CN116640838A

CN116640838A - 一种打破泊松分布形成反应隔室群的方法

Info

Publication number: CN116640838A
Application number: CN202211501276.9A
Authority: CN
Inventors: 张经纬; 景祥益; 梁雪
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2022-11-28
Publication date: 2023-08-25
Also published as: WO2023093887A1

Abstract

本申请涉及一种打破泊松分布规律形成反应隔室群的方法，所述方法包括：准备待检测物群，其由两个以上待检测物构成；准备靶向反应复合物群，所述靶向反应复合物群由两个以上靶向反应复合物构成，所述靶向反应复合物包括载体、连接于载体上对应于待检测物的靶向配基、连接于载体上对应于待检测物的反应试剂、可选地包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子。

Description

一种打破泊松分布形成反应隔室群的方法

技术领域

本申请涉及高通量化学分析领域，具体涉及一种靶向反应复合物以及它们在打破泊松分布形成反应隔室群的用途。

背景技术

细胞的异质性是普遍存在的生命现象，单细胞作为独立活动的生命个体，所展现出来的性质和差异性对于整个生命系统的发展起到了至关重要的作用。人体内的每一个组织、器官都涵盖多种细胞类型，并且每一种类型的细胞随着生物体生命活动状态的不同而会发生改变，如果将成千上万个单细胞进行研究，就会模糊细胞之间的异质性信息，因此理解复杂的机体的工作原理、了解每一种细胞类型的生命功能和免疫应答对于揭示人体组织、器官工作的机理和基因调控的规律极为重要。例如导致人体患癌的恶性肿瘤为高度异质性的组织，由多种表型的肿瘤细胞组成，而真正的恶性细胞与正常细胞混杂，往往只占整个组织的一小部分，因此进行单细胞的分析，可以判断哪些细胞具有抗药性、哪些细胞易于转移，在指导精准用药、预测病程发展和临床指导等领域有重要的作用。

在看似同质的细胞亚群中，单细胞之间的表达也可能不尽相同，基因组虽从根本上决定了细胞的行为如转录或翻译，但基因表达是一个随机的分子进程，与细胞生长时间、空间均有关，使基因组的分析并不能准确反映细胞间实际行为的差异性；蛋白质作为生命活动的主要承担者，对细胞差异性、动力学以及功能直接产生影响，但蛋白质在单细胞水平的定量分析、蛋白质扩增以及蛋白质序列的高效读取始终是巨大的技术壁垒；而RNA作用于DNA的下游、蛋白质上游，已经逐渐成为间接判断基因表达情况及蛋白质丰度的有力工具，因此对转录组进行分析，可以揭示单细胞水平上遗传物质及其表达的异质性和随机性。

发明内容

目前高通量单细胞测序技术存在诸多技术难题：其一是高通量单细胞的分离，应用最广的高通量单细胞分离方法主要通过荧光激活细胞流式分选术来完成，荧光激活流式分选术可以同时通过多光谱通道扫描上千个细胞，通量高、速度快，可精确定位单细胞分选的位置；可以进行特异与非特异性细胞的分选从而获得所需的细胞亚群，还可以实现多参数分析，在实际样品的分析中具有极大的优势，因此利用荧光激活流式分选对单细胞进行分离，使单细胞分隔在96或384微孔板中进行后续分析是目前在单细胞分析领域应用最广的技术之一(Jaitin，et al.，Science，343.776-779；Ba gnoli，et al.，Naturecommunications，9.2937.)

第二个技术难题是单细胞内微量内含物的扩增，以及为实现高通量的单细胞测序，如何在样品制备过程中对每个细胞进行标记，即引入细胞编码；并且由于扩增过程中存在偏差，如何对单细胞内每个转录本信息进行标记，即引入分子编码，如何将细胞编码与分子编码进行整合，实现细胞内含物的准确定量是科研工作者近几年来方法学上创新的重点。近年来，科研工作者发展了一种编码微球的技术，可用于高通量单细胞内含物信息的标记。

第三个技术难题在于实现微孔板内单细胞与单微球的高通量一对一配对，目前广泛用于微粒分选的荧光激活流式分选不适用于编码微球的分选，一是编码微球成本昂贵，由于荧光激活流式分选需要消耗大量的背景微球，这种方式会造成大量试剂浪费，二是微球大小往往与流式分选的耗材不匹配，三是分选效率低，单位时间内细胞与微球分选数量有限，无法实现高效的高通量单细胞与单微球一对一快速配对，距离临床对细胞总数的要求相去甚远，四是分选出的单微球容易破碎。

目前尚无能够将高通量捕获单细胞、无偏扩增微量单细胞内含物、全面分析单细胞内含物集成在一起的公开技术。但已有公开报道利用微流控技术高通量分析单细胞转录组。比如Cell文章(Macosko et al.，2015，Cell：161，1202-1214；Klein et al.，2015，Cell161，1187-1201)报道的结合液滴微流控和编码微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配对捕获单细胞与单微球，单细胞裂解释放的mRNA被与之配对的编码微球捕获，再经过逆转录和扩增，将单细胞mRNA信息编码与放大，通过高通量测序与生物信息学方法分析大量大细胞mRNA的表达情况。该方法中细胞与微球的捕获是基于泊松分布原理，大部分的液滴没有细胞，只有～1％的液滴含有单个细胞，再结合微球的泊松分布，有效分析目标进一步减少，只能实现对大量实际样品中少部分细胞的分析，这样可能会忽略掉样品中一些重要的细胞个体。另外该策略只适合分析对象数目较多的样品，对于一些稀有细胞(比如循环肿瘤细胞)，由于其样品中细胞数量太少(10-100/mL血液)，无法用该方法来实现单细胞分析。这些技术都仅限于分析单细胞的mRNA，其他单细胞内含物无法进行分析，如基因组、miRNA、蛋白组、甲基化DNA、代谢产物、脂质体、磷脂等。目前公开的技术中，都没有涉及到高通量分析。

微流控芯片是近些年来新兴并且快速发展走向成熟的领域，它利用结构各异的微通道和形式多样的外加力场，对微量流体或样品在微观尺度上进行操纵、处理与控制，从而实现了传统实验室部分乃至全部功能在一块芯片上的集成。然而，常规微流控芯片的局限性也是非常明显的，其需要在芯片内部设计泵、阀与操作复杂的外部流体控制设备配合使用，技术门槛高，且一块芯片难以重复使用，当需要用不同的反应试剂对同一样本进行多层次、多尺度分析时需要消耗大量的芯片制作成本(Macosko et al.，2015，Cell，161，1202-1214；Klein et al.，2015，Cell，161，1187-1201；Han et al.，2018，Cell，172，1091-1107)。

第四个潜在的技术问题在于以往的测序方法在对实际样品进行分析的时候，目前已报道的基于编码微球的测序方法都需要先用荧光激活流式分选出目标细胞，再转移至各个分析平台上，而细胞内含物信息会随着细胞所处环境的变化而发生改变，导致最后测序结果反映的测序信息对比细胞当时所处的真实环境下的信息可能会有所偏差。

第五个技术难题在于稀有细胞的分离，当待分析的细胞数量非常稀少又需要对每个单细胞独立的转录组信息进行分析时，传统基于毛细管挑取、梯度稀释或者激光切割等技术人力成本高、耗时耗力、通量低，限制了稀有细胞的高通量快速分离及测序分析。

