[go: up one dir, main page]

CN116635712A - 用于随机传感的可编程纳米反应器（pnrss） - Google Patents

用于随机传感的可编程纳米反应器（pnrss） Download PDF

Info

Publication number
CN116635712A
CN116635712A CN202180076322.2A CN202180076322A CN116635712A CN 116635712 A CN116635712 A CN 116635712A CN 202180076322 A CN202180076322 A CN 202180076322A CN 116635712 A CN116635712 A CN 116635712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanopore
pnrss
reaction
binding
event
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180076322.2A
Other languages
English (en)
Inventor
黄硕
贾文东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University
Original Assignee
Nanjing University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University filed Critical Nanjing University
Publication of CN116635712A publication Critical patent/CN116635712A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

提供了一种用于表征目标分析物的系统和方法。该系统包含纳米孔和聚合物链，该聚合物链包含系链位点和反应段，其中通过系链位点系链聚合物链，使得聚合物链不能穿过纳米孔，并且其中反应段包含至少一个传感模块，该传感模块可以与目标分析物的单个分子相互作用。

Description

用于随机传感的可编程纳米反应器(PNRSS)
技术领域
本发明涉及使用纳米孔识别分析物的系统和方法。
背景技术
尽管是以单分子来描述和表示，但化学反应很少在单分子水平上被监测或表征，而是以整体进行。目前的仪器，包括扫描探针显微镜1、尖端/表面增强拉曼谱2、分子结3、单分子力谱4或生物纳米孔5，几乎没有能够解析单个分子的化学反应的离散步骤的。然而，这些现有技术报告了单分子特性的不同方面。扫描通道显微镜和分子结侧重于目标分子的电子状态。拉曼谱侧重于研究化学键的振动。而力谱则测量分子的弹性。
生物纳米孔，包括α-溶血素(α-HL)6、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)7、气溶素8、CsgG9、溶细胞素A(ClyA)10、fragaceatoxin C(FraC)11、侧耳溶血素(pleurotolysin，PlyA/B)12、外膜蛋白G(OmpG)13、phi29连接器14和其他，是为单分子传感而开发的一类大通道蛋白。可以在分析物通过孔缢缩处的移位过程中探测核酸15、肽16、蛋白质17和小分子18的构象特性。采用类似测量方案的纳米孔测序仪MinIONTM能够直接报告核酸序列19。由Bayley等人5开创的工程化α-HL纳米孔，在其腔内具有唯一的固定反应位点，能够与离散的自由移位反应物发生反应，形成单分子反应器，能够解析单个金属离子的结合20-22。然而，使用α-HL进行的纳米孔单分子化学测量通常报告微弱的事件幅度，测量值为1-5pA23，这阻碍了它获得进一步精细的分辨率。均匀分布在α-HL的圆柱形腔内的非期望的反应位点也可能干扰测量，需要在孔工程化方面付出过量劳动22。大多数生物纳米孔显示出寡聚对称性6，因此需要付出巨大努力来产生异质寡聚组装体以引入唯一的反应位点5，这是仅由该领域中少数人掌握的小众技术。通过工程化的同质寡聚体孔蛋白进行的纳米孔单分子化学测量将不可避免地报告来自多个反应物的同时结合，不适用于事件识别和定量24-27。孔腔中的修饰可能不可预测地干扰孔的组装或稳定性，因此，大量蛋白质筛选的工作是不可避免的。为了将非天然反应位点引入孔腔，通过天然化学连接(NCL)制备了半合成的α-HL28,29。然而，通过NCL制备纳米孔需要极其复杂的纯化程序，并且当要对对不同位点或孔类型进行工程化时，并不总能保证可用。其他一些现有技术在孔腔内部应用内部衔接子，例如环糊精30,31或蛋白质18,32，以获得新传感能力。然而，这些方法需要存在合适的衔接子。大型酶衔接子的停留对于区分具有极小结构差异的分子分析物来说也可能具有不希望的分辨率。为了解决这些问题，需要在技术上取得突破，以实现完全自由地将任何类型、数量或空间组合的反应位点置于孔腔的任何部位。
发明内容
本发明的第一方面提供了一种用于表征目标分析物的系统，所述系统包含：
纳米孔；和
聚合物链，所述聚合物链包含系链位点和反应段，
其中所述聚合物链通过所述系链位点系链，使得所述聚合物链不能穿过所述纳米孔，并且其中所述反应段包含至少一个传感模块，所述传感模块可以与所述目标分析物的单个分子相互作用。
在一些实施方案中，所述反应段包含两个或更多个传感模块，所述传感模块可以与两种或更多种不同目标分析物相互作用。
在一些实施方案中，每个传感模块由一个、两个或更多个传感部分组成，并且每个传感部分可以与所述目标分析物的单个分子的一个或两个或更多个结合位点相互作用。
在一些实施方案中，所述传感部分选自由任何核苷酸的碱基、任何氨基酸、1,2,3-三唑、苯硼酸(PBA)或其任何组合组成的组。
在一些实施方案中，所述传感模块中的至少一个由选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的两个相邻嘌呤组成。
在一些实施方案中，所述反应段通过以下方式中的任一种或其任意组合进行制备：
a.将一种或更多种包含传感部分的单体掺入所述反应段；
b.将一种或更多种包含官能团的单体掺入所述反应段，并且将所述官能团化学修饰成传感部分；或
c.将一种或更多种包含第一反应柄的单体掺入所述反应段，并且使所述第一反应柄与第二反应柄反应，所述第二反应柄与传感部分连接。
在一些实施方案中，所述第一反应柄和所述第二反应柄是点击反应柄。
在一些实施方案中，所述第一反应柄和所述第二反应柄选自由叠氮化物和炔烃组成的组。
在一些实施方案中，将所述聚合物链系链至阻挡物分子或所述纳米孔蛋白质。
在一些实施方案中，所述阻挡物分子是可以特异性结合小分子化合物的蛋白质，所述系链位点包含所述小分子化合物，并且通过所述小分子化合物与所述蛋白质的特异性结合将所述聚合物链系链至所述阻挡物分子。
在一些实施方案中，所述阻挡物分子是链霉亲和素或半抗原的抗体，并且所述小分子化合物是生物素或所述半抗原。
在一些实施方案中，所述系链位点包含可以与所述阻挡物分子或所述纳米孔蛋白质的表面上的天然氨基酸反应的小分子，并且通过所述小分子化合物与所述天然氨基酸之间的反应将所述聚合物链系链至所述阻挡物分子。
在一些实施方案中，将第一反应柄引入所述阻挡物分子或所述纳米孔蛋白质的表面，所述系链位点包含第二反应柄，并且通过所述第一反应柄与所述第二反应柄之间的反应将所述聚合物链系链至所述阻挡物分子。
所述聚合物链还包括延伸段，并且所述延伸段被设置成能够使所述反应段位于适合测量阻塞的区域中在一些实施方案中，所述聚合物链还包括延伸段，并且所述延伸段被设置成能够使所述反应段位于适合测量阻塞的区域中。
在一些实施方案中，所述聚合物链进一步包含牵引段，并且所述牵引段被设置成将所述反应段保持在适合测量阻塞的区域中。
在一些实施方案中，所述牵引段包含以下中的任一项：
a.聚合物链，其在施加于所述纳米孔的电场中倾向于穿过纳米孔通道；
b.偶联位点，其可以与所述纳米孔的通道的表面上的天然氨基酸反应；
c.第二反应柄，其可以与被引入至所述纳米孔的通道的表面的第一反应柄反应；或
d.聚合物链，其可以穿过所述纳米孔的通道，并且在所述纳米孔外形成尺寸大于所述纳米孔的出口的三维结构。
在一些实施方案中，所述牵引段是长度为10nt或更长的核酸。
在一些实施方案中，所述聚合物链基于核酸、核酸类似物、多肽、多糖、均聚物、共聚物或其任何组合。
在一些实施方案中，所述目标分析物选自由以下组成的组：
包含金属元素的离子；优选包含碱土金属或过渡金属的离子；更优选AuCl4 -、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+或Pb2+；
单糖；优选核糖、果糖或甘露糖；更优选D-(-)-核糖、D-果糖或D-(+)-甘露糖；
寡糖；优选二糖或三糖；更优选4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖)、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖)或4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖)；
多糖；
葡萄糖苷；
多酚，例如花青素或原花青素；
儿茶酚胺；
儿茶酚胺衍生物；优选肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素；
多元醇；优选含有两个邻位羟基基团、1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物；更优选3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)、3,4-二羟基苯乙酸、儿茶酚、乙二醇、甘油、L-乳酸或维生素(例如维生素C或维生素B6)；
质子化或去质子化形式化合物；优选质子化或去质子化形式的tris；
含有核糖部分的化合物；优选核苷酸、核苷、其类似物或其单磷酸盐衍生物或其多磷酸盐衍生物；更优选核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物、胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)；
过氧化氢；
寡肽或环肽；
缓冲试剂；优选tris；
小分子药物；优选核苷类似物药物；更优选galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物；
神经递质；优选儿茶酚胺或其衍生物；
具有特定手性的化合物；优选L-去甲肾上腺素或D-去甲肾上腺素；
含有同位素的分析物；优选儿茶酚-D6(氘取代儿茶酚上的所有氢原子)；
化学中间体；
或其任何组合。
在一些实施方案中，所述纳米孔是生物纳米孔、固态纳米孔或DNA纳米孔。
在一些实施方案中，所述蛋白质纳米孔是MspA、α-HL、气溶素、ClyA、FhuA、FraC、PlyA/B、CsgG Phi 29连接体或者其同源物或变体。
在一些实施方案中，所述系统包含两个或更多个纳米孔。
本发明的另一方面提供了用于表征目标分析物的方法，所述方法包括：
(i)提供根据权利要求1-22中任一项的系统；
(ii)在所述纳米孔的两侧之间施加电压并允许一条聚合物链进入所述纳米孔；
(iii)允许目标分析物穿过所述纳米孔；和
(iv)测量通过所述纳米孔的离子电流以提供电流模式，并基于所述电流模式表征所述目标分析物。
在一些实施方案中，所述系统的聚合物链包含两个或更多个传感模块，所述传感模块可以与两种或更多种不同目标分析物相互作用，并且其中所述方法用于表征两种或更多种目标分析物。
在一些实施方案中，所述方法包括：
(i)提供根据权利要求1-22中任一项的系统；
(ii)在所述纳米孔的两侧之间施加第一电压并允许一条聚合物链进入所述纳米孔；
(iii)允许第一目标分析物穿过所述纳米孔；和
(iv)测量通过所述纳米孔的离子电流以提供电流模式，并基于所述电流模式表征所述第一目标分析物；
(v)将两个隔室之间的电压转换成与所述第一电压方向相反的第二电压，从而使所述纳米孔中的聚合物链从所述纳米孔退出；
(vi)将所述两个隔室之间的电压转换成所述第一电压并允许另一条聚合物链进入所述纳米孔；和
(vi)将步骤(iii)-(iv)应用于不同于所述第一目标分析物的第二目标分析物。
在一些实施方案中，所述传感模块能够与所述第一目标分析物和/或所述第二目标分析物发生不可逆的相互作用。
在一些实施方案中，所述目标分析物选自由以下组成的组：
含有金属元素的离子；优选包含碱土金属或过渡金属的离子；更优选AuCl4 -、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+或Pb2+；
单糖；优选核糖、果糖或甘露糖；更优选D-(-)-核糖、D-果糖或D-(+)-甘露糖；
寡糖；优选二糖或三糖；更优选4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖)、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖)或4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖)；
多糖；
葡萄糖苷；
多酚，例如花青素或原花青素；
儿茶酚胺；
儿茶酚胺衍生物；优选肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素；
多元醇；优选含有两个邻位羟基基团、1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物；更优选3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)、3,4-二羟基苯乙酸、儿茶酚、乙二醇、甘油、L-乳酸或维生素(例如维生素C或维生素B6)；
质子化或去质子化形式的化合物；优选质子化或去质子化形式的tris；
含有核糖部分的化合物；优选核苷酸、核苷、其类似物或其单磷酸盐衍生物或其多磷酸盐衍生物；更优选核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物、胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)；
过氧化氢；
寡肽或环肽；
缓冲试剂；优选tris；
小分子药物；优选核苷类似物药物；更优选galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物；
神经递质；优选儿茶酚胺或其衍生物；
具有特定手性的化合物；优选L-去甲肾上腺素或D-去甲肾上腺素；
含有同位素的分析物；优选儿茶酚-D6(氘取代儿茶酚上的所有氢原子)；
化学中间体；
或其任何组合。
附图说明
图1显示了PNRSS的概念展示。a.PNRSS链。PNRSS链由所述的功能模块组成。反应段是最关键的模块，其含有形成固定反应物的一个或更多个反应位点。b.测量设置。在PNRSS过程中，MspA纳米孔用于对接链霉亲和素系链的PNRSS链。反应段(深黄色)正好位于孔缢缩处以获得最佳性能。c.PNRSS用于探测Ni2+和双鸟嘌呤反应物之间的单分子反应的设计。PNRSS链上的两个相邻鸟嘌呤协同结合Ni2+离子。d.含有PNRSS测量的不同状态的连续迹线。最初，孔未被占位(i)，报告开孔电流。然后，PNRSS链被孔捕获，导致阻塞水平立即下降至(ii)。在置入Ni2+后，观察到Ib和Ip之间的可逆转换，这分别证明了PNRSS链未与Ni2+结合(iii)或与其结合(iv)时的状态。e.△I相对于toff的密度散点图。每个点周围的局部密度是彩色编码的。使用高斯拟合的△I的直方图位于散点图的右侧。包括13435个事件的结果。f.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对[Ni2+]作图。如方法中所述进行测量。应用PNRSS链13G/14G(表1)。向trans侧添加期望终浓度的硫酸镍。
图2显示了使用非天然反应组分的PNRSS。a.将1,2,3-三唑(TAZ)引入PNRSS链及其反应机制。PNRSS链14TAK(表1)与3-叠氮基丙胺反应，如图17中所述。生成的TAZ用作固定反应物。Ni2+是移动反应物，其参与到与TAZ的可逆配位中。b.迹线展示。包含Ni2+结合事件的连续迹线。在Ni2+结合过程中始终观察到特征噪声波动。c.代表性事件。结合事件的放大展示。Ni2+结合过程中的噪声波动表明通过PNRSS可观察到可能的反应性中间体。d.△I相对于toff的密度散点图。每个点周围的局部密度是彩色编码的。观察到高度一致的事件群。包括905个事件的结果。e.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对[Ni2+]作图(表6)。如方法中所述进行测量。向trans侧添加期望终浓度的硫酸镍。
图3显示了使用苯硼酸的PNRSS。a.引入苯硼酸(PBA)及相应的反应机制。如图24-26中所述，通过CuAAC引入PBA。b-g.14PBA上的PBA作为固定反应物。含有1,2-二醇或1,3-二醇的移动反应物，例如儿茶酚(b)、乙二醇(c)、甘油(d)、L-乳酸(e)、维生素C(f)或维生素B6(g)，所有均报告清晰且不同的结合事件。h.缺少相容反应基团的间苯二酚无法报告任何结合事件。如方法中所述进行实验。向trans侧添加儿茶酚(500μM，b)、乙二醇(18mM，c)、甘油(12mM，d)、L-乳酸(5mM，e)、维生素C(1.6mM，f)、维生素B6(50μM，g)或间苯二酚(1mM，h)达到上述终浓度。图27-38提供了相应的△I相对于toff的散点图和1/τon和1/τoff的结果相对不同分析物浓度和时间直方图的。
图4显示了不可逆反应的重复PNRSS测量。a.引入PBA及相应的反应机制。如图24-26中所述，通过CuAAC引入PBA。PNRSS链上的PBA用作固定反应物。作为移动反应物的过氧化氢可以与PBA可逆结合或不可逆地将PBA氧化为苯酚。b.含有PBA的可逆(i)-(ii)和不可逆(iii)反应的迹线。c.应对不可逆反应的PNRSS策略。在发生不可逆氧化时，停驻的PNRSS链被电压弹出并重新装载以启动新测量周期。d.含有重复PNRSS测量的迹线。展示了四个连续的测量周期。星形标签标记了进行电压弹出和重新装载的时刻(视频3)。
图5显示了肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的PNRSS传感。a.反应机制。去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素均含有1,2-苯二醇部分，其能够结合PBA。b.肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素结合的代表性事件。对事件进行低通Butterworth滤波，截止频率为100Hz(图50)。所有事件均呈负向(Ib<Ip)。c-d.含有去甲肾上腺素、肾上腺素或异丙肾上腺素结合事件的代表性迹线。迹线是Butterworth滤波器，分为低通(c)和高通(d)部分。截止频率为100Hz(图50)。e.基于输入SVC模型的1455个事件生成混淆矩阵(图51)。f.来自PNRSS传感儿茶酚胺混合物事件的低通(Lp)和高通(Hp)幅度标准偏差(S.D.)的散点图(图52)。包括150个事件的结果。将散点图分成绿色(去甲肾上腺素)、粉红色(肾上腺素)和橙色(异丙肾上腺素)颜色编码区域的决策边界通过机器学习算法确定(图51)。
图6显示了瑞德西韦和瑞德西韦三磷酸代谢物的PNRSS传感。a.传感机制。瑞德西韦和瑞德西韦代谢物均含有核糖部分，能够与PBA结合。b.瑞德西韦和瑞德西韦代谢物的代表性事件。标签R和M分别标记瑞德西韦和瑞德西韦代谢物。对事件进行Butterworth低通滤波，截止频率为100Hz(图50)。这两类事件似乎均呈正向(Ib>Ip)。瑞德西韦的结合导致具有特征噪声波动的时间延长的事件。另一方面，瑞德西韦代谢物以最小的噪声报告瞬态事件。c.事件幅度标准偏差(S.D.)相对事件停留时间的散点图。事件幅度标准偏差(S.D.)的直方图及其高斯拟合结果绘制于右侧。包括119个事件的结果。d.高通(Hp)和低通(Lp)幅度S.D.的散点图。两种分析物在散点图中被清晰分离。包括126个事件的结果。e.含有来自瑞德西韦和瑞德西韦代谢物的结合事件的连续迹线。基于d中描述的事件特征调用每个事件的标识。
图7显示了Ni2+与双鸟嘌呤反应物的结合。a.示意图。如图1c中所述进行PNRSS测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。PNRSS链13G/14G(表1)含有两个相邻鸟嘌呤，它们协同作为结合Ni2+的配体。向trans侧添加作为移动反应物的Ni2+达到期望的终浓度。b.使用不同Ni2+浓度获得的代表性迹线。Ni2+浓度在0至1mM之间调整，并在每条相应迹线的左侧标记，这表明当Ni2+浓度升高时，事件出现率增加。
图8显示了不使用固定反应物的PNRSS。a.示意图。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。应用PNRSS链14X(表1)，其中反应段由五个连续的无碱基位点组成。Ni2+作为移动反应物。原则上，无碱基位点不能结合Ni2+。b.来自相应PNRSS测量的代表性迹线。向trans侧添加Ni2+，终浓度为0-1mM。在每条相应迹线的左侧标记Ni2+的终浓度。未观察到Ni2+结合事件，结论是PNRSS链14X没有报告任何Ni2+结合事件。
图9显示了Ni2+与双鸟嘌呤反应物的结合(模拟)。Ni2+与双鸟嘌呤配体结合的优化结构。显示了具有(a)低自旋状态、(c)高自旋状态的(dGMP)2-Ni-4wt，以及具有(b)低自旋状态、(d)高自旋状态的(dGMP)2-Ni-5wt。还显示了参与结合的水分子。绿色、灰色、蓝色、红色、橙色和白色球分别代表Ni、C、N、O、P和H原子。
图10显示了PNRSS测量和数据分析。a.PNRSS测量的代表性迹线。动画图描述了测量过程中孔的不同状态。状态(i)表示未占位的孔，在该状态下测量的电流为开孔电流(I0)。状态(ii)和(iii)表示PNRSS链占位的孔，其中PNRSS链的固定反应物不结合(ii)或结合(iii)移动反应物。在状态(ii)或(iii)下的测量电流分别定义为Ip或Ib。b.含有结合事件的迹线放大视图。清楚地观察到显示为电阻脉冲(灰色)的连续结合事件。事件幅度(△I)定义为△I＝Ib－Ip。移动反应物的结合可能产生正向(Ib>Ip)或负向(Ib<Ip)事件，从而产生正或负△I值。事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的定义如迹线上所述。c-d.平均事件间间隔(τon)(c)和平均事件停留时间(τoff)(d)的推导。ton和toff分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)。e.平均事件幅度的推导源自高斯拟合的中心位置。展示结果来自图1中描述的测量结果，使用PNRSS链13G/14G(表1)和Ni2+进行。除非另有说明，否则本文中所有PNRSS测量的分析均按照所述定义进行。
图11显示了Ni2+与双鸟嘌呤反应物结合的τon和τoff。呈现了使用不同Ni2+浓度获得的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链13G/14G(表1)。使用1.5MKCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。
图12显示了其他金属离子与双鸟嘌呤反应物的结合。a.示意图。PNRSS测量与图1c中描述的相似。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。PNRSS链(13G/14G)上的两个相邻鸟嘌呤用作固定反应物(表1)。二价离子例如Zn2+、Cd2+、Co2+或Cu2+用作移动反应物。b-e.当Zn2+(b)、Cd2+(c)、Co2+(d)或Cu2+(e)置于trans侧时，PNRSS测量的代表性迹线。添加的二价离子的终浓度在每条相应迹线的左侧标注。根据结果，Zn2+(b)或Cd2+(c)报告没有与PNRSS链结合。然而，Co2+(d)或Cu2+(e)显示出明显的结合事件。上述结果表明，使用PNRSS也可观察到Co2+或Cu2+与双鸟嘌呤配体的结合9。进一步的研究将在单独的后续研究中进行。
图13显示了使用单一腺嘌呤反应物的PNRSS测量。a.示意图。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。应用PNRSS链14A(表1)。14A含有单一腺嘌呤，用作固定反应物。Ni2+用作移动反应物。b.向trans侧添加不同终浓度的Ni2+时的代表性迹线。Ni2+的浓度在每条迹线的左侧标注。Ni2+与单个腺嘌呤的结合产生尖峰、负向事件。c.1/τon或1/τoff相对于Ni2+浓度的图。1/τon与Ni2+的终浓度呈线性相关。然而，1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的事件散点图。Ni2+浓度为0.8mM。所有事件均从15min连续记录的迹线提取。散点图中包括1137个事件。每个点均根据局部点密度进行颜色编码。分别识别△I中约～39pA的主要群体和△I中～56pA的次要群体。△I的事件直方图附在散点图的右边。△I的两个群体分别进行高斯拟合并在直方图上叠加。上述观察结果表明，使用PNRSS可以观察到Ni2+和单个腺嘌呤之间的配位相互作用。固定反应物的不同选择导致不同的结合动力学。根据先前的研究，腺嘌呤具有两个可能的结合位点来结合Ni2+，这可能有助于解释观察到两个事件群体92。
