CN116648137A

CN116648137A - 甘草查尔酮c的农药组合物

Info

Publication number: CN116648137A
Application number: CN202180086297.6A
Authority: CN
Inventors: 大卫·帕尼克; 艾杜·科尔曼
Original assignee: Metabolic Insights Ltd
Current assignee: Metabolic Insights Ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2023-08-25
Also published as: US20240049707A1; IL303694A; EP4262390A1; EP4262390A4; WO2022137225A1

Abstract

提供一种包含甘草查尔酮C或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的组合物。还提供一种控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部位或植物繁殖材料的植物病原体侵染症状的方法，该方法包括向植物、植物部位、植物器官或植物繁殖材料，或者向所述植物周围的土壤施用农药有效量的甘草查尔酮C或包含甘草查尔酮C的农药组合物，其中，所述植物病原体为选自以下当中的一种：伞菌纲下的一个目；腐霉科下的一个属；选自核盘菌属和镰刀菌属的核盘菌科下的一个属；以及假单胞菌目下的一个科。

Description

甘草查尔酮C的农药组合物

技术领域

本发明总体涉及一种具有杀真菌和杀细菌特性的农用化合物。

背景技术

植物害虫及植物病是现代农业生产力面临的主要挑战。土传植物病原体会对农作物造成严重损害。丝核菌属(Rhizoctonia)植物病原真菌属于担子菌门(Basidiomycetes)系统发育谱系，会造成一大系列在商业上具有显著影响的植物病，如褐斑病、秧苗立枯病、蔬菜作物的根腐病及腹腐病以及水稻纹枯病。植物发生的所有丝核菌病以及随后的继发感染均难以控制(埃拉赫尔(Erlacher)等人，2014年)。

腐霉属(Pythium)为植物病原真菌样生物，属于称作卵菌纲(Oomycetes)的真核微生物的系统发育谱系，其会导致大面积的烟草、番茄、芥菜、辣椒及水芹秧苗立枯病(马丁(Martin)及洛珀(Loper)，2010年)。

镰刀菌属(Fusarium)为一大类丝状真菌，属于子囊菌纲(Ascomycetes)系统发育谱系。许多种类的镰刀菌对植物具有致病性，并会导致具有重要经济价值的植物(大部分为蔬菜)发生枯萎或“腐烂”等严重疾病。此外，镰刀菌属会感染谷物，导致玉米的赤霉病及穗腐病，并在某些条件下导致霉菌毒素积累(J·E·E·詹金斯(Jenkins)，Y·S·克拉克(Clark)及A·E·巴克尔(Buckle)，1998年)。

核盘菌属(Sclerotinia)为一种植物病原真菌，属于子囊菌纲系统发育谱系。核盘菌属会导致许多植物宿主(大部分为蔬菜)发生称作白霉病的疾病(https://anrcatalog.ucanr.edu/pdf/8042.pdf)。

假单胞菌属(Pseudomonas)为一类植物病原细菌，对多种作物具有毒性，会导致严重的叶部和茎部病变。假单胞菌属会使具有重要经济价值的作物和果树发生疾病，如欧防风及番茄的髓部坏死病、水稻的褐斑病及叶鞘褐腐病、杏树的细菌性溃疡病以及橄榄树的橄榄结病(摩尔(Moore)·L·W，1988；霍夫特(Hofte)·M及德(De)·沃斯(Vos)·P，2006年)。目前为止，人们已经试验了各种控制作物体内假单胞菌属的方法，包括培养控制法、宿主抗性法、微生物拮抗剂生物控制法以及化学控制法。所有这些方法均不能实现完全控制。

由于害虫抗药性逐渐增强，气候状况变化无常以及监管压力的逐渐增大，针对上述疾病为作物提供保护的可用活性成分的种类逐年减少。为了开发在环境方面具有可持续性的新型作物保护方案，急需新的活性成分。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及一种包括甘草查尔酮C或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。

在另一方面中，本发明提供一种控制、预防、减少或根除在植物、植物器官、植物部位或植物繁殖材料上的植物病原体侵染或其症状的方法，该方法包括：向植物、植物器官或植物繁殖材料，或者向所述植物周围的土壤，施用农药有效量的甘草查尔酮C或任一下述实施方式的农药制剂，其中，所述植物病原体为选自以下当中的一种：伞菌纲(Agaricomycetes)下的一个目；腐霉科(Pythiaceae)下的一个属；选自核盘菌属和镰刀菌属的核盘菌科(Sclerotiniaceae)下的一个属；以及假单胞菌目(Pseudomonadales)下的一个科。

附图说明

图1至图8所示为8项独立实验中甘草查尔酮C(LIC)对黄瓜秧苗存活状况的影响，存活状况测定为接种瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)7天后的疾病严重程度百分比。

图9至图11所示为3项独立实验中甘草查尔酮C(LIC)对黄瓜秧苗存活状况的影响，存活状况测定为接种立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)7天后的疾病严重程度。其中，*表示p值<0.05，**表示p值<0.01，#表示p值<0.1，n.s.表示与未治疗植物无显著差异。关于所使用的甘草查尔酮C配方的描述，见实施例7。总的来说，甘草查尔酮C在预防腐霉属和丝核菌属导致的植物死亡方面具有优异的功效(可高达100％)。

具体实施方式

根据本发明发现，对于伞菌纲下的立枯丝核菌、腐霉科下的瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、核盘菌科下的菌核核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)以及假单胞菌目下的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，甘草查尔酮C为一种强效农药。

美国化学文摘社(CAS)登记处将甘草查尔酮C确定为(E)-3-[4-羟基-2-甲氧基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基]-1-(4-羟基苯基)丙-2-烯-1-酮，化学式如下：