本申请主要聚焦于上面的第三类技术难题，即，在实现对多个细胞进行高通量分析时解决了单细胞与反应试剂的一对一配对问题，同时增加液滴对细胞与微球的共捕获率，解决了″双泊松分布″造成的低效。

为了解决上述技术问题，本申请提供了：

1.一种形成反应隔室群的方法，所述方法包括：

准备待检测物群，其由两个以上待检测物构成；

准备靶向反应复合物群，所述靶向反应复合物群由两个以上靶向反应复合物构成，所述靶向反应复合物包括载体、连接于载体上对应于待检测物的靶向配基、连接于载体上对应于待检测物的反应试剂、可选地包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子；

使用所述待检测物群与所述靶向反应复合物群接触，形成结合物群；

由所述结合物自身或者由媒介物包裹所述结合物形成反应隔室群。

2.如项1所述的方法，其中，所述待分析物选自蛋白质、核酸、糖、脂、代谢物、多肽、细菌、病毒、细胞器以及细胞中的一种或两种以上，以及由它们形成的复合体，最优选所述待分析物为细胞。

3.如项1所述的方法，其中所述载体的形状选自正方体形、四面体形，球形、椭球形、章鱼形、碗形、红血球形的一种或两种以上；最优选为碗形和/或红血球形。

4.如项3所述的方法，其中所述载体的数量为所述待检测物数量的4倍及以上，优选为所述待检测物数量的10倍及以上，最优选为所述待检测物数量的10倍至30倍。

5.如项3或4所述的方法，其中所述载体为的最大直径为待检测物的1倍以上，优选其最大直径为待检测物的3倍及以上，最优选其最大直径为待检测物的4倍至10倍。

6.如项3至5的任一项所述的方法，其中所述载体由聚合物或小分子构成，优选为聚合物载体，进一步优选为聚苯乙烯载体聚苯乙烯或水凝胶制成，进一步该聚合物载体由聚苯乙烯制成，最优选该聚合物带有铁磁性或顺磁性。

7.如项1所述的方法，其中，所述靶向配基可以是天然或人造的，选自包括锁核酸和X NA的核酸及其类似物、适配体、小肽、多肽、糖基化肽、多糖、可溶性受体、类固醇、荷尔蒙、促分裂原、抗原、超级抗原、生长因子、细胞因子、瘦素、病毒蛋白、细胞黏附分子、趋化因子、链霉亲和素及其类似物、生物素及其类似物、抗体、抗体片段、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、T细胞受体、主要组织相容性复合体(M HC)分子、抗原肽-MHC分子复合物(pMHC)、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、细胞内或细胞表面受体配基中的一种或两种以上以及它们共同形成的多重配基、复合配基、耦合配基。

8.如项1所述的方法，其中，所述标签分子选自天然或人造的信息分子，包括：寡核苷酸条形码、寡肽或多肽条形码、由天然碱基与LNA、PNA、XNA等非天然碱基构成的核苷酸、寡糖或多糖条形码、生色团(chromophoric group)和助色团(auxochrome group)、金属原子或离子、分子量可区分的小分子、嵌段聚合物、聚合物与骨架分子共价连接物中的一种或两种以上以及它们之间形成的复合体。

9.如项1所述的方法，其中，所述反应试剂是寡聚核苷酸引物、酶或小分子。

10.如项1所述的方法，其中，所述载体直径粒径分布系数CV小于20％。

11.如项10所述的方法，其中，所述载体表面涂覆有力学缓冲涂层；进一步优选涂覆有水凝胶涂层；最优选该水凝胶涂层带有铁磁性或顺磁性颗粒。

12.如项1所述的方法，其中，所述连接选自共价键、金属键、离子键、范德华力、包括氢键、机械键、卤键、硫族键、亲金作用、嵌入、重叠、阳离子-π键、阴离子-π键、盐桥、非金属原子间次级键、金属原子与非金属原子间次级键、亲金作用、亲银作用、双氢键和金键的次级键。

13.如项1所述的方法，其中，所述靶向配基与所述载体连接是通过所述反应试剂的连接、通过所述标签分子的连接或通过接头的连接；所述反应试剂与所述载体的连接是通过所述靶向配基的连接、通过所述标签分子的连接或通过接头的连接；所述标签分子与所述载体的连接是通过所述靶向配基的连接、通过所述反应试剂的连接或通过接头的连接。

14.如项6所述的方法，其中所述小分子为所述靶向配基、所述反应试剂、所述标签分子中的一项或两项以上。

15.如项1所述的方法，其中，所述媒介物是油性介质，优选含氟油性介质，或者固体介质，优选微孔板。

16.如项1所述的方法，其中所述两个以上待检测物是可以是相同或不相同的，且所述两个以上靶向反应复合物可以是相同的或者不相同的，当所述两个以上待检测物不相同且所述两个以上靶向反应复合物不相同时，所述靶向反应复合物包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子。

本申请的技术方案实现的有益技术效果

采用本申请的技术方案，在实现对多个的待分析物(例如细胞)进行高通量分析的同时解决了待分析物(单细胞)与载体(单微球)的一对一配对问题，同时增加媒介物(液滴)对细胞与微球的共捕获率，解决了待分析物与载体配对时出现的″双泊松分布″现象造成的低效问题。通过使用红细胞形和碗形的载体(例如聚苯乙烯微球)以及相对于待检测物(例如细胞)尺寸较大且数量较多的载体，利用空间位阻效应进一步确保了″单细胞与单微球的一对一配对″这一目的的实现。通过在载体(例如聚苯乙烯微球)的表面包覆一层缓冲层(水凝胶层)，避免了在细胞与微球结合过程中细胞被碾碎的危险，减少了待检测物损失。本申请所采用的靶向复合物群具有至少一种反应试剂，实现了对待检测物的高通量分析。

附图说明

图1显示了根据本申请的靶向反应复合物的构成示意图；靶向反应复合物包括载体、连接于载体上对应于待检测物的靶向配基、连接于载体上对应于待检测物的反应试剂、可选地包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子。

图2A显示硬质微球在与细胞结合时，可能将细胞碾碎；图2B显示在硬质微球表面包裹水凝胶涂层对细胞有保护作用；图2C显示了根据本申请的涂有水凝胶覆层的靶向反应复合物(包裹水凝胶镀层的DNA编码微球)。

图3A显示了移液枪吹打微球实现水凝胶包裹；图3B显示水凝胶成胶破乳后的图像。

图4A显示微球直径大于细胞，位阻效应有助于微球与细胞1∶1结合；一个细胞较难与两个及以上的微球结合；图4B显示微球比细胞尺径小时，形成多个微球结合一个细胞，或细胞与微球的聚团。

图5A显示了水凝胶包裹磁性微球的制备；图5B显示了破乳后通过磁性纯化；图5C显示了水凝胶包裹磁性微球，破乳后通过磁性纯化；图5D显示了在荧光显微镜下，可观察到活化后水凝胶层表面修饰的抗体(外层亮白色)；图5E中，白色箭头所指的是带抗体修饰的水凝胶包裹微球通过孵育与细胞形成1∶1结合。

图6A-C显示了碗形载体，位阻效应有助于微球与细胞1∶1结合；一个细胞较难与两个及以上的碗形或红细胞形微球结合；图6A为在液滴里进行碗形双水相的生成与紫外交联；图6B为碗形的颗粒；图6C为碗形的颗粒与细胞形成1∶1结合。