图14显示了Ni2+与单一腺嘌呤反应物结合的τon和τoff。呈现了使用不同Ni2+浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14A(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。
图15显示了使用单一鸟嘌呤反应物的PNRSS测量。a.示意图。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。应用PNRSS链14G(表1)。14G含有单一鸟嘌呤，用作固定反应物。Ni2+用作移动反应物。b.向trans侧添加不同终浓度的Ni2+时的代表性迹线。Ni2+的浓度在每条迹线的左侧标注。观察到Ni2+的结合事件为尖峰、负向事件。c.1/τon或1/τoff相对于Ni2+浓度的图。1/τon与Ni2+的终浓度呈线性相关。然而，1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的事件散点图。Ni2+浓度为0.8mM。所有事件均从15min连续记录的迹线提取。散点图中包括1773个事件。每个点均根据局部点密度进行颜色编码。识别单个事件群体，在△I中测量～30pA。△I的事件直方图，与其高斯拟合结果叠加，附在散点图的右边。上述观察表明，使用PNRSS可以观察到Ni2+和单一鸟嘌呤之间的配位相互作用。固定反应物的不同选择导致不同的结合动力学92。
图16显示了Ni2+与单一鸟嘌呤反应物结合的τon和τoff。呈现了使用不同Ni2+浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14G(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。
图17显示了PNRSS链14TAZ的化学合成。a.将TAZ引入PNRSS链的动画图。b.CuAAC反应。为了在PNRSS链上产生三唑，通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成反应(CuAAC)使3-叠氮基丙胺与14TAK(表1)反应93。简言之，将10μL DNA 14TAK(100μM)溶液、6μL 3-叠氮基丙胺(330mM)的乙腈溶液、1.5μL硫酸铜(20mM)、3μL抗坏血酸钠(20mM)和3.5μL Milli-Q水添加至6μL HEPES缓冲液(100mM HEPES，pH 7.4)中，并在25℃下以600rpm振荡4h。之后，将6μL EDTA溶液(100mM)添加至混合物以终止反应。使用Micro Bio-Spin6Columns(Bio-Rad)纯化产物DNA。为了确认缀合成功，通过配备电喷雾电离(ESI)源的液相色谱-质谱(Xevo G2-XS QTOF MS+Acuqity UPLC I-Class plus,Waters Corporation)分析纯化的产物。产物DNA被称为14TAZ(表1)，直接用于下游PNRSS测量。c.14TAK的质谱结果。计算值：18271.0，实测值：18272.1。d.14TAZ的质谱结果。计算值：18371.1，实测值：18372.3。
图18显示了PNRSS链14TAZ的单分子特征。a.三唑的生成及其Ni2+传感机制。PNRSS链14TAK(表1)含有单一炔烃(蓝色弧线)。通过CuAAC使3-叠氮基丙胺(灰色符号)与14TAK反应(图17)，产生14TAZ，其含有单一三唑作为固定反应物(蓝色+灰色)。Ni2+用作移动反应物，与三唑可逆配位94。b-c.使用14TAK(b)或14TAZ(c)的Ip测量。施加+180mV电位。当14TAK(b)或14TAZ(c)被孔捕获时，观察到Ip的明显差异，这为成功生成TAZ提供了单分子证据。当进行静态孔阻塞测量时，在14TAK(d)或14TAZ(f)的事件直方图中也总结了这种差异。表5总结了平均阻塞幅度值。例如，使用14TAK(e)或14TAZ(g)进行PNRSS。Ni2+用作移动反应物并以1mM终浓度添加至trans侧。使用14TAK(e)未观察到Ni2+结合事件。然而，使用14TAZ(g)观察到特征性结合，再次证实链上已生成TAZ。
图19显示了Ni2+与三唑的结合。a.示意图。如图2中所述进行PNRSS测量。含有单一三唑的PNRSS链14TAZ(表1)用作固定反应物。Ni2+与三唑形成可逆配位，用作移动反应物。b.使用不同Ni2+浓度获得的代表性迹线。Ni2+浓度在0至1mM之间调整，并分别在每条相应迹线的左侧标注。Ni2+结合产生负向事件(Ib<Ip)。当Ni2+与三唑结合时产生特征噪声，明确地报告发生这种特定反应。当Ni2+浓度升高时，事件出现率增加，提供了具体证据表明观察到的事件由Ni2+结合引起。
图20显示了Ni2+与三唑结合的τon和τoff。呈现了使用不同Ni2+浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14TAZ(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。
图21显示了Co2+与三唑的结合。a.示意图。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。应用PNRSS链14TAZ(表1)。14TAZ含有单一三唑，用作固定反应物。Co2+用作移动反应物。b.向trans侧添加Co2+时的代表性迹线。Co2+的浓度在0至250μM之间调整，并分别在每条相应迹线的左侧标记。观察到Co2+的结合事件为尖峰、负向事件。c.1/τon或1/τoff相对于Co2+浓度的图。1/τon与Co2+的终浓度呈线性相关。然而，1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的事件散点图。Co2+浓度为0.2mM。所有事件均从15min连续记录的迹线提取。散点图中包括3632个事件。每个点均根据局部点密度进行颜色编码。识别单个事件群体，在△I中测量～-25pA。△I的事件直方图附在散点图的右边。△I的事件直方图与其高斯拟合结果叠加，附在散点图的右边。上述观察表明，使用PNRSS可以观察到Co2+和单一三唑之间的配位相互作用。然而，结合特性与Ni2+不同
图22显示了Co2+与三唑结合的τon和τoff。呈现了使用不同Co2+浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14TAZ(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。
图23显示了使用14TAZ测量时依次添加Co2+和Ni2+。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。应用PNRSS链14TAZ(表1)。a.未添加移动反应物时的代表性PNRSS迹线。b.以250μM终浓度添加Co2+时的代表性PNRSS迹线。仅观察到Co2+结合事件。c.进一步添加400μM终浓度的Ni2+时的代表性PNRSS迹线。观察到Co2+和Ni2+结合事件。Ni2+产生的独特事件噪声为事件识别提供了明确证据。
图24显示了4-(叠氮甲基)苯硼酸的1H NMR谱。1H NMR(BRUKER AVANCE III,400MHz,298K,DMSO-d6)δ8.08(s,2H),7.81(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),4.44(s,2H)。90
图25显示了PNRSS链14PBA的化学合成。a.PBA引入的动画图。b.反应。为了在PNRSS链上产生PBA，通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成反应(CuAAC)使4-(叠氮甲基)苯硼酸与14TAK(表1)反应95。简言之，将10μL DNA 14TAK(100μM)、6μL 4-(叠氮甲基)苯硼酸溶液(溶于MeCN，200mM)、1.5μL硫酸铜(20mM)、3μL抗坏血酸钠(20mM)和3.5μLMilli-Q水添加至6μL HEPES缓冲液(100mM HEPES，pH 7.4)中，并在25℃下以600rpm振荡4h。之后，将6μL EDTA溶液(100mM)添加至混合物以终止反应。使用Micro Bio-Spin6Columns(Bio-Rad)纯化产物DNA。为确认缀合成功，通过配备电喷雾电离(ESI)源的液相色谱-质谱(Xevo G2-XS QTOF MS+Acuqity UPLC I-Class plus,Waters Corporation)分析纯化的产物。这种功能化的DNA被称为14PBA(表1)并直接用于下游PNRSS测量。c.14PBA的质谱结果。对于[14PBA]，质量计算值：18448.0。对于[14PBA-2H2O]，质量计算值：18412.0，实测值：18413.1。在质谱测量过程中，每个硼酸失去2个H2O，这可能是由于硼酸与DNA磷酸骨架的强分子内相互作用所致，这种现象在文献中也有报道96。
图26显示了PNRSS链14PBA的单分子特征。a.引入苯硼酸(PBA)及其儿茶酚传感机制。PNRSS链14TAK(表1)含有单一炔烃(蓝色弧线)。通过CuAAC使4-(叠氮甲基)苯硼酸(灰色符号)与14TAK反应，产生14PBA，其含有单一PBA作为固定反应物。14PBA的合成和表征详细信息在图24-25中提供。与PBA形成可逆相互作用的儿茶酚用作移动反应物。b-c.使用14TAK(b)或14PBA(c)进行的Ip测量。施加+160mV电位。当14TAK(b)或14PBA(c)被孔捕获时，观察到Ip的明显差异，这为PBA缀合成功提供了单分子证据。当在静态孔阻塞测量过程中测量14TAK(d)或14PBA(f)时，在Ip的事件直方图中也总结了这种差异。表7总结了平均阻塞幅度值。例如，使用14TAK(e)或14PBA(g)进行PNRSS。儿茶酚用作移动反应物并以500μM的终浓度添加至trans侧。使用14TAK(e)未观察到儿茶酚结合事件。然而，使用14PBA(g)观察到特征性结合，再次证实PBA已成功缀合至链。
图27显示了儿茶酚与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合儿茶酚97，如动画图所示。b.含有儿茶酚结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加儿茶酚，终浓度为0-0.5mM，在每条相应迹线的左侧标记。儿茶酚的结合产生正向事件(Ib>Ip)。当儿茶酚浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数1/τon和停留时间的倒数1/τoff相对trans侧中儿茶酚的终浓度作图。1/τon显示出与儿茶酚浓度呈线性相关。1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括100个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。儿茶酚浓度为400μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图28显示了儿茶酚与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同儿茶酚浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加儿茶酚，终浓度为0.1-0.5mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图29显示了乙二醇与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合乙二醇98，如动画图所示。b.含有乙二醇结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加乙二醇，终浓度为0-18mM，在每条相应迹线的左侧标记。当乙二醇浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对乙二醇的终浓度作图。1/τon证明与乙二醇浓度呈线性相关。1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括135个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。乙二醇浓度为14mM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图30显示了乙二醇与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同乙二醇浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加乙二醇，终浓度为2-18mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图31显示了甘油与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合甘油98，如动画图所示。b.含有甘油结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加甘油，终浓度为0-12mM，在每条相应迹线的左侧标记。当甘油浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对甘油的终浓度作图。1/τon证明与甘油浓度呈线性相关。1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括267个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。甘油浓度为10mM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图32显示了甘油与PBA结合的τon和τoff。呈现了不同甘油浓度下的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加甘油，终浓度为4-12mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图33显示了L-乳酸与苯硼酸(PBA)反应物的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合L-乳酸97，如动画图所示。b.含有L-乳酸结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加L-乳酸，终浓度为0-5mM，在每条相应迹线的左侧标记。当L-乳酸浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对L-乳酸的终浓度作图。1/τon证明与L-乳酸浓度呈线性相关。1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括213个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。乳酸浓度为4mM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图34显示了L-乳酸与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同L-乳酸浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加L-乳酸，终浓度为1-5mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图35显示了维生素C与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合维生素C 99，如动画图所示。b.含有维生素C结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加维生素C，终浓度为0-2mM，在每条相应迹线的左侧标记。当维生素C浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对维生素C的终浓度作图。1/τon证明与维生素C浓度呈线性相关。1/τoff保持恒定。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括120个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。维生素C浓度为1.6mM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图36显示了维生素C与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同维生素C浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加维生素C，终浓度为0.4-2.0mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图37显示了维生素B6与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合维生素B6100，如动画图所示。b.含有维生素B6结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加维生素B6，终浓度为0-0.05mM，在每条相应迹线的左侧标记。当维生素B6浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对维生素B6的终浓度作图。(1/τon)证明与维生素B6浓度呈线性相关。(1/τoff)保持恒定。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括763个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。维生素B6浓度为40μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图38显示了维生素B6与PBA结合τon和τoff。呈现了使用不同维生素B6浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加维生素B6，终浓度为0.01-0.05mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图39显示了Tris与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合tris，如动画图所示。b.含有tris结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加tris，终浓度为0-1.0mM，在每条相应迹线的左侧标记。当tris浓度升高时，事件出现率增加。c.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对tris的终浓度作图。(1/τon)证明与tris浓度呈线性相关。(1/τoff)保持恒定。事件从每个条件的15min连续记录的迹线提取。
图40显示了tris与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同tris浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加Tris，终浓度为0.2-1.0mM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图41显示了使用PNRSS观察化学中间体。a.与PBA结合时，建议的tris反应模型。可以根据环境pH值对tris进行质子化或去质子化。b.含有化学中间体的代表性PNRSS事件，在pH 8.0下获得。观察到状态0、1或2之间的转变。然而，从未观察到转变成其他状态。c-d.在pH 7.0(c)或pH 8.0(d)下获得的代表性迹线。在pH 7.0下，与PBA结合的tris仅产生一种类型的阻塞水平Ib1。然而，在pH 8.0下，tris结合在Ib1之上产生新的阻塞水平Ib2。e-f.由在pH7.0(e)或pH 8.0(f)下获得的事件形成的△I相对于toff的事件散点图。在散点图中，在pH8.0下观察到△I中Ib2的新事件群体。如方法中所述进行所有上述测量。e中包括1577个事件。f中括8261个事件。在更高pH值下测量产生更高事件出现率。14PBA用作PNRSS链。所有上述测量均使用1.5M KCl、10mM tris的缓冲液进行。持续施加+160mV电位。散点图(e,f)由每个条件的连续15min记录形成。
图42显示了对PBA不可逆氧化的化学性质的研究。PNRSS测量类似于图4中所述进行。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。向cis侧添加PNRSS链14PBA，终浓度为10nM。向trans侧同时添加H2O2、Ni2+和甘油，终浓度分别为5.4mM、0.2mM和8mM。持续施加+160mV电位。a.在PNRSS过程中获得的代表性迹线。H2O2或甘油与PBA的结合产生正向事件，而Ni2+的结合产生负向事件。PBA也可以被H2O2不可逆氧化以生成苯酚(红色箭头标记)。之后，不再从迹线中观察到H2O2或甘油的结合。b.来自a的迹线段(蓝色标记)的放大视图。H2O2(绿色三角形)、甘油(橙色圆圈)和Ni2+(紫色方块)的结合分别在迹线上标记。c.建议的结合机制。d.来自a的迹线段(灰色标记)的放大视图。仅Ni2+结合(紫色方块)仍可以观察到。e.建议的机制。H2O2和甘油结合事件的消失以及Ni2+结合的保留证实了PBA已被不可逆氧化为苯酚的假设。
