59957364G>A位点)扩增产物测序(反向序列)及基因型鉴定图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
根据前期对处于泌乳高峰期具有极端高和极端低乳脂含量的不同奶山羊个体进行转录组测序的结果，发现TRIB3基因在极端高、极端低乳脂组的表达差异显著。因此，筛选TRIB3基因在涉及多个基因的大群关联分析中进行了验证。在此基础上，本发明利用PCR扩增及直接测序方法对山羊TRIB3基因突变位点g.59957364G>A(参考序列：GenBank登录号NC_030820.1)在奶山羊群体中可能产生的多态性进行检测，并将其不同基因型与奶山羊乳成分性状进行关联分析，揭示其上具备可以用作奶山羊分子育种中辅助选择的分子标记，具体说明如下。
1.试验动物
本试验以西北农林科技大学萨能羊原种场和陕西省千阳县种羊场的共计213只西农萨能奶山羊为检测对象，具体选用足月正常分娩、健康的泌乳母羊进行血样和乳样的采集以及乳成分性状的测定，其中血样采集时间为：2021年6月(西北农林科技大学萨能羊原种场)和2021年7月(陕西省千阳县种羊场)。
2.实验药品与试剂
2.1.血样DNA提取使用血液基因组柱式小量提取试剂盒(0.1-1mL)，购自康为世纪生物科技有限公司。
2.2.琼脂糖凝胶电泳所需试剂：①Plus DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；②10×GelRed核酸凝胶染色剂，购自笛医生物科技有限公司；③LoadingBuffer，购自北京擎科生物科技有限公司；④琼脂糖，购自北京基华生物技术服务有限公司。
2.3.PCR扩增所需试剂：PrimeSTAR Max DNAPolymerase，购自TAKARA公司。
2.4.本试验中所有试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)，用水均使用去离子超净水。高温灭菌条件为120℃、30min。
3.合成TRIB3基因SNP位点的PCR引物
根据NCBI公布的山羊(capra hircus)物种序列设计可扩增TRIB3基因突变位点g.59957364G>A的引物，并由杨凌天润奥科生物科技有限公司合成，具体序列如下：
上游引物：5’-CCGAGTAGCCTGACTTCA-3’
下游引物：5’-GTGATGCTCATGGAGATGG-3’。
以上述引物进行PCR扩增，其扩增产物包含TRIB3基因突变位点g.59957364G>A，可直接送公司测序。
4.表型值的获取与数据统计
4.1.西农萨能奶山羊乳样采集及乳成分测定方法
在2021至2022年间，每月测定日采集一次乳样，早6时、晚6时各采集一次，两次乳样等比例混合，加入防腐剂后摇匀，4℃低温保存带回实验室，用于乳成分的测定。
将低温保存的奶样置于40℃水浴中预热15min后，于50mL离心管中采用乳成分分析仪(FOSSMilkoScanTMFT-120，美国)测定乳成分。测定乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、总脂固形物共4个指标。剔除表型数据3倍标准差外的极端值，保存供后续关联分析使用。
5.PCR扩增奶山羊TRIB3基因目的片段
5.1.西农萨能奶山羊血样采集
在2021年，从西北农林科技大学萨能羊原种场和陕西省千阳县种羊场对213只西农萨能奶山羊进行血样采集。每只静脉取血5mL于抗凝采血管(EDTA)，迅速带回实验室，-80℃冻存。
5.2.血样基因组DNA的提取及检测
血样DNA的提取方法，参照康为世纪生物科技有限公司血液基因组柱式小量提取试剂盒(0.1-1mL)说明书，提取完成的样品于-80℃保存。DNA样品使用紫外分光光度计(NanoDrop1000，Thermo)检测浓度(μg/mL)和260nm和280nm处的吸光值；使用1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性。
5.3.奶山羊个体TRIB3基因突变位点g.59957364G>A扩增及基因分型
PCR扩增具体反应体系见表1，反应程序见表2。PCR产物的浓度以及特异性利用1％的琼脂糖凝胶电泳(120V、30min)检测(图1)，结果显示PCR产物符合质量要求，遂送往杨凌天润奥科生物科技有限公司进行测序。
利用Chromas软件分析送回的测序结果(图2)，可直接进行基因分型，获得TRIB3基因突变位点g.59957364G>A的基因型数据。
表1.PCR反应体系(20μL)
表2.PCR反应程序
6.奶山羊群体中TRIB3基因突变位点g.59957364G>A的遗传多态性指标