CAS登记号为144506-14-9。甘草查尔酮C为刺甘草查尔酮中的一种。

在某些实施方式中，所述农药组合物进一步包括农业上合适的或农业上可接受的溶剂或增溶剂。

在某些实施方式中，所述农业上可接受的溶剂或增溶剂为能够溶解或增溶甘草查尔酮C的水混溶性溶剂。

在某些实施方式中，能够溶解或增溶甘草查尔酮C的所述水混溶性溶剂为极性溶剂，如醇、酮、内酯、酮醇、乙二醇、乙二醇醚、酰胺、烷醇胺、亚砜及吡咯烷酮。

在具体实施方式中，所述组合物包括选自二甲基亚砜或乙醇的溶剂以及作为聚山梨酯类非离子表面活性剂的聚山梨酯20。

在另一方面，本发明提供一种控制、预防、减少或根除在植物、植物器官、植物部位或植物繁殖材料上的植物病原体侵染或其症状的方法，该方法包括：向植物、植物器官或植物繁殖材料，或者向所述植物周围的土壤，施用农药有效量的作为活性农药成分的甘草查尔酮C或其具有农药活性的盐，或上述任一实施方式的农药组合物，其中，所述植物病原体为选自以下当中的一种：伞菌纲下的一个目；腐霉科下的一个属；选自核盘菌属和镰刀菌属的核盘菌科下的一个属；以及假单胞菌目下的一个科。

本发明的治疗方法可例如用于以下疾病：丝核菌属引起的褐斑病、秧苗立枯病、蔬菜的根腐病及腹腐病及水稻纹枯病；腐霉属引起的烟草、番茄、黄瓜、芥菜、辣椒及水芹秧苗立枯病；镰刀菌属引起的蔬菜、香蕉的枯萎或“腐烂”；镰刀菌属引起的玉米顶腐病和穗腐病；禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小粒谷物赤霉病；核盘菌属引起的许多植物(大部分为蔬菜)的白霉病；假单胞菌属引起的欧防风及番茄的髓部坏死病、水稻的褐斑病及叶鞘褐腐病、杏树的细菌性溃疡病及橄榄树的橄榄结病。

在某些实施方式中，所述植物病原体为伞菌纲中的一种。

在某些实施方式中，所述伞菌纲植物病原体为鸡油菌目(Cantharellales)中的一种。

在某些实施方式中，所述鸡油菌目植物病原体为角担菌科(Ceratobasidiaceae)中的一种。

在某些实施方式中，所述角担菌科植物病原体为丝核菌属中的一种，如立枯丝核菌、甘薯丝核菌(Rhizoctonia bataticola，也称菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina))、胡萝卜丝核菌(Rhizoctonia carotae，也称扣状胡萝卜丝核菌(Fibulorhizoctonia carotae))、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis，禾谷角担菌(Ceratobasidium cereale)的无性态)、紫纹羽丝核菌(Rhizoctonia crocorum，或Thanatophytum crocorum，紫纹羽病菌(Helicobasidium purpureum)的无性态)、草莓丝核菌(Rhizoctonia fragariae，喙角担菌(Ceratobasidium cornigerum)的无性态)、斑叶兰丝核菌(Rhizoctonia goodyerae-repentis，也称喙角担菌)、稻丝核菌(Rhizoctoniaoryzae，也称旋卷似串担革菌(Waitea circinate)以及多枝丝核菌(Rhizoctoniaramicola，也称多枝角菌根菌(Ceratorhiza ramicola)，多枝角担菌(Ceratobasidiumramicola)的无性态)。

在某些实施方式中，所述植物病原体为立枯丝核菌。

在某些实施方式中，所述植物病原体为腐霉科中的一种。

在某些实施方式中，所述腐霉科植物病原体为腐霉属中的一种，如瓜果腐霉及终极腐霉(Pythium ultimum)。

在某些实施方式中，所述植物病原体为瓜果腐霉。

在某些实施方式中，所述植物病原体为选自核盘菌属和镰刀菌属的核盘菌科中的一种。

在某些实施方式中，所述植物病原体为镰刀菌属中的一种，如尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、布比水杨镰刀菌(Fusarium bubigeum)、旋卷镰刀菌(Fusarium circinatum)、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌、朗塞斯镰刀菌(Fusarium langsethiae)、梨孢镰刀菌(Fusariumpoae)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)、产毒镰刀菌(Fusarium venenatum)、拟轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)及杆状镰刀菌(Fusarium virguliforme)。

在某些实施方式中，所述植物病原体为尖孢镰刀菌。

在某些实施方式中，所述植物病原体为核盘菌属中的一种，如菌核核盘菌、北方核盘菌(Sclerotinia borealis)、球茎核盘菌(Sclerotinia bulborum(Wakker)Sacc.)、币斑核盘菌(Sclerotinia homoeocarpa F.T.Benn.)、小核盘菌(Sclerotinia minor Jagger)、蓖麻核盘菌(Sclerotinia ricini)、德巴里菌核核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)、诺布尔三叶草核盘菌(Sclerotinia spermophila Noble)、具槽核盘菌(Sclerotinia sulcate)、三叶草核盘菌(Sclerotinia trifoliorum Erikss.)及鹿食草核盘菌(Sclerotinia veratri)。

在某些实施方式中，所述植物病原体为菌核核盘菌。

在某些实施方式中，所述植物病原体为假单胞菌目中的一种。

在某些实施方式中，所述假单胞菌目植物病原体为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)中的一种。

在某些实施方式中，所述假单胞菌科植物病原体为假单胞菌属中的一种，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)及丁香假单胞菌。