图43显示了去甲肾上腺素与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合去甲肾上腺素，如动画图所示。b.含有去甲肾上腺素结合事件的代表性迹线。如图5所述进行PNRSS测量。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans侧添加去甲肾上腺素，终浓度为0-180μM，在每条相应迹线的左侧标记。当去甲肾上腺素浓度升高时，事件出现率增加。c.反应机制101。d.浓度依赖性。去甲肾上腺素浓度在20-180μM之间调整。对每个条件进行15min连续记录。如图10所述推导1/τon和1/τoff值。平均值和标准偏差值来自每个条件的三次独立测量。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对去甲肾上腺素的终浓度作图。(1/τon)证明与去甲肾上腺素浓度呈线性相关。(1/τoff)保持恒定。e.△I相对于toff的散点图。散点图中包括106个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。去甲肾上腺素浓度为140μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图44显示了去甲肾上腺素与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同去甲肾上腺素浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加去甲肾上腺素，终浓度为20-180μM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5MKCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图45显示了肾上腺素与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合肾上腺素，如动画图所示。b.含有肾上腺素结合事件的代表性迹线。如图5所述进行PNRSS测量。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans侧添加肾上腺素，终浓度为0-180μM，在每条相应迹线的左侧标记。当肾上腺素浓度升高时，事件出现率增加。c.反应机制101。d.浓度依赖性。肾上腺素浓度在20-180μM之间调整。对每个条件进行15min连续记录。如图10所述推导1/τon和1/τoff值。平均值和标准偏差值来自每个条件的三次独立测量。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对肾上腺素的终浓度作图。(1/τon)证明与肾上腺素浓度呈线性相关。(1/τoff)保持恒定。e.△I相对于toff的散点图。散点图从15min连续记录的迹线生成。散点图中包括109个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。肾上腺素浓度为140μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图46显示了肾上腺素与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同肾上腺素浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加肾上腺素，终浓度为20-180μM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mMHEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图47显示了异丙肾上腺素与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合异丙肾上腺素，如动画图所示。b.含有异丙肾上腺素结合事件的代表性迹线。如图5所述进行PNRSS测量。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans侧添加异丙肾上腺素，终浓度为0-180μM，在每条相应迹线的左侧标记。当异丙肾上腺素浓度升高时，事件出现率增加。c.反应性机制101。d.浓度依赖性。异丙肾上腺素浓度在20-180μm之间调整。对每个条件进行15min连续记录。如图10所述推导1/τon和1/τoff值。平均值和标准偏差值来自每个条件的三次独立测量。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对异丙肾上腺素的终浓度作图。(1/τon)证明与异肾上腺素浓度呈线性相关。(1/τoff)保持恒定。e.△I相对于toff的时间散点图。散点图从15min连续记录的迹线生成。散点图中包括101个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。异丙肾上腺素浓度为140μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图48显示了异丙肾上腺素与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同异丙肾上腺素浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加异丙肾上腺素，终浓度为20-180μM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5MKCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图49显示了正向和负向的事件。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合儿茶酚或去甲肾上腺素，如动画图所示。b.含有儿茶酚和去甲肾上腺素结合事件的代表性迹线。向trans侧同时添加儿茶酚和去甲肾上腺素，分别达到400μM和140μM的终浓度。儿茶酚或去甲肾上腺素与PBA的结合分别报告正向(Ib,C,Ib,C>Ip)或负向进行事件(Ib,N,Ib,N<Ip)。还提供了可视化展示(视频4)。c.不同结合事件的放大展示。展示了来自儿茶酚(左上)或去甲肾上腺素(右上)的代表性结合事件。还展示了与PBA结合时的儿茶酚(左下)或去甲肾上腺素(右下)的化学结构。d.△I相对于toff的时间散点图。事件从15min连续记录的迹线提取。散点图中总共包括119个事件。从散点图中，儿茶酚和去甲肾上腺素的结合事件产生两个明显分开的群体。△I的直方图绘制于散点图的右侧。△I的两个峰分别被高斯拟合并叠加在直方图上。
图50显示了分频展示。当使用PNRSS探测时，儿茶酚胺(例如去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素)与PBA的结合产生丰富的化学过程信息，表现为不同频域的波动。示出了由(a)去甲肾上腺素、(e)肾上腺素或(i)异丙肾上腺素与PBA结合产生的硼酸酯复合物的化学结构。在PNRSS过程中，以25kHz采样率采集原始迹线，并以1kHz进行低通滤波。记录的迹线按频率分成低通和高通部分，由Butterworth滤波进行。选择截止频率为100Hz和滤波器阶数为2。展示了由(b)去甲肾上腺素、(f)肾上腺素或(j)异丙肾上腺素与PBA结合产生的原始事件。展示了由(c)去甲肾上腺素、(g)肾上腺素或(k)异丙肾上腺素与PBA结合产生的事件的低通部分。展示了由(d)去甲肾上腺素、(h)肾上腺素或(l)异丙肾上腺素与PBA结合产生的事件的高通部分。具体地，去甲肾上腺素在事件的低通部分没有表现出波动，但肾上腺素和异丙肾上腺素表现出轻微的电报式转换。异丙肾上腺素可以通过在事件的高通部分识别其独特的噪声特性而与肾上腺素相区分。
图51显示了机器学习工作流程。使用进行机器学习，是基于模型自动化设计的进化算法开发的商业AutoML平台。为了进行学习过程(I)，分别使用去甲肾上腺素、肾上腺素或异丙肾上腺素作为唯一分析物进行PNRSS测量(图43-48)。abf文件中的原始时间迹线通过Python中的neo模块(v0.8.0，https://pypi.org/project/neo-python/)提取。迹线中的事件通过用Python编写的自定义事件分割程序提取。然后通过集成在Python的SciPy模块中的Butterworth滤波器将提取的事件频率分成高通和低通部分。截止频率设置为100Hz，滤波器阶数设置为2。分别计算并应用高通和低通部分的标准偏差以形成特征矩阵。特征矩阵中的1455个事件被输入DarwinML102平台进行模型构建。简言之，80％、10％和10％的事件分别用作训练、验证和测试数据集。训练和验证集用于构建和验证模型。应用10倍交叉验证方法。应用多于10个流行模型，例如SVC(用于分类的SVM)、逻辑回归、随机森林、XGboost、LightGBM、RidgeClassifier、MLPClassifier、BaggingClassifier等。当使用测试集(所有1455个事件中的剩余10％)进行评价时，SVC模型报告的最高准确度评分为99.6％。经过训练的SVC模型在所有1455个事件中得到进一步验证，报告的总体准确度评分为98.3％。混淆矩阵结果如图5f所示。为了进行预测过程(II)，使用样品混合物进行PNRSS。原始电流迹线按频率分成高频和低频部分。应用SVC标记事件(图5f)。为了生成决策边界，在Lp S.D.中的0-3pA区域内和在Hp S.D.中的1-4.5pA区域内生成网格，间隔为0.01pA。当从SVC模型推断时，可以通过这些网格参数识别事件类型区域。分隔这些区域的边界被视为决策边界(图5f)。
图52显示了依次添加去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素。如图5所述进行PNRSS测量。应用的缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans隔室依次添加去甲肾上腺素(N)、肾上腺素(E)和异丙肾上腺素(I)，终浓度分别达到280μM、280μM和180μM。a.仅添加去甲肾上腺素时获得的代表性迹线。b.如a中所述获取的从15min连续记录的迹线生成的事件散点图。c.散点图中包括241个事件。进一步添加肾上腺素时的代表性迹线。d.如c中所述获取的从15min迹线生成的相应事件散点图。散点图中包括323个事件。e.进一步添加异丙肾上腺素时获得的代表性迹线。f.从e中所述的条件获取的15min迹线生成的相应事件散点图。散点图中包括388个事件。根据每个事件的低通(Lp)和高通(Hp)标准偏差(S.D.)值生成事件散点图，如图50所述。
图53显示了瑞德西韦与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合瑞德西韦，如动画图所示。b.反应机制。瑞德西韦的核糖部分与PBA结合，形成硼酸酯103。c.含有瑞德西韦结合事件的代表性迹线。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans侧添加溶解于DMSO中的10mM浓度的瑞德西韦以达到0-100μM的终浓度，在每条相应迹线的左侧标记。当瑞德西韦浓度升高时，事件出现率增加。d.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对瑞德西韦的终浓度作图。1/τon证明与瑞德西韦浓度呈线性相关性。但是，1/τoff保持恒定。e.△I相对于toff的散点图。散点图中包括118个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。瑞德西韦浓度为80μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图54显示了瑞德西韦与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同瑞德西韦浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加瑞德西韦，终浓度为20-100μM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mMHEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图55显示了瑞德西韦代谢物与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合三磷酸瑞德西韦代谢物，如动画图所示。b.反应机制。瑞德西韦三磷酸代谢物的核糖部分与PBA结合，形成硼酸酯103。c.含有瑞德西韦三磷酸代谢物结合事件的代表性迹线。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。向trans侧添加已溶解于DMSO中的10mM浓度的瑞德西韦三磷酸代谢物，终浓度为0-600μM，在每条相应迹线的左侧标记。持续施加+160mV电位。当三磷酸瑞德西韦代谢物浓度升高时，事件出现率增加。d.浓度依赖性。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对三磷酸瑞德西韦代谢物的终浓度作图。1/τon证明与三磷酸瑞德西韦代谢物浓度呈线性相关性。但是，1/τoff保持恒定。e.△I相对于toff的散点图。散点图中包括130个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。瑞德西韦三磷酸代谢物浓度为500μM。事件从15min连续记录的迹线提取。
图56显示了瑞德西韦代谢物与PBA结合的τon和τoff。呈现了使用不同瑞德西韦代谢物浓度的事件间间隔(ton)和事件停留时间(toff)的直方图。向trans侧添加瑞德西韦代谢物，终浓度为200-600μM。在每个相应直方图的左侧标记应用的浓度。所有直方图分别使用单指数函数y＝a*exp(-x/τ)拟合，从中得出平均事件间间隔(τon)和平均事件停留时间(τoff)，并在每个相应的直方图上标记。如方法中所述进行PNRSS测量。应用PNRSS链14PBA(表1)。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。
图57显示了依次添加瑞德西韦代谢物和瑞德西韦。如图6所述进行PNRSS测量。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans隔室依次添加瑞德西韦代谢物(M)和瑞德西韦(R)，终浓度分别达到500μM和20μM。a.仅添加瑞德西韦代谢物时获得的代表性迹线。瑞德西韦代谢物结合事件用紫色M字符标记。b.15min连续记录迹线的低通(Lp)标准偏差相对于高通(Hp)标准偏差的事件散点图，如a中所述。散点图中包括100个事件。在散点图中仅观察到瑞德西韦代谢物结合事件(M)。c.进一步添加瑞德西韦时获得的代表性迹线。新出现的瑞德西韦结合事件用洋红色R字符标记。d.15min连续记录迹线的低通(Lp)标准偏差相对于高通(Hp)标准偏差的事件散点图，如c中所述。散点图中包括126个事件。从图中观察到两个明显分离的事件群体，证明了分别与瑞德西韦代谢物(M)和瑞德西韦(R)的结合。
图58显示使用α-HL的PNRSS展示。a.测量设置。在PNRSS过程中，α-溶血素(α-HL)纳米孔用于容置链霉亲和素系链的PNRSS链。b.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合异丙肾上腺素，如动画图所示。c.含有异丙肾上腺素结合事件的代表性迹线(紫色圆圈)。即使不添加异丙肾上腺素，也观察到一些负向尖峰噪声，表明苯硼酸与孔腔内的氨基酸残基具有可检测的相互作用。然而，当使用MspA测量时，未观察到这一点。异丙肾上腺素与PBA的结合产生负向事件。如方法中所述进行PNRSS测量。电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。持续施加+160mV电位。向trans侧添加异丙肾上腺素，终浓度为0-30μM。在每条相应迹线的左侧标记应用的浓度。当异丙肾上腺素浓度升高时，事件出现率增加。插图：结合事件的扩展视图。d.浓度依赖性。异丙肾上腺素浓度在10-30μM之间调整。对每个条件进行15min的连续记录。从图10的数据中获得所述τon和τoff值。平均值和标准偏差值来自每个条件的三次独立测量。事件间间隔的倒数(1/τon)和停留时间的倒数(1/τoff)相对异丙肾上腺素的终浓度作图。1/τon证明与异丙肾上腺素浓度呈线性相关。但是，1/τoff保持恒定。e.△I相对于toff的散点图。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。识别单个事件群体，在△I中测量～-4.6pA。异丙肾上腺素浓度为30μM。事件从10min连续记录的迹线提取。结合事件数为100。
图59显示了未包括牵引段的PNRSS链。a.PNRSS链14TAK-NTS的示意图(表1)。14TAK-NTS没有牵引段。b.使用链霉亲和素系链的14TAK-NTS进行PNRSS测量的代表性迹线。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。在没有牵引段的情况下，链霉亲和素系链的14TAK-NTS无法被MspA有效捕获。仅观察到短暂的孔阻塞。这证实了PNRSS链的牵引段对于以电泳方式将链引入孔中并将链保持在孔腔中以进行连续测量至关重要。
图60显示了在不同电压下测量的儿茶酚与PBA结合。a.当施加+80mV、+100mV、+120mV、+140mV或+160mV电压时，儿茶酚与PBA结合的代表性迹线。在trans侧中儿茶酚的浓度保持在200μM。儿茶酚与PBA的结合产生正向事件。当施加的电压被调节时，事件出现率通常不变。当电压升高时，事件幅度(ΔI＝Ib-Ip)增加。b.1/τon或1/τoff相对于施加电压的图。当施加不同的电压时，1/τon和1/τoff通常保持恒定。c.平均事件幅度相对于施加电压的图。施加较大电压时，平均事件幅度较大。与施加的电压呈指数关系。事件从15min连续记录的迹线提取。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以生成统计数据。
图61显示了在不同电压下的去甲肾上腺素与PBA结合。a.当施加+80mV、+100mV、+120mV、+140mV或+160mV电压时，去甲肾上腺素与PBA结合的代表性迹线。在trans侧中去甲肾上腺素的浓度保持在60μM。去甲肾上腺素与PBA的结合产生负向事件。当电压升高时，事件出现率增加。当电压升高时，事件的幅度增加。b.1/τon或1/τoff相对于施加电压的图。1/τon与电压呈线性相关。但是，1/τoff保持恒定。c.平均事件幅度相对于施加电压的关系图。电压升高时，的绝对值增加并与电压呈线性相关。事件从15min连续记录的迹线提取。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以生成统计数据。
图62显示了在不同盐浓度下的去甲肾上腺素与PBA结合。a.当应用0.5M、1.5M或2.5M KCl电解质缓冲液(其他组分：10mM HEPES，pH 8.0)时，含有去甲肾上腺素与PBA结合事件的代表性迹线。在trans侧中去甲肾上腺素的浓度保持在60μM。持续施加+160mV电位。去甲肾上腺素与PBA的结合产生负向事件。当KCl浓度升高时，事件出现率降低。但是，事件的幅度增加。b.1/τon或1/τoff相对于电解质缓冲液中KCl浓度的图。1/τon与[KCl]呈线性负相关，而1/τoff保持恒定。c.平均事件幅度相对于[KCl]的图。当[KCl]升高时，的绝对值增加。事件从15min连续记录的迹线提取。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以生成统计数据。
图63显示了在不同温度下的去甲肾上腺素与PBA结合。a-e.当温度设置为5℃、10℃、15℃、20或25℃时，含有去甲肾上腺素与PBA结合事件的代表性迹线。在cis侧中去甲肾上腺素的浓度保持在400μM。去甲肾上腺素与PBA的结合产生负向事件。当温度升高时，事件出现率和事件停留时间增加。f.1/τon相对于温度的图。g.1/τoff相对于温度的图。1/τon和1/τoff均与温度呈指数关系，并且可以用Arrhenius关系描述22。h.Kb相对于温度的图。Kb随温度的升高而减小。所有涉及温度变化的测量均使用Orbit Mini微型双层工作站(NanionTechnologies GmbH，Germany)进行，取样率为1.25kHz，未进行进一步的数字滤波。事件从15min连续记录的迹线提取。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以生成统计数据。
图64显示了人尿液样品的PNRSS检测。如方法中所述进行测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。应用PNRSS链14PBA(表1)。a.未添加尿液样品时的代表性PNRSS迹线。在添加任何尿液样品之前随机出现正向尖峰事件。b.向trans侧添加20μL人尿液样品时的代表性迹线。c.向trans侧添加50μL尿液样品时的代表性迹线。从人尿液样品未观察到额外事件，证实尿液样品没有对该测量产生任何干扰事件。
图65显示了尿液中维生素B6的PNRSS检测。a.工作流程。检测由三个步骤组成，包括尿液样品采集(I)、尿液中不同浓度维生素B6的预混合(II)和PNRSS检测(III)。尿液样品采集自健康志愿者(亚洲，男性，27岁)。为了校准和测试可行性，向尿液样品添加维生素B6以达到10、15、20、25或30μM的终浓度。在每次PNRSS测量之前，向trans侧添加50μL含有维生素B6的尿液样品。b-d.用不同尿液样品获得的代表性迹线。维生素B6的事件用紫色圆圈标记。插图：结合事件的扩展视图。通常，当添加更高浓度的维生素B6时，事件出现率增加。e.1/τon或1/τoff相对于尿液中维生素B6浓度的图。(1/τon)证明与尿液中维生素B6浓度呈线性相关。(1/τoff)保持恒定。f.△I相对于toff的散点图。散点图中包括189个事件。△I的直方图与其高斯拟合结果叠加，绘制于散点图的右侧。单个事件群体被识别，其△I测量为～7.4pA。尿液中维生素B6的浓度为40μM。事件从10min连续记录的迹线提取。
图66显示了使用聚合物PNRSS链的PNRSS测量。a.示意图。聚合物PNRSS链14PBA-Spacer9由寡核苷酸和聚合物组成。聚合物单元由三分子的乙二醇聚合形成，如动画图所示。此外，14PBA-Spacer9含有单一PBA，能够结合去甲肾上腺素。b.未添加移动反应物时的代表性迹线。c.含有去甲肾上腺素结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加去甲肾上腺素，终浓度为0.1mM。对每个条件进行10min连续记录。
图67显示了fPNRSS的概念展示。a.固定PNRSS(fPNRSS)的流程图。如方法中所述，通过CuAAC使具有氨基修饰的PNRSS链14TAK与4-(叠氮甲基)苯硼酸反应。然后，该产物经由Sulfo-SMCC接头与含有半胱氨酸突变的MspA蛋白结合。b.测量设置。最初，孔未被占位(i)并且开孔电流报告为I0(i)。然后在20mV电压下捕获与孔缀合的PNRSS链，导致阻塞水平立即下降至Ip(ii)。c.未添加移动反应物时的代表性迹线。d.含有去甲肾上腺素结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加去甲肾上腺素，终浓度为0.2mM。对每个条件进行10min连续记录。
图68显示了lPNRSS的概念展示。a.锁定PNRSS(lPNRSS)的流程图。lPNRSS链含有锁定段，能够形成发夹结构，以避免lPNRSS链从孔中逸出。此外，lPNRSS链14PBA含有单一PBA，能够结合去甲肾上腺素。b.测量设置。最初，孔未被占位(i)并且开孔电流报告为I0(i)。然后lPNRSS链被孔捕获，导致阻塞水平立即下降两次(ii和iii)，以达到最终的阻塞水平，即Ip(iii)。其中，阻塞水平(ii)由发夹结构打开引起，如动画图所示。c.含有去甲肾上腺素结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加去甲肾上腺素，终浓度为0.05mM。对每个条件进行10min连续记录。
图69显示了糖与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合糖，如动画图所示。b.未添加移动反应物时的代表性迹线。c-e.含有D-(-)-核糖(c)、D-果糖(d)、D-(+)-甘露糖(e)结合事件(紫色圆圈)的代表性迹线。在每条相应迹线的左侧标记糖的结构式。空白(b)中的尖峰事件来自Tris。Tris是用于提供缓冲能力并与苯硼酸反应的组分(图S33-S35)。然而，Tris与PBA结合的事件(b)明显不同于糖与PBA结合的事件(c-e)。使用1.5M KCl、10mM Tris，pH 8.0的缓冲液。持续施加+140mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加D-(-)-核糖(4mM，c)、D-果糖(4mM，d)、D-(+)-甘露糖(6mM，e)达到上述终浓度。对每个条件进行10min连续记录。
图70显示了5’-CMP与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)，如动画图所示。b.未添加移动反应物时的代表性迹线。c.含有5’-CMP结合事件的代表性迹线(紫色圆圈)。d.△I相对于toff的散点图。散点图中包括65个事件。e.△I的直方图与其高斯拟合结果叠加。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加5’-CMP，终浓度为0.8mM。对每个条件进行10min连续记录。
图71显示了对映体去甲肾上腺素的PNRSS鉴别。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合L或D-去甲肾上腺素，如动画图所示。b.仅添加L-去甲肾上腺素时获得的代表性迹线。L-去甲肾上腺素与PBA的结合仅产生一种类型的阻塞水平。c.进一步添加D-去甲肾上腺素时的代表性迹线。然而，D-去甲肾上腺素结合产生新阻塞水平Ib,D，超出Ib,L。d.如b中所述获取的从10min连续记录的迹线生成的事件散点图。散点图中包括136个事件。e.如c中所述获取的从10min连续记录的迹线生成的事件散点图。散点图中包括199个事件。此处，PNRSS区分对映异构体的能力通过L或D-去甲肾上腺素得到验证。在后续工作中还将使用该系统研究其他对映体儿茶酚胺，例如DL-3,4-二羟基苯丙氨酸(DL-DOPA)、DL-肾上腺素和DL-异丙肾上腺素。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加L或D-去甲肾上腺素，终浓度为0.15mM。对每个条件进行10min连续记录。
图72显示了儿茶酚-D6与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA(表1)在位点14处含有单一PBA，能够结合儿茶酚-D6，如动画图所示。儿茶酚-D6是氘化合物，并且氘取代儿茶酚上的所有氢原子。b.未添加移动反应物时的代表性迹线。c.含有儿茶酚-D6结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加A+160mV电位。如方法中所述进行实验。向trans侧添加儿茶酚-D6，终浓度为0.3mM。对每个条件进行10min连续记录。儿茶酚-D6购自Cambridge Isotope Laboratories,Inc(U.S.A.)。
图73显示了使用PNRSS进行的多糖传感。引入苯硼酸(PBA)用于检测具有邻二醇的糖类。含有果糖的代表性多糖，例如4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖，a)、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖，b)和4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖，c)，所有均报告了清晰且不同的结合事件。用于结合的潜在邻二醇用红色字符标记。在三种多糖中，半乳糖基蔗糖与PBA的亲和力最低。因为果糖基中已知对PBA具有高亲和力的1,2-顺式-二醇已被破坏以形成糖苷键。如方法中所述进行实验。向trans隔室添加乳果糖(a)、异麦芽酮糖(b)和半乳糖基蔗糖(c)，每种分析物的终浓度为8mM。