使用Microsoft Excel 2016统计TRIB3基因突变位点g.59957364G>A的基因频率、基因型频率、基因纯合度(homozygosity,Ho)、基因杂合度(heterozygosity,He)、有效等位基因数(number of effective alleles,Ne)和多态信息含量(polymorphism informationcontent,PIC)；并且利用卡方适应性检验测定Hardy-Weinberg平衡状态。具体信息如表3所示：
表3.西农萨能奶山羊TRIB3基因g.59957364G>A位点的遗传多态性指标
由表3结果可见，TRIB3基因突变位点g.59957364G>A为一个SNP位点。
7.奶山羊群体中TRIB3基因SNP位点(g.59957364G>A位点)的遗传效应关联分析
采用SPSS.26软件进行TRIB3基因SNP位点(g.59957364G>A位点)与奶山羊乳成分性状关联分析。
基因型数据来自PCR扩增后直接测序获得的基因型；
表型数据：奶山羊乳成分性状数据包括乳蛋白率(％)、乳脂率(％)、乳糖率(％)、总脂固形物(％)；产奶量。
具体分析过程中，奶山羊乳成分性状表型数据结果(表4)以平均值±标准差来显示，分析模型如公式1所示：
式中：ymnijl为泌乳奶山羊母羊第m个出生年份、第n个出生季节、第i个产羔胎次、第j个场、第l个SNP位点的的乳成分或产奶量观测值；μ为群体均值；为年份效应(m＝1～3)；δn为季节效应(n＝1～2)；θi为胎次效应(i＝1～5)；ωj为场效应(j＝1～2)；φl为SNP效应(l＝1～3)；emnijl为随机残差。
表4.西农萨能奶山羊TRIB3基因突变位点g.59957364G>A的多态性与乳成分性状的关联分析
注：表中数据进行同列比较，标有不同小写字母者为差异显著(P<0.05)，标有相同字母者为差异不显著(P>0.05)；P-value表示SNP与乳成分性状关联程度，其中**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)
由表4可知，TRIB3基因SNP位点(g.59957364G>A位点)与乳蛋白率关联极显著(P＜0.01)，且AA基因型个体乳蛋白率为最高。而且AA基因型西农萨能奶山羊个体的乳成分性状明显优于AG、GG基因型个体；奶山羊TRIB3基因g.59957364G>A位点突变对萨能奶山羊乳成分性状有较大的遗传效应(乳脂率、乳糖率、总脂固形物的数据也是AA基因型个体更佳)，AA基因型可作分子标记辅助选择的候选标记，为选育优良奶山羊提供科学资料。
其他实验结果表明，TRIB3基因SNP位点(g.59957364G>A位点)与产奶量不显著相关。
总之，TRIB3基因突变位点g.59957364G>A不同基因型中存在可用于开展乳成分性状优势奶山羊群体早期选择及分子育种的SNP标记，即本发明提供了一种PCR-直接测序法检测山羊TRIB3基因SNP标记的方法，可用于快速建立羊乳品质优良的奶山羊遗传资源种群，从而加快良种选育进程。
Claims (4)
1.山羊TRIB3基因第59957364位突变位点NC_030820.1:g.59957364G>A在奶山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述山羊TRIB3基因第59957364位突变位点NC_030820.1:g.59957364G>A的AA基因型为提高奶山羊乳成分性状的DNA标记，所述奶山羊为西农萨能奶山羊，所述乳成分性状为乳蛋白率、乳脂率。
2.一种检测奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性的方法在奶山羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测奶山羊TRIB3基因单核苷酸多态性的方法包括以下步骤：
以奶山羊离体生物材料所含DNA为模板，利用PCR扩增包含TRIB3基因单核苷酸多态性位点的部分片段，然后鉴定该单核苷酸多态性位点的基因型，所述单核苷酸多态性位点为山羊TRIB3基因第59957364位突变位点NC_030820.1:g.59957364G>A；
所述山羊TRIB3基因第59957364位突变位点NC_030820.1:g.59957364G>A的AA基因型为提高奶山羊乳成分性状的DNA标记，所述奶山羊为西农萨能奶山羊，所述乳成分性状为乳蛋白率、乳脂率。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR的引物对为：
上游引物：5’-CCGAGTAGCCTGACTTCA-3’
下游引物：5’-GTGATGCTCATGGAGATGG-3’。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR的反应程序为：95.0℃预变性4min；94.0℃变性30s，60.0℃退火30s，进行34个循环；72.0℃延伸30～60s；72.0℃终延伸10min。
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