本发明农药组合物可配制成用于促进所述活性农药成分的施用的制剂。

所述制剂可以为水混溶性制剂，如悬浮剂(SC)、微囊悬浮剂(CS)、水分散粒剂(WG)、乳油(EC)、可湿性粉剂(WP)、可溶(液)剂及可溶粉剂(SP)。

该制剂可进一步包括至少一种溶剂或增溶剂、佐剂、载体、稀释剂及/或表面活性剂。

佐剂例如但不限于为活化剂佐剂，如阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，油剂，以及能够提高所述农药产品活性的氮基肥料。油剂可以为作物油，如基于石蜡或石脑油的石油类油剂，基于可乳化石油类油剂的作物油浓缩物，以及从种子油(通常为棉花籽油、亚麻籽油、大豆油或葵花籽油)获得的蔬菜油浓缩物，用于抑制禾本科杂草。氮基肥料可以为硫酸铵或尿素硝酸铵。

增溶剂或溶剂例如但不限于为石油类溶剂，上述油剂，以及脂肪酸、乙醇、甘油及二甲基亚砜的液体混合物。所述农业上可接受的溶剂或增溶剂可以为例如极性溶剂之类能够溶解或增溶甘草查尔酮C的水混溶性溶剂，所述极性溶剂例如为醇、酮、内酯、酮醇、乙二醇、乙二醇醚、酰胺、烷醇胺、亚砜及吡咯烷酮。

载体例如但不限于为沉淀二氧化硅、胶态二氧化硅、绿坡缕石、瓷土、滑石、高岭土及其组合。

所述农药制剂可进一步包括稀释剂，如乳糖、淀粉、尿素、水溶性无机盐及其组合。

所述农药制剂可进一步包括一种或多种表面活性剂，如聚山梨酯类非离子表面活性剂、苯乙烯丙烯酸分散剂聚合物、基于酸性树脂共聚物的分散剂、聚羧酸钾、烷基萘磺酸钠混合物、二异丙基萘磺酸钠、萘磺酸缩合物钠盐、木质素磺酸盐及其组合。

在上述任一实施方式的方法中，甘草查尔酮C、组合物或包含甘草查尔酮C、组合物的制剂通过喷洒、浸没、掺拌、包衣、丸粒化或浸泡，施用至所述植物、部位、器官或其植物繁殖材料。

定义

本文中，“农药”一词是指在控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部位、植物繁殖材料或植物周围的土壤的植物病原体侵染或其症状方面有效的化合物，并且包括抗细菌剂、杀真菌剂、除草剂及杀虫剂。

本文中，“活性农药成分”一词是指在作为农药方面有效的化合物。

本文中，“植物器官”一词是指叶、茎、根及生殖结构。

本文中，“植物部位”一词是指与营养繁殖相关的植物材料，如插条或块茎、叶、花、树皮或茎。

本文中，“植物繁殖材料”一词是指植物的种子、根、果实、块茎、球茎、根茎或植物的一部分。

本文中，“农药有效量”一词是指在控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部位、植物繁殖材料或植物周围的土壤的植物病原体侵染或其症状方面有效的农药量。

本文中，“纲”、“目”、“科”、“属”、“种”各词的用法遵循《国际藻类、真菌及植物命名法规》的第3.1条。

权利要求书中使用的“包括”一词为“开放”性词语，不但指所列出的元素或其结构或功能上的等同物，而且指未列出的任何其他一个或多个元素。该词不应解释为仅限于其后所列出的事物，也不排除其他元素或步骤。该词需解释为指明存在所提及的特征、整体、步骤或部件，但不排除存在或加入一个或多个其他特征、整体、步骤、部件或其组成的组。因此，“一种组合物，包括x和z”这一表述的范围不应限制于仅由化合物x和z组成的组合物。同样地，“一种方法，包括步骤x和步骤z”这一表述不应限制于仅由此两步骤组成的方法。

本文中，“和/或”一词包括一个或多个相关列举事项的任何和所有组合。除非另有定义，本文中的所有词语(包括科技术语)与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的含义相同。还应理解的是，词语(如常用词典中定义的词语)应解释为具有与其在本说明书上下文及相关技术领域背景中的含义相一致的含义，而且除非本文中明确指出，否则不应按照理想化或过于正式的方式进行理解。出于简洁和/或清楚起见，众所周知的功能或结构可能不会进行详细描述。

除非另有说明，否则本说明书中使用的所有数字均应理解为在所有情况下均以“约”一词修饰。除非特别指出，否则本文中的“约”一词均应理解为处于本技术领域的正常公差范围内，例如处于平均值的两个标准偏差范围内。在一种实施方式中，“约”一词表示处于其所修饰的数字所给出的数值的10％的偏差以内，优选处于所给出的数值的5％的偏差以内。例如，“约”一词可直观地理解为处于所列值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的偏差以内。在其他实施方式中，取决于所使用的实验技术等，“约”一词可表示更大的偏差容限。本领域技术人员应理解与给定值存在偏差的情况，而且此类情况处于本发明框架之内。作为一种说明示例，“约1至约5”这一数值范围应解释为不仅包括“约1至约5”中明确列出的值，而且包括所给范围中的单独值以及子范围。因此，这一数值范围包括2、3、4之类的单独值，以及各个子范围，例如，1～3，2～4，3～5，以及1、2、3、4、5或6。这一原则同样适用于仅给出一个作为最小值或最大值的数值的范围。除非根据上下文明确可知，否则本文给出的所有数值均以“约”一词修饰。“基本上”、“总体上”、“以内”等其他类似词语应解释为以使得所修饰的词语或数值变得不绝对的方式修饰该词语或数值。此类词语随具体情况以及其所修饰的词语而定，这与本领域技术人员对这些词语的理解方式一致。这方面至少包括具体实验、技术或用于测量某值的仪器的预期实验误差、技术误差以及仪器误差。

