CN116640845A

CN116640845A - 一种快速分析ctc生物标志物的引物组及其应用

Info

Publication number: CN116640845A
Application number: CN202211498607.8A
Authority: CN
Inventors: 樊嘉; 杨欣荣; 周俭; 郭玮; 孙云帆; 周琰
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Shanghai Puen Haihui Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2022-11-28
Filing date: 2022-11-28
Publication date: 2023-08-25

Abstract

本发明公开了一种新颖、快速的基于LAMP的核酸检测方法，用于快速分析CTC生物标志物，包括上皮细胞特异性标志物CK19和EpCAM，以及CTC生物标志物CD133和CD90，并在45min内对CTC进行鉴定，以提供现场生物标志物信息，以降低肝切除术后复发的风险。通过试验表明，在CD133和CD90的检测反应中，检测限可达到10个拷贝，而CK19和EpCAM的检测限在10‑20个拷贝之间，检测结果显示采用该方法检测灵敏度高。

Description

一种快速分析CTC生物标志物的引物组及其应用

技术领域

本发明属于CTC生物标志物生物检测技术领域，涉及一种快速分析CTC生物标志物的引物组及其应用。

背景技术

近年来肝细胞肝癌的发病率和死亡率迅速上升，跃居恶性肿瘤第五位。虽然治疗技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，约50％的患者在术后5年发生肿瘤复发或远处转移。因此，预测肝癌患者术后复发以便早期进行必要的干预是进一步改善肝癌预后的关键。临床迫切需要一种有效、可靠的检测技术解决疾病早期诊断、高风险复发的筛查、抗肿瘤治疗的效果评价、预防并控制远处转移等HCC治疗中所面临的难题。

循环肿瘤细胞(CTC，circulating tumor cell)是指有原发肿瘤或肿瘤转移灶释放入外周血的肿瘤细胞，在健康人体内极为罕见。根据文献报道，循环肿瘤细胞在恶性肿瘤形成早期即可释放入血。循环肿瘤细胞由原发灶释放进入血液循环，是恶性肿瘤复发和转移的关键步骤。因此，CTC检测被认为是一种新的诊断技术，一项新的预后评价工具、一项有效的恶性肿瘤治疗应答的预测指标，在临床应用中被寄予极高期望。CTC的检测有助于早期肿瘤患者的诊断、术后患者监测肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略。

一般而言，CTC检测的方法大致可以分为细胞计数技术和基于核酸检测的技术两类，通常都包括富集和检测两个步骤。由于CTC在外周血中数量稀少，通过富集细胞来提高检测的敏感性很有必要。

常用的CTC检测技术有流式细胞术(flow cytometry，FCM)和逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)。RT-PCR技术因其操作简单、可标记物选择多、特异性好等特点而应用较多。

目前商业化CTC富集和检测相结合的技术主要有Cell Search、Epithelialimmunospot(EPISPOT)、CTC-chip等。其中，Cell Search是目前美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)唯一批准检测CTC的方法。但是，Cell Search检测价格昂贵、标本用量大(7.5ml)，选用EpCAM作为标志物筛选(阳选法)CTC会对细胞表面不表达EpCAM的CTC造成漏检，且存在CTC数量少时检测重复性差、结果判断主观性强等缺点。EPISPOT是一种基于酶联免疫吸附测定原理的免疫学分析方法，基于阳选法的富集原理和Cell Search存在类似的缺点。CTC-chip作为一种全新的芯片技术，具有灵敏度高、特异性好的优点，但需要特殊的检测设备，且检测成本很高，不适合高通量检测。因此，临床上迫切需要一种特异性高、灵敏度高；通量高；成本低、高效且操作简单的CTC富集和检测技术。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明建立了一种新颖、快速的基于LAMP的核酸检测方法，用于快速分析CTC生物标志物，包括上皮细胞特异性标志物CK19和EpCAM，以及CTC生物标志物CD133和CD90，并在45min内对CTC进行鉴定，以提供现场生物标志物信息，以降低肝切除术后复发的风险。