图74显示了3,4-二羟基扁桃酸与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA在位点14处含有单一PBA，能够结合3,4-二羟基扁桃酸，如动画图所示。b.含有3,4-二羟基扁桃酸结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加3,4-二羟基扁桃酸，终浓度为0和0.4mM，在相应迹线的左侧标记。3,4-二羟基扁桃酸的结合产生正向事件(Ib>Ip)。c.△I相对于toff的散点图。d.△I的直方图，与其高斯拟合结果叠加。3,4-二羟基扁桃酸浓度为0.4mM。事件从15min连续记录的迹线提取。△I＝26.6349pA。
图75显示了4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA在位点14处含有单一PBA，能够结合VMA，如动画图所示。b.含有VMA结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加VMA，终浓度为0和2mM，在相应迹线的左侧标记。VMA的结合产生正向事件(Ib>Ip)。c.△I相对于toff的散点图。d.△I的直方图，与其高斯拟合结果叠加。VMA浓度为2mM。事件从15min连续记录的迹线提取。△I＝26.4662pA。
图76显示了3,4-二羟基苯乙酸与PBA的结合。a.示意图。PNRSS链14PBA在位点14处含有单一PBA，能够结合3,4-二羟基苯乙酸，如动画图所示。b.含有3,4-二羟基苯乙酸结合事件的代表性迹线。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。向trans侧添加3,4-二羟基苯乙酸，终浓度为0和0.5mM，在相应迹线的左侧标记。3,4-二羟基苯乙酸的结合产生正向事件(Ib>Ip)。c.△I相对于toff的散点图。d.△I的直方图，与其高斯拟合结果叠加。3,4-二羟基苯乙酸浓度为0.5mM。事件从15min连续记录的迹线提取。△I＝25.1196pA。
具体实施方式
通过参考以下详细描述、实施例和权利要求以及它们之前和之后的描述，可以更容易地理解本文所述的实施方案。应当理解，本文描述的实施方案不限于特定用途、方法和/或产品。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并不旨在进行限制。
此外，提供以下描述作为各种实施方案在其最佳的、当前已知的方面的有效教导。相关领域的技术人员将认识到可以对所描述的方面进行许多改变，同时仍获得本公开的有益结果。还显而易见的是，可以通过选择各种实施方案的一些特征而不利用其他特征来获得本发明的一些期望的益处。因此，本领域的技术人员将认识到对本文描述的各种实施方案的许多修改和调整是可能的，并且在某些情况下甚至可能是期望的且是本公开的一部分。因此，提供以下描述作为本文描述的实施方案的原理的说明而不是对其的限制。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均将公开和描述与引用该出版物相关的方法和/或材料。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值所采用的系统或方法的误差的标准偏差，例如，术语“约”可以指等于特定值加或减百分之二十(+/-20％)的范围。在结合术语“约”使用的数值的背景下讨论的任何实施方案中，特别考虑到可以省略术语“约”。
必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“分析物”包括一种分析物和多种不同的分析物，以及提及“该分子”包括提及一种或更多种分子。还应注意，权利要求可以撰写为排除任何任选的要素。因此，本声明旨在作为使用“唯一”、“仅”等与权利要求要素的描述或“否定”性限定的使用有关的排他性术语的前提依据。
术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“含有(contain)”、“具有(have)”和这些术语的变形形式，例如包含(comprising,comprises和comprised)，旨在不排除进一步的添加、组分、整数或步骤。这些术语还涵盖“由……组成(consist of或consisting of)”的含义。
术语“和/或”是指由该术语连接的任何一个、任何几个或所有要素。
应当理解，本发明的方法可以在体内、体外或离体进行。本发明的方法可以不用于疾病治疗目的，和/或不用于疾病诊断目的。
如本文所用，术语“修饰(modified或modifying)是指本发明的分子的改变的状态或结构。分子可以以多种方式进行修饰，包括化学上、结构上和功能上，例如，通过共价连接引入分子或基团。
术语“炔烃”和“炔基”可以互换使用，并且是指-C≡C-。
术语“叠氮化物(azide)”和“叠氮基(azido)”可以互换使用，并且是指-N3。
由化学键的快速形成或断裂引起的单分子的化学反应即使用最先进的仪器也很难观察到。生物纳米孔可以设计成单分子反应器，能够检测单原子离子的结合或化学中间体的瞬时出现。然而，这种类型的孔工程在技术上具有挑战性，这极大地限制了该技术的进一步发展。我们提出了通用策略，“用于随机传感的可编程纳米反应器”(programmablenano-reactors for stochastic sensing,PNRSS)，通过它可以直接观察过氧化氢、金属离子、乙二醇、甘油、乳酸、维生素、儿茶酚胺或核苷类似物的各种单分子反应。PNRSS提供了精细的传感分辨率，可以通过人工智能算法进一步增强。瑞德西韦是一种核苷类似物和研究性抗病毒药物，可用于治疗COVID-19的，可以使用PNRSS将瑞德西韦与它的活性三磷酸盐形式区分，这表明PNRSS在药代动力学或药物筛选中的应用。
由化学键的快速形成或断裂引起的单分子的化学反应即使用最先进的仪器也很难观察到。生物纳米孔可以设计成单分子反应器，能够检测单原子离子的结合或化学中间体的瞬时出现。然而，这种类型的孔工程在技术上具有挑战性，这极大地限制了该技术的进一步发展。我们提出了通用策略，“用于随机传感的可编程纳米反应器”(programmablenano-reactors for stochastic sensing,PNRSS)，通过它可以直接观察到过氧化氢、金属离子、乙二醇、甘油、乳酸、维生素、儿茶酚胺或核苷类似物的各种单分子反应。PNRSS提供了精细的传感分辨率，可以通过人工智能算法进一步增强。瑞德西韦是一种核苷类似物和研究性抗病毒药物，可用于治疗COVID-19的，可以使用PNRSS将瑞德西韦与它的活性三磷酸盐形式区分，这表明PNRSS在药代动力学或药物筛选中的应用。
我们在此提出了通用策略，“用于随机传感的可编程纳米反应器”(PNRSS)，以使基于纳米孔的单分子化学研究大众化。PNRSS由合成聚合物链和纳米孔(分别定义为PNRSS链和PNRSS孔)协同进行。PNRSS链本身由被定义为系链位点、延伸段、反应段和牵引段的功能模块组成(图1a)。系链位点用于将链的一端与系链(例如链霉抗生物素蛋白)缀合。链霉亲和素系链的PNRSS链通过电泳入孔，在PNRSS孔中保持完全伸展(图1b)。这种设置先前已应用于区分不同的核酸序列15,33,34，但从未被用于进行纳米孔单分子化学测量。这种设置大大降低了孔工程的技术障碍。PNRSS链的设计是完全灵活的，并且相应的合成可以通过低成本的商业服务进行。PNRSS链的延伸段的长度经优化，精度为使得反应段位于孔限缩处以获得最佳性能。反应段内的一个或多个反应位点形成固定反应物，其直接参与所研究的反应。牵引段的作用是维持链上的电泳力。与固定反应物结合的移动反应物被置于测量环境中，并在与固定反应物结合时发挥作用。PNRSS链可以由任何合成聚合物组成，例如核酸、肽、多糖或其组合，但为了研究更广泛的单分子反应，PNRSS链的组成应该是任意可编程的。DNA是研究最多的合成聚合物，可以容易且经济地合成、化学修饰、酶处理、纯化、表征和储存35。该方法不限于DNA，但它是PNRSS链的理想组成部分。
PNRSS孔应具有尖锐且狭窄的限制以实现高空间分辨率、刚性且可重复的结构以实现高测量一致性以及化学惰性孔腔以最大限度地减少非期望的反应。最近关于工程化耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)在单分子化学应用中的报告已经证明了其结构优势，报告事件幅度显著扩大(～55pA)27。尽管不限于此，本文中应用MspA(方法)来展示所有PNRSS测量。
总之，由化学键的快速形成或断裂引起的单分子的化学反应即使使用最先进的仪器也很难观察到。生物纳米孔可以设计成单分子反应器，能够检测单原子离子的结合或化学中间体的瞬时出现。然而，这种类型的孔工程在技术上具有挑战性，这极大地限制了该技术的进一步发展。我们提出了通用策略，“用于随机传感的可编程纳米反应器”(PNRSS)，通过它可以直接观察到过氧化氢、金属离子、乙二醇、甘油、乳酸、维生素、儿茶酚胺或核苷类似物的各种单分子反应。PNRSS提供了精细的传感分辨率，可以通过人工智能算法进一步增强。瑞德西韦是一种核苷类似物和研究性抗病毒药物，可用于治疗COVID-19的，可以使用PNRSS将瑞德西韦与它的活性三磷酸盐形式区分，这表明PNRSS在药代动力学或药物筛选中的应用。
纳米孔
如本文所用，术语“纳米孔”通常是指具有纳米级的直径非常小的孔、通道或管道，其延伸穿过膜。纳米孔可以具有0.1纳米(nm)至约1000nm量级的特征宽度或直径。
本发明的纳米孔可以是任何形式并且可以是生物纳米孔或合成纳米孔。如本领域技术人员已知的，本发明的纳米孔可以是，例如，固态纳米孔、蛋白质纳米孔、混合固态-蛋白质纳米孔或DNA折纸纳米孔。
蛋白质纳米孔的实例包含α-溶血素(α-HL)、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)、气溶素、curli产生组装/转运组分(curli production assembly/transport component,CsgG)、外膜孔蛋白F(OmpF)、溶细胞素A(ClyA)、异羟肟酸铁摄取组分A(ferrichydroxamate uptake component,FhuA)、Fragaceatoxin C(FraC)、侧耳溶血素A(PlyA)/侧耳溶血素B(PlyB)、Curli产生组装/转运组分CsgG(Curli production assembly/transport component,CsgG)和Phi29连接蛋白。蛋白质纳米孔可以是天然存在的野生型蛋白质纳米孔或者野生型蛋白质纳米孔的同源物或变体。
野生型蛋白质纳米孔的序列可见于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上的GenBank。例如，野生型MspA可以具有以下氨基酸序列：
GLDNELSLVDGQDRTLTVQQWDTFLNGVFPLDRNRLTREWFHSGRAKYIVAGPGADEFEGTLELGYQIGFPWSLGVGINFSYTTPNILIDDGDITAPPFGLNSVITPNLFPGVSISADLGNGPGIQEVATFSVDVSGAEGGVAVSNAHGTVTGAAGGVLLRPFARLIASTGDSVTTYGEPWNMN(SEQ ID NO:1)。
如本领域技术人员所知，蛋白质纳米孔通常包含缢缩区，其是纳米孔通道的最窄部分。蛋白质纳米孔还可以包含位于纳米孔通道一端的前庭，其也是纳米孔通道的一部分，但具有比缢缩区更大的直径。
一些蛋白质纳米孔可以包含两个或更多个单体，它们彼此缔合并形成通道，其中每个单体可以相同或不同。形成蛋白质纳米孔的任何一种单体可以选自野生型蛋白质，或其同源物或变体。在一些实施方案中，蛋白质纳米孔中的所有单体均相同。
如本文定义，术语“同源物”是具有与另一基因或其蛋白质产物相似的结构和功能的基因或其蛋白质产物。同源物与其对应物相比可以具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。术语“同源物”有时用于表示由物种形成事件分离的基因或其蛋白质产物之间的关系(参见“直系同源物”)，或用于表示由基因复制事件分离的基因或其蛋白质产物之间的关系(参见“旁系同源物”)。术语“直系同源物”是指不同物种中从共同进化起源进化的基因或其蛋白质产物。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制相关的基因。
变体与它们的野生型突变相比可以具有一个或更多个突变(例如氨基酸的一个或更多个添加、替换和/或缺失)，并保留通道形成能力。
本领域技术人员容易理解如何确定两个多肽的身份。例如，可以在比对两个序列后计算同一性，使同一性处于最高水平。例如，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的“同一性百分比”，为了最佳比较目的对序列进行排列(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占位时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比可以是两个序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数量/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。序列同一性可以以多种不同的方式并通过多种算法来确定。为了确定序列同一性，可以使用各种方法和计算机程序(例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)比对序列，这些方法和计算机程序可在万维网网站上获得，包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/。参见，例如，Altschul等人.(1990),J.Mol.Bioi.215:403-10。
在一些实施方案中，突变(例如一个或更多个氨基酸的添加、替换和/或缺失)可以在任何位点，例如在蛋白质纳米孔的孔腔表面、周质环的边缘或外侧。在一些实施方案中，对于具有锥形腔的蛋白质纳米孔，突变可以在蛋白质纳米孔的缢缩区和/或前庭中。
在一些实施方案中，与其亲本蛋白质相比，蛋白质纳米孔的变体可以在其孔腔中包含至少一个另外的带正电荷的氨基酸，至少一个另外的带负电荷的氨基酸，，至少一个带正电荷较少的氨基酸或至少一个带负电荷较少的氨基酸。
在一些实施方案中，蛋白质纳米孔的孔腔中的一个或更多个带正电荷的氨基酸被带负电荷的氨基酸取代，并且每个带负电荷的氨基酸相同或不同；或蛋白质纳米孔的腔中的一个或更多个带负电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且每个带正电荷的氨基酸相同或不同。
作为变体的实例，MspA的变体可以包含(i)突变，使得氨基酸第90、91和93位含有带中性电荷的氨基酸，和(ii)在以下氨基酸位置的一个或更多个突变：第88、105、108、118、126、134、138或139位；优选地，与野生型MspA相比，变体MspA可以包含D90N/D91N/D93N或D93N/D91N/D90N/D118R/D134R/E139K突变。D90N/D91N/D93N或D93N/D91N/D90N/D118R/D134R/E139K意指突变体同时包含所有列出的六个突变体；更优选地，与野生型MspA相比，MspA的变体可以仅具有D90N/D91N/D93N(M1 MspA)或D93N/D91N/D90N/D118R/D134R/E139K(M2MspA)突变。本文使用的数字标识定点诱变的位置，其中紧接在起始密码子之后的第一个氨基酸被定义为1。
在本发明中，蛋白质纳米孔可以是重组蛋白质。
固态纳米孔的实例包含用固态材料(例如SiNx、石墨烯、玻璃、石英)制造的纳米孔。
混合纳米孔的实例包含设置在固态膜中的蛋白质纳米孔或具有嵌入其中的蛋白质纳米孔的固态纳米孔。
纳米孔可以经修饰，例如经化学修饰。纳米孔可以以任何方式和在任何位置进行化学修饰，例如在纳米孔的孔腔表面上。蛋白质纳米孔可以通过将分子连接至一个或更多个氨基酸(例如半胱氨酸或赖氨酸)进行化学修饰。进行此类修饰的合适方法是本领域熟知的。纳米孔可以通过连接任何分子进行化学修饰。例如，纳米孔可以通过连接反应柄进行化学修饰。蛋白质纳米孔可以通过对纳米孔的物理或化学性质有影响的衔接子(例如环糊精)进行化学修饰。
优选地，本发明中使用的蛋白质纳米孔即使在150mV-200mV或更高时也不自发门控。“门控(to gate或gating)”是指通过蛋白质通道的电导的自发变化，这通常是暂时的(例如，持续时间短至1-10毫秒到长达1秒)。对于一些蛋白质纳米孔，门控的可能性随施加更高的电压而增加。通常，在门控过程中，蛋白质的导电性降低，导电性可能因此而永久停止(即通道可能永久关闭)，这样的过程是不可逆的。任选地，门控是指通过蛋白质通道的电导自发地改变为小于其开放状态电流的75％。
纳米孔的制备方法是本领域技术人员熟知的，例如，蛋白质纳米孔可以通过原核表达制备并容易通过色谱纯化，固态纳米孔可以通过聚焦离子束和高能电子束的蚀刻方法制备。
聚合物链(PNRSS链)
如本文所用，PNRSS链通常是包含一个或更多个传感模块的聚合物链，因此，在本发明中PNRSS链也称为聚合物链。在本发明中，PNRSS链进入纳米孔的通道。优选地，PNRSS链在纳米孔的通道中延伸。在目标分析物进入纳米孔的通道后，传感模块与目标分析物之间的相互作用导致纳米孔阻塞，这是可测量的，例如测量为离子电流的变化。分析物可以通过测量由相互作用引起的阻塞来表征。不同分析物的表征可以通过使用不同的传感模块来实现，从而使PNRSS链可编程。
本发明的聚合物链可以被驱动进入纳米孔并以任何方式在纳米孔的通道中延伸，例如通过跨过纳米孔的电压。
本发明的聚合物链至少包含系链位点和反应段。聚合物链可以带电荷，例如，带正电荷或带负电荷。
系链位点用于系链(或约束)聚合物链，使得聚合物链不能移位通过纳米孔。系链位点可以位于聚合物链的一端。聚合物链被系住，使得反应段位于适合测量阻塞的区域中。聚合物链可以以任何合适的方式经由系链位点系在任何合适的基底上。
例如但不限于，基底可以是阻挡物分子。阻挡物分子可以具有阻止阻挡物分子穿过纳米孔(优选进入纳米孔)的尺寸。换言之，阻挡物分子的尺寸或阻挡物分子的至少一部分的尺寸大于纳米孔的开口)。阻挡物分子可以具有三维结构，这决定了阻挡物分子的尺寸。阻挡物分子可以是任何满足上述尺寸要求的分子，例如蛋白质分子。
基底的另一个实例是纳米孔本身，例如蛋白质纳米孔。可以将聚合物链系链至蛋白质纳米孔的任何合适位置，例如蛋白质纳米孔通道外部(例如，蛋白质纳米孔的周质环的边缘或外侧)的任何氨基酸。
聚合物链可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方式将系链至基底。
例如，聚合物链可以通过蛋白质和化合物之间的高结合亲和力系链至阻挡物分子。阻挡物分子可以是能够特异性结合化合物(例如小分子化合物)的蛋白质，并且系链位点包含该化合物。聚合物链通过蛋白质和化合物之间的高结合亲和力系链至阻挡物分子。例如，阻挡物分子可以是半抗原的抗体，并且系链位点可以包含半抗原。例如，阻挡物分子可以是链霉抗生物素蛋白，并且系链位点可以包含生物素。作为另一个实例，阻挡物分子可以是抗地高辛抗体，并且系链位点可以包含地高辛。
作为另一个实例，阻挡物分子可以是包含可以与小分子反应的天然氨基酸的任何蛋白质，或者纳米孔蛋白质包含可以与小分子反应的天然氨基酸，并且系链位点可以包含该小分子。所述天然氨基酸可以位于阻挡物分子或纳米孔蛋白质的表面。所述天然氨基酸可以位于纳米孔蛋白质周质环的边缘或外侧的表面，或位于纳米孔蛋白质的通道开口附近的表面。聚合物链可以通过天然氨基酸和可以与天然氨基酸反应的小分子之间的反应而系链至阻挡物分子或纳米孔蛋白质，包括但不限于，半胱氨酸的硫醇基团与马来酰亚胺或其衍生物之间的迈克尔加成反应(Nair,D.P.等人,2013,The Thiol-Michael AdditionClick Reaction:A Powerful and Widely Used Tool in MaterialsChemistry.Chemistry of Materials,26(1),724–744)、碘乙酰胺或其衍生物与半胱氨酸的硫醇基团共价结合(Tyagarajan,K.等人,2003,Thiol-reactive dyes forfluorescence labeling of proteomic samples.ELECTROPHORESIS,24(14),2348–2358)、半胱氨酸的硫醇基团与化合物的乙烯基之间的硫醇-烯反应(Dondoni,A.,2008,TheEmergence of Thiol-Ene Coupling as a Click Process for Materials andBioorganic Chemistry.Angewandte Chemie International Edition,47(47),8995–8997)；半胱氨酸的硫醇基团与化合物的硫醇之间的硫醇-硫醇反应(Gilbert,H.F.,1995,[2]Thiol/disulfide exchange equilibria and disulfidebond stability.BiothiolsPart A Monothiols and Dithiols,Protein Thiols,and Thiyl Radicals,8–28)；赖氨酸与三甲基铵硝基氟苯(Sutton,D.A.等人,1972,Evaluation of 1-fluoro-2-nitro-4-trimethylammoniobenzene iodide,a protein-solubilizing reagent.BiochemicalJournal,130(2),589–595)或芳基卤化物之间的反应(Lautrette,G.等人,2016,NitrogenArylation for Macrocyclization of Unprotected Peptides.Journal of theAmerican Chemical Society,138(27),8340–8343)；甲硫氨酸与氧杂吖丙啶或其衍生物之间的反应(Lin,Shixian,等人,2017,Redox-based reagents for chemoselectivemethionine bioconjugation,Science,355(6325),597-602)。与小分子化合物反应的天然氨基酸包括但不限于半胱氨酸、赖氨酸和/或甲硫氨酸。与天然氨基酸反应的小分子化合物包括但不限于马来酰亚胺或其衍生物、碘乙酰胺或其衍生物、包含乙烯基或硫醇的小分子、三甲基硝基氟苯铵、芳基卤化物和/或氧杂吖丙啶或其衍生物。优选地，在阻挡物分子或纳米孔蛋白质中，可以与小分子化合物反应的天然氨基酸基团是自由的。优选地，在阻挡物分子或纳米孔蛋白质中，天然氨基酸和/或可以与小分子化合物反应的天然氨基酸基团暴露在阻挡物分子或纳米孔蛋白质的表面上。
例如，MspA的D56可以突变为半胱氨酸，系链位点可以包含马来酰亚胺或其衍生物、碘乙酰胺或其衍生物、包含乙烯基或硫醇的小分子，聚合物链被系链至MspA的第56位的半胱氨酸。
作为另一个实例，阻挡物分子可以是具有引入的第一反应柄的任何蛋白质，或者可以将第一反应柄引入至纳米孔蛋白质中。例如，可以将包含第一反应柄的非天然氨基酸掺入阻挡物分子或纳米孔蛋白质中，例如，在蛋白质的人工合成过程中或通过蛋白质的化学修饰。因此，阻挡物分子或纳米孔蛋白质包含暴露的第一反应柄，系链位点包含可以与第一反应柄反应的第二反应柄，并且通过第一和第二反应柄之间的反应将聚合物链系链至阻挡物分子或纳米孔蛋白质。所述天然氨基酸可以位于阻挡物分子或纳米孔蛋白质的表面。所述第一反应柄可以位于阻挡物分子的表面，或位于纳米孔蛋白质的周质环的边缘或外侧，或位于纳米孔蛋白质的通道开口附近的表面上。
如本文所用，术语“反应柄”意指化学分子、化学部分或化学基团，其被暴露并且可以与另一反应柄反应。反应柄对由第一反应柄和第二反应柄组成，其中第一反应柄可以与第二反应柄反应。反应柄对是本领域技术人员已知的。可用于本发明的反应柄对包括但不限于点击反应柄。反应柄对的实例包括但不限于叠氮化物和炔烃，它们可以通过铜(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成(CuAAC)相互反应；叠氮化物和二氟环辛炔，它们可以通过无铜炔烃-叠氮化物环加成相互反应；叠氮化物和磷化氢，它们可以通过staudinger连接反应；硫醇和烯烃，它们通过自由基加成相互反应；硫醇和马来酰亚胺，它们通过迈克尔加成相互反应；胺和对氟，它们通过亲核取代相互反应(Becer,Hoogenboom和Schubert,ClickChemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition,Angewandte ChemieInternational Edition,2009,48:490-4908；Rostovtsev,V.V.等人,2002,A stepwiseHuisgen cycloaddition process:Copper(i)-catalyzed regioselective“ligation”ofazides and terminal alkynes.Angew.Chem.,Int.Ed.41,2596–2599；Torne,C.W.等人,2002,Peptidotriazoles on solid phase:[1,2,3]-Triazoles by regiospecificcopper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes toazides.J.Org.Chem.67,3057–3064；Agard,N.J.等人,2004,A strainpromoted[3+2]azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules inliving systems.J.Am.Chem.Soc.126,15046–15047；Kohn,M.和Breinbauer,R.,2004,TheStaudinger ligation:A gift to chemical biology.Angew.Chem.,Int.Ed.43,3106–3116)。反应柄对中的任何一个均可以用作第一反应柄或第二反应柄。