以下，通过非限制性实施例，对本发明进行说明。

实施例

缩略语表：

RPM–每分钟转数

RCF–相对离心力

CFU–菌落形成单位

PDBC–含20μg/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖肉汤

PDAC–含20μg/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂

PDAT–含12μg/ml四环素的马铃薯葡萄糖琼脂

DMSO–二甲基亚砜

LB–LB肉汤

LBA–LB琼脂

SCH–施密特纳(Schmittner)培养基

2倍稀释PDBC–以无菌蒸馏水2倍稀释的PDBC

PDA–马铃薯葡萄糖琼脂

PDBT–含12μg/ml四环素的马铃薯葡萄糖肉汤

实施例1：通过基于微孔板的测定进行甘草查尔酮C对立枯丝核菌的生物活性筛查

概要：

将以DMSO稀释的甘草查尔酮C加入微孔板的板孔内，并与50μl菌丝悬浮液混合。通过读板仪和目视检验，观察以混合菌丝为起始物的真菌生长情况。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：PDAC，PDBC，DMSO

设备:读板仪，离心机，摇床，培养箱

方法：

制备立枯丝核菌菌丝接种物

在盛有PDAC的90mm培养皿内培养该丝核菌，以获得生长时间为1～4天以内的菌丝。

在250ml无菌锥形瓶内加入50ml的PDBC培养基。

以手术刀将固体培养基切成数个小块，放入锥形瓶中。

在27℃和150RPM下，在摇床上培养2～4天。

丢弃液体部分，将菌丝倒入空的培养皿中。

以手术刀从菌丝上切下多个小条，将其放入盛有50ml的PDBC培养基的250ml无菌锥形瓶内。

制备4瓶培养物，在27℃和150RPM下摇动培养3天。

将培养物在冰箱中冷藏1小时。

将低温培养物倒入250ml烧杯中。

加入20ml低温PDBC，以使得混合物覆盖搅拌器叶片。

利用搅拌器，将培养物在冰上以最大速度搅拌2分钟，并将搅拌器上下提动若干次。

将混合物保持于冰上。

将约5ml的搅拌过后的混合物移入置于冰上的15ml试管中。

将15ml试管内的培养物在冰上匀浆2分钟，根据需要上下提动试管。

按照上述方式，进行若干批的5ml匀浆，以制备所需的量(以5ml匀浆的培养物制备约100ml的接种物)。

将匀浆液的一部分稀释10倍，以确定匀浆液浓度。该悬浮液浓度应为4×10⁴CFU/ml(10倍稀释后的浓度应为4000CFU/ml)。

按1：20的比例，将接种物母液稀释于PDBC中(1ml前者稀释于20ml的后者内)，或者计算所需的稀释倍数，以制备2000CFU/ml的最终浓度。每一板孔内的量应为约100CFU。

制备用于甘草查尔酮C生物活性实验的微孔板：

1)从-20℃的冷柜中取出1％甘草查尔酮C母液(经纯化的溶于DMSO内的1％甘草查尔酮C)，将其在工作台上解冻。

2)取1μl的1％甘草查尔酮C母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

3)以多通道移液器取10μl的稀释(250ppm)甘草查尔酮C溶液，将其移入微孔板的板孔中。

4)以多通道移液器在微孔板的板孔中加入40μl剧烈混合后的孢子悬浮液接种物。

5)以透明密封物密封孔板。

6)将孔板在2000RPM下摇动10分钟，以将甘草查尔酮C与菌丝悬浮液混合。

7)将孔板在1000RCF下离心1秒后停止离心，并收集孔板底部的液体。

8)将微孔板保持于工作台上，直至以读板仪读板。

9)以读板仪读板。

10)收集工作台上的孔板。

11)将收集的孔板放入带有布盖的塑料盒中，并将该盒放入27℃的培养箱中。

孔板筛查：

1)除测定开始当天之外，还在另外3天内筛查孔板，即分别在第3天、第7天、第14天及第21天筛查。

2)计算每次筛查时的吸光度与初始吸光度之间的差异。

3)计算每一时间点下每一板孔的生长抑制百分比，其中，将以DMSO处理的对照孔板的结果作为100％生长量。

结果：见实施例6。

实施例2：通过微孔板进行甘草查尔酮C对瓜果腐霉的潜在生物活性筛查

概要：

将以DMSO稀释的甘草查尔酮C加入微孔板的板孔内，并与50μl的游动孢子PDBC悬浮液混合。通过读板仪和目视检验，观察以游动孢子为起始物的真菌生长情况。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：

SCH，PDBC，DMSO

设备：

读板仪，离心机，摇床，培养箱

方法：

制备腐霉菌丝接种物：

在盛有SCH的90mm培养皿内培养瓜果腐霉，以获得能够生产孢子的菌丝。每一培养皿生产50ml的游动孢子悬浮液，足以供十个96孔板进行生物活性筛查。

在250ml无菌锥形瓶中加入60ml的无菌水。

以手术刀将两培养皿中的固体培养基切成12小块(每一培养皿12小块)，并将其放入锥形瓶(固体小块应被水没过)。

将菌丝在17℃下静置过夜，令其生产孢子。

以手摇动锥形瓶，以使游动孢子悬浮。

将悬浮液经16层纱布滤入50ml试管。

将悬浮液移入500ml无菌试剂瓶中。

丢弃固体部分，并以次氯酸盐将锥形瓶消毒。

将游动孢子悬浮液在冰上冷却。

测定悬浮液的游动孢子浓度(该浓度应为1000～4000个孢子/ml)。

以经冰箱冷藏的无菌蒸馏水，将悬浮液稀释于500ml无菌试剂瓶中。

加入相同体积的(与悬浮液体积相同)经冰箱冷藏且无菌的2倍稀释PDBC，以获得500～2000个孢子/ml的接种物。稀释后，每一板孔内的游动孢子量为25～100个。