本发明第一方面，提供了一种快速分析CTC生物标志物的引物组，所述引物组包括上皮细胞特异性标志物CK19和EpCAM，以及CTC生物标志物CD133和CD90的LAMP引物，

所述标志物CK19的引物序列如SEQ ID NO.1-6所示，

所述标志物EpCAM的引物序列如SEQ ID NO.7-12所示，

所述标志物CD133的引物序列如SEQ ID NO.13-18所示，

所述标志物CD90的引物序列如SEQ ID NO.19-23所示。

本发明第二方面，提供了一种快速分析CTC生物标志物的联合检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含至少一次用量的所述的引物组。具体包含：

1)外周血循环肿瘤细胞富集试剂；优选地，所述外周血循环肿瘤细胞富集试剂采用RosetteSep Human CD45 Depletion Cocktail(Stemcell Canada)试剂；

2)RNA抽提试剂；

3)RNA逆转录试剂；

4)标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的特异性-LAMP引物对，及其特异性引物对(内引物和外引物)；

5)RT-LAMP反应体系试剂。

所述联合试剂盒适用于(不限于)冻干芯Lamp试剂的包装方式。

具体地，冻干芯保存方式：保护剂配方：以25微升反应体系计算的终浓度为10％海藻糖+5％甘露醇。冻干程序：-60℃预冷冻1小时，之后-50℃5小时，-40℃3小时，-30℃3小时，0℃3小时，10℃2小时，20℃2小时。冻干制品最终为粉末状。

具体地，所述标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的荧光染料结合其特异性LAMP-引物对(内引物和外引物)；将引物配制成含有1.6M的内引物(FIP和BIP)、0.2M的外部引物(F3和B3)和0.6M的环引物(LF和LB)的工作液。

本发明第三方面，提供了第一方面所述的引物组或第二方面所述的联合检测试剂盒在快速分析CTC生物标志物中的应用。

具体地，采用联合检查试剂盒同时检测CTC表面四种干性细胞标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19；

分别计算四种干性细胞标志物的相对表达量：使用2^-ΔΔCt计算法，以健康组的平均ΔCt[ΔCt＝Ct(target)-Ct(β-actin)]作为校准值，ΔΔCt＝[Ct(target样本)-Ct(β-actin样本)-ΔCt健康组均值]，其中所述Ct：扩增循环数；所述ΔCT：扩增循环数差值；所述target：目的基因；所述β-actin内参基因；

分别将四种干性细胞标志物相的对表达量结果代入计算公式：logit(p＝HCC)＝-2.15+0.74×EpCAM+0.65×CD133+0.34×CD90+0.99×CK19，得出个体多干细胞标志物联合预测值；预测值按0.57作为诊断切点。

本发明相对于现有技术而言，目的在于通过富集循环中的微量肿瘤细胞，而后通过微量核酸提取及合成技术提取富集肿瘤细胞的RNA并进行逆转录，最后通过高灵敏的RT-LAMP技术，检测肿瘤细胞表面多种干细胞标志物完成对肿瘤细胞的检测。本发明的操作步骤简单，分离效果基本满足CTC富集要求。本发明采用荧光染料结合RT-LAMP技术检测CTC具有高特异性、高灵敏度、良好的重复性等特点，且可以根据需要设计检测四种CTC表面标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19的LAMP特异性引物，进行多基因标志物联合检测，满足临床对肝癌诊治需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1本发明方法的检测流程示意图。

图2本发明LAMP引物可行性和特异性测试结果，a-d：分别为CK19、EpCAM、CD133和CD90的示例图。蓝色、绿色、黄色、粉红色和黑色的线条分别代表CK19、EPCAM、CD133、CD90和阴性对照的模板。

图3本发明LAMP检测方法中Mg²⁺的优化结果，a-d：分别在CK19、EpCAM、CD133和CD90的LAMP反应中进行Mg²⁺优化。蓝色、绿色、黄色、粉色和黑色线条分别代表4、6、8、10和12mM的Mg²⁺浓度。○代表阳性试验，◇代表阴性对照。