图7A显示了用微流控设备制备的水凝胶微球成品；图7B显示了水凝胶微球中，标签分子与polyT在同一个逆转录引物上；图7C显示了水凝胶微球在液滴里聚合。

图8A显示了经修饰的带有抗人-CD298、人β2微球蛋白、小鼠CD45以及小鼠MHCclass l抗体的微球，可作为通用结合微球与细胞结合；图8B显示了该水凝胶微球与细胞结合，形成1∶1复合物。

图9A为整个高通量分析过程的流程图(靶向反应复合物与待分析物预先结合，再被包裹进高通量隔室)；图9B，当微球数量为细胞10倍或以上时，可形成1∶1结合，大概有1/100的概率观察到一个细胞结合两个微球；图9C为形成隔室后每个细胞都有靶向反应复合物微球与之结合，从而打破泊松分布，提高细胞的捕获率；图9D为部分情况下，靶向反应复合物与所结合的细胞会在隔室内分离；图9E显示待分析物为彼此相互作用的细胞对。

图10A-D显示了通过注射泵控制微流控内的水/油液体形成油包水隔室的过程；其中图10B显示了微流控装置高通量形成隔室；图10C显示了微球与细胞复合物进入微流控十字交叉口，高通量液滴生成；图10D显示了单细胞分析结果；显示了单细胞分析结果，人和鼠的细胞亚群能够分离。

图11A显示了下述步骤：第一步微球的水凝胶包裹，并交联链霉亲和素；第二步细胞生物素化；第三步，将生物素化的细胞与带链霉亲和素的孵育结合；第四步，高通量对微球与细胞的复合物进行包裹形成隔室，并在隔室里释放反应试剂、对隔室内细胞进行标签化；图11B显示了水凝胶包裹的靶向标签微球，经过带荧光的链霉亲和素修饰；图11C显示了生物素化的细胞；图11D显示了水凝胶微球结合细胞；图11E显示了手动枪头吹打在水凝胶包裹微球外形成隔室，对隔室中细胞进行细胞裂解释放其中的mRNA。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施例。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的″包含″或″包括″为一开放式用语，故应解释成″包含但不限定于″。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如本文所用，就特定组分而言″基本上不含″在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。

如在本说明书中所使用的，″一″或″一个″可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词″包含″一起使用时，单词″一″或″一个″可以表示一个或多于一个。

在权利要求中使用术语″或″用于表示″和/或″，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和″和/或″的定义。如本文所用，″另一个″可以表示至少第二个或更多个。

贯穿本申请，术语″约″用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本申请生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本申请提供了形成反应隔室群的方法。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，所述方法包括：

准备待检测物群，其由两个以上待检测物构成；

在此，″隔室″意指为特定的化学反应提供特定的反应空间，在该反应空间内，反应物相互之间可以发生反应，而不会与邻近隔室的反应物发生反应，但是，隔室的生成物依其类型有可能与邻近隔室的生成物发生物质交换(例如：染料、表面活性剂等)。

在本说明书的上下文中，″靶向″符合生物技术领域的一般定义，典型地为抗体-抗原亲和反应，互补的核酸序列的亲和反应。

在本说明书的上下文中，″连接″应作广义的理解，至少包括各种通过分子键的和不通过分子键的连接。

图1给出了靶向反应复合物的组成成分，在此示出了靶向配基、标签分子和反应试剂分别连接于″载体″的结构关系。其中，″载体″可以由与靶向配基、标签和反应试剂同样的分子构成，即可以由小分子构成。更常见地，所述载体由聚合物，优选由聚苯乙烯构成。

在又一具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述待分析物选自蛋白质、核酸、糖、脂、代谢物、多肽、细菌、病毒、细胞器以及细胞中的一种或两种以上，以及由它们形成的复合体，最优选所述待分析物为细胞。

在本说明书的上下文中，″细胞″符合生物学领域的一般定义，其至少包括原核细胞和真核细胞，针对本申请的技术的用途，有时可以特指多细胞生物的经过分化的细胞群，例如免疫细胞群，其至少包括淋巴B细胞、淋巴T细胞、NK细胞。

在本说明书的上下文中，″细胞器″符合生物学领域的一般定义，细胞器(organelle)一般认为是散布在细胞质内具有一定形态和功能的微结构或微器官。它们组成了细胞的基本结构，使细胞能正常的工作，运转。细胞中的细胞器主要有：线粒体、内质网、中心体、叶绿体，高尔基体、核糖体等。

在本说明书的上下文中，″复合体″指的是彼此相互作用、具有一定结合强度的两种或两种以上的物质，这些物质可以由蛋白质、核酸、糖、脂、代谢物、多肽、细菌、病毒、细胞器以及细胞组成。例如：HepG2与识别该细胞系的T细胞(基因改造后，携带靶向″主要组织相容性复合体-AFP158肽段″的T细胞受体基因)孵育后会形成细胞与细胞的相互作用；具体的例子还有：细菌和噬菌体(病毒)的复合体、细胞和膜蛋白(多肽)的复合体、以及核糖体和RNA(核酸)的复合体。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述载体的形状选自正方体形、四面体形，球形、椭球形、章鱼形、碗形、红血球形的一种或两种以上；最优选为碗形和/或红血球形。″碗形″特指一种凹球形，其在″半球体″的平面一侧设置有凹面，当待检测物结合至所述载体的该凹面时，由于空间位阻效应，所述待检测物不会再结合至另一载体。凹球形特指一种球形的圆平面上有凹形面，当待检测物结合至所述载体的该凹面时，由于空间位阻效应，所述待检测物不会再结合至另一载体。而″红血球形″的载体具有两个凹面，当待检测物结合至所述载体的上凹面或下凹面时，由于空间位阻效应，所述待检测物不会再结合至另一载体。

在又一具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述载体的数量为所述待检测物数量的10倍以上，最优选为所述待检测物数量的10倍至50倍。具体地，所述载体的数量可以为所述待检测物数量的10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、22倍、24倍、26倍、28倍、30倍、32倍、34倍、36倍、38倍、40倍、42倍、44倍、46倍、48倍或50倍。希望控制进行相互作用的待分析物与前述靶向反应复合物或前述反应复合物群的量以及分析过程，使得对每个结合物中仅含有一个待分析物的结合物进行分析。在本申请的实施例中，具体而言，当携带反应试剂的微球数量为被分析细胞数量10倍-20倍时，根据泊松分布每个微球大概率仅结合一个细胞。

在本说明书的上下文中，″泊松分布″的含义是描述单位空间内随机出现微球或细胞的数量；″双泊松分布″的含义是描述单位空间内随机出现同时有微球和细胞的数量。在实施例中，如果出现单位空间内出现同时有微球和细胞的数量大于双泊松分布的现象，则可以认为″打破泊松分布″。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述载体的最大直径为待检测物的2倍以上，最优选其最大直径为待检测物的3倍至10倍。具体地，所述载体的最大直径可以为待检测物的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在本说明书的上下文中，″直径″特指通过一平面图形或立体(如圆、圆锥截面、球、立方体)中心到边上两点间的距离)。在使用红细胞形和碗形的载体的情况下，由于空间位阻效应，最大程度地实现了载体和待检测物的1∶1的结合。特别在使用红细胞形微球和免疫细胞，且红细胞形微球的直径为免疫细胞3倍至30倍的情况下，最大程度地实现了载体和待检测物的1∶1的结合。