将游动孢子悬浮液接种物保持于冰上。

制备用于甘草查尔酮C生物活性实验的微孔板：

2)取1μl的1％甘草查尔酮C母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

5)以透明密封物密封孔板。

8)将微孔板保持于工作台上，直至以读板仪读板。

9)以读板仪读板。

10)收集工作台上的孔板。

孔板筛查：

2)计算每次读板时的吸光度与初始吸光度之间的差异。

结果：见实施例6。

实施例3：通过微孔板进行甘草查尔酮C对尖孢镰刀菌的潜在生物活性筛查概要：

将以DMSO稀释的甘草查尔酮C加入微孔板的板孔内，并与新鲜制备的孢子悬浮液混合。通过读板仪和目视检验，观察以冷冻孢子为起始物的真菌生长情况。

背景:

镰刀菌为一种属于子囊菌纲的真菌，而且为一种土传病原体。镰刀菌极易生产大量孢子，这些孢子能够在-20℃下存活于60％的液体甘油中。因此，发明人在生物活性筛查实验中使用冷冻孢子母液，而非针对每一实验制备新鲜孢子。

目标：

确定甘草查尔酮C对镰刀菌的存活和生长的影响。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：PDAC，PDBC，DMSO

设备：读板仪，离心机，摇床，培养箱

方法：

制备镰刀菌孢子悬浮液：

1)将含生长中的镰刀菌的琼脂块置于PDAC板中央的PDAC中，25℃下培养9天。

2)将板在冰箱中冷藏至少1小时。

3)在50ml试管中加入30ml经冰箱冷藏的60％无菌甘油溶液。

4)以手术刀将带有菌丝和孢子的琼脂板切成小块，并放入盛有30ml的60％甘油的50ml试管中。

5)3000RPM下摇动1分钟。

6)在整个过程中，将孢子保持于冰上。

7)将液体转入新的50ml无菌试管内(所得体积应为约25ml)。

8)将孢子悬浮液经16层纱布直接滤入干净的50ml无菌试管中，并丢弃菌丝。

9)计算孢子浓度(40×10放大倍数)，并以低温60％无菌甘油溶液稀释至2×10⁵个孢子/ml。

10)将孢子悬浮液等分成1ml每份并将其放入1.5ml试管中，每一等份供20个孔板进行筛查。

11)将孢子悬浮液于-20℃下保存。

制备用于筛查的孢子悬浮液：

1)从冷柜中取出1ml的冷冻孢子悬浮液，将其在冰上解冻。

2)将200μl的孢子悬浮液与20ml经冰箱冷藏的PDBC在50ml试管中混合，以获得2000个孢子/ml的悬浮液；

3)利用上述浓度，对每孔100个孢子的4个微孔板进行筛查。

制备用于甘草查尔酮C生物活性实验的微孔板:

2)取1μl的1％甘草查尔酮C母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

5)以透明密封物密封孔板。

8)将微孔板保持于工作台上，直至以读板仪读板。

9)以读板仪读板。

10)收集工作台上的孔板。

11)将收集的孔板放入带有布盖的塑料盒中，并将该盒放入25℃的培养箱中。

读板

1)除测定开始当天之外，还在另外3天内筛查孔板，即分别在第3天、第7天、第14天及第21天读板。

2)计算每次读板时的吸光度与初始吸光度之间的差异。

结果：见实施例6。

实施例4：通过微孔板进行甘草查尔酮C对菌核核盘菌的潜在生物活性筛查

概要：

将以DMSO稀释且经纯化的甘草查尔酮C加入微孔板的板孔内，并与50μl菌丝悬浮液混合。通过目视检验，观察以混合菌丝为起始物的真菌生长情况。

背景:

菌核核盘菌为一种属于子囊菌纲的真菌，而且为一种土传病原体。由于菌核核盘菌难以生产大量孢子，因此本筛查中选择以菌丝接种，而非以孢子接种。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：PDBC，PDA，PDAT，PDBT，DMSO

设备:离心机，摇床，培养箱

方法：

制备菌核核盘菌菌丝接种物：

在盛有PDA的试管内，将菌核核盘菌在21℃下培养4天。

转移琼脂块，并在盛有PDAT的90mm培养皿内21℃下培养菌核核盘菌，以获得生长时间为3天以内的菌丝。

在250ml无菌方形瓶内加入50ml的PDBT培养基。

以手术刀将固体培养基切成15个极小的块(1×5mm)，放入方形瓶中。

在21℃和130RPM下，在摇床上培养2天。

丢弃液体部分，将菌丝倒入空的培养皿中。

以手术刀从菌丝上切下多个小条(避免带入琼脂)，将其放入盛有50ml的PDBT培养基的250ml无菌方形瓶内。

21℃下培养2天，通过在130RPM下摇动而获得快速生长的分散菌丝。

将培养物在冰箱中冷藏1小时。

将低温培养物倒入50ml试管中。

将混合物保持于冰上。

将约5ml的搅拌过后的混合物移入置于冰上的15ml试管中。

将15ml试管内的培养物在冰上匀浆2分钟。

按照上述方式，进行若干批的5ml匀浆，以制备所需的量(以5ml匀浆的培养物制备约50ml的接种物)。

将匀浆液的一部分稀释10倍，以确定匀浆液浓度。该悬浮液浓度应为2×10⁴CFU/ml(10倍稀释后的浓度应为2000CFU/ml)。

按1：10的比例，将接种物母液稀释于PDBC中(2ml前者稀释于20ml的后者内)，或者计算所需的稀释倍数，以制备2000CFU/ml的最终浓度。每一板孔内的最终菌丝数应为100CFU。