通过基底和系链位点的设计，本发明的聚合物链可以以多种灵活的方式系链，不限于上述任何实例。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括天然和非天然存在的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽骨架的多肽。
反应段可以包含一个或更多个单体(如两个或更多个、三个或更多个、四个或多更多个、或五个或更多个)，并且包含一个或更多个传感模块(本发明中也称为固定反应物)。每个传感模块可以看作是与目标分析物的单个分子(在本发明中也称为移动反应物)相互作用的传感位点或反应位点。当反应段包含两个或更多个单体时，两个或更多个单体聚合形成聚合物链。例如，反应段可以带正电或带负电。
如本文所用，术语“传感模块”是指可以与目标分析物的单个分子相互作用的化学部分。传感模块可以由一个或更多个(例如两个或更多个)传感部分组成。
如本文所用，术语“部分”是指化学分子或化学分子的任何部分，例如官能团。如本文所用，术语“传感部分”是指与目标分析物的单个分子的一个或两个或更多个结合位点相互作用的化学分子或化学分子的一部分。传感部分可以被包含在反应段的单体单元的侧链中。如本文所用，术语“侧链”是指附接至被称为“主链”或骨架的分子核心部分的化学基团。
如本文所用，术语“相互作用(interact或interaction)”可指传感模块或传感部分与目标分析物之间的反应或结合，其可以是可逆的或不可逆的。传感模块和目标分析物之间的相互作用可以导致穿过纳米孔的离子电流发生变化，这是可测量的。
传感模块可以由一个传感部分组成，其能够单独与目标分析物的单个分子相互作用，其中传感部分被称为非协同传感部分。
传感模块还可以由两个或更多个传感部分组成，其中两个或更多个传感部分一起与目标分析物的单个分子相互作用，并且每个传感部分与单个分子的一个或两个或更多个结合位点相互作用。两个或更多个传感部分一起与目标分析物的单个分子相互作用，称为协同传感部分。协同传感部分可以被包含在相邻的单体单元中。一些目标分析物的单个分子可以包含两个或更多个结合位点，传感部分通过所述的两个或更多个结合位点与目标分析物相互作用。一个分子中的两个或更多个结合位点可以彼此相同或不同，例如具有相同或不同的基团或具有相同或不同的键。一个传感模块中的两个或更多个协同传感部分可以分别与一个分子中的两个或更多个结合位点相互作用。一个传感模块中的两个或更多个协同传感部分可以相同或不同，可以根据目标分析物的结合位点进行设计。由协同传感部分组成的传感模块可以更容易、更有利地抓取分析物分子。
例如，反应段是核酸，两个相邻的选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的嘌呤可以形成传感模块以抓取二价金属离子(例如Ni2+、Co2+或Cu2+、Zn2+、Cd2+)的单个分子，相邻的两个嘌呤可以相同也可以不同。
反应段内传感模块的总数可以是1至20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。反应段内的两个或更多个传感模块可以彼此相同或不同。在一些实施方案中，反应段内的所有传感模块均是相同的。在一些实施方案中，反应段内的部分传感模块是相同的。在一些实施方案中，反应段内的所有传感模块均彼此不同。
反应段可以包含两个或更多个能够与不同的目标分析物相互作用的传感模块，以便于同时或先后对不同的目标分子进行表征。
例如，可以使用两个或更多个相同或不同的传感模块，或者其组合，只要传感模块能够与不同的目标分析物相互作用，则所述不同的目标分析物可以分别与两个或更多个传感模块相互作用，从而同时进行表征。
例如，可以使用两个或更多个不同的传感模块，它们可以分别与特定目标分析物相互作用并且与待表征的其他目标分析物没有交叉反应性的。在这种情况下，不同的分析物不仅可以同时被表征，而且可以在连续的轮次中分别被表征。例如，可以首先表征第一样品中的第一目标分析物，然后可以在不改变PNRSS链的情况下依次表征第二样品中的第二目标分析物。作为实例，反应段可以包含与第一目标分析物相互作用的第一传感模块和与第二目标分析物相互作用的第二传感模块，并且第一传感模块和第二传感模块是不同的，其中第一传感模块不与第二目标分析物相互作用并且第二传感模块不与第一目标分析物相互作用。在第一轮测量中，第一目标分子占位第一传感模块并被表征，并且在第二轮测量中，虽然第一传感模块被占位，但第二传感模块仍可用，使得第二目标分子可以与第二传感模块相互作用并被表征。
两个或更多个含有传感部分的单体单元可以彼此相邻排列，可选地，两个或更多个含有传感部分的单体单元可以被一个或更多个不含传感部分的单体单元隔开。反应段可以由一个或更多个含有传感部分的单体单元组成，例如一个含有传感部分的单体单元或者两个或更多个彼此相邻排列的含有传感部分的单体单元。反应段还可以包含一种或更多种含有传感部分的单体单元和不含传感分子的另外的单体单元(例如位于任何含有传感部分的单体单元的任一侧的1-3个单体单元，或位于任何两个含有传感分子的单体单元之间的1-3个单体单元)。
具有传感模块的反应段的尺寸(例如直径或宽度)应被设置成反应段可以进入并被容纳在纳米孔的通道中，并且可测量传感模块与目标分析物相互作用造成的阻塞。
尽管纳米孔的最窄区域具有最高灵敏度，但应该理解的是，可测量的阻塞可以发生在在通道的任何区域。阻塞信号的质量和分辨率与通道特定区域的直径和该区域中存在的阻塞物的尺寸有关。对于设计的反应段，本领域技术人员应该知晓那个区域适合于容纳它，例如，根据纳米孔通道的直径、聚合物链的反应段的尺寸和目标分析物的尺寸。例如，聚合物链的反应段和目标分析物越大，则直径较大的通道区域越适合；聚合物链的反应段和目标分析物越小，则直径较小的通道区域越适合。例如，对于一些具有三维结构的蛋白质分析物，具有锥形腔的蛋白质纳米孔的前庭可能是合适的。例如，对于具有小尺寸的目标分析物，具有圆柱形腔的纳米孔或具有锥形腔的蛋白质纳米孔的缢缩区可能是合适的。本领域技术人员可以确定纳米孔通道的哪个区域适合获得由聚合物链的反应段与目标分析物之间的相互作用引起的可测量的阻塞信号。因此，本领域技术人员可以确定反应段在聚合物链上的位置和/或反应段的长度，以将反应段定位在合适的位置。
传感模块可以被设计成与特定目标分析物相互作用，并且反应段可以被设计成包含传感模块。可以设计合适的单体单元来包含构成传感模块的传感部分。制备所设计的具有一个或更多个传感模块的反应段的方法应该是本领域技术人员所熟知的。所设计的具有一个或更多个传感的反应段可以以任何合适的方式制备，例如通过化学合成。
例如，可以使用包含传感部分的单体来合成反应段，使得将传感部分掺入反应段中。在反应段的制备中，将一种或更多种包含传感部分的单体掺入反应段中。此类单体包括但不限于天然核苷酸(例如鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、胞嘧啶核苷酸或尿嘧啶核苷酸)、氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)。例如，含有鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸或核苷酸类似物可用作合成反应段的单体，并且鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶可用作传感部分或传感模块。在一些实施方案中，合成的反应段包含两个相邻的选自由鸟嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸组成的组的嘌呤核苷酸。两个相邻的嘌呤构成传感模块。
作为另一个实例，用于合成的单体可以包含官能团，并且官能团可以经进一步修饰以形成传感部分，从而将传感部分掺入反应段中。在反应段的制备中，将一种或更多种包含官能团的单体掺入反应段。此类单体包括但不限于5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺。例如，含有炔烃或叠氮化物的单体(例如5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺)被用于合成，炔烃或叠氮化物可以进一步通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成(CuAAC)进行修饰，形成1,2,3-三唑，其可用作传感部分或传感模块。
作为另一个实例，用于合成的单体可以包含第一反应柄，第一反应柄可以进一步与连接至传感部分的第二反应柄反应，从而将传感部分掺入反应段中。在反应段的制备中，将一种或更多种包含第一反应柄的单体掺入反应段中。术语“反应柄”定义如上。例如，含有炔烃或叠氮化物的单体(例如5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺)被用于合成，其中作为第一反应柄的炔烃或叠氮化物可以进一步与连接至传感部分的第二反应柄(叠氮化物或炔烃)反应，例如连接至PBA的第二反应柄。
以上方式可以组合使用。作为上述方式组合的实例，用于合成的单体可以包含官能团，并且该官能团可以进一步经修饰以形成第一反应柄，并且第一反应柄可以进一步与连接至传感部分的第二反应柄反应，从而将传感部分掺入反应段。
应当理解，上述制备具有传感部分的反应段的方式仅为示例性的，并不用于限制本发明的范围。传感部分可以以任何合适的方式掺入反应段。
传感模块可以设计成与待表征的目标分子相匹配。仅需改变PNRSS链上的传感模块即可表征不同的目标分析物。例如，目标分析物可以包括但不限于：
包含金属元素的离子，其中包含金属元素的离子可以是阳离子或阴离子，或多原子离子或单原子离子，并且包含金属元素的离子可以是含碱土金属或过渡金属的离子，例如AuCl4 -、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+、Pb2+等。
糖类，例如单糖、寡糖或多糖，其中单糖可以选自核糖、果糖和甘露糖，例如，D-(-)-核糖、D-果糖、D-(+)-甘露糖，寡糖可以选自二糖和三糖；其中二糖的实例可以包含4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖)或6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖)；三糖的实例可以包含4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖)；
葡萄糖苷；
多酚，例如花青素或原花青素；
儿茶酚胺或儿茶酚胺衍生物，例如肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素；
多元醇，例如含有两个邻位羟基、1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物，例如，3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)、3,4-二羟基苯乙酸、儿茶酚、乙二醇、甘油、L-乳酸或维生素(例如维生素C或维生素B6)；
质子化或去质子化形式的化合物，例如质子化或去质子化形式的tris；
含有核糖部分的化合物，例如核苷酸、核苷、其类似物或其单磷酸盐衍生物或其多磷酸盐衍生物，例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物，例如胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)；
过氧化氢；
寡肽或环肽；
缓冲试剂，例如tris；
小分子药物，例如核苷类似物药物，例如galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物；
神经递质，例如儿茶酚胺或其衍生物；
具有特定手性的化合物，例如L-去甲肾上腺素或D-去甲肾上腺素；
含有同位素的分析物，例如儿茶酚-D6(氘取代儿茶酚上的所有氢原子)；
化学中间体；
或其任何组合。
例如，鸟嘌呤、腺嘌呤、由选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的两个相邻嘌呤组成的传感模块或1,2,3-三唑可用作传感模块，以与用作目标分析物的包含金属元素的离子相互作用。包含金属元素的离子可以是阳离子或阴离子。包含金属元素的离子可以是多原子离子或单原子离子。包含金属元素的离子可以是含碱土金属或过渡金属的离子，例如AuCl4 -、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+、Pb2+等。
例如，PBA可用作传感模块以与以下目标分析物相互作用：
糖类例如单糖、寡糖或多糖，其中单糖可以选自核糖、果糖和甘露糖，例如，D-(-)-核糖、D-果糖、D-(+)-甘露糖，寡糖可以选自二糖和三糖；其中二糖的实例可以包含4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖)或6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖)；三糖的实例可以包含4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖)；
葡萄糖苷；
多酚，例如花青素或原花青素；
儿茶酚胺或儿茶酚胺衍生物，例如肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素；
多元醇，例如含有两个邻位羟基、1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物，例如，3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)、3,4-二羟基苯乙酸、儿茶酚、乙二醇、甘油、L-乳酸或维生素(例如维生素C或维生素B6)；
质子化或去质子化形式的化合物，例如质子化或去质子化形式的tris；
含有核糖部分的化合物，例如核苷酸、核苷、其类似物或其单磷酸盐衍生物或其多磷酸盐衍生物，例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物，例如胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)；
过氧化氢；
寡肽或环肽；
缓冲试剂，例如tris；
小分子药物，例如核苷类似物药物，例如galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物；
神经递质，例如儿茶酚胺或其衍生物；
具有特定手性的化合物，例如L-去甲肾上腺素或D-去甲肾上腺素；
含有同位素的分析物，例如儿茶酚-D6(氘取代儿茶酚上的所有氢原子)；
化学中间体；
或其任何组合。
在一些实施方案中，聚合物链可以进一步包含在系链位点和反应段之间的延伸段，尽管延伸段不是必需的。
如果仅具有反应段和系链位点的PNRSS链的长度可以使得反应段位于适合测量在PNRSS链被驱动进入纳米孔的通道之后传感模块与目标分析物之间的相互作用引起的阻塞的区域，则可能不需要延伸段。然而，如果仅具有反应段和系链位点的PNRSS链的长度不足以使反应段位于适合测量在PNRSS链被驱动进入纳米孔的通道之后传感模块与目标分析物之间的相互作用引起的阻塞的区域，延伸链可用于调整反应段在通道中的位置，使反应段位于纳米孔通道内的合适位置，从而可以测量反应段与目标分析物相互作用造成的阻塞。在优选的实施方案中，延伸链用于将反应段定位在纳米孔通道的最窄区域中。因此，延伸段的长度根据实际需要而定。延伸段可以包含一个或更多个单体单元。例如，延伸段可以包含寡核苷酸。寡核苷酸的长度可以为1nt或更多、2nt或更多、3nt或更多、4nt或更多、5nt或更多、6nt或更多、7nt或更多、8nt或更多、9nt或更多、10nt或更多、11nt或更多、12nt或更多、13nt或更多、14nt或更多、或15nt或更多。
在一些实施方案中，聚合物链可以进一步包含牵引段，尽管牵引段不是必需的。
牵引段可以在反应段的与系链位点相对的一侧，即牵引段和系链位点不在反应段的同一侧。例如，牵引段可以带正电荷或负电荷。
牵引段可用于将聚合物链(尤其是反应段)保持在纳米孔的通道中。牵引段可以将反应段保持在纳米孔通道内适合测量由目标分析物与传感模块之间的相互作用引起的阻塞的区域中。牵引段可以防止聚合物链反向移动。牵引段可以防止聚合物链退出纳米孔的入口。牵引段有助于将反应段稳定在适合测量由反应段和目标分析物之间的相互作用引起的阻塞的通道区域中。
“反向”意指与聚合物链进入纳米孔的移动方向相反的方向。
“退出纳米孔的入口”意指聚合物链从其进入纳米孔的开口离开纳米孔。
牵引段不是必需的。即使没有牵引段将反应段保持在纳米孔中，也可以实现测量，只要聚合物链能够暂时进入纳米孔并伸展即可。
牵引段的形式没有限制，只要它能以任何方式发挥其功能。
例如，牵引段可以设计成聚合物链，在施加于纳米孔的电场中，其可以受到电泳力或电渗流的作用，从而趋向于向纳米孔通道的另一侧移动(或趋向于穿过纳米孔通道)，从而拉动反应段。例如，牵引段可以包含寡核苷酸。寡核苷酸的长度可以为10nt或更多、11nt或更多、12nt或更多、13nt或更多、14nt或更多、15nt或更多、16nt或更多、17nt或更多、18nt或更多、19nt或更多、20nt或更多、21nt或更多、22nt或更多、23nt或更多、24nt或更多、25nt或更多、26nt或更多、27nt或更多、28nt或更多、29nt或更多、30nt或更多、31nt或更多、32nt或更多、33nt或更多、34nt或更多、35nt或更多、36nt或更多、37nt或更多、38nt或更多、39nt或更多、40nt或更多、41nt或更多、42nt或更多、43nt或更多、44nt或更多、45nt或更多、50nt或更多、或55nt或更多。
“通道的另一侧”或“纳米孔的另一侧”意指与聚合物链进入纳米孔的开口相对的一侧。
作为另一个实例，牵引段可以是用于将反应段系链至纳米孔通道表面的偶联位点。例如，牵引段可以是可以与纳米孔通道表面上的天然氨基酸反应的小分子。反应段可以通过天然氨基酸和小分子之间的反应系链至纳米孔通道的表面。可以与天然氨基酸反应的小分子的实例如上所述。
作为另一个实例，可以将第一反应柄引入纳米孔通道的表面，并且牵引段包含第二反应柄。例如，可以将包含第一反应柄的非天然氨基酸掺入纳米孔蛋白质中，例如，在蛋白质的人工合成过程中或通过蛋白质的化学修饰，使引入的第一反应柄位于纳米孔通道的表面。反应段可以通过第一和第二反应柄之间的反应系链至纳米孔通道的表面。反应柄定义如上。
作为另一个实例，牵引段可以被设计为聚合物链，并且牵引段的至少一部分可以在施加于纳米孔的电场中被驱动穿过纳米孔。穿过纳米孔的部分牵引段可以在纳米孔外形成三维结构。三维结构可以具有比纳米孔的出口更大的尺寸并且可以防止牵引段的所述部分缩回到纳米孔中。可以设计牵引段的长度，以保证能够形成三维结构的部分能够穿过纳米孔到达纳米孔的外侧。在一些实施方案中，牵引段可以包含核酸。在一些实施方案中，三维结构可以是发夹结构。在一些实施方案中，三维结构可以是由核酸序列形成的发夹结构。
如本文所用，术语“聚合物”是指包含通过共价键连接在一起的两个或更多个单体的分子。术语“聚合物”包括均聚物、共聚物、生物聚合物例如核酸或肽。
如本文所用，术语“聚合物链(polymer strand)”、“聚合物链(polymer chain)”或“聚合物”可以互换使用，并且可以是直链或支链的。
术语“单体”、“单元”、“单体单元”和“结构单元”在本发明中可以互换使用并且是指聚合物的构成单元。聚合物链或聚合物链中包含的两种或更多种单体可以相同或不同，或者它们的一部分是相同的。
本发明的聚合物链的单体单元不受限制，并且可以包括核苷酸或其类似物、脱碱基、氨基酸或其类似物、单糖、可以聚合形成均聚物的单体单元(例如乙二醇，其可以聚合形成PEG)、可以聚合形成共聚物的单体单元或其任何组合。可以聚合形成均聚物或共聚物的单体单元可以是小分子化合物。
如本文所用，术语“小分子”和“小分子化合物”可以互换使用，并且是指低分子量化合物，例如，<900道尔顿，或尺寸在1nm量级。本发明中的小分子可以意指核苷酸、氨基酸和/或单糖以外的小分子。
术语“核苷酸类似物”通常是非天然存在的并且与天然存在的核苷酸(A、T、C或G)相比具有修饰的核苷酸碱基部分、修饰的戊糖部分和/或修饰的磷酸盐部分。核苷酸类似物的实例包括但不限于阿拉伯核酸(ANA)、桥接核酸(BNA)、环己烯基核酸(CeNA)、2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、乙二醇核酸(GNA)、己糖核酸(HNA)、锁核酸(LNA)、吗啉、肽核酸(PNA)或苏糖核酸(TNA)的单体单元。
术语“氨基酸类似物”是指结构上类似于天然存在的氨基酸的化合物，其中C-末端羧基、N-末端氨基或侧链官能团已经被化学修饰。氨基酸类似物包括但不限于β-氨基酸和其中氨基或羧基被类似反应基团取代的氨基酸(例如，伯胺被仲胺或叔胺取代，或用酯取代羧基)。天冬氨酸-(β-甲酯)是天冬氨酸的氨基酸类似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸类似物；或丙氨酸羧酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。
本发明的聚合物链可以基于(换言之，基本上由其组成)核酸、核酸类似物、多肽、多糖、均聚物(例如聚乙烯、PEG)、共聚物或其任何组合，也就是说，聚合物链的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的单体单元可以聚合形成核酸、核酸类似物、多肽、多糖、均聚物(例如聚乙烯、PEG)、共聚物或其任何组合。
如本文所用，“核酸类似物”是指与天然存在的RNA和DNA类似(结构上相似)的化合物。核酸是核苷酸链，其由三部分组成：磷酸骨架、戊糖(核糖或脱氧核糖)和四种核碱基中的一种。类似物可以具有改变的这些中的任何一个。核酸类似物可以通过分子骨架的变化与天然存在的DNA或RNA相区分。核酸类似物的实例包括但不限于阿拉伯核酸(ANA)、桥接核酸(BNA)、环己烯基核酸(CeNA)、2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、乙二醇核酸(GNA)、己糖核酸(HNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)。
本发明的聚合物链的每个部分(例如反应段、延伸段和/或牵引段)可以独立地基于(换言之，基本上由其组成)核酸、核酸类似物、多肽、多糖、均聚物(例如聚乙烯、PEG)、共聚物或其任何组合，也就是说，这些段(例如反应段、延伸段和/或牵引段)中的每一个的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的单体单元可以聚合形成核酸、核酸类似物、多肽、多糖、均聚物(例如聚乙烯、PEG)、共聚物或其任何组合。
如本文所用，术语“核酸类似物”是指与天然存在的RNA和DNA类似(结构相似)并且由核苷酸类似物组成的化合物。核酸类似物包括但不限于，阿拉伯核酸(ANA)、桥接核酸(BNA)、环己烯基核酸(CeNA)、2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、乙二醇核酸(GNA)、己糖核酸(HNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代、肽核酸(PNA)或苏糖核酸(TNA)。
如本文所用，术语“多肽”可以包含天然存在的氨基酸和/或氨基酸类似物。
鉴于前述，可以设计聚合物链的每个部分，包括系链位点、延伸段、反应段和/或牵引段。聚合物链的每一部分可以以任何合适的方式实现，并且不限于上述示例。
用于表征目标分析物的系统和方法
纳米孔可以被放置在将第一导电液体介质与第二导电液体介质分隔开的膜中，其可以称为纳米孔系统。纳米孔的通道是第一导电液体介质和第二导电液体介质连通的唯一路径。通常，目标分析物被添加在第一导电液体介质和第二导电液体介质中的至少一个中。该膜可以是有机膜，例如脂质双层，或合成膜，例如由聚合物材料形成的膜。纳米孔延伸穿过的膜的厚度可以在1nm至约10μm的范围内。
纳米孔系统的制备是众所周知的，例如，对于蛋白质纳米孔系统，当将孔蛋白(例如MspA)置于被膜(例如脂质双层)分隔开的第一导电液体介质和第二导电液体介质中的任何一个中时，蛋白质可以自发插入膜中形成纳米孔。
聚合物链(PNRSS链)可以被置于纳米孔的任一侧，即第一导电液体介质或第二导电液体介质。目标分析物可以被置于纳米孔的任一侧，即第一导电液体介质或第二导电液体介质。在一些实施方案中，聚合物链和目标分析物被置于在纳米孔的相同侧或不同侧。