具体地，可以在使用″碗形″或″红血球″形载体的同时使用例如比待检测物多10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、22倍、24倍、26倍、28倍、30倍、32倍、34倍、36倍、38倍、40倍、42倍、44倍、46倍、48倍或50倍的载体数量；具体地，可以在使用最大直径为待检测物的3倍至10倍的载体尺寸的同时使用例如比待检测物多10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、22倍、24倍、26倍、28倍、30倍、32倍、34倍、36倍、38倍、40倍、42倍、44倍、46倍、48倍或50倍的载体数量；具体地，可以在使用例如比待检测物多10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、22倍、24倍、26倍、28倍、30倍、32倍、34倍、36倍、38倍、40倍、42倍、44倍、46倍、48倍或50倍的载体数量的同时使用″碗形″或″红血球″形载体；具体地，可以在使用例如比待检测物多10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、22倍、24倍、26倍、28倍、30倍、32倍、34倍、36倍、38倍、40倍、42倍、44倍、46倍、48倍或50倍的载体数量的同时使用″碗形″或″红血球″形载体，且使用最大直径为待检测物的3倍至10倍的载体尺寸；以最终实现″根据泊松分布每个微球大概率仅结合一个细胞″的技术效果。

在又一具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述载体由聚苯乙烯或小分子制成，最优选由聚苯乙烯制成。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述靶向配基可以是天然或人造的，选自包括锁核酸和XNA的核酸及其类似物、适配体、小肽、多肽、糖基化肽、多糖、可溶性受体、类固醇、荷尔蒙、促分裂原、抗原、超级抗原、生长因子、细胞因子、瘦素、病毒蛋白、细胞黏附分子、趋化因子、链霉亲和素及其类似物、生物素及其类似物、抗体、抗体片段、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、T细胞受体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、抗原肽-MHC分子复合物(pMHC)、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、细胞内或细胞表面受体配基中的一种或两种以上以及它们共同形成的多重配基、复合配基、耦合配基。在本说明书的上下文中，″抗体″符合生物学领域的一般定义，具体地，抗体(antibody)是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。在本申请的技术方案中，可以使用例如淋巴细胞的表面受体作为抗原，制备相应的抗体，化学修饰在微球表面，以起到分离淋巴细胞群的作用。在本说明书的上下文中，″适配体″符合生物学领域的一般定义，在本申请的技术方案中，可以特别指代核酸适配体。核酸适配体(Aptamer)是一段DNA(脱氧核糖核酸)，RNA(核糖核酸)序列，XNA(核酸类似物)或肽。通常是利用体外筛选技术一一指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。在本申请的技术方案中，当待分析物为核酸片段时，可以选用它的核酸适配体，经化学修饰固定在微球表面，以起到分离细胞的作用。

在又一具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述标签分子选自天然或人造的信息分子，包括：寡核苷酸条形码、寡肽或多肽条形码、由天然碱基与LNA、PNA、XNA等非天然碱基构成的核苷酸、寡糖或多糖条形码、生色团(chromophoricgroup)和助色团(auxochrome group)、金属原子或离子、分子量可区分的小分子、嵌段聚合物、聚合物与骨架分子共价连接物中的一种或两种以上以及它们之间形成的复合体。在本说明书的上下文中，DNA条形码(DNA barcode)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。在发现一种未知物种或者物种的一部分时，研究人员便描绘其组织的DNA条形码，而后与国际数据库内的其他条形码进行比对。如果与其中一个相匹配，研究人员便可确认这种物种的身份。DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。具体到本申请的实施例，当所述″分析″是针对免疫细胞群的转录组测序时，使用DNA条形码可以在取得对免疫细胞群的高通量分析结果后，对这些分析结果去卷积化。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述反应试剂是寡聚核苷酸引物、酶或小分子。在本文中，反应试剂是用来与待分析物发生反应并产生能够用于检测信号的物质。在本说明书的上下文中，″反应试剂″有时可以特指能够促使待分析物发出荧光的荧光试剂。在本说明书的上下文中，″引物″符合生物技术领域的一般定义，具体地，引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。具体到本申请的实施例，在所述″分析″是转录组测序时，可以采用寡聚核苷酸引物作为″反应试剂″。在本说明书的上下文中，″构成反应试剂的小分子″可以是化学技术领域的各种小分子，当所述″分析″是荧光检测时，特别地，所述″小分子″是可以发出荧光的小分子，例如FAM、VIC等。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述载体直径粒径分布系数CV小于20％。此处的英文缩写定义如下：CV＝SD/平均粒径，它可以表示粒度分布的宽窄。其中SD：是标准偏差(Standard Deviation)统计数学上记为σ；CV也称相对标准偏差(Coefficient of variation)统计数学上记为α。在本文中，采用的微球的直径可以采用本领域技术人员所公知的方式和装置来计算，例如可以在显微镜下进行测量并用图像处理软件分析，可以通过测定颗粒粒度的仪器(Bio-Rad T20细胞技术仪)来测定，也可以使用微球供应商提供的数据。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述载体表面涂覆有力学缓冲涂层；最优选涂覆有水凝胶涂层。在此，所述″力学缓冲涂层″应当视为″载体″的一部分，即，所述本说明书中所描述的″靶向配基″、″反应试剂″、″标签分子″都是在于载体(无涂层的母核)上涂覆完″力学缓冲涂层″之后才通过例如化学修饰连接在所述载体之上。

作为替选，先将所述标签分子连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层，最后在力学缓冲涂层之外通过例如化学修饰连接上所述反应试剂和所述靶向配基。

作为替选，先将所述反应试剂连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层，最后在力学缓冲涂层之外通过例如化学修饰连接上所述标签分子和所述靶向配基。

作为替选，先将所述靶向配基连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层，最后在力学缓冲涂层之外通过例如化学修饰连接上所述反应试剂和所述标签分子。

作为替选，先将所述标签分子和反应试剂连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层，最后在力学缓冲涂层之外通过例如化学修饰连接上所述靶向配基。

作为替选，先将所述标签分子和靶向配基连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层，最后在力学缓冲涂层之外通过例如化学修饰连接上所述反应试剂。

作为替选，先将所述反应试剂和靶向配基连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层，最后在力学缓冲涂层之外通过例如化学修饰连接上所述标签分子。

作为替选，先将所述标签分子、靶向配基和标签分子连接在载体上，随后涂覆力学缓冲涂层。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述连接选自共价键、金属键、离子键、范德华力、包括氢键、机械键、卤键、硫族键、亲金作用、嵌入、重叠、阳离子-π键、阴离子-π键、盐桥、非金属原子间次级键、金属原子与非金属原子间次级键、亲金作用、亲银作用、双氢键和金键的次级键。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述靶向配基与所述载体连接是通过所述反应试剂的连接、通过所述标签分子的连接或通过接头的连接；所述反应试剂与所述载体的连接是通过所述靶向配基的连接、通过所述标签分子的连接或通过接头的连接；所述标签分子与所述载体的连接是通过所述靶向配基的连接、通过所述反应试剂的连接或通过接头的连接。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中所述小分子为所述靶向配基、所述反应试剂、所述标签分子中的一项或两项以上。即，所述靶向配基、所述反应试剂、所述标签分子自身就可形成载体的一部分。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，所述媒介物是油性介质，优选含氟油性介质，或者固体介质，优选微孔板。使用油性介质作为″隔室″的″媒介物″的原因是油性介质可有效阻断带电荷的核酸分子跨越不同的″隔室″，好处是携带不同待分析物标签的反应试剂在对细胞内容进行标记后不会穿越″隔室″产物形成交叉污染。