制备用于活性实验的微孔板

2)取1μl的1％甘草查尔酮C母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

5)以透明密封物密封孔板。

8)收集工作台上的孔板，直至所有微孔板可供进行培养。

9)将收集的孔板放入塑料盒中，并将该盒放入21℃的培养箱中。

孔板筛查：

1)除接种当天之外，还在第4天、第7天、第14天及第21天筛查孔板，共5天。

2)在灯光下目视评估甘草查尔酮C对真菌经时生长状况的影响。

3)在取下盒盖后检视孔板，如果盒盖上(内侧)有液状物，通过在60℃下加热，将该液状物蒸发。

4)将每一板孔的菌丝生长状况与对照孔板的板孔(含活性杀真菌剂或0.5％DMSO溶液)内菌丝生长状况相比较。

5)在特殊设计的表格中记录结果：板孔清澈＝3(无菌丝生长)；正常菌丝结构＝1(正常生长)；不确定＝2(非预期类型的固体结构，或板孔区域仅部分覆盖)。

结果：见实施例6。

实施例5：通过微孔板进行甘草查尔酮C对丁香假单胞菌的潜在生物活性筛查

背景：

假单胞菌为一种杆状的革兰氏阴性细菌。本生物活性筛查实验以配制于60％甘油内的冷冻细菌母液为接种物。

概要：

将以DMSO稀释的甘草查尔酮C加入微孔板的板孔内，并与100μl冷冻细菌悬浮液混合。通过目视检验，观察假单胞菌的生长情况。

其中，使用如下材料、方法及设备。

材料：LB，LBA，DMSO

设备:离心机，摇床，培养箱

方法：

制备假单胞菌悬浮液

1)将假单胞菌在LBA培养板上28℃培养2天，以获得单个菌落。

2)以无菌牙签将单个菌落移入盛有5ml LB的50ml无菌试管内，并在28℃和150RPM下培养24小时。

3)将试管在冰箱内冷藏1小时。

4)向试管内加入7.5ml经冰箱冷藏的无菌甘油溶液，以获得60％甘油溶液。

5)通过1000RPM涡旋进行均匀轻柔混合，以达到完全混合效果。

6)将60％甘油细菌悬浮液等分为100μl每份并将其放置于1.5ml试管中，每一等份足以供10个孔板进行筛查。

7)将细菌悬浮液在-20℃的60％甘油内保存。

制备用于生物活性筛查实验的假单胞菌悬浮液：

1)从冷柜中取出内盛100μl冷冻假单胞菌悬浮液的1.5ml试管，并将其在冰上解冻。

2)在通风橱内内将40ml经冰箱冷藏的LB倒入50ml试管；

3)将40μl的细菌悬浮液与50ml试管内所盛的40ml经冰箱冷藏的LB混合，该量足以供10个微孔板的活性筛查。

4)以所得悬浮液进行生物活性筛查实验。

制备用于生物活性筛查实验的微孔板

2)取1μl的1％甘草查尔酮C母液，并以39μl的水稀释至250ppm。

4)以多通道移液器在微孔板的板孔中加入40μl剧烈混合后的细菌悬浮液接种物。

5)以透明密封物密封孔板。

6)将孔板在2000RPM下摇动10分钟，以将甘草查尔酮C与细菌悬浮液混合。

9)将孔板放入带盖塑料盒中，并将该盒放入28℃的培养箱中。

微孔板的生物活性筛查：

1)在接种后的第3天、第5天、第7天、第14天及第21天的5天内筛查孔板。

2)在灯光下目视评估细菌生长状况。

3)筛查前的孔板准备工作：将孔板在2000RPM下摇动2分钟，以使细菌悬浮，然后将孔板在1000RCF下离心数秒钟。

4)在取下盒盖后检视孔板，如果盒盖上(内侧)有液状物，通过在60℃下加热，将该液状物蒸发。

5)将每一板孔的透明度与对照板孔(含对照杀细菌剂或0.5％DMSO溶液)的透明度相比较。

6)以具有如下含义的条项记录结果：清澈＝3(无细菌生长)；浑浊＝1(正常细菌生长)；不确定＝2(与0.5％DMSO溶液中的生长状况相比，浑浊度极低)。

结果：见实施例6。

体内验证实验的统计分析

为了在与对照植物(感染但未治疗)的对比下评价甘草查尔酮C对已感染植物的效果，通过学生t检验对所得数据进行分析，并计算p值。每项试验最少重复三次。如果p<0.05，则认为结果具有显著性。数据表示为平均值附加各项重复生物实验的标准差平均值的形式。其中，*表示p值<0.05，**表示p值<0.01，#表示p值<0.1。

实施例6：基于实施例1～5方案的体外实验结果

体外筛查矩阵

针对选定的农业害虫(如下表所示)，对甘草查尔酮C进行筛查。其中，生物活性值以百分比的形式表示，并反映了其根除目标害虫的潜力。

生物活性相对值(表示为最大值的百分比)的计算原则

1.立枯丝核菌、菌核核盘菌、尖孢镰刀菌、瓜果腐霉：活性等级(1/2/3)×重复次数×活性保持天数/252(最大值3×4×21＝252)*100

2.丁香假单胞菌：活性等级(1/2/3)×重复次数×活性保持天数/168(最大值3×4×14＝168)*100

总而言之，针对如下害虫，甘草查尔酮C是一种有效的农药：瓜果腐霉(其有效性见下文的体内结果部分)；立枯丝核菌(其有效性见下文的体内结果部分)；菌核核盘菌；尖孢镰刀菌；以及丁香假单胞菌。