当在第一导电液体介质和第二导电液体介质之间施加电位差(也称为电压或电场)时(即跨纳米孔施加电场或电压)，产生穿过纳米孔的通道离子电流，并且聚合物链可以被驱动从导电液体介质进入纳米孔并伸展，例如在电泳力和/或电渗流的作用下。电位差可以不小于20mV、不小于40mV、不小于60mV、不小于80mV、不小于100mV、不小于120mV、不小于140mV、不小于160mV、不小于180mV或不小于200mV；或在约20mV至200mV的范围、在约40mV至180mV的范围、在约600mV至180mV的范围、在约80mV至180mV的范围、在约100mV至180mV的范围、在约120mV至180mV的范围、在约140mV至180mV的范围、在约160mV至180mV的范围。
在一些实施方案中，第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的电位差有变化或保持不变化。向纳米孔施加电场的方法和装置是本领域技术人员已知的。例如，可以使用一对电极向纳米孔施加电场。正如所理解的那样，可以使用的电压范围可以取决于纳米孔系统的类型和所使用的分析物。
纳米孔系统与聚合物链相组合，可用于表征(或识别)目标分析物。首先，聚合物链被驱动进入纳米孔的通道并停留在通道中，然后目标分析物被驱动进入纳米孔并与聚合物链上的传感模块相互作用。这种相互作用导致阻塞，测量该阻塞以表征目标分析物。用于表征目标分析物的系统可以进一步包含目标分析物。任选地，在该系统中，目标分析物可能已经与传感模块相互作用，或者目标分析物可能还没有与传感模块相互作用。
可以通过电泳力或浓度差(扩散效应)驱动目标分析物进入纳米孔。目标分析物与纳米孔通道中存在的传感模块相互作用，并且相互作用导致离子电流的阻塞，这是可测量的，例如，通过测量目标分析物进入纳米孔后的电流，并将其与聚合物链进入纳米孔且目标分析物未进入纳米孔时的电流进行比较。离子电流的阻塞可能与目标分析物的身份、目标分析物与试剂(如传感模块)的相互作用、目标分析物的结合动力学等有关。
通常，“离子电流的阻塞”也可以称为“阻塞电流”，这可以通过离子电流的变化来证明，该变化可以明显地与噪声波动区分，并且通常与纳米孔内存在的分析物分子有关。阻塞的强度或电流的变化将取决于分析物的特性。更具体地，“阻塞”可以指离子电流下降到比未阻塞电流水平低约5-100％的水平，保持一段时间，然后自发返回至未阻塞水平的区间。例如，阻塞电流水平可以是比未阻塞电流水平低约、至少约或至多约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。阻塞可以称为阻塞事件或事件。
测量可以在任何合适的温度下进行，例如-4℃-100℃，例如4℃-50℃、5℃-25℃或室温。
测量完成后，可施加反向电压驱动聚合物链反向移动并退出纳米孔。然后，可以再次改变电压方向，驱动另一条传感模块未被占用的聚合物链进入纳米孔的通道中，进行下一次测量。因此，本发明的方法可以重复使用同一系统进行多次测量。
通过纳米孔的电流的测量是本领域熟知的并且可以通过光信号或电流信号进行。例如，可以使用一个或更多个测量电极测量通过纳米孔的电流。这些可以是，例如，膜片钳放大器或数据采集设备。
“液体介质”包括水性、有机-水性和仅有机液体介质。有机介质包括，例如，甲醇、乙醇、二甲亚砜及其混合物。可用于本文所述方法的液体是本领域熟知的。此类介质(包括导电液体介质)的描述和实例在美国专利号7,189,503中提供，例如，其通过引用以其全文并入本文。可以向此类培养基中添加盐、去污剂或缓冲液。此类试剂可用于改变液体介质的pH或离子强度。在一些实施方案中，盐可以包含KCl和/或盐的浓度可以为0.5M-2.5M。在一些实施方案中，KCl的浓度为1.5M。缓冲剂可以是HEPES或Tris等。第一导电液体介质和/或第二导电液体介质的pH可以是1.0-13.0，优选6.0-8.0，优选7.0-7.4，这可以取决于目标分析物的期望电荷性质。在一些实施方案中，第一导电液体介质和/或第二导电液体介质不含有Tris。
如本文所用，电流模式和电流迹线可以互换使用，是指离子电流随时间的变化。电流模式可以含有一种或更多种类型的阻塞事件，并且可以含有一种或更多种相同类型的单独阻塞事件。阻塞事件的分布、频率、幅度等特征可以从电流模式获知。
在本发明中，纳米孔在测量过程中具有不同的状态。状态I代表未占位的纳米孔，在该纳米孔处测量的电流为开孔电流(I0)。状态II和III代表被PNRSS链占位的纳米孔，其中PNRSS链的传感部分不与靶分子相互作用(II)或与靶分子相互作用(III)。在状态(II)或(III)测量的电流分别定义为第一阻塞电流(Ip)或第二阻塞电流(Ib)
如本文所用，“事件”是指目标分析物对纳米孔的阻塞(即，离子电流下降到比第一阻塞电流水平低约5-100％的水平的区间，保持该水平一段时间，并自发返回至第一阻塞电流水平)，也指目标分析物阻塞引起的电流变化。如本文所用，第一阻塞电流水平是指当纳米孔被PNRSS链占位时测量的电流水平，其中PNRSS链的传感模块不与目标分析物分子相互作用。本领域技术人员知晓如何确定事件的发生。
可以从电流模式获得多种特征参数。特征参数包括但不限于开孔电流(I0)、第一阻塞电流幅度(Ip)、第二阻塞电流幅度(Ib)、事件幅度(△I，定义为△I＝Ib－Ip)、事件间持续时间(ton)、事件停留时间(toff)、平均事件幅度这些特征参数中的一个或更多个可用于表征分析物。
目标分析物的表征可以包括但不限于确定目标分析物的身份、确定目标分析物是否为特定物质、确定存在或不存在目标分析物、确定目标分析物和试剂的相互作用(例如，试剂可以是传感模块，本发明的系统和方法可用于确定目标分析物和传感部分之间存在相互作用)，或测量目标分析物与试剂的结合动力学(例如，试剂可以是传感模块，本发明的系统和方法可用于确定目标分析物与传感部分的结合动力学)。身份可以包括但不限于分析物是什么、分析物的结构、分析物的质子化状态或去质子化状态、分析物的手性等。
例如，为了确定目标分析物的身份，可以将测试的电流模式与参考电流模式进行比较，并确定目标分析物的身份。
例如，为了确定目标分析物和试剂是否相互作用，试剂可以作为传感模块被包含在聚合物链的反应段中，事件的发生代表目标分析物和试剂之间的相互作用。
如本文所用，测试电流模式是指通过使用测试的分析物(即目标分析物)获得的电流模式。
参考电流模式是指用作参考以确定目标分析物的至少一个特性的电流模式。根据检测的目的，可以使用不同的参考电流模式。例如，参考电流模式可以是在与被测电流模式相同条件下使用已知分析物得到的电流模式。可以确定被测分析物与参考分析物相同还是不同。
在一些实施方案中，可以通过使用机器学习算法来实现根据测试电流模式对目标分析物的表征。
在一些实施方案中，可以对测试的电流模式进行滤波以获得高通和/或低通，并且从高通和/或低通提供测试的电流模式。在一些实施方案中，高通和/或低通的截止频率为约100Hz，高通和/或低通的截止频率为约100Hz。
本发明的系统和方法可用于表征单分子的目标分析物。本发明的系统和方法可以表征大量的分析物，只要分析物的尺寸允许其进入纳米孔的通道。如果分析物可以与某个部分(moiety)相互作用，则可以通过本发明的系统和方法使用该部分作为传感模块来表征分析物。
本发明的系统和方法可用于表征多种不同的目标分析物，例如通过使用包含多个(例如两个或更多个)传感模块的聚合物链，该传感模块可以与多个(例如两个或更多个)不同的目标分析物相互作用。在一些实施方案中，可以驱动多种不同的目标分析物同时进入纳米孔的通道，并分别与多个传感模块相互作用。产生的多重相互作用可以同时测量，并根据它们各自的电流模式相互区分。在一些实施方案中，可以驱动多种不同的目标分析物以不同轮次进入纳米孔的通道进行测量。例如，多个传感模块彼此不同，并且每个传感模块可以与一种或更多种特定分析物特异性相互作用。这种传感模块的设计可用于表征多种不同的目标分析物，其中每种目标分析物只能与多个传感模块中的一个相互作用。作为说明，可以驱动第一目标分析物进入纳米孔的通道并与第一传感模块相互作用，并测量第一目标分析物与第一传感模块之间的第一相互作用；然后，可以驱动第二目标分析物进入纳米孔的通道并与第二传感模块相互作用，并测量第二目标分析物与第二传感模块之间的第二相互作用。对其他目标分析物重复上述步骤，直到所有目标分析物均被表征或所有传感模块均被占据。
在本发明的系统和方法中，可以同时使用多个纳米孔，这可以提高分析物的检测限。优选地，多个纳米孔是相同的。
本发明还涉及以下方面：
方面1.用于识别目标分析物的系统，该系统包括：
(1)纳米孔；
(2)由系链位点、延伸段、反应段和牵引段依次组成的聚合物链；
其中聚合物链在系链位点与系链分子偶联，并且系链分子的尺寸大于纳米孔腔，使其不能进入纳米孔腔；
其中延伸段具有合适的长度，使得当聚合物链被装载到纳米孔中时，反应段位于纳米孔的最窄处；
其中反应段包含能够与目标分析物结合的第一活性基团。
方面2.根据方面1所述的系统，其中第一活性基团被包含在所述聚合物骨架中。
方面3.根据方面2所述的系统，其中聚合物骨架包含一个或更多个聚合物单体衍生物并且第一活性基团被包含在一个或更多个聚合物单体衍生物中。
方面4.根据方面1的系统，其中第一活性基团直接或通过一个或更多个接头与聚合物骨架连接。
方面5.用于识别目标分析物的系统，该系统包括：
(1)纳米孔；
(2)由系链位点、延伸段、反应段和牵引段依次组成的聚合物链；
其中聚合物链在系链位点与系链分子偶联，并且系链分子的尺寸大于纳米孔腔，使其不能进入纳米孔腔；
其中延伸段具有合适的长度，使得当聚合物链被装载到纳米孔中时，反应段位于纳米孔的最窄处；
其中反应段包含第二活性基团，并且第二活性基团能够与包含第一活性基团的化合物直接结合或通过一个或更多个接头结合；其中第一活性基团能够与目标分析物结合。
方面6.根据方面5所述的系统，其中第二活性基团被包含在聚合物骨架中。
方面7.根据方面6所述的系统，其中聚合物骨架包含一个或更多个聚合物单体衍生物，并且第一活性基团被包含在一个或更多个聚合物单体衍生物中。
方面8.根据方面5所述的系统，其中第二活性基团与聚合物骨架直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面9.根据前述方面中任一项所述的系统，其中该系统进一步包含被界面分隔开的两个隔室；其中两个隔室中的每一个均包含液体介质并且纳米孔位于界面中。
方面10.根据前述方面中任一项所述的系统，其中聚合物骨架是核酸、肽、多糖或其任何组合。
方面11.根据前述方面中任一项所述的系统，其中聚合物骨架是DNA、RNA，或DNA和RNA的杂合体。
方面12.根据前述方面中任一项所述的系统，其中反应段包含鸟嘌呤、腺嘌呤或其任何组合。
方面13.根据前述方面中任一项所述的系统，其中反应段包含选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的相邻嘌呤，优选地选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的两个相邻嘌呤。
方面14.根据前述方面中任一项所述的系统，其中第一活性基团是1,2,3-三唑。
方面15.根据前述方面中任一项所述的系统，其中1,2,3-三唑通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成(CuAAC)反应将叠氮化物与炔烃缀合而产生。
方面16.根据前述方面中任一项所述的系统，其中炔烃被包含在聚合物骨架中，或包含炔烃的化合物与聚合物骨架连接直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面17.根据前述方面中任一项所述的系统，其中聚合物骨架包含5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺。
方面18.根据前述方面中任一项所述的系统，其中叠氮化物是3-叠氮基丙胺。
方面19.根据前述方面中任一项所述的系统，其中第一活性基团是苯硼酸。
方面20.根据前述方面中任一项所述的系统，其中苯硼酸通过CuAAC将4-(叠氮甲基)苯硼酸与炔烃缀合而产生。
方面21.根据前述方面中任一项所述的系统，其中第二活性基团是炔烃。
方面22.根据前述方面中任一项所述的系统，其中炔烃被包含在聚合物骨架中，或包含炔烃的化合物与聚合物骨架直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面23.根据前述方面中任一项所述的系统，其中聚合物骨架包含5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺。
方面24.根据前述方面中任一项所述的系统，其中目标分析物选自由以下组成的组：金属离子、糖类、儿茶酚胺、儿茶酚胺衍生物、含有1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物、多元醇(例如儿茶酚)、乙二醇、甘油、L-乳酸、维生素(例如维生素C或维生素B6)、缓冲试剂例(例如质子化或去质子化形式的tris)、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、抗病毒药物(例如瑞德西韦或瑞德西韦的三磷酸代谢物)、过氧化氢、多糖或环肽。
方面25.根据前述方面中任一项所述的系统，其中所述金属离子是过渡金属离子，优选Ni2+、Zn2+、Cd2+、Co2+或Cu2+。
方面26.根据前述方面中任一项所述的系统，其中目标分析物是多元醇并且液体介质不含tris缓冲液。
方面27.根据前述方面中任一项所述的系统，其中系链分子是链霉亲和素。
方面28.根据前述方面中任一项所述的系统，其中系链位点用5’生物素-TEG修饰。
方面29.根据前述方面中任一项所述的系统，其中第二活性基团能够与多种含有不同第一活性基团的化合物结合。
方面30.根据前述方面中任一项所述的系统，其中目标分析物是单个分子、单原子离子或化学中间体。
方面31.根据前述方面中任一项所述的系统，其中目标分析物是单原子离子或化学中间体。
方面32.根据前述方面中任一项所述的系统，其中纳米孔是蛋白质纳米孔、固态纳米孔或DNA纳米孔。
方面33.根据前述方面中任一项所述的系统，其中纳米孔具有圆锥形或圆柱形的腔。
方面34.根据前述方面中任一项所述的系统，其中蛋白质纳米孔是MspA、M2MspA突变体(D93N/D91N/D90N/D118R/D134R/E139K)、α-HL、气溶素、ClyA、FraC、PlyA/B或Phi 29连接体。
方面35.根据前述方面中任一项所述的系统，其中纳米孔由固态材料(例如SiNx、石墨烯、玻璃、石英或DNA框架)制成。
方面36.用于识别目标分析物的方法，该方法包括：
提供纳米孔；
提供由系链位点、延伸段、反应段和牵引段依次组成的聚合物链；其中聚合物链在系链位点与系链分子偶联，并且系链分子的尺寸大于纳米孔腔，使其不能进入纳米孔腔；其中延伸段具有合适的长度，使得当聚合物链被装载到纳米孔中时，反应段位于纳米孔的最窄处；并且其中反应段具有能够与目标分析物结合的活性基团；
使聚合物链进入纳米孔并将反应段定位在纳米孔的最窄处；
使目标分析物穿过纳米孔；和
在移位过程中测量通过纳米孔的离子电流的变化，从而识别目标分析物。
方面37.根据方面36所述的方法，其中第一活性基团被包含在所述聚合物骨架中。
方面38.根据方面37所述的方法，其中聚合物骨架包含一个或更多个聚合物单体衍生物并且第一活性基团被包含在一个或更多个聚合物单体衍生物中。
方面39.根据方面36的方法，其中第一活性基团与聚合物骨架直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面40.用于识别目标分析物的方法，该方法包括：
提供纳米孔；
提供由系链位点、延伸段、反应段和牵引段依次组成的聚合物链；其中聚合物链在系链位点与系链分子偶联，系链分子的尺寸大于纳米孔腔，使其不能进入纳米孔腔；其中，延伸段具有合适的长度，使得当聚合物链被装载到纳米孔中时，反应段位于纳米孔的最窄处；其中反应段包含第二活性基团并且第二活性基团能够与包含第一活性基团的化合物直接结合或通过一个或更多个接头结合；并且其中第一活性基团能够与目标分析物结合；
使第二活性基团与包含第一活性基团的化合物直接结合或通过一个或更多个接头组合；
使聚合物链进入纳米孔并将反应段定位在纳米孔的最窄处；
使目标分析物穿过纳米孔；和
在移位过程中测量通过纳米孔的离子电流的变化，从而识别目标分析物。
方面41.根据方面40所述的方法，其中第二活性基团被包含在所述聚合物骨架中。
方面42.根据方面41所述的方法，其中聚合物骨架包含一个或更多个聚合物单体衍生物并且第一活性基团被包含在一个或更多个聚合物单体衍生物中。
方面43.根据方面40所述的方法，其中第二活性基团与聚合物骨架直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面44.用于识别多个目标分析物的方法，该方法包括：
(1)提供由界面分隔开的两个隔室；其中两个隔室中的每一个均包含液体介质并且界面具有纳米孔；
(2)提供由系链位点、延伸段、反应段和牵引段依次组成的聚合物链；其中聚合物链在系链位点与系链分子偶联，系链分子的尺寸大于纳米孔腔，使其不能进入纳米孔腔；其中延伸段具有合适的长度，使得当聚合物链被装载到纳米孔中时，反应段位于纳米孔的最窄处；并且其中反应段具有能够与第一目标分析物不可逆结合的活性基团；
(3)在两个隔室之间施加第一电压，从而使聚合物链进入纳米孔，并将反应段定位在纳米孔的最窄处；
(4)使第一目标分析物移位穿过纳米孔；和
(5)测量移位过程中通过纳米孔的离子电流的变化，从而识别第一目标分析物；
(6)在两个隔室之间施加与第一电压方向相反的第二电压，从而使与第一目标分析物不可逆结合的聚合物链离开纳米孔；
(7)重复(3)-(5)以将另一条聚合物链重新装载到纳米孔中并识别另一目标分析物。
方面45.根据前述方面中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括提供由界面分隔开的两个隔室；其中两个隔室中的每一个均包含液体介质并且纳米孔位于界面中。
方面46.根据前述方面中任一项所述的方法，其中聚合物骨架是核酸、肽、多糖或其任何组合。
方面47.根据前述方面中任一项所述的方法，其中聚合物骨架是DNA、RNA，或DNA和RNA的杂合体。
方面48.根据前述方面中任一项所述的方法，其中反应段包含鸟嘌呤、腺嘌呤或其任何组合。
方面49.根据前述方面中任一项所述的方法，其中反应段包含选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的相邻嘌呤，优选选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的两个相邻嘌呤。
方面50.根据前述方面中任一项所述的方法，其中第一活性基团是1,2,3-三唑。
方面51.根据前述方面中任一项所述的方法，其中1,2,3-三唑通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成(CuAAC)反应将叠氮化物与炔烃缀合而产生。
方面52.根据前述方面中任一项所述的方法，其中炔烃被包含在聚合物骨架中，或包含炔烃的化合物与聚合物骨架直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面53.根据前述方面中任一项所述的方法，其中聚合物骨架包含5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺。
方面54.根据前述方面中任一项所述的方法，其中叠氮化物是3-叠氮基丙胺。
方面55.根据前述方面中任一项所述的方法，其中第一活性基团是苯硼酸。
方面56.根据前述方面中任一项所述的方法，其中苯硼酸通过CuAAC将4-(叠氮甲基)苯硼酸缀合至炔烃而产生。
方面56.根据前述方面中任一项所述的方法，其中第二活性基团是炔烃。
方面58.根据前述方面中任一项所述的方法，其中炔烃被包含在聚合物骨架中，或包含炔烃的化合物与聚合物骨架直接连接或通过一个或更多个接头连接。
方面59.根据前述方面中任一项所述的方法，其中聚合物骨架包含5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺。
方面60.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物选自由以下组成的组：金属离子、糖类、儿茶酚胺、儿茶酚胺衍生物、含有1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物、多元醇(例如儿茶酚)、乙二醇、甘油、L-乳酸、维生素(例如维生素C或维生素B6)、缓冲试剂(例如质子化或去质子化形式的tris)、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、抗病毒药物(例如瑞德西韦或瑞德西韦的三磷酸代谢物)、过氧化氢、多糖或环肽。
方面61.根据前述方面中任一项所述的方法，其中所述金属离子是过渡金属离子，优选Ni2+、Zn2+、Cd2+、Co2+或Cu2+。
方面62.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物是多元醇并且液体介质不含tris缓冲液。
方面63.根据前述方面中任一项所述的方法，其中系链分子是链霉亲和素。
方面64.根据前述方面中任一项所述的方法，其中系链位点用5’生物素-TEG修饰。
方面65.根据前述方面中任一项所述的方法，其中第二活性基团能够与多种含有不同第一活性基团的化合物结合。
方面66.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物是单个分子、单原子离子或化学中间体。
方面67.根据前述方面中任一项所述的方法，其中目标分析物是单原子离子或化学中间体。
方面68.根据前述方面中任一项所述的方法，其中纳米孔是蛋白质纳米孔、固态纳米孔或DNA纳米孔。
方面69.根据前述方面中任一项所述的方法，其中纳米孔具有圆锥形或圆柱形的腔。
方面70.根据前述方面中任一项所述的方法，其中蛋白质纳米孔是MspA、M2MspA突变体(D93N/D91N/D90N/D118R/D134R/E139K)、α-HL、气溶素、ClyA、FraC、PlyA/B或Phi 29连接体。
方面71.根据前述方面中任一项所述的方法，其中纳米孔由固态材料(例如SiNx、石墨烯、玻璃、石英或DNA框架)制造。
方面72.根据前述方面中任一项所述的方法，其用于筛选药物。
方面73.根据方面1-35中任一项所述的系统在筛选药物中的用途。
实施例1使用天然DNA碱基的PNRSS
天然核酸碱基，例如鸟嘌呤、腺嘌呤或其任何组合，可以充当可以结合金属离子的配位体36,37。第一PNRSS链13G/14G(表1)具有两个相邻的鸟嘌呤，它们协同结合Ni2+离子(图1c)。为了避免来自其他DNA碱基的干扰，这些鸟嘌呤被不能结合金属离子的无碱基残基包围。如方法中所述进行PNRSS测量。向cis室添加该13G/14G链，终浓度为10nM。插入单个孔并持续施加+180mV电位，初始报告开孔电流I0。随后，通过电泳捕获PNRSS链并报告静态剩余电流Ip(表2)。然后，向trans室添加Ni2+作为移动反应物，终浓度为1mM。这立即导致进一步的阻塞事件，达到定义为Ib的水平。事件的连续出现被观察为Ip和Ib之间的电报式转换(图1d，视频1)。trans侧中Ni2+的浓度在0-1mM之间调整(图7)，然后事件出现率在较高[Ni2+]下明显增加。然而，从另一个PNRSS链14X(图8)未观察到这些事件，证实它们源自与双鸟嘌呤配体的结合37。这种现象也进行了理论模拟，发现N(7)和O(6)原子在Ni2+的配位中起关键作用(图9，表3，方法)。
定量描述任何PNRSS事件的核心参数总结在图10中，其中定义了停留时间toff和事件间间隔ton。阻塞幅度ΔI定义为Ib－Ip。使用13G/14G和Ni2+测量的ΔI相对于toff的事件散点图显示了单一事件群，其中ΔI＝～-60pA(图1e)，明显大于单原子离子产生的事件，其中当使用α-HL 23观察时，幅度为约2pA。平均停留时间τoff和平均事件间间隔τon分别由图10的数据得出。时间直方图总结在图11中，从中得出相应的τon和τoff值。如图1f所示，平均事件间间隔的倒数(1/τon)与[Ni2+]成正比，这与单步双分子模型一致，其中1/τon＝kon[Ni2+]。然而，平均停留时间τoff表明对[Ni2+]的依赖性可以忽略不计，这与单分子解离模型一致，其中1/τoff＝koff。因此，kon被确定为1/τon相对于[Ni2+]的拟合线的斜率，并且koff由1/τoff值的平均值确定。
还使用13G/14G测试了其他二价离子例如Zn2+、Cd2+、Co2+或Cu2+，这表明与Co2+和Cu2 +的结合偏好优先于Zn2+或Cd2+(图12)。Ni2+、Co2+或Cu2+的结合事件也彼此显著不同，表明使用PNRSS可以进行单个离子区分。不同的PNRSS链，例如14A，具有单一腺嘌呤作为固定反应物，或14G，具有鸟嘌呤(表1)，也提供了Ni2+结合的事件(图13-16)。然而，此处的结合特性与使用13G/14G观察到的不同(表4)，表明使用PNRSS监测的不同化学过程正在发生。尽管先前使用NMR或红外光谱进行了整体研究36,37，但据我们所知，先前尚未报告金属离子与DNA碱基结合的直接单分子观察及其相应的定量结合动力学。
实施例2使用1,2,3-三唑的PNRSS