图4本发明LAMP检测方法中甜菜碱的优化结果，a-d：分别在CK19、EpCAM、CD133和CD90的LAMP反应中优化甜菜碱；蓝色、绿色、黄色、粉色和黑色线条分别代表0、0.4、0.8、1.2和1.6M的甜菜碱浓度。○代表阳性试验，◇代表阴性对照。

图5本发明灵敏度极限测试的LAMP结果。a-d：分别针对CK19、EpCAM、CD133和CD90验证引物的灵敏度极限测试。黑色、粉色、黄色、绿色和蓝色线分别代表100、50、20、10和5个拷贝数的模板。在CD133和CD90的检测反应中，检测反应灵敏限可达10个拷贝，以及CK19和EpCAM在LAMP反应中的拷贝数在10-20个之间。

图6实施例中肝切除术前(a-d)和(e-h)后临床标本RT-LAMP结果，其中线代表10名HCC患者。

图7实施例中接受肝切除术前(a-d)和后(e-h)的临床标本qRT-PCR结果，其中线代表10名HCC患者。

图8实施例中来自HCC患者的4个CTC特异性生物标志物的RT-LAMP阳性结果。蓝色、绿色、黄色和粉色线分别代表CK19、EpCAM、CD133和CD90 LAMP检测。

图9实施例中IMS对捕获的CTC的结果。4张图片分别显示了由CK19、EpCAM、CD133和CD90珠捕获的CTC。比例尺：10μm。

图10评估构建的CTC诊断模式的诊断和鉴别结果。

图11实施例中200例肝细胞癌患者中使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标的建模组结果示意图。

图12实施例中131例早期肝细胞癌患者使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标的建模组结果示意图。

图13实施例中195例肝细胞癌患者使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标的验证组结果示意图。

图14实施例中94例早期肝细胞癌患者使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标的验证组结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

一种循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒，由以下试剂组成：

1.外周血循环肿瘤细胞富集试剂：RosetteSep Human CD45Depletion Cocktail(Stemcell，Canada)，5*2ml，Cat.No.15162；

2.Mini Kit(50)(Qiagen，Germany)，Cat.No.74104；

3.Reverse Transcription Kit(Qiagen，Germany)，Cat.No.205313；

4.qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen，USA)，Cat.No.C11730-025；

5、使用Primer Explorer V5软件分别针对4个CTC生物标志物的特异性基因设计LAMP引物：

CK19:KRT19 gene(GenBank accession no.NM_002276.5)

EpCAM:GA-733-2gene(GenBank accession no.NM_002354.2)

CD133:PROM1 gene(GenBank accession no.XM_011513897.3)

CD90:THY1 gene(GenBank accession no.NM_001311162.2)

人工设计正向环引物(LF)和反向环引物(LB)。

表1 4个CTC生物标志物LAMP引物序列

将引物配制成含有1.6M的内引物(FIP和BIP)、0.2M的外部引物(F3和B3)和0.6M的环引物(LF和LB)的工作液，储存在-20℃中。

使用上述循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒检测循环肿瘤细胞，评价所建方法的CTC富集效率，具体检测步骤见自主专利(专利号：201410081508.9)

实施例2 RT-LAMP检测体系的性能验证

一种循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒，组成包括光染料SYBRGreen I、分别针对4个循环肿瘤细胞生物标志物的特异性基因设计LAMP引物以及(不限于)冻干芯LAMP试剂包装。使用上述循环肿瘤细胞检测试剂盒检测循环肿瘤细胞，评估批内和批件不精密度。

(1)目标片段的准备

为了评价LAMP检测的敏感性，构建了包含CK19、EpCAM、CD133和CD90四个生物标志物的靶基因序列的重组质粒：(1)通过PCR合成靶序列(设计了4对PCR引物，如表2所示)；(2)用pMD19-T载体克隆试剂盒将PCR产物连接到pMD19-T载体上；(3)连接产物被转化为感受态细胞并培养过夜；(4)对重组质粒进行测序，并与Ge nBank中的序列进行比对，验证克隆的基因序列的正确性；(5)测定提取的质粒的浓度，并将其-20℃保存。