在一个具体实施方式中，提供了一种形成反应隔室群的方法，其中，

所述两个以上待检测物可以是相同或不相同的，

且所述两个以上靶向反应复合物可以是相同的或者不相同的，

当所述两个以上待检测物不相同且所述两个以上靶向反应复合物不相同时，所述靶向反应复合物包括连接于载体上对应于待检测物的标签分子。

在一个具体实施方式中，在上述形成反应隔室群的方法中，所述两个以上待检测物是相同的，且所述两个以上靶向反应复合物是相同的。

在一个具体实施方式中，在上述形成反应隔室群的方法中，所述两个以上待检测物是相同的，且所述两个以上靶向反应复合物是不同的。

在一个具体实施方式中，在上述形成反应隔室群的方法中，所述两个以上待检测物是不同的，且所述两个以上靶向反应复合物是相同的。

在一个具体实施方式中，在上述形成反应隔室群的方法中，所述两个以上待检测物是不同的，且所述两个以上靶向反应复合物是不同的；且所述靶向反应复合物包括连接于所述载体上对应于所述待检测物的标签分子。

实施例部分

实施例一带有力学缓冲涂层的载体(包裹有水凝胶层的微球)的制备

聚苯乙烯微球(纳微科技Uni-PS-30)经过Chemgenes Corp订制可形成带DNA编码(标签)的逆转录polyT引物(反应试剂)的微球。

1、吸取1mL乙醇保存中的DNA编码polyT微球到2ml中离心管中；

2、移去上清，加入0.2ml PBS缓冲液(Teknova)冲洗微球，重复2遍；

3、吸取10μl微球，在细胞计数板中计数；

4、将剩余微球全部加入实施例一所述的聚丙烯酰胺(PAA)溶液中，同时充分混匀；

5、吸取步骤4中全部溶液加入含氟油相中，使用200μl移液枪吹打3～4min(图3A)。

6、室温静置4h。

7、用移液管除去下层的油。

8、向2ml收集管中加入100uL HFE油中20％(v/v)全氟辛醇(PFO)作为化学破乳剂；

9、混合后，旋转2ml收集管2000g 2分钟。移液去除PFO/HFE上清液。重复1x；

10、移液去除上清，加入1ml含0.2％Tween20的PBS去除表面活性剂/溶液。重复2x；

11、加入1mL TEBST缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，274mM NaCl，5.4mM KCl，20mMEDTA，0.2％Triton X-100)，混合均匀。

12、3000×g旋转3分钟。移液去除上清液。重复3x。

13、重悬于1ml TEBST中(图3B)。此微球在此溶液可在4℃下无限期保存。

在包裹有水凝胶层的微球上(载体)，可预先或之后装载靶向配基、标签或反应试剂。

实施例二(一)结合物的形成

称重10mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(缩写：EDC)和5mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，分别用200μL MES缓冲液(pH 6.5)溶解。

将实施例一产生的带有羧基水凝胶涂层的微球和EDC/NHS溶液混合，在室温下旋转15分钟

·以5rpm将微球旋转孵育5分钟

·去除上层清液

·在500μL PBS缓冲液中重悬微球

·将200μL的500mg/ml Anti human CD20(Biolegend)添加到珠状溶液中

·在RT下旋转微球2小时

·以每分钟5转的速度向下旋转微球5分钟

·计数细胞8.0*10^5细胞与带抗体修饰(靶向配基)的水凝胶包裹微球孵育在200μL PBS缓冲液与2mM EDTA，旋转溶液30分钟

·收集抗体修饰好的微球，去除所有上清计数上清中细胞，观察靶向配基修饰微球与细胞形成1∶1结合物(图4A)

由于细胞结合了微球，在单位体积中同时有微球和细胞的概率打破了泊松分布。

实施例二(二)载体尺寸对载体与细胞结合的影响(作为对比例)

之前的文献和商业化产品说明中有很多亲和力磁珠分选细胞的报导(例如：美天旎的MicroBead技术Technology、赛默飞的亲和力Dyna Bead产品等：https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/macs-cell-separation/cell-separation-reagents/realease-microbeads.html)，这些磁珠尺径小于细胞(即处于100nm～2.7微米)。

本实施例为对比例，实验目的：验证微球尺寸如果太小，会对其与细胞结合的影响。其数量大于细胞数量时，会形成多个微球结合一个细胞的现象。

活化微球的步骤：

1、在500ul MES缓冲液中计数带羧基的微球(Polysciences lnc.cat#18133)。该微球上的羧基活化后能够与细胞结合(靶向配基)：5.0*10^6个微球(90uL PBS缓冲液中的10uL微球(检测微球浓度：6.72×10^5/mL，转移～744uL微球→5.0×10^6)

2、添加7.7mg(标准方案0.5mg/100uL)EDC和8.0mgNHS至744uL微球重悬MES缓冲液；

3、混合微球和EDC/NHS溶液，在室温下旋转溶液20分钟，在10分钟间隔期间轻轻混合；

4、以500rpm的速度将微球旋转5分钟(或使用磁性分离器)；

5、去除上清液(在此过程中丢失一些微球)；

6、用750uL DPBS缓冲液洗涤两次，pH＝7.0

7、在300uL DPBS缓冲液中重悬；测量微球浓度(1.35×10^6/mL)，添加额外的99uL以在DPBS中达到1×10^6微球/mL

8、将100uL离心分装到4个试管中(对于各种微球：细胞比例进行测试，分别是1∶1、1∶5)

细胞结合的步骤：

1、将溶液置换到在DPBS+1mM EDTA buffer中进行细胞微球结合反应

2、在室温下旋转微球2小时；过程中t＝0min，30min，1h取样检查

3、显微镜下观察

本实验为对比例，推导出的结论是：微球尺寸大于细胞是非常重要的。

因为如本对比例所示：当微球如果尺径小于细胞，则会出现多个微球结合一个细胞、甚至多个微球与多个微球形成聚团的现象(图4B)，无法打破细胞分析时细胞端的泊松分布；而当微球直径大于等于细胞直径时(在此实施例中是大于细胞直径的两倍)，位阻效应导致微球不易与第二个细胞结合，从而打破泊松分布。

实施例三(一)带有分离功能(磁性纳米颗粒层)的载体(微球)的制备以及与细胞的结合实验

1、用实施例2的方法制备带磁性内核的水凝胶包裹微球(图5A-C)：该微球结构为聚苯乙烯内核，涂有磁性纳米颗粒，外层为带羧基的聚丙烯酰胺水凝胶层(PAA溶液配方和聚合方式见实施例二)

2、加入5mg EDC和1.2mg NHS到100μL MES缓冲液中；

3、旋转15分钟，在RT旋转下降5点微球转5分钟去除上层清液；

4、重悬微球500mg/μL PBS缓冲液；

5、加入200抗-human CD2(Biolegend，靶向配基)旋转的微球；

6、在室温下微球孵育2小时；

7、微球旋转离心5分钟(图5D)；

8、计数8.0*10^5个微球和不同数量的细胞在200μL PBS缓冲液，旋转30分钟；

测量细胞数的步骤为：

a、测量的Jurkat细胞浓度(7.62×10^5mL)*3.5mL

b、在100uL PBS+2mM EDTA中重悬细胞以达到1×10^6/100uL～1×10^7细胞/mL

c、对于各种微球：细胞比例的实验，将细胞等分到每个rxn管中(100uL Jurkat细胞，40uL Jurkat细胞+160uL DPBS，20uL Jurkat细胞+180uL DPBS)。