除了上述概念证明之外，更广泛的人工的、功能性的DNA亚磷酰胺的选择为PNRSS链的设计和合成提供了相对不受限制的自由度，并彻底拓宽了下游PNRSS测量的通用性和复杂性38。5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺(Glen Research，USA)是含有炔烃的胸腺嘧啶衍生物，用于合成PNRSS链14TAK(表1，方法)。14TAK在位点14处含有单一炔烃，任何叠氮化物均可以通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成(CuAAC)反应(广泛应用的点击化学反应)与该炔烃缀合39。3-叠氮基丙胺是最简单的叠氮化物之一，它与14TAK反应(表1，图17)。通过质谱(图17)和单通道记录(图18，表5)对产物进行表征。确认成功缀合，产生新PNRSS链，被称为14TAZ(表1)。通过CuAAC反应，在14TAZ的第14位产生1,2,3-三唑(TAZ)(图2a)。
先前已有报道，TAZ的N(2)或N(3)原子可以作为电子孤对供体并作为结合金属离子的配位点40。作为单分子行为的证明，进行PNRSS测量，其中14TAZ的TAZ用作固定反应物。向trans侧添加Ni2+用作移动反应物，终浓度为1mM。在持续施加+180mV电位的情况下，观察到连续出现具有高特征噪声信号的结合事件(图2b-2c，视频2)。在ΔI相对于toff的散点图中报告了事件的单一分布(图2d)。通过将trans侧中Ni2+浓度从0mM上调至1mM，事件出现率明显增加(图19-20)。平均事件间间隔的倒数(1/τon)与Ni2+浓度成正比(图2e)。然而，平均停留时间τoff表明对[Ni2+]的依赖性可以忽略不计。还使用Co2+进行类似测量，其中结合事件显示为瞬态电阻脉冲(图21-22)，报告平均停留时间τoff为1.32ms，远短于使用Ni2+时观察到的220ms(表6)。速率常数kon和koff分别来自图2e和21c中的结果。平衡结合常数Kb计算为Kb＝kon/koff，其中Ni2+对TAZ的结合亲和力明显强于Co2+(表6)。当同时检查Ni2+和Co2+时，它们的结合事件被明确识别(图23)。因此，PNRSS链14TAK证明了其作为引入任何叠氮化物的模板的通用性。当与3-叠氮基丙胺反应时，生成的TAZ本身可以作为固定反应物，Ni2+或Co2+将与该反应物结合。
实施例3使用苯硼酸进行的PNRSS
然而，在涉及CuAAC的大多数情况下，TAZ被视为接头，其他功能模块可以附接至该接头41。苯硼酸(PBA)是糖类或儿茶酚胺传感器的核心组分42，其与含有1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物反应形成五元或六元硼酸酯(图3a)43-45。为了将PBA引入PNRSS链，4-(叠氮甲基)苯硼酸通过CuAAC与PNRSS链14TAK反应(方法，图24-25)。该产物通过质谱(图25)和单通道记录(图26，表7)进一步表征，证实了偶联成功并产生新PNRSS链，称为14PBA的(表1)。为了进行PNRSS，14PBA的第14位的PBA用作固定反应物。持续施加+160mV电位。多元醇(例如儿茶酚)44(图3b，图27-28)、乙二醇45(图3c，图29-30)、甘油45(图3d，图31-32)、L-乳酸44(图3e，图33-34)、维生素C46(图3f，图35-36)或维生素B647(图3g，图37-38)，用作移动反应物并以期望浓度单独添加至trans侧。尽管结合特性和动力学不同(表8-9)，但所有上述反应物均报告了与PBA的可检测结合。相反，当使用14TAK探测时，未观察到结合事件，证实这些事件是与PBA结合的结果(图26e)。与PBA反应结构不相容的间苯二酚未能产生任何结合事件(图3h)，进一步证实了反应机制。图3b-3g中讨论的所有观察到的反应都报告了正向事件(Ib＞Ip)。这是有悖直觉的，因为在纳米孔腔中占据更多空间的结合分子预期会产生负向事件(Ib＜Ip)。所提出的机制是上述任何分析物与PBA的结合导致阴离子硼酸酯的产生，如先前几篇文献中所报道的48,49。这种产生的负电荷通常可以增强通过孔的离子流。证明向孔缢缩处引入负电荷将增强孔电导的证据是，在孔缢缩处比M2 MspA具有更多负电荷的野生型MspA在开孔状态下比M2 MspA的导电性显著更高7。另一方面，所结合的分析物的整体尺寸可能有助于减少离子流。因此，结合的分析物对阻塞幅度的总体贡献可能是正向的，特别是当研究的分析物是小分子时。可以进行使用量子化学和分子动力学模拟的系统研究以进一步量化这种现象，但要在单独的后续研究中进行。
基于纳米孔的单分子化学的核心优势在于可以以μs的分辨率探测化学中间体的瞬时出现50。三(羟甲基)-氨基乙烷(tris)是广泛使用的缓冲试剂，其共轭酸的pKa为～8.351。当溶解在pH值接近其pKa的水溶液中时，质子化或去质子化形式的tris均以相当大的比例存在。在任一形式中，作为多元醇的tris分子可以与PBA反应，并且可以观察到由其质子化或去质子化产生的化学中间体。尽管tris易于获得并被广泛使用，但迄今为止似乎尚未研究tris与PBA的结合。为了证明使用PNRSS直接观察化学中间体，PBA和tris分别被用作固定和移动反应物(图39-40)。在pH 7.0下，tris与PBA的结合产生正向事件，达到Ib1水平。然而，在pH 8.0下，除了Ib1外，还观察到了另外的结合水平(Ib2)。当与PBA结合时，还观察到Ip、Ib1和Ib2之间的动态转换，其中Ib1和Ib2分别代表质子化和去质子化的tris(图41)。带更多负电荷的去质子化状态报告更高阻塞状态(Ib2>Ib1)，该观察结果也与我们先前的推测一致，即更多的负电荷通常增强该测量设置中的离子流。通过这个简单的实例可以看出，直接观察化学中间体可以了解瞬态化学过程。如果设计得当，化学中间体的出现也有助于区分具有细微差异的化合物。上述展示还表明，在使用PNRSS进行的任何基于PBA的多元醇传感测定中均应避免使用tris缓冲液，以避免干扰。
实施例4重复观察不可逆反应
根据先前报道的基于纳米孔的单分子化学测量52，仅单一反应位点永久固定在孔腔中，这表示该位点的任何不可逆化学反应均立即终止任何新化学过程信息的产生。尽管很少讨论，但这种技术限制将纳米孔单分子化学研究仅限于可逆反应。然而，使用PNRSS，含有固定反应物的链与孔化学分离。即使发生不可逆转反应，整个PNRSS链也可以被电压弹出和重新装载，从而重新启动新测量周期。
为了证明这一点，过氧化氢(H2O2)，一种能够将PBA不可逆地氧化成苯酚的强氧化剂53，被用作移动反应物(图4a)，而PBA被用作固定反应物。在PNRSS过程中，H2O2最初与PBA发生可逆反应，产生正向尖峰事件，可能是由于苯酚产生之前的中间状态造成的(图4aii)，如文献中所提出的54,55。然而，硼原子在这个阶段尚未被去除。后来，这些尖峰事件突然消失，给出了无波动的基线(图4b)。在这种状态下，该链仍可以与Ni2+反应，表明1,2,3-三唑接头仍然存在。然而，它不能再与任何多元醇或H2O2反应，表明硼酸基团已缺失，这是由于被不可逆氧化成苯酚所致(图42)。然而，新测量周期可以通过电压方案重新启动(图4c)，因此现在可以重复监测不可逆单分子反应，承认PNRSS的这种独特特性(图4d，视频3)。
实施例5肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的区别
除了结合动力学的测量，使用PNRSS监测的化学反应的丰富信息也可用于识别单分子。去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素是儿茶酚胺衍生物56。去甲肾上腺素和肾上腺素均是天然激素和神经递质并可在医学上使用57。异丙肾上腺素是拟交感神经β-肾上腺素激动剂药物58。具体地，去甲肾上腺素主要作用于α受体并起维持血压的作用，而肾上腺素特异较低地刺激α和β受体并起放松呼吸管并调节血流、心率和糖原代谢的作用。而异丙肾上腺素主要用于治疗心动过缓、心脏传导阻滞和哮喘。这些功能上的差异源于其化学结构的细微变化。然而，它们均含有与PBA反应的1,2-苯二醇部分(图5a)。
这些化合物的PNRSS测量使用14PBA进行。向trans侧分别添加去甲肾上腺素(图43-44)、肾上腺素(图45-46)或异丙肾上腺素(图47-48)，达到期望的最终浓度。在持续施加+160mV电位的情况下，所有三种化合物均报告负向结合事件(Ib＜Ip)，这与报告正向事件(Ib＞Ip)的邻苯二酚显著不同。据推测，去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素都是阳离子，它们可能补偿了由于阴离子硼酸酯的产生而导致的离子流动增强的效果。当同时检测到儿茶酚和去甲肾上腺素时，这种差异更加明显(图49，视频4)。尽管它们的结合亲和力相似(表10)，但由去甲肾上腺素、肾上腺素或异丙肾上腺素引起的结合事件可以通过它们独特的结合特征来区分，包括ΔI、τoff或噪声水平。获取的迹线首先按频率分为低通和高通部分，由具有100Hz截止频率的Butterworth滤波器进行(图50)。由去甲肾上腺素结合引起的事件的低通部分报告了较小幅度的ΔI。结合状态也没有任何另外的波动。相反，由肾上腺素或异丙肾上腺素结合引起的事件导致较大幅度的ΔI，此外还观察到次级电报式波动(图5b)。然而，由肾上腺素或异丙肾上腺素引起的事件可以更清楚地与其高通部分分开，其中异丙肾上腺素的结合产生幅度更大的高频噪声。这些结合特性的差异在同时传感测定中得到了更清楚的证明(图5c和5d，视频5)。通过低通和高通部分的标准偏差(S.D.)值有效区分不同儿茶酚胺结合引起的事件。为了自动事件识别，这两个参数被用于构建机器学习算法(方法，图51)。简言之，该算法是基于支持向量分类(SVC)模型而开发的，其是用于数据分类的机器学习方法59。以肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素作为单一分析物获得总共1455个事件，用于确定模型。根据混淆矩阵结果，异丙肾上腺素引起的事件报告的准确率达惊人的99.9％。肾上腺素或去甲肾上腺素引起的事件报告的准确率为95.5％或98.6％(图5e)。当同时传感时，从长度为15min的连续记录迹线提取事件，并呈现低通和高通标准偏差值(图5f)。三种事件群体，来自去甲肾上腺素、肾上腺素或异丙肾上腺素的结合，被清楚地分开(图52)。由机器学习算法生成的决策边界图被置于散点图上方以辅助事件识别。上述三种儿茶酚胺的展示提供了具体的证据，证明化学反应产生的大量信息可以促进单分子识别。虽然PBA和儿茶酚胺之间的反应是公知的60,61，但这是首个关于该主题的单分子化学研究，并且由PNRSS促进。与先前关于纳米孔神经元递质传感的报告不同62，其中肾上腺素和去甲肾上腺素分别与工程化的α-HL结合仅报告了0.9和1.1pA的弱幅度，本文的PNRSS方法应用了不同的化学反应和锥形孔，产生更丰富的传感信息和更大的事件幅度(～21-32pA)，清楚地区分三种儿茶酚胺(表11)。机器学习辅助的分频分析进一步提升了传感性能。与在整体性研究中使用的荧光探针设计策略不同，其中需要化学合成复杂探针结构的来区分化学相似的儿茶酚胺63,64，PNRSS的策略仅需要单一PBA来区分三种儿茶酚胺。该系统还研究了其他儿茶酚胺，例如多巴胺和L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，它们是去甲肾上腺素和肾上腺素的前体65。然而，这些结果将在后续研究中单独报告。
实施例6瑞德西韦和三磷酸瑞德西韦代谢物的区分
在抗病毒药物的开发过程中，已经合成、筛选和临床检测了多种基于核苷类似物的化合物66。瑞德西韦是一种具体的核苷类似物和研究性抗病毒药物67，已有报道它能有效治疗由2019年冠状病毒(COVID-19)引起的疾病，该病毒是造成当前全球危机的流行病的原因68-70。瑞德西韦是前药，在细胞中代谢转化成其活性三磷酸盐形式，其作用是阻断RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，从而阻止病毒进一步复制71。
瑞德西韦及其三磷酸代谢物均含有核糖部分，其与PBA反应72(图6a)。相应的试验被设计为将14PBA置于cis侧。瑞德西韦(图53-54)或三磷酸瑞德西韦(图55-56)作为移动反应物单独处理，并分别以期望浓度添加至trans侧。持续施加+160mV电位。在PNRSS过程中，瑞德西韦和三磷酸瑞德西韦均报告正向事件。然而，来自瑞德西韦的事件是长期保留的，并且还观察到剧烈波动，而三磷酸瑞德西韦事件的保留时间要短得多，并且观察到的水平波动可以忽略不计(图6b，表12-13)。当阻塞水平的S.D.相对事件停留时间作图时，清楚地展示了这些不同的事件特征(图6c)。高通和低通标准偏差值的散点图也展示了事件的区别，从中明确分离出两个群体(图6d，图57)。图6e展示了添加两种试剂的连续迹线，其中可以清楚地识别两种事件类型之间的差异(视频6)。
尽管关于瑞德西韦治疗COVID-19的治疗效果存在相互矛盾的结论73,74，但上述展示扩大了PNRSS可以研究的分析物类型。尽管先前已经研究了PBA和核苷类似物之间的化学反应72，但迄今为止尚未研究瑞德斯韦及其衍生物与PBA之间的结合。通过PNRSS，它们的单分子结合动力学在纳米级的有限空间中确定(表13)。还实现了对瑞德西韦及其代谢物的直接区分。虽然本文没有证明，其他核苷类似物，例如Galidesvir75、利巴韦林76或法维拉韦-RTP77原则上可以使用类似的PNRSS检测来识别。这些展示可能激发药代动力学或药物筛选应用，并可能在当前的流行病中有用。
实施例7
PNRSS链可以由任何合成聚合物组成，例如核酸、肽、多糖或其组合，但为了研究更广泛的单分子反应，PNRSS链的组成应该是任意可编程的。如上图所示，我们设计了由寡核苷酸和聚合物组成的PNRSS链(图66a)。聚合物单元由三分子的乙二醇聚合形成。此外，该链含有单一PBA，能够结合去甲肾上腺素。在这种情况下，去甲肾上腺素在+160mV报告负向结合事件(图66b和c)。总之，在PNRSS技术中PNRSS链可以由聚合物组成。
在PNRSS测量中，链霉亲和素系链的PNRSS链通过电泳入孔，在PNRSS孔中保持完全伸展。然而，如图67所示，我们展示了另一种没有亲和素的PNRSS方法，称为固定PNRSS(fPNRSS)。在这种情况下，我们设计了与MspA蛋白缀合的PNRSS链，从而消除了对溶液中PNRSS链的需求。该PNRSS链可以通过电泳入孔，在+20mV下在PNRSS孔中保持完全伸展。去甲肾上腺素在+160mV下报告负向结合事件。总之，fPNRSS链可以与孔永久缀合，以进一步提高PNRSS的分辨率和一致性。
如图68所示，我们展示了另一种PNRSS方法，称为锁定PNRSS(lPNRSS)。lPNRSS链含有锁定段，能够通过氢键相互作用形成发夹结构，以避免lPNRSS链从孔中逃脱(图68a和b)。此外，lPNRSS链14PBA含有单一PBA，能够结合去甲肾上腺素。在这种情况下，去甲肾上腺素在+160mV下报告负向结合事件(图68c)。总之，在PNRSS方法的基础上，我们在PNRSS链上设置锁定段，通过形成发夹结构来避免PNRSS链从纳米孔中随机逃脱。lPNRSS技术可以延长测量时间和一致性。
如图69所示，我们展示了PNRSS技术传感糖类的能力。此处显示了三种单糖。需要注意的是，背景中有一些信号是由Tris缓冲液引起的。当时使用的Tris缓冲液可以与苯硼酸反应，引入背景。然而，Tris与PBA结合的事件与糖类与PBA的结合事件明显不同。综上所述，主要通过苯硼酸引入的PNRSS技术可以直接传感多种糖类。
如图70所示，我们展示了PNRSS技术传感核苷酸的能力。需要注意的是，此处我们以5’-单磷酸(5’-CMP)为例。然而，理论上可以使用PNRSS技术直接观察到具有二醇结构的核苷、核苷酸和核苷类似物。综上所述，主要通过苯硼酸引入的PNRSS技术可以直接传感多种核苷、核苷酸和核苷类似物。
如图71所示，我们展示了PNRSS技术对分子手性的区分。在此我们以对映异构体去甲肾上腺素为例，显示连续添加L和D-去甲肾上腺素的信号。综上所述，主要通过苯硼酸引入的PNRSS技术可以直接区分儿茶酚胺的分子手性。
如图72所示，我们展示了PNRSS技术传感具有同位素的儿茶酚的能力，其中分子上的氢已被氘的同位素取代。综上所述，PNRSS技术可以直接传感多种含有同位素的分子。
如图73所示，我们展示了PNRSS技术传感多糖的能力。此处显示了三种多糖，包括二糖和三糖。所有均报告了清晰且明确的结合事件。综上所述，主要通过苯硼酸引入的PNRSS技术可以直接传感多种多糖。
如图74所示，我们展示了PNRSS技术传感含有两个反应基团的分子的能力。3,4-二羟基扁桃酸具有两个二醇结构，其可以以两种方式与苯硼酸反应。
如图75所示，我们展示了PNRSS技术传感4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)的能力。VMA具有可与苯硼酸反应的二醇结构。
如图76所示，我们展示了PNRSS技术传感3,4-二羟基苯乙酸的能力。3,4-二羟基苯乙酸具有可与苯硼酸反应的二醇结构。
讨论
迄今为止，已经使用MspA作为PNRSS孔分析了20种分析物。原则上，其中可以系链合成聚合物并使其完全伸展的任何纳米孔均适合进行PNRSS。然而，其性能将取决于该孔的整体结构。为了验证PNRSS与其他通道蛋白一起工作的通用性，使用野生型α-溶血素(WTα-HL)作为PNRSS孔和14PBA(表1)作为PNRSS链进行可行性测试。应用异丙肾上腺素作为移动反应物(图58)。实验上，成功观察到异丙肾上腺素结合事件，表现为负向(Ib<Ip)电阻脉冲，证实了我们的假设，即PNRSS在与其他通道蛋白一起使用时具有通用性。然而，报告的事件幅度(～-4.6pA)远小于MspA产生的幅度(～-32.2pA，表11)，尽管其他测量条件保持相同。这在实验上表明具有整体锥形几何形状的MspA在孔缢缩处产生更集中的电场，因此产生了更大事件幅度。因此，它是区分具有相似化学结构的分析物的PNRSS孔的最佳选择。对没有牵引段的PNRSS链(14TAK-NTS，表1)也进行了测试，它没有报告任何成功的PNRSS链捕获(图59)。尽管牵引段有助于在测量过程中保持电泳力，应该理解，可以使用其他方法来保持PNRSS链，或者可以进行瞬时测量。
为了在全文中保持一致，测量条件一般是相同的，使用1.5M KCl、10mM HEPES的缓冲液并施加高电压(例如+180mV或+160mV)。分别以儿茶酚(图60)或去甲肾上腺素(图61)作为代表性电中性或电正性分析物，在+80mV和+160mV之间的电压梯度下进行PNRSS测量。对于这两种分析物，当施加更高电位时，报告的事件幅度通常更大，这表明更高的施加电位产生更高的传感分辨率，因而更有优势。尽管+20mV电位足以使PNRSS链保持在孔腔中，并且很少观察到PNRSS链的回流，但至少需要+60mV电位才能产生足够大的事件幅度以进行检测。对两种分析物来说，事件停留时间通常与施加的电位的幅度无关。然而，带正电荷的去甲肾上腺素在施加较大电位时报告明显更高的事件出现率，这表明当移动反应物带电荷时电泳力至关重要(图61)。相反，对于邻苯二酚，事件出现率受施加电位的调节较少，证明电渗流的贡献可以忽略不计(图60)。PNRSS也可以在不同的盐浓度下进行，通常更高的盐浓度也更有利于通过产生更大的离子流通过孔而产生大的事件幅度(图62)。
单分子化学反应的速率也可以通过温度来调节。实验中，以去甲肾上腺素作为模型分析物，以苯硼酸作为固定反应物，在带有内置温度控制模块的Orbit Mini纳米孔读取仪(Nanion Technologies GmbH，德国)上进行PNRSS(图63)。很明显，开启和关闭速率以及结合亲和力均受温度调节。反应速率通常与设定温度呈指数相关，符合Arrhenius方程所描述的规则78。Orbit Mini芯片的trans隔室太小，无法放置移动分析物，因此在此测量中，将去甲肾上腺素添加至cis，与图43中进行的不同。然而，在两种设置中均可以检测到事件，这证实了小分子分析物的快速扩散也有助于事件的产生。
在本文中，检测限被具体定义为在10min的连续测量过程中采集至少5个事件的测量室中的最低最终分析物浓度(表14)。由于测量室的体积大而单个纳米孔传感器的尺寸小，因此检测效率对于电目前的设置来说通常不是最佳的。因此，在没有任何样品富集的情况下，当目标分析物在生理样品中以低浓度存在时，预期观察不到足够的定量事件。肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素就是这种情况，它们在血清中的生理浓度约在nM级别79，但此处报告的检测限为约1μM。从工程化的角度，这可以通过引入数千个独立的平行纳米孔传感器和极平坦的流通池来提高传感效率，类似于MinION测序仪中展示的设置19。另一方面，本文中测试的一些分析物可能以高浓度出现在天然样品中，即使在目前的设置下也可能直接用于检测。维生素B6在PNRSS过程中报告了易于识别的事件模式，检测限为～400nM。因此，我们设计了测定方法来模拟真实人尿液样品中维生素B6的检测。实验中，将真实人尿液样品添加至trans侧，没有报告任何干扰事件(图64)。然而，添加了维生素B6的人尿液样品测试报告了相应的事件，适合根据报告的校准曲线直接定量(图65)。这些结果表明PNRSS测定可以使用真实生物样品进行测试，类似于其他最先进的纳米孔检测80,81。独特的事件模式有助于辅助从异质性溶液中识别事件。
限制
然而，上述展示还远未完善。为了快速展示，所有PNRSS均在孔和链化学分离的情况下进行。虽然这种传感模式有利于重复测量不可逆反应，但PNRSS链可以与孔永久缀合，以进一步提高PNRSS的分辨率和一致性。例如，由CuAAC反应产生的三唑可能与瞬态金属离子发生非期望的化学反应(图2)。然而，这种干扰可以通过添加螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))或通过替代的缀合化学的选择来最小化82。本文中的结果可能对化合物的制备有启发性。然而，由于这种单分子反应器的规模较小，PNRSS目前被设计为传感方法而不是制备方法。使用PNRSS测量的Kb值也与文献报告的值进行了比较(表15)。虽然很难在本文中报告所有化学反应的结果，其结果也很难在完全相同的条件下进行，但可以看到结果的普遍一致性。然而，我们想强调的是，开发PNRSS的目的是应用现有的反应物之间化学相互作用的知识来实现对小分子分析物的直接化学传感，本文的结果很好地支持了这一点。
结论
总之，本文首次报告了PNRSS，其可作为方便的分子工具包，用纳米孔研究单分子化学过程。为了更好地说明PNRSS的理念，这里包括艺术性视频展示(视频7)。具体目的是打破将任何数量或类型的反应基团引入纳米孔腔的任何位置的技术瓶颈，即使对于该领域的佼佼者而言，这也是很困难的。然而，有了PNRSS，这一困难被转变为功能性DNA寡聚体的合成，这是无数生物化学实验室每天进行的例行工作，或是由各种商业供应商提供的低成本服务。与先前的设置不同，PNRSS还能够重复监测不可逆反应，进一步拓宽了先前难以通过纳米孔研究的化学反应的选择范围。我们总共报告了20个单分子化学反应，其中涉及过氧化氢、缓冲试剂、过渡金属离子、甘油、乳酸、维生素、儿茶酚胺衍生物或抗病毒药物。报告的事件模式高度多样化，与分析物的大小、电荷和构象有关，可用于单分子识别。虽然受限于本文篇幅，但这些反应展示了PNRSS技术的核心方面，并展示了其可行性和多功能性。据我们所知，这是在单一出版物中报告的数量最多的基于纳米孔的单分子化学反应。它们中的大多数先前从未作为单分子进行过研究(表16)。鉴于MspA的锥形结构，它有效地将离子流集中到其狭窄的孔限缩处，本文中讨论的所有单分子化学反应均证明了完全解析的事件幅度。对于PBA，直接识别肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素也表明其直接的生物医学应用。PNRSS对瑞德西韦及其三磷酸代谢物的单分子区分可能激发对各种核苷类似物药物的药代动力学测量。
在后续研究中，可能在同一链上使用多个固定反应物进行PNRSS，从而增加传感的复杂性。尽管使用MspA和α-HL6进行了证明，但其他生物纳米孔(例如aerolysine 8或CsgG9)原则上也与PNRSS相容，只要含有设计的反应位点的系链聚合物可以在孔腔中完全伸展。具有大开口的溶细胞素A(ClyA)10、fragaceatoxin C(FraC)11、侧耳溶血素(PlyA/B)12或phi29连接体14等纳米孔也可用于探测涉及更大或更复杂的移动反应物(例如多糖)的化学反应或环肽。然而，这些将PNRSS与大通道蛋白一起应用的拟定计划尚未实施，但可能对该领域的其他同事有所启发。
作者贡献
S.H.和W.D.J.构思了本项目。W.D.J.和C.Z.H.进行测量。Y.M.G.和J.M.进行分子模拟。G.R.Q.设计了机器学习算法。Y.Q.W.、Y.L.S.H.Y.J.C.和S.Y.Z.制备MspA纳米孔。W.D.J.和X.Y.D使用α-HL进行测量。W.D.J.和L.Y.W在不同的温度下进行测量。P.K.Z.设置仪器。S.H.和W.D.J.撰写本文。Y.Q.W.和W.D.J.准备补充视频。S.H.和H.Y.C.监督本项目。
数据和代码可用性声明
如有合理要求，可向相应作者索取本工作中提供的所有数据和代码。
竞争利益声明
S.H.和W.D.J.已申请描述PNRSS技术及其应用的专利。G.R.Q.是IntelligenceQubic Technology Co.Ltd的创始人，该公司是从事人工智能软件界面开发的公司。作者声称没有其他竞争利益。
致谢