表2PCR引物序列

(2)关于LAMP检测方法的可行性和特异性的评估

为了确定LAMP反应的可行性和特异性，将4个引物分别与4个模板和无菌水(阴性对照)交叉反应。作为平行对照，每个实验重复三次。LAMP反应体系如表3所示，反应温度为63℃。

表3LAMP反应体系

LAMP方法的灵敏度极高，大约是PCR方法的10到1000倍，并且LAMP产生了大量的扩增产物。因此，一旦LAMP扩增产物暴露在外界环境中，就会导致实验环境的气溶胶污染，可能导致反应的假阳性结果。通过预先加入荧光染料，借助实时荧光检测监测实时荧光变化，我们可以清晰直观地了解核酸扩增的情况，而不需要获取琼脂糖凝胶电泳的扩增产物，降低了被污染的风险。SYBR Green I是一种有着绿色激发波长的染料，能够与所有双链DNA的双螺旋小沟槽区域结合，在那里它的荧光会大大增强。建立LAMP体系的第一步是验证引物的可行性和特异性。引物的特异性是核酸诊断的关键。在相关的癌症诊断中，没有假阳性结果和与其他非靶基因的交叉反应，证明了我们建立的LAMP系统具有很高的可行性和特异性，详见图2。

(3)关于LAMP检测方法的的优化

Mg²⁺是影响核酸体外扩增的重要因素。CK19Ep、CAM、CD133、和CD90的LAMP反应中(详见图3)，Mg²⁺的最适最终浓度为8mM。在LAMP反应中，Mg²⁺是Bst DNA聚合酶的活性因子，能够增强Bst DNA聚合酶的活性并促进LAMP反应的进行。

然而，Mg²⁺也能与LAMP反应中的其他物质反应，游离Mg²⁺与螯合剂(如乙二胺四乙酸)和磷酸(由三磷酸脱氧核苷提供)结合，这会降低参与实际扩增过程的Mg²⁺浓度，降低BstDNA聚合酶的活性。因此，应适当增加Mg²⁺，过多则会导致假阴性结果增多从而影响LAMP反应的特异性。

在CK19、EpCAM、CD133和CD90的LAMP反应中(详见图4)，分别在30、32、37、37min出现阳性结果。在大多数LAMP反应中，如果添加足够的模板，阳性结果出现的时间在30分钟内。于是为了提高反应效率，在反应中加入适量的甜菜碱。甜菜碱浓度梯度试验发现，甜菜碱在CK19、EpCAM、CD133和CD90的LAMP反应中的最适最终浓度为0.8M。当甜菜碱最终浓度超过1.2M时，LAMP反应的特异性会降低，导致更多的假阳性结果，有时会因为甜菜碱过多而根本无法进行LAMP反应。

甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)是LAMP反应的主要试剂。它的结构复杂，作用机制不是很清楚。根据我们的研究结果推测其作用机理如下：(1)促进模板的DNA聚合。(2)在CK19和CD90LAMP反应中，阳性结果的出现时间比EpCAM)和CD133提前。参照GC值(GC值：CK1962.4％，EpCAM43％，CD133 42.9％，CD90 57.2％)，推测甜菜碱能促进高GC值基因的扩增反应。然而，值得注意的是，添加过多甜菜碱会导致更多的假阳性结果，影响扩增。此外，以往的研究表明甜菜碱可以显著提高LAMP的扩增效率，因为它可以减少碱基堆积，防止二级结构的形成，并稳定DNA，从而促进DNA扩增。