9、使用磁铁收集微球，可观察到细胞与微球1∶1结合(图5E)，这说明，在细胞端打破了泊松分布规律。

实验结论：当微球与细胞预结合时，可提高细胞捕获效率，打破泊松分布。

实施例三(二)载体形状对载体与细胞结合的影响

本实验目的是证明碗形微球可与细胞结合，并利用位阻效应打破泊松分布规律。

第一步：碗形微球的制造(载体)

对于分散相，将含有6.3％w/v生物素化聚乙二醇、4.5％w/v明胶和1.5％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)溶解在DPBS中的均匀前体溶液注入平行化以8μL/min的速度分步乳化。将包含2％Pico-Surf的Novec 7500以16μL/min注入连续相。生成单相的PEG/明胶液滴流过浸入4℃水浴中的Tygon管(0.03″1.D.，0.0625″O.D，Murdock)，用于PEG和明胶的温度诱导相分离。调整管道的长度以确保完全相分离(约60厘米，孵育10分钟)。将相分离的液滴流引入浸没在4℃水浴中的PDMS储液器中，并在储液器出口区域附近暴露于紫外线(200mW/cm²)1-3秒以进行聚合。在紫外线照射下，可光交联的PEG组分形成聚合物网络，而明胶组分保持未聚合状态(详见图6A)。收集交联颗粒，并在一系列洗涤步骤中去除油和富含明胶的液滴。首先通过移液枪去除表面活性剂油。连续添加20％v/v全氟辛醇(PFO，Sigma)在Novec7500中的溶液和milli-q水以破乳并将颗粒转移至水相。样品以2500×g离心1分钟，去除油相。微球用Novec 7500洗涤两次以去除剩余的PFO和表面活性剂。用移液器去除油层后，残留的油用己烷(Sigma)洗涤三次。然后将样品用70％乙醇洗涤三次，然后用毫定量水洗涤两次以去除明胶。使用前通过在70％乙醇中孵育过夜对颗粒进行灭菌。碗形颗粒在显微镜下(如图6B所示)。

第二步：碗形微球与细胞结合

碗形微球在使用前用AF350链霉亲和素(Fisher Scientific)修饰(靶向配基)。碗形微球用细胞培养基洗涤并浓缩在锥形管中。计算浓缩碗形微球的量以用碗形颗粒单层覆盖整个孔区域，对于55μm的碗形微球，分别为4.8μL/cm²。将计算量的碗形颗粒转移并分散在孔板中。将用Jurkat细胞以目标细胞与碗形微球以1∶1的比例接种到具有碗形微球单层的孔中。多次吸取孔中的溶液，使细胞和微球均匀分散在整个孔区域，并使细胞粘附在碗形微球上。为了去除未附着的细胞，用20μm可逆细胞过滤器(CellTrics)对样品进行过滤，并用由0.5％牛血清白蛋白(BSA)、1％P/S和含0.05％Pluronic F-127的DPBS组成的″洗涤缓冲液″洗涤。接下来，翻转细胞过滤器并用洗涤缓冲液洗涤，以在锥形管中回收碗形颗粒。将碗形颗粒离心以去除洗涤缓冲液。通过显微镜观察碗形颗粒与细胞结合(详见图6C)。

实验结论：当微球为碗形时，可更好地实现微球与细胞1∶1结合(详见图6C)。相较于实施例二(二)，位阻效应导致微球不易与第二个细胞结合，从而打破泊松分布。

实施例四通用性载体的制备：载体(微球)带有多种靶向配基：抗人-CD298、人β2微球蛋白、小鼠CD45以及小鼠MHC class l抗体。

1、商业化微球(Chemgenes Corp.Cat#Macosko-2011-10)含有带DNA编码的polyT捕获寡核苷酸(反应试剂和标签)。通过液滴微流控对其包覆带羧基的水凝胶涂层，在500μLMES缓冲液中对微球进行计数8.0*10^5个微球

2、将5mg EDC和1.2mg NHS添加到100μL MES缓冲液中

3、混合微球和EDC/NHS溶液，在室温下旋转溶液15分钟

4、以5rpm的速度离心微球5分钟

5、去除上清液

6、在500μL PBS缓冲液中重悬微球

7、将200μL的500mg/mL人-CD298，人β2微球蛋白，小鼠CD45以及小鼠MHC class l添加到微球溶液中(靶向配基)

8、在室温下旋转微球2小时

9、以5rpm的速度离心微球5分钟

10、计数细胞8.0*10^5个细胞在200μL含2mM EDTA的PBS缓冲液中与珠一起孵育，旋转溶液30分钟

11、使用磁铁收集微球，去除所有上清液(图2C)。

实验结论：通过给含DNA编码(标签)的逆转录引物(反应试剂)的水凝胶包裹微球(载体)装载多种抗体(靶向配基)，可进一步扩大微球的细胞结合的范围。

实施例五水凝胶微球载体的制备(载体为不含包裹层的实心水凝胶微球)

如无特别说明，下述实施例中化学试剂均采购自Sigma Aldrich。

1、制备由6.2％丙烯酰胺，0.18％N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)，0.3％过硫酸铵，0.6％丙烯酸钠组成的聚丙烯酰胺(PAA)溶液。将此溶液装入带有28G针头的1ml注射器(BD公司)中。

2、在氢氟醚(HFE)油中制备5％(w/w)含氟表面活性剂和1％N，N，nn-四甲基乙基二胺(TEM ED)组成的不溶连续相，用于液滴的生成和稳定。将溶液装入新的1ml注射器。

3、在15ml的收集管中收集1ml的液滴，在室温下培养3小时用于聚合。孵育后，用移液管除去下层的油。

4、向15ml收集管中加入1ml HFE油中20％(v/v)全氟辛醇(PFO)作为化学破乳剂

5、混合后，旋转15ml收集管2000×g 2分钟。移液去除PFO/HFE上清液。重复1x。

6、移液去除上清，加入1ml含0.2％Tween20的PBS去除表面活性剂/溶液。重复2x。

7、加入1mL TEBST缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，274mM NaCl，5.4mM KCl，20mMEDTA，0.2％Triton X-100)，混合均匀。

8、3000×g旋转3分钟。移液去除上清液。重复3x。

9、重悬于1ml TEBST中(图7A)。此微球在此溶液可在4℃下无限期保存。

实施例六所制备的微球所携带的反应试剂和标签分子可合并为同一物质(即5′-Acrydite-CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNT₂₈VN引物兼有标签分子与反应试剂双重功能)；序列中，V代表G、C、A的混合；N代表A、G、C、T四种碱基的混合。

应用实施例六中的微流控系统制备由40％丙烯酸-N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)(37.5∶1)，10％过硫酸铵，10X Gel buffer(100uL 1M的Tris HCl pH＝7.5；20uL pH＝8的0.5M EDTA；150uL 1M NaCl；730uL ddH₂O)，2X Oligo solution(100uM)，的聚丙烯酰胺(PAA)溶液形成的水凝胶微球(配方如图7B)。其中Oligo序列为：5′-Acrydite-CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC T NNNNT₂₈VN(SEQ ID NO：1)。

装载含低聚物的溶液，用于生成液滴。当液滴不稳定时，拍摄液滴照片，确定液滴大小。运行后，取出油，加入TEMED，油中含有0.4％TEMED，为将油倒回珠状乳剂中，放置在37度使微球凝固(图7C)。