实施例7：体内(温室条件下)验证制剂的制备

制剂1：最终浓度为400ppm，组成如下：

A、40％–溶于25％碳酸钠水溶液中的0.1％甘草查尔酮C

B、10％(重量百分比)–0.6％喜威(Silwet，有机硅表面活性剂)母液

C、10％(重量百分比)–0.4％黄原胶(Xanthan Gum)母液

D、40％–水

在制备溶液A时，先将甘草查尔酮C溶于水中，获得0.1％溶液，并超声处理5～10分钟。然后，加入碳酸钠，直至最终浓度达到25％，并将其充分混合(该溶液的pH值应为8)。

A、B、C、D充分混合后获得最终制剂。最终制剂1以400ppm施用至黄瓜秧苗，或者先稀释至所需浓度，然后施用至黄瓜秧苗。

制剂2：最终浓度为400ppm，组成如下：

A、0.4％–含吐温20(聚山梨醇酯-20)的10％甘草查尔酮C乙醇溶液

B、10％(重量百分比)–0.6％喜威母液

C、10％(重量百分比)–0.4％黄原胶母液

D、79.6％–水

在制备溶液A时，先将甘草查尔酮C溶于乙醇中，获得0.1％溶液，并超声处理5～10分钟。然后，加入非离子洗涤剂吐温20，直至最终浓度达到1％，并将其充分混合。所得溶液经氮气中蒸发处理，获得10％的甘草查尔酮C溶液。

A、B、C、D充分混合后获得最终制剂。制剂4以400ppm施用至黄瓜秧苗，或者先稀释至所需浓度，然后施用至黄瓜秧苗。

实施例8：对感染瓜果腐霉的黄瓜秧苗进行温室条件下的体内验证

概述：在以甘草查尔酮C(LIC)进行预防性治疗后，对瓜果腐霉病严重程度的发展状况进行评估。

制备腐霉接种物：

1)将10ml的藜麦种子放入100ml的瓶中。

2)加入10ml的无菌蒸馏水。

3)将种子在冰箱中放置24小时，令其吸水。

4)24小时后，在瓶顶放置透气的布，并松松地合上顶部瓶盖。

5)高压灭菌40分钟(121℃)(液体循环)

6)在通风橱内冷却，并取下瓶盖

7)以长于PDAC培养板上的小块腐霉菌接种藜麦种子。

8)再次盖上透气的布以及瓶盖。

9)将在瓶中以固态生长的腐霉放入27℃的培养箱内。

11)5天后，腐霉菌应可供接种植物。

12)将腐霉菌丝匀浆至所需体积：

A、以250ml烧杯及棒式搅拌机制备混合物。

B、加入100ml水

C、加入1g的固状腐霉菌培养物，获得1％菌丝悬浮液。

D、在冰上高速匀浆2分钟。

E、以无菌水稀释匀浆后的菌丝悬浮液，获得0.5％菌丝悬浮液。

F、稀释后，立即以匀浆后的菌丝悬浮液接种土壤，并将其保持于4℃下，以供后续使用。

秧苗发芽条件

1)使用在育苗盘中发芽的6日龄黄瓜秧苗。使用合适的黄瓜品种，以允许疾病发展。秧苗应为6日龄。土壤种植基质的组成以优质的椰子和珍珠岩为基础(50％对50％)，并具有良好透水、通风特性以及完全的惰性。

2)秧苗在温室内于如下育苗条件发芽：40ppm的氮磷钾肥；每天浇水两次。

3)实验开始前，将秧苗子叶已完全展开但首片真叶尚未长出的育苗盘从浇水系统中取出，以允许治疗药物浸渗。

4)播种后第6天开始治疗。第7天，在每一苗穴内加入接种物。

施加治疗

1)根据实施例7配制甘草查尔酮C。

2)当采用淋施时，每一苗穴分别施加5～6ml甘草查尔酮C制剂。

3)当采用喷施时，不同治疗条件采用不同施加方式。每8株秧苗施加5ml具有相应浓度的分子制剂。喷洒采用塑料喷雾器，直至秧苗的叶片充分吸收。

4)在小规模实验中，每一条件下测试的秧苗数为n＝8(187a号、206号、177a号、187b号、206b号实验)。在大规模实验(204、271及286号实验)中，每一条件下测试的秧苗数为n＝24，但未治疗组的测试苗数为n＝16。

土壤接种：

1)秧苗在以甘草查尔酮C治疗后的24小时接种(预防法)。

2)利用移液器，分别在每一苗穴处的土壤表面散播5～6ml的接种物。每一苗穴处的土壤应将所有的接种物完全吸收。治疗药物与接种物应会均匀分布于根围。

生长与分析：

1)在正常浇水条件下令黄瓜秧苗继续生长7天。

2)在第7天(播种后14天)，进行疾病严重程度的评价。

3)疾病症状：秧苗应因根腐病而开始倒伏，而且接地处的杆部应出现褐色。

4)接种后第7天，统计病苗和死苗。

5)计算每一治疗方案的死亡率百分比。

结果：甘草查尔酮C获得优异的黄瓜秧苗腐霉病预防结果——两种不同制剂在100～400ppm剂量下的功效均高达100％。

实施例9：对感染立枯丝核菌的黄瓜秧苗进行温室条件下的体内验证

概述：在以甘草查尔酮C(LIC)进行预防性治疗后，对丝核菌病严重程度进行评估。其中，以菌丝感染6日龄的黄瓜秧苗，该黄瓜秧苗已采用甘草查尔酮C进行治疗。

制备丝核菌接种物：

1)将10ml的藜麦种子放入100ml的瓶中。

2)加入10ml的无菌蒸馏水。

3)将藜麦种子在冰箱中4℃下放置24小时，令其吸水。

4)24小时后，在瓶顶放置透气的布，并松松地合上顶部瓶盖。

5)高压灭菌40分钟(121℃)(液体循环)