为了获得最高的扩增效率，我们设定了Mg²⁺和甜菜碱的五个最终浓度。当甜菜碱的最终浓度被设置为0.8M时，Mg²⁺的最终浓度被设置为4mM、6mM、8mM、10mM和12mM。相反，当甜菜碱的最终浓度被设置为0M、0.4M、0.8M、1.2M和1.6M，而Mg²⁺的最终浓度被设置为8mM。确保其他因素相同，每个实验在63℃下重复三次。结论：在CK19、EpCAM、CD133、CD90的LAMP反应中，Mg²⁺的最终最适浓度为8mM，甜菜碱的最终最适浓度为0.8M。

(4)LAMP检测方法的灵敏度评价

用分光光度法测定4种不同质粒的浓度以用来计算拷贝数。4个重组质粒的浓度被调整到1,000个拷贝/5μL并进行梯度稀释，得到500、100、50、10和5个拷贝/5μL的重组质粒作为模板，以验证反应的敏感性。作为平行对照，每个实验重复三次。

我们的结果表明，在CD133(图5中C)和CD90(图5中D)的检测反应中，检测限可达到10个拷贝，而CK19(图5中A)和EpCAM(图5中B)的检测限在10-20个拷贝之间。四种生物标志物的检测限均小于20个拷贝，能够满足临床要求。可见，本申请的10～20拷贝检测结果显示采用该方法检测非常灵敏。

实施例3HCC患者临床标本中，RT-LAMP与qPCR检测结果一致性比较

在使用已建立的LAMP系统对临床标本进行分析的过程中，从10名接受肝切除术前后的患者中收集了20份临床样本，以验证所建立的RT-LAMP系统(图6)。为了实现更准确的检测，我们分析了四个CTC特异的生物标志物(CK19，EpCAM，CD90和CD133)，并将结果与标准qRT-PCR(图7)的结果进行了比较。结果如表4所示。

表4来自HCC患者的CTC样生物标志物的表达谱

其中，数字代表CTC标志物检查结果呈阳性的患者数量。

RT-LAMP和qPCR在手术前后检测到相同的EpCAM和CK19的表达。LAMP组10名患者中有6名和qPCR组10名患者中有7名在手术前检测到CD90；LAMP组和qPCR组均有2名患者在手术后检测到CD90。CD133组中，LAMP组和qPCR组分别有10人中的6名患者术前有检测，而LAMP组和qPCR组均有2例术后检测。因此，RT-LAMP检测显示出与qPCR相似的灵敏度。

实施例4RT-LAMP在HCC患者临床应用中的评价

进一步研究了临床亚组中术前LAMP结局的预后意义。肝切除术前EpCAM+/CK19+/CD90+/CD133+LAMP结果阳性的患者通常有较高的转移风险(4/4VS 2/6)(表5)。此外，LAMP阳性的患者更有可能有卫星损伤(1/1VS 1/9)，血管侵犯(2/3VS 4/7)，更高的转移率(4/4VS 2/8)(表S3)。LAMP阳性结果与诊断分期一致。高水平的肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤包膜、卫星损伤和血管侵犯也是复发的不利预后变量。

表5HCC患者临床特征及与术前LAMP阳性检测的相关性

实施例5RT-LAMP与IMS在HCC患者临床应用中的性能比较(评估远处转移风险)

在临床诊断中，伴有CTC的HCC患者通常有较高的远处转移风险。RT-LAMP可以检测出CTC的生物标志物CK19、EpCAM、CD133和CD90。RT-LAMP检测四种CTC特异性生物标志物的阳性结果(图8)与IMS获得的CTC阳性结果一致，如图9所示。

这一结果表明，RT-LAMP检测CTC特异性标志物的方法可以替代IMS用于临床检测。此外，在这种情况下使用RT-LAMP比使用IMS更可行，与IMS相比，它可以更快地显示患者的转移情况，并提供了实时更广泛的应用前景。

实施例6

一种循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒，组成与实施例1相同。评估本发明的CTC诊断模式(EpCAM、CD133、CD90和CK19)在肝细胞肝癌、乙肝和/或肝硬化和健康人的诊断和鉴别诊断价值。