在此，一个物质(引物)兼有两种功能(标签分子和反应试剂)。

实施例七靶向细胞的水凝胶微球的制备，并与细胞结合形成复合物

取实施例七制备的水凝胶微球(羧基来自丙烯酸单体)，在500μL MES缓冲液中对微球进行计数8.0*10^5个微球

·将5mg EDC和1.2mg NHS添加到100μL MES缓冲液中

·混合微球和EDC/NHS溶液，在室温下旋转溶液15分钟

·以5rpm的速度离心微球5分钟

·去除上清液

·在500μL PBS缓冲液中重悬微球

·将200μL含各种反应试剂的微球分别与500mg/mL抗CD45抗体(BioLegend，靶向配基)混合

·在室温下旋转微球2小时(图8A)

·以5rpm的速度离心微球5分钟

·计数细胞8.0*10^5个PBMC细胞在200μL含2mM EDTA的PBS缓冲液中与珠一起孵育，旋转溶液30分钟

·使用重力离心收集微球，去除所有上清液(图8B)

此实施例证明，当反应试剂与标签分子属于同一种物质时，携带了靶向配基的微球也能与细胞结合。

实施例八隔室的高通量形成及单细胞RNA测序(使用实施例四的同时结合人与鼠通用抗体的微球)

通过液滴微流控设备(图10A)用媒介物(含氟油性介质)来包裹微球(图2C)与细胞复合物。如图10A所示，使用定制设计的微流体装置将单个细胞与微球的复合物(来自于实施例四)一起包裹到液滴中。该装置在它们分成离散的液滴之前连接两路水相。层流防止在液滴形成之前混合两种水相输入，一路流相包含裂解液和其他缓冲液，另一路流相包含悬浮在缓冲液中的细胞与DNA编码微球复合物。液滴反应隔室是使用使用90μm高度和80μm宽喷嘴的微流控芯片产生的。使用的典型流速为：富含裂解液的相～200μL/h，富含细胞与DNA编码微球复合物的相～100μL/h和液滴稳定油(2％PEG-PFPE₂ HFE7500)～600μL/h(图10B)。

微流体装置组件列表

(1)倒置显微镜

(2)压力控制器+3流量传感器/三个注射泵

(3)3个falcon管/3mL注射器

(4)磁力搅拌系统

(5)用于实验装置元件连接的微流体导管

(6)微流体配件和连接器

(7)PDMS共流微流体液滴生成装置

(8)用于beads的100微米细胞过滤器

(9)用于细胞的40微米细胞过滤器

(10)计数室

物料清单：

表1单细胞转录组测序的反应物料清单

1.用30mL 100％EtOH X2清洗微球(来自于实施例8)

2.用30mL TE/TW buffer X2清洗微球

3.将微球重悬于10ml TE/TW缓冲液中

4.通过100um过滤器(@4℃长期保存)

5.对于单细胞转录组分析，用生理盐水冲液清洗微球与细胞形成的复合物

6.在生理盐水中重悬清洗微球与细胞形成的复合物，浓度约120个复合物/μL

7.用6.4mm磁力搅拌器将细胞-微球复合物的悬浮液装入3ml塑料注射器中；裂解液从另一个针管中装入(10％Sarkosyl的生理盐水)

8.将液滴生成油装入10ml塑料注射器

9.将注射器连接到具有0.38mm内径管的125um同流装置

10.通过连续磁力搅拌使微球-细胞复合物保持悬浮状态

将收集的液滴放置在显微镜下观察(图10C)

11.添加30ml 6X SSC@室温

12.用P1000移液器从每个等分液滴底部除去油

13.加入600ul全氟-1-辛醇

14.用手大力震荡管子～20s

15.旋转1,000g～1min

16.将样品放在冰上以减少退火的mRNA解离

17.除去油水层上方约5ml的上清液

18.用另外30ml的6X SSC缓冲液在室温清洗微球

19.将水层转移到新管中

20.旋转1,000g～1min

21.将微球转移到不粘的1.5ml管中

22.用1ml 6X SSC缓冲液洗涤两次

23.用300ul 5x Maxima H-RT缓冲液清洗一次

24.对于90,000颗微球，添加200ul RT混合液：

i.1X Maxima RT缓冲液

ii.4％Ficoll PM-400

iii.1mM dNTP

iv.1U/ul核糖核酸酶抑制剂

v.2.5uM的TSO

vi.10U/ul Maxima H-RT

25.室温孵育～30min

26.42℃孵育～90min

27.用1ml 1X TE清洗一次：含0.5％十二烷基硫酸钠

28.用1ml TE/TW缓冲液清洗微球两次

29.用10mM Tris pH＝7.5清洗微球一次30.将微球重悬于200ul核酸外切酶I混合液中

1X核酸外切酶I缓冲液(NEB)

1U/ul核酸外切酶l(NEB)

31.孵育@37℃～45min

32.用1mL TE/SDS清洗一次

33.用1mL TE/TW洗涤两次

34.用ddH₂O清洗一次

35.重悬于ddH₂O

36.将1000个微球的等分试样通过PCR扩增，每份体积为50uL 1x Hifi HotStartReadymix(Roche)

0.8uM TSO引物

37.PCR程序如下：

温度	时间	循环	循环数
				95℃	3min

				98℃	20s	1	4
65℃	45s	1
				72℃	3min	1

				98℃	20s	2	X
67℃	20s	2
				72℃	3min	2

				72℃	5min

表2 cDNA扩增的PCR反应程序

38.制备3′-末端cDNA片段进行测序

a.将四等分的600pg cDNA放到到四个标准Nextera XT标记反应中

b.使用P5-TSO-hybrid和Nextera_N701代替试剂盒提供的寡核苷酸

表3文库构建的PCR反应程序

该扩增文库送至第三方测序服务公司进行测序。

实施例九分析实施例八的实验结果

申请人使用Seurat等生物信息学工具处理原始测序结果，整体表达低或线粒体比例高的细胞被去除。对于聚类，使用了主成分分析，然后进行k均值聚类以识别不同的细胞状态。t-分布式随机邻域嵌入(t-SNE)用于可视化细胞聚类。对于元聚类，来自所有宿主的表达矩阵使用Seurat合并了四个实验。少于2000个细胞转录本被排除在分析之外，少于100个的细胞检测到的独特基因被排除在分析之外(图10D)。

实施例十微球带有另一种靶向配基(链霉亲和素)

本实验目的：微球的水凝胶涂层上连接链霉亲和素，与表面修饰生物素的细胞进行结合。实验流程如图11A所示：

第一步：微球的水凝胶珠功能化

1、_1.12_μL 1×PBST中的微球(_8.90×10^3_微球/μL)～5000-10k微球(载体)

使用600μl MES缓冲液(pH＝4.7，0.1M)重悬水凝胶珠去除缓冲液。

2、EDC(10mg)和NHS(5mg)分别溶解于200μl MES缓冲液中，并在洗涤后的微球中加入储备液以达到最终浓度

物质	重量(g)
		EDC	0.01
磺基-NHS	0.005

表4微球活化试剂

样本

200uL含10mg/ml EDC的MES

200uL含5mg/ml Sulfo-NHS的MES

3、溶液涡旋30s，置于水平振荡器(650rpm)室温下振荡30min。

4、离心在PBST中的颗粒，来回漂洗四次

5、向颗粒中加入NeutrAvidin原液(5mg/m1)使蛋白终浓度为1mg/mL，水平摇床孵育2.5h(650rpm，室温)。

	样本	对照组
			NeutrAvidin_μl	100	/
荧光链霉亲和素(2μg/ml)_μL	/	2

表5链霉亲和素的修饰条件

6、颗粒漂洗4次后保存在PBST中4℃可长期保存(图11B)，该微球上的NeutrAvidin为靶向配基，可与下游修饰了生物素的细胞靶向结合。

第二步：293T细胞生物素化(全程4℃操作)