6)在通风橱内冷却，并取下瓶盖

7)以长于PDAC(含20μg/ml氯霉素的马铃薯葡萄糖琼脂)培养板上的小块丝核菌接种藜麦种子。

8)再次盖上透气的布以及瓶盖。

9)将在瓶中以固态生长的丝核菌放入27℃的培养箱内。

10)8～10天后，丝核菌应可供接种黄瓜秧苗。

11)将丝核菌菌丝匀浆至所需体积：

以250ml烧杯及棒式搅拌机制备混合物；

加入100ml水；

加入1g的固状丝核菌培养物，获得1％菌丝悬浮液；

在冰上高速匀浆2分钟。

12)以无菌水稀释匀浆后的菌丝悬浮液，获得0.5％菌丝悬浮液。

13)稀释后，立即以匀浆后的菌丝悬浮液接种土壤(保持于4℃下，以供后续使用)。

黄瓜秧苗发芽方法

1)使用在育苗盘中发芽的136株6日龄黄瓜秧苗。使用合适的敏感性黄瓜品种，以允许疾病发展。秧苗应为6日龄。土壤种植基质的组成以优质的椰子和珍珠岩为基础(50％对50％)，并具有良好透水、通风特性以及完全的惰性。

2)秧苗在温室内于如下育苗条件发芽：40ppm的氮磷钾肥；每天浇水两次(夏季)。在冬季条件下，需要不同的浇水方式。

3)实验开始前，将秧苗子叶已长全但首片真叶尚未长出的育苗盘从浇水系统中取出，以允许治疗药物渗入土壤。

4)播种后第6天开始治疗。第7天，在每一苗穴内加入接种物。

施加治疗

1)根据实施例7配制甘草查尔酮C。

2)当采用5～6ml治疗药物淋施时，每一苗穴分别施加相应浓度的治疗药物。

3)当采用喷施时，不同治疗条件采用不同施加方式。各株黄瓜秧苗施加5ml具有相应浓度的甘草查尔酮C制剂。秧苗喷洒采用塑料手动喷雾器，直至秧苗的叶片充分吸收。

4)在小规模实验中，每一治疗条件下测试的秧苗数为n＝8(178号和185号实验)。在大规模实验(252号实验)中，每一治疗条件下测试的秧苗数为n＝24，但未治疗组的测试苗数为n＝16。

土壤接种：

1)在以甘草查尔酮C治疗后的24小时进行接种(预防法)。在治疗后及接种之前，秧苗一直不浇水，以避免甘草查尔酮C被洗脱。

2)利用10ml移液器，分别在每一苗穴处的土壤表面散播5～6ml的接种物。每一苗穴处的土壤应将所有的接种物完全吸收。治疗药物与接种物应会均匀分布于根围。

3)生长与分析：

4)在正常浇水条件下令黄瓜秧苗继续生长7天。

5)在第7天(播种后14天)，进行最终疾病评估。

6)疾病发展表现：秧苗应因根腐病而开始倒伏，而且接地处的杆部应出现褐色。

7)统计病苗和死苗。

8)计算每一治疗方案的死亡率百分比。

结果：甘草查尔酮C获得优异的黄瓜秧苗丝核菌病预防结果——两种不同制剂在100～400ppm剂量下的功效为66.66～100％。

参考文献

埃拉赫尔·A，卡尔迪纳莱(Cardinale)·M，格罗什(Grosch)·R，博格(Berg)·G，病原体——立枯丝核菌及其有益对应物——解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)对本地莴苣微生物组的影响，微生物学前沿(Front Microbiol.)，2014年，5：175，在线发布日：2014年4月21日，doi:10.3389/fmicb.2014.00175。

霍夫特·M及德·沃斯·P，植物致病性假单胞菌种，格南纳马尼卡姆(Gnanamanickam)·S·S(编辑)，植物相关细菌，2006年，507～533。

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弗兰克(Frank)·N·马丁及乔依斯(Joyce)·E·洛珀，腐霉属引起的土传植物病：生态学、流行病学及生物防治前景，植物科学评论(Critical Reviews in PlantSciences)，1999年，18：111～181。

摩尔·L·W，丁香假单胞菌：疾病与冰核活性，西北观赏植物简报(OrnamentalsNorthwest Newsletter)，1988年，第12期：4～16。

Claims

1.一种控制、预防、减少或根除植物、植物器官、植物部位或植物繁殖材料的植物病原体侵染症状的方法，其特征在于，该方法包括：向植物、植物器官或植物繁殖材料，或者向所述植物周围的土壤，施用以下当中的任何一者：

(a)农药有效量的化合物(E)-3-[4-羟基-2-甲氧基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基]-1-(4-羟基苯基)丙-2-烯-1-酮；或

(b)所述化合物的农业上可接受的盐；或

(c)包含所述化合物作为活性农药成分的农药组合物，

其中，所述植物病原体为选自以下当中的一种：伞菌纲下的一个目；腐霉科下的一个属；选自核盘菌属和镰刀菌属的核盘菌科下的一个属；以及假单胞菌目下的一个科。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病原体为伞菌纲中的一种。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述伞菌纲植物病原体为鸡油菌目中的一种。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述鸡油菌目植物病原体为角担菌科下的一个属。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述角担菌科植物病原体为丝核菌属中的一种，如立枯丝核菌。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病原体为腐霉科中的一种。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述腐霉科植物病原体为腐霉属中的一种，如瓜果腐霉。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病原体为选自核盘菌和镰刀菌的核盘菌科下的一个属，如菌核核盘菌及尖孢镰刀菌。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物病原体为假单胞菌目中的一种。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌目植物病原体为假单胞菌科下的一个属。

11.一种包含化合物(E)-3-[4-羟基-2-甲氧基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基]-1-(4-羟基苯基)丙-2-烯-1-酮或其农业上可接受的盐作为活性农药成分的农药组合物。