使用上述的循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒以建立的CTC诊断模式检测200例肝细胞肝癌(肝细胞肝癌组)、101例乙肝和/或肝硬化(肝炎/肝硬化组)和100例健康人(健康对照组)的外周血样本。肝细胞肝癌患者、肝炎/肝硬化患者和体检健康人中EpCAM、CD133、CD90、CK19 mRNA相对表达量，检测步骤具体见自主专利(专利号：201410081508.9)。mRNA相对表达量：使用2-ΔΔCt计算法，以健康组的平均ΔCt[ΔCt＝Ct(target)-Ct(β-actin)](Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因；)作为校准值，ΔΔCt＝[Ct(target样本)-Ct(β-actin样本)-ΔCt健康组均值]，(Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因)。

如图10所示，使用Logistic回归模型构建CTC诊断模式，评估其诊断和鉴别诊断价值。使用2-ΔΔCt计算法计算4个标志物的相对表达量(详见专利号：201410081508.9)，最后分别将4个标志物相对表达量的结果代入计算公式：logit(p＝HCC)＝-2.15+0.74×EpCAM+0.65×CD133+0.34×CD90+0.99×CK19，得出个体多干细胞标志物联合预测值。预测值按0.57作为诊断切点。健康对照组和肝炎/肝硬化组中CTC诊断模式mRNA表达量显著低于HCC组和早期HCC组，p<0.001。同时，使用CTC诊断模式诊断HCC，在肝细胞肝癌、乙肝和/或肝硬化和健康人中的诊断和鉴别诊断效能优于AFP。

如图11中A所示，在200例肝细胞癌患者中，分别使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标，CTC诊断模式的阳性率为73％，而AFP仅为57.5％，联合检测AFP和CTC诊断模式可提高阳性率为94％；在200例肝细胞癌患者中，根据AFP结果阳性和阴性分为两组，在AFP阴性亚组中CTC诊断模式仍有较高的肝细胞肝癌的阳性率(77.9％)

如表6和图11中A所示，使用ROC曲线评价CTC诊断模式和AFP诊断HCC的效能，其中CTC诊断模式曲线下面积0.878，灵敏度77.50％，特异性86.14％；联合检测AFP和CTC诊断模式可提高曲线下面积至0.899，灵敏度79.90％，特异性90.10％，显著优于单一标志物与AFP。

表6CTC诊断模式诊断HCC效果评价

如图12中A所示，在131例早期肝细胞癌患者(BCLC 0+A)中，分别使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标，CTC诊断模式的阳性率为71.76％，而AFP仅为53.44％，联合检测AFP和CTC诊断模式可提高阳性率为88.55％；在131例肝细胞癌患者中，根据AFP结果阳性和阴性分为两组，在AFP阴性亚组中CTC诊断模式仍有较高的肝细胞肝癌的阳性率(75.41％)。

实施例7

一种循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒，组成与实施例1相同。验证本发明设计的CTC诊断模型(EpCAM、CD133、CD90和CK19)捕获CTC和在肝细胞肝癌、乙肝和/或肝硬化和健康人的诊断和鉴别诊断价值。

使用上述的循环肿瘤细胞表面多种干细胞标志物联合检测试剂盒以EpCAM、CD133、CD90、CK19干性标志物建立CTC诊断模型捕获CTC，检测195例肝细胞肝癌(肝细胞肝癌组)、100例乙肝和/或肝硬化(肝炎/肝硬化组)和94例健康人(健康对照组)的外周血样本。肝细胞肝癌患者、肝炎/肝硬化患者和体检健康人中EpCAM、CD133、CD90、CK19 mRNA相对表达量，检测步骤具体见自主专利(专利号：201410081508.9)。mRNA相对表达量：使用2-ΔΔCt计算法，以健康组的平均ΔCt[ΔCt＝Ct(target)-Ct(β-actin)](Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因；)作为校准值，ΔΔCt＝[Ct(target样本)-Ct(β-actin样本)-ΔCt健康组均值]，(Ct：扩增循环数；ΔCT：扩增循环数差值；target：目的基因；β-actin内参基因；)。