1、哺乳动物细胞在含有0.04％BSA的1mL PBS中用钙黄绿素AM(ThermoFisher#C3099)染色。

2、准备90-95％融合细胞的6×6cm²培养皿

3、用冰冷的PBS(pH 8.0)洗涤细胞3次，去除细胞中含胺的培养基和蛋白质。快速除去PBS(注意：如果细胞在悬浮液中生长，每毫升步骤3中制备的生物素溶液使用1×10^6个细胞。每个标记反应的细胞总数不要超过4×10^7个)

注意：不要让PBS与细胞保持接触超过5秒，以防止细胞变圆和脱落。

4、将细胞轻轻刮入溶液中，将细胞悬浮在1ml PBS(pH 8.0)中，浓度约为25×10^6个细胞/mL。

5、1000μL 293T cell in 1×PBS(1.90×106cell per mL)～10^6cell

6、每毫升细胞悬液加入1.0mg Sulfo-NHS-SS-Biotin(不称量)试剂(产生～2mM生物素试剂)。

注意：在使用前立即制备10mM的Sulfo-NHS-SS-Biotin溶液，如下所示：Sulfo-NHS-SS-Biotin：将1mg放入微量管中，加入164μL超纯水。

将反应混合物在4℃温度下孵育30分钟。

注意：在4℃下进行孵育可能会降低生物素试剂的活性内化。

7、将PBS加入细胞沉淀中，用血清移液管轻轻上下吸取细胞3次。以500×g离心1分钟并弃去上清液。

注意：淬灭反应并去除多余的生物素试剂和副产物(图11C)。

第三步：链霉亲和素化的微球捕获293T细胞

1、所有实验中的微球和细胞均重悬在100％PBS。

水凝胶包裹微球的浓度(/mL)	细胞浓度(/mL)
		10000	1000

表6细胞与微球孵育时的浓度

2、4℃温育30min，轻轻搅动。

3、总溶液体积≈1mL。在成像之前，将溶液轻轻涡旋以去除颗粒中的非贴壁细胞。细胞结合后形成微球与细胞1∶1捕获(图11D)

第四步：对捕获了细胞的水凝胶包裹微球进行包裹。

对水凝胶包裹的微球进行吹打，形成液滴隔室

	油相	水相	总体积	吹打时间
					样本	60ul	30ul	90ul	3min

表7液滴生成的条件

水相中含有29U/mL蛋白酶K(NEB#P8107S)和70mM DTT(Sigma#D9779)，并混合10次移液器冲程。在将结合了细胞的微球与溶液混合时要小心避免产生气泡。将280μL 0.5％离子型Krytox的HFE 7500油65添加到细胞-珠复合物中，并以3000RPM的速度水平涡旋15秒，然后使用定制涡旋仪垂直涡旋2分钟。从乳液下方去除油，使得剩余的油少于100μL。在裂解之前，微球-细胞的乳液在C-Chip一次性血细胞计数器(Fisher Scientific#DHCN015)上进行二次采样，每个子样本每个视野包含3.5μL乳液。芯片以2倍放大倍数在明场中成像。剩余的乳液在PCR热循环仪(Eppendorf Mastercycler Pro)上在65℃下进行酶裂解35分钟，盖子温度设置为105℃。裂解完成后，使用具有470nm激发光的Nikon 2000显微镜(ThorlabM470L5)捕获荧光图像(图11E)。

实施例结果总结：

本申请列举了三种靶向反应复合物的生产工艺。这些靶向反应复合物都可以与待检测物(细胞)结合：A)包裹水凝胶涂层的聚合物微球；B)一般球形水凝胶微球；C)碗形水凝胶微球。

应用本申请的靶向反应复合物，可实现单细胞分析，在打破泊松分布的同时提高细胞分析的效率。该流程涉及两个关键步骤：1.以细胞为代表的待分析物与靶向反应复合物进行孵育，并通过靶向配基进行有效结合；2.通过液滴微流控或枪头吹打，可高通量形成反应隔室，打破细胞分析的双泊松分布；

在隔室内进行高通量反应时，靶向反应复合物上的标签分子可对待分析物进行标记。其他公共反应物可通过混合溶液进入反应隔室。

实施例论证了球形微球尺寸必须大于细胞才能更高效地打破细胞结合的概率(双泊松分布)，当微球数量为细胞数量的10-20倍时，可进一步实现微球与细胞的1∶1结合(具体见图8A和图8B)；而当使用碗形的水凝胶微球时，位阻效应更为显著，微球数量无需比细胞数量过量太多。

一旦靶向反应复合物与细胞结合完成，高通量生成反应隔室(生成隔室后的图片应该是最重要的：9A为最重要的概念图；5E、8B、6C、9B为反应隔室形成前；9C为反应隔室形成后，如9C所示：液滴中没有找到一个反应隔室，仅有细胞、但没有微球的；意味着所有的细胞都被分析了，意味着打破泊松分布)可对细胞进行各种深度分析(包括细胞裂解、mRNA捕获或单细胞测序)。

尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims

1.一种形成反应隔室群的方法，所述方法包括：

准备待检测物群，其由两个以上待检测物构成；

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述待分析物选自蛋白质、核酸、糖、脂、代谢物、多肽、细菌、病毒、细胞器以及细胞中的一种或两种以上，以及由它们形成的复合体，最优选所述待分析物为细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述载体的形状选自正方体形、四面体形，球形、椭球形、章鱼形、碗形、红血球形的一种或两种以上；最优选为碗形和/或红血球形。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述载体的数量为所述待检测物数量的4倍及以上，优选为所述待检测物数量的10倍及以上，最优选为所述待检测物数量的10倍至30倍。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述载体为的最大直径为待检测物的1倍以上，优选其最大直径为待检测物的3倍及以上，最优选其最大直径为待检测物的4倍至10倍。

6.如权利要求3至5的任一项所述的方法，其中所述载体由聚合物或小分子构成，优选为聚合物载体，进一步优选为聚苯乙烯载体聚苯乙烯或水凝胶制成，进一步该聚合物载体由聚苯乙烯制成，最优选该聚合物带有铁磁性或顺磁性。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述靶向配基可以是天然或人造的，选自包括锁核酸和XNA的核酸及其类似物、适配体、小肽、多肽、糖基化肽、多糖、可溶性受体、类固醇、荷尔蒙、促分裂原、抗原、超级抗原、生长因子、细胞因子、瘦素、病毒蛋白、细胞黏附分子、趋化因子、链霉亲和素及其类似物、生物素及其类似物、抗体、抗体片段、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、T细胞受体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、抗原肽-MHC分子复合物(pMHC)、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、细胞内或细胞表面受体配基中的一种或两种以上以及它们共同形成的多重配基、复合配基、耦合配基。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述标签分子选自天然或人造的信息分子，包括：寡核苷酸条形码、寡肽或多肽条形码、由天然碱基与LNA、PNA、XNA等非天然碱基构成的核苷酸、寡糖或多糖条形码、生色团(chromophoric group)和助色团(auxochrome group)、金属原子或离子、分子量可区分的小分子、嵌段聚合物、聚合物与骨架分子共价连接物中的一种或两种以上以及它们之间形成的复合体。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述反应试剂是寡聚核苷酸引物、酶或小分子。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述载体直径粒径分布系数CV小于20％。