作者感谢Prof.Hagan Bayley(牛津大学)在手稿准备过程中提出的宝贵建议。作者感谢南京大学的Prof.Shaolin Zhu、Prof.Congqing Zhu、Prof.Jie Li和Prof.Ran Xie，南京航空航天大学的Mrs.Yiou Ma、Prof.Daoqiang Zhang、Xiaoyu Guan进行的启发讨论。在本项目完成过程中，S.H.感谢他的祖母Mrs.Jiqing Xia的鼓励。不幸的是，由于年事已高，Mrs.Xia在稿件提交之前去世。
本项目由国家自然科学基金(No.31972917、No.91753108、No.21675083)、中央高校基本科研业务费专项资金(No.020514380257、No.020514380261)、生命分析化学国家重点实验室资助(No.5431ZZXM1902、No.5431ZZXM1804)、江苏省自然科学基金、江苏省高层次创业创新人才引进计划(个人和团体计划)。南京大学科技创新基金项目。南京大学卓越研究计划(项目编号ZYJH004)。
材料
戊烷、十六烷、乙二胺四乙酸(EDTA)、Genapol X-80获自Sigma-Aldrich。1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)由Avanti Polar Lipids提供。氯化钾(KCl，99.9％)、氢氧化钠(NaOH，99.9％)、七水硫酸钴(CoSO4·7H2O，99.99％)、六水硫酸镍(NiSO4·6H2O，99.9％)、五水硫酸铜(CuSO4·5H2O，99.9％)、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O，99.995％)、8/3水合硫酸镉(CdSO4·8/3H2O，99.99％)、乙二醇(99.9％)、甘油(99.7％)、L-乳酸(98％)、吡哆醇(维生素B6)(98％)、30％过氧化氢溶液(H2O2，GR)、DL-去甲肾上腺素盐酸盐(97％)、DL-肾上腺素盐酸盐(98％)、DL-盐酸异丙肾上腺素(99％)、3-叠氮基丙胺(95％)、无水硫酸钠(Na2SO4，99％)、二甲亚砜(DMSO，99.9％)和二甲亚砜-d6(DMSO-d6，D.99.9％+0.03％ TMS)来自Aladdin(中国)。甲基硼酸(97％)、儿茶酚(99.5％)、间苯二酚(AR)和乙腈(MeCN，99.9％)来自Macklin(中国)。盐酸(HCl)、丙酮(Me2CO，99.5％)和二氯甲烷(DCM，99.5％)来自Sinopharm(中国)。抗坏血酸钠(维生素C)(99％)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES，99％)购自Shanghai Yuanye Bio-Technology(中国)。4-(叠氮甲基)苯硼酸频哪醇酯(95％)来自Alfa Aesar(美国)。瑞德西韦(99.74％)和瑞德西韦代谢物(99.87％)购自MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。
大肠杆菌菌株BL21(DE3)来自Biomed(中国)。链霉亲和素来自New EnglandBiolabs。不含二噁烷的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素和三-(羟基-甲基)氨基甲烷(Tris)来自Solarbio Biotechnology(中国)。Luria-Bertani肉汤和Luria-Bertani琼脂来自Hopebio(中国)。Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards和TGXTM FastCastTM Acrylamide Kit(12％)购自Bio-Rad。
单体DNA亚磷酰胺5-乙炔基-dU-CE亚磷酰胺购自Glen Research(美国)，含炔烃的寡核苷酸14TAK(表1)由Shanghai Generay Biotech Co.,Ltd.合成。所有其他DNA寡核苷酸均由Genscript(美国新泽西州)合成。完整序列列于表1。
方法
1.纳米孔制备
合成编码单体M2 MspA突变体(D93N/D91N/D90N/D118R/D134R/E139K)的基因并插入pet-30a(+)载体。如先前所报道，用大肠杆菌BL21(DE3)表达M2 MspA，并使用镍亲和层析(GE Akta Pure,GE Healthcare)进行纯化1。纯化的M2 MspA自发低聚成轴对称的八聚体形式，用于本文中的所有PNRSS测量。八聚体M2 MspA是这项工作中使用的唯一纳米孔。为简单起见，除非另有说明，否则在全文中均称为MspA。
合成编码单体野生型α-溶血素(WTα-HL)的基因并插入pet-30a(+)载体。七聚体WTα-HL的制备严格按照先前报道的进行83。
编码M2 MspA和WTα-HL的质粒DNA已在分子云质粒库(https://www.molecularcloud.org/s/shuo-huang,GenScript,New Jersey)中共享，访问代码MC_0101191和MC_0068416。使用该质粒发表文章时要求引用。
2.纳米孔测量和数据分析
纳米孔测量在定制的测量室中进行。由1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)形成的自组装脂质双层，将室分隔为cis和trans隔室。每个隔室均装有500μL 1.5MKCl、10mM HEPES，pH 7.0或8.0的电解质缓冲液。所有PNRSS链14X、13G/14G、14A、14G和14TAZ(表1)的测量均在pH 7.0下进行。当tris不用作移动反应物时，所有使用PNRSS链14PBA(表1)的测量均在pH 8.0下完成。对于使用tris的所有测量，将pH值调整为7.0或8.0。一对Ag/AgCl电极分别置于室的cis和trans侧，与每一侧的水性缓冲液接触。Ag/AgCl电极电连接至膜片钳放大器以形成闭合电路。按照惯例，cis隔室中的电极是电接地的，而相对的电极是工作电极。
为了获得平均阻塞水平使用已发表的方法进行静态孔阻塞测量84。简言之，在插入单个MspA的情况下，向cis侧添加PNRSS链，终浓度为20nM。反复施加+180mV或+160mV(0.9s)和-100mV(0.3s)的电压方案，并在施加+180mV或+160mV电位时测量Ip。在每个实验期间至少收集500个Ip事件。这些事件符合高斯分布。进行三次独立测量以获得的平均值和标准偏差。
为了进行PNRSS，向cis侧添加所需的PNRSS链，终浓度为10nM。持续施加正电位。在Ip水平之上，PNRSS事件被识别为是进一步的孔阻塞事件(图10)。
所有电生理记录均使用Axopatch 200B膜片钳放大器进行。采集的迹线由Digidata1550B模数转换器(Molecular Devices，UK)以25kHz的取样率和1kHz的转角频率进行低通滤波。实验中，向cis侧添加MspAs用于自发单孔插入。在膜中插入单个孔，cis侧的电解质缓冲液被交换以避免进一步的孔插入。所有PNRSS测量均在室温(21±2℃)下进行。通过Clampfit 10.7(Molecular Devices，UK)的单通道搜索功能提取纳米孔事件。在Origin 2019中进行进一步分析。所有颜色编码的散点图均由ggplot2生成，其是可用于数据可视化的R软件包。
3.链霉亲和素DNA缀合
为了形成链霉亲和素系链的DNA复合物，将具有5’生物素-TEG修饰的DNA寡聚体(表1)与等摩尔比的链霉亲和素在室温(rt)下孵育10min。在PNRSS测量过程中，以期望的终浓度向cis侧添加形成的链霉亲和素系链的DNA复合物。
4.优化结合设置的理论计算
所有理论计算均使用Gaussian 16软件包套件进行85。使用密度泛函理论(DFT),用M06泛函进行几何优化86,87。对于C、H、O、N和P原子采用6-31+G(d)基组，而Ni原子采用LANL2DZ基组以及相关的有效核心电位88。低自旋(ELS)状态和高自旋(EHS)状态的系统之间的相对能量(ΔE)计算如下：
ΔE＝ELS–EHS (1)
研究了具有低自旋(LS)和高自旋(HS)状态的Ni2+可能的结合模式，如图9所示。为了进行接下来的研究，计算了Ni2+簇与4个或5个H2O分子的两种模式。不同自旋状态之间的相对能量ΔE的计算结果如表3所示。(dGMP)2-Ni-4wt和(dGMP)2-Ni-5wt的HS状态分别比LS状态低-44.13和-36.85kcal/mol，表明HS状态在能量上是有利的。HS状态的几何结构显示出6个配位的八面体结构，Ni和N(O)原子之间的距离为 然而，八面体几何在LS状态下显示出一定程度的变形。O-H…O和O-H…N氢键相互作用在与Ni2+簇的结合中起重要作用。
计算了结合能(Eb)以研究不同模式的结合能力。结合能通过分别计算复杂系统的总能量(E)与H2O(Ewt)、Ni2+离子(ENi)和两种脱氧鸟苷酸(EdGMP/dGMP)的单个能量之和之间的能量差来获得，计算公式如下：
Eb＝E–xEwt–ENi–EdGMP/dGMP (2)
其中x是H2O分子的数量。Ni2+离子可以与四个H2O和两个鸟嘌呤分子结合，结合能为-45.33kcal/mol。对于(dGMP)2-Ni-5wt，Ni2+离子可以结合一个鸟嘌呤和五个H2O分子，Eb为-46.07kcal/mol，其中一个H2O分子可以通过N(7)原子氢键相互作用结合鸟嘌呤。
5.将功能性叠氮化物引入PNRSS链
含有炔烃的DNA链14TAK(表1)被用作通用PNRSS链模板以引入任何功能性叠氮化物。功能性叠氮化物，例如3-叠氮基丙胺(图17-18)或4-(叠氮基甲基)苯硼酸(图24-26)，通过Huisgen铜(I)催化的叠氮化物-炔烃1,3-偶极环加成(CuAAC)反应进行化学缀合。
6.产生4-(叠氮甲基)苯硼酸的程序
将4-(叠氮甲基)苯硼酸频哪醇酯(158mg，0.6mmol)和甲基硼酸(360mg，6mmol)添加至10mL反应管中，并溶解于丙酮(2mL)中。在进一步添加0.1M NaOH(2mL)后，将所得溶液在室温下搅拌12h。之后，将4mL二氯甲烷添加至溶液中。将所得混合物倒入分液漏斗中以除去有机层。通过用0.1M HCl滴定将溶液的pH值调节至7。然后，在水层中添加4mL二氯甲烷，提取目标产物。用水洗涤有机层以除去残留的盐。有机相进一步用固体Na2SO4干燥。用旋转蒸发仪除去有机溶剂以收集4-(叠氮甲基)苯硼酸，为白色粉末(74.2mg，68％收率)89。通过1H NMR光谱进一步表征产物以确认成功90(图S18)。
表1|本研究中所有PNRSS链的序列背景。
脚注：
1.反应段在每个序列中用粗体标记。
2.天然DNA碱基或其组合(例如A、G或GG)可用作固定反应物。
3.X代表无碱基位点，其不能结合本研究中测试的任何移动反应物。
4.5’生物素TEG用作系链点，与链霉亲和素阻挡物形成紧密结合。
5.(TAK)是炔烃修饰的胸腺嘧啶类似物(5-乙炔基脱氧尿苷，Glen Research，U.S.)，用作引入功能性叠氮化物的通用连接体。(TAK)的化学结构如下所示：
6.(TAZ)代表1,2,3-三唑。以下提供了含有TAZ的核苷酸的化学结构。其化学合成和表征的详细程序在方法和图17-18中提供。
7.(PBA)代表苯硼酸。以下提供了含有TBA的核苷酸的化学结构。其化学合成和表征的详细程序在方法和图25-26中提供。
表2|14X、14A、14G或13/14G阻塞的统计数据。如方法中所述进行静态孔阻塞测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。向cis侧添加每种PNRSS链，终浓度为20nM。施加+180mV偏压时测量Ip(图10)。在每次测量过程中采集500个事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表3|(dGMP)2-Ni-4wt和(dGMP)2-Ni-5wt的相对能量。
表4|Ni2+与14A、14G或13G/14G结合的和τoff统计数据。PNRSS测量按照图13(14A)、图15(14G)和图1(13G/14G)中的描述进行。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加A+180mV电位。Ni2+与14A结合产生两个事件群体(图13-14)，以使得可以分别获得和τoff。Ni2+分别与14G(图15-16)或13G/14G(图1)结合，报告单个事件群体。每次测量至少包括1000个事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以生成统计数据。
表5|14TAK和14TAZ的统计数据。如方法中所述进行静态孔阻塞测量。使用1.5MKCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。向cis侧添加每种PNRSS链，终浓度为20nM。施加+180mV偏压时测量Ip(图10)。从每次测量中获取500个事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以生成统计数据。
表6|Ni2+或Co2+与TAZ结合的τoff和Kb统计数据。PNRSS测量按照图19(Ni2+)和图21(Co2+)中的描述进行。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液。持续施加+180mV电位。每次测量至少包括1000个事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表7|PNRSS链14TAK和14PBA的统计数据。如方法中所述进行静态孔阻塞测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。施加+160mV偏压时测量Ip。从每次测量中获取500个事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表8|苯硼酸与二醇结合的和τoff统计数据。如图3中所述进行PNRSS测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。分别向trans侧添加每种类型的移动反应物，终浓度为400μM(儿茶酚)、14mM(乙二醇)、10mM(甘油)、4mM(L-乳酸)、1.6mM(维生素C)、40μM(维生素B6)。在测量过程中持续施加+160mV偏压。和τoff的定义和数据来源如图10所示。对于每次测量，和τoff值来自15min连续记录迹线内的事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表9|PBA和二醇之间复合物形成的动力学常数。按照图27-38中的描述进行PNRSS测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。对于每次测量，动力学常数值来自15min连续记录的迹线内的事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表10|儿茶酚胺与PBA相互作用的动力学常数。按照图43-48中的描述进行PNRSS测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。对于每次测量，动力学常数值来自15min连续记录的迹线内的事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表11|儿茶酚胺事件的△I和τoff统计数据。按照图43、图45和图47中的描述进行PNRSS测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。向trans侧添加每种移动反应物，终浓度为140μM。在测量过程中持续施加+160mV偏压。对于每次测量，和τoff值来自5min连续记录的迹线所产生的事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表12|瑞德西韦和瑞德西韦代谢物事件的△I和τoff统计数据。如图53和图55所述进行PNRSS测量。在单独的独立测量中，向trans侧添加瑞德西韦或瑞德西韦代谢物，终浓度为80μM或500μM。在测量过程中持续施加+160mV偏压。对于每次测量，和τoff值来自5min连续记录的迹线所产生的事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以形成统计数据。
表13|瑞德西韦和瑞德西韦代谢物与PBA结合的动力学常数。如图53和图55所述进行PNRSS测量。使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液。持续施加+160mV电位。对于每次测量，动力学常数值来自15min连续记录的迹线内的事件。对每个条件进行三次独立测量(N＝3)以产生统计数据。
表14|检测限。在本文中，检测限定义为在测量的10min内至少检测到5个事件所需的分析物的最低浓度。所有PNRSS测量均如方法中所述进行。对于所有使用14A、14G、13G/14G或14TAZ的测量，使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0的缓冲液，并中持续施加+180mV电位。对于所有使用14PBA的测量，使用1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0的缓冲液，并持续施加+160mV电位。
表15|先前报道的和PNRSS之间的结合常数Kb(M-1)的总结。
表16|本文中的PNRSS测量总结。
视频1|Ni2+与双鸟嘌呤反应物结合。如图1所述进行PNRSS测量。应用的电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 7.0。向cis侧添加PNRSS链13G/14G(表1)，终浓度为10nM。13G/14G上的双鸟嘌呤用作固定反应物。向trans侧添加Ni2+用作移动反应物，终浓度为1mM。持续施加+180mV电位。最初(第一个～0.1s)，孔未被占位，报告开孔电流(～575pA)。之后，捕获PNRSS链，并观察到电流立即下降至～170pA。进一步结合事件相继出现(0.2-5s)，测量ΔI约-60pA。这些事件是由于Ni2+与双鸟嘌呤反应物的可逆结合导致的，如图1c-1d所示。
视频2|Ni2+与TAZ结合。如图2中所述进行PNRSS测量。应用的电解质缓冲液为1.5MKCl、10mM HEPES，pH 7.0。向cis侧添加PNRSS链14TAZ(表1)，终浓度为10nM。TAZ用作固定反应物。向trans侧添加Ni2+用作移动反应物，终浓度为1mM。在此视频中，PNRSS链14TAZ已经被孔捕获。Ni2+与TAZ的可逆结合导致的事件被连续观察为进一步的阻塞。当Ni2+被结合时，所有事件均报告特征噪声波动。
视频3|不可逆反应的重复测量。如图4中所述进行PNRSS测量。应用的电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。向cis侧添加PNRSS链14PBA(表1)，终浓度为10nM。14PBA上的苯硼酸(PBA)用作固定反应物。向trans侧添加加入过氧化氢作为移动反应物，终浓度为5.4mM。过氧化氢可以与PBA可逆结合或将其不可逆地氧化成苯酚(图4a，4b)。最初，连续观察到过氧化氢与PBA的可逆结合，报告尖峰、正向事件(2-80s)。PBA的不可逆氧化使固定反应物的化学反应性失活，产生迹线的无事件部分。通过依次将施加的电位转换至-100mV(链弹出)和+160mV(链重新装载)，失活的PNRSS链被弹出并装载另一条反应链。通过PNRSS的这种特殊测量模式，可以对不可逆反应进行重复测量。
视频4|使用PBA获得的正向和负向事件。如图10所述进行PNRSS测量。应用的电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。向cis侧添加PNRSS链14PBA(表S1)，终浓度为10nM。14PBA上的苯硼酸(PBA)用作固定反应物。向trans侧添加儿茶酚或去甲肾上腺素用作移动反应物，每种分析物的终浓度为280μM。在此视频中，PNRSS链14PBA被孔捕获，报告的Ip值为～100pA。儿茶酚或去甲肾上腺素的结合分别报告正向(Ib>Ip)或负向(Ib<Ip)事件。儿茶酚或去甲肾上腺素的结合在迹线上分别用C或N标记。
视频5|肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的PNRSS传感。如图5所述进行PNRSS测量。应用的电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。向cis侧添加PNRSS链14PBA(表1)，终浓度为10nM。14PBA上的苯硼酸(PBA)用作固定反应物。向trans侧添加去甲肾上腺素、肾上腺素和异丙肾上腺素作为移动反应物，终浓度分别为280μM、280μM和180μM。持续施加+160mV电位。在此视频中，PNRSS链14PBA被孔捕获。观察到去甲肾上腺素、肾上腺素或异丙肾上腺素与PBA的连续结合。原始迹线按频率分成低通(lp，顶部迹线)和高通(hp，底部迹线)部分。应用Butterworth滤波器进行分频。截止频率设置为100Hz(图50)。通过机器学习算法进行事件识别(图51)，识别的事件分别标记为N(去甲肾上腺素)、E(肾上腺素)或I(异丙肾上腺素)。
视频6|瑞德西韦及其代谢物的PNRSS传感。如图6所示进行PNRSS测量。应用的电解质缓冲液为1.5M KCl、10mM HEPES，pH 8.0。向cis侧添加PNRSS链14PBA(表1)，终浓度为10nM。14PBA上的苯硼酸(PBA)用作固定反应物。向trans侧添加瑞德西韦及其代谢物作为移动反应物，终浓度分别为20μM或500μM。持续施加A+160mV电位。从此视频开始时，PNRSS链14PBA已被孔捕获。瑞德西韦或其代谢物与PBA的结合均产生正向事件(图6b)。根据它们不同的结合特性(图6b-d)，识别瑞德西韦或其代谢物，并分别在迹线上用R或M标记。
视频7|PNRSS的艺术展示。PNRSS的核心概念是降低蛋白质工程的技术障碍，以制备异质低聚纳米孔纳米反应器。使用PNRSS，反应组分在工具箱中作为单独模块使用。通过这些模块的无数组合，实现新的应用。而不需要蛋白质纳米孔的反复工程化。
参考文献
1.Huang,S.et al.Identifying single bases in a DNA oligomer withelectron tunnelling.Nature Nanotechnology 5,868-873(2010).
2.Zrimsek,A.B.et al.Single-Molecule Chemistry with Surface-and Tip-Enhanced Raman Spectroscopy.Chemical Reviews 117,7583-7613(2017).
3.Jia,C.et al.Covalently bonded single-molecule junctions with stableand reversible photoswitched conductivity.Science 352,1443-1445(2016).
4.Huang,W.et al.Maleimide–thiol adducts stabilized throughstretching.Nature Chemistry 11,310-319(2019).
5.Braha,O.et al.Designed protein pores as components forbiosensors.Chemistry&Biology 4,497-505(1997).
6.Song,L.et al.Structure of Staphylococcalα-Hemolysin,a HeptamericTransmembrane Pore.Science 274,1859-1866(1996).
7.Butler,T.Z.,Pavlenok,M.,Derrington,I.M.,Niederweis,M.&Gundlach,J.H.Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore.PNatl Acad Sci USA 105,20647-20652(2008).
8.Cao,C.et al.Discrimination of oligonucleotides of different lengthswith a wild-type aerolysin nanopore.Nature Nanotechnology 11,713-718(2016).
9.Bock,A.V.,Dill,D.B.&Edwards,H.T.LACTIC ACID IN THE BLOOD OF RESTINGMAN.The Journal of clinical investigation 11,775-788(1932).
10.Soskine,M.et al.An Engineered ClyA Nanopore Detects Folded TargetProteins by Selective External Association and Pore Entry.Nano Letters 12,4895-4900(2012).
11.Wloka,C.,Mutter,N.L.,Soskine,M.&Maglia,G.Alpha-HelicalFragaceatoxin C Nanopore Engineered for Double-Stranded and Single