如图13中A所示，在195例肝细胞癌患者中，分别使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标，CTC诊断模式的阳性率为82.0％，而AFP仅为55.9％，联合检测AFP和CTC诊断模式可提高阳性率为91.8％；在1050例肝细胞癌患者中，根据AFP结果阳性和阴性分为两组，在AFP阴性亚组中CTC诊断模式仍有较高的肝细胞肝癌的阳性率(81.4％)

如表7和图13中B所示，使用ROC曲线验证CTC诊断模式和AFP诊断HCC的效能，其中CTC诊断模式曲线下面积0.901，灵敏度80.51％，特异性96.00％；CTC联合AFP诊断模式曲线下面积提高至0.938，灵敏度83.59％，特异性98.00％；显著优于单一标志物EPCAM与AFP。

表7CTC诊断模式诊断HCC效果评价

如图14中A所示，在94例早期肝细胞癌患者(BCLC 0+A)中，分别使用CTC诊断模式和AFP作为诊断指标，CTC诊断模式的阳性率为85.10％，而AFP仅为46.80％，联合检测AFP和CTC诊断模式可提高阳性率为89.36％；在94例肝细胞癌患者中，根据AFP结果阳性和阴性分为两组，在AFP阴性亚组中CTC诊断模式仍有较高的肝细胞肝癌的阳性率(80.00％)。

综上所述，与IMS和qPCR相比，LAMP对临床诊断的敏感性与它们相似，而在操作上则比IMS和qPCR更快、更可行。LAMP是一种新的、快速的供选择的肿瘤趋势监测方法，可为临床医生提供诊断指导。IMS和qPCR相比，LAMP对临床诊断的敏感性与它们相似，而在操作上则比IMS和qPCR更快、更可行,适合即时检验。

研究人员提出了适用于核酸即时(POC)诊断的新方法，包括环介导的等温扩增(LAMP)、RCA、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。这些方法灵敏度高，类似于PCR，可以克服PCR检测时间长、成本高等局限性。在所有的等温扩增中，LAMP提供了一个相对简单的反应体系，只需要Bst聚合酶。此外，借助全自动引物设计软件，LAMP引物的设计非常方便。它已经成为商业应用中使用最广泛的等温扩增技术。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims

1.一种快速分析CTC生物标志物的引物组，其特征在于，所述引物组包括上皮细胞特异性标志物CK19和EpCAM，以及CTC生物标志物CD133和CD90的LAMP引物，

所述标志物CK19的引物序列如SEQ ID NO.1-6所示，

所述标志物EpCAM的引物序列如SEQ ID NO.7-12所示，

所述标志物CD133的引物序列如SEQ ID NO.13-18所示，

所述标志物CD90的引物序列如SEQ ID NO.19-23所示。

2.一种快速分析CTC生物标志物的联合检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包含至少一次用量的权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述联合检测试剂盒还包括外周血循环肿瘤细胞富集试剂、RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、RT-LAMP反应体系试剂。

4.权利要求1所述的引物组或权利要求2-3任一所述的联合检测试剂盒在快速分析CTC生物标志物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤，

A)采用联合检查试剂盒同时检测CTC表面四种干性细胞标志物EpCAM、CD133、CD90和CK19；

B)分别计算四种干性细胞标志物的相对表达量：使用2^-ΔΔCt计算法，以健康组的平均ΔCt[ΔCt＝Ct(target)-Ct(β-actin)]作为校准值，ΔΔCt＝[Ct(target样本)-Ct(β-actin样本)-ΔCt健康组均值]，其中所述Ct：扩增循环数；所述ΔCT：扩增循环数差值；所述target：目的基因；

所述β-actin内参基因；

C)分别将四种干性细胞标志物相的对表达量结果代入计算公式：logit(p＝HCC)＝-2.15+0.74×EpCAM+0.65×CD133+0.34×CD90+0.99×CK19，得出个体多干细胞标志物联合预测值；预测值按0.57作为诊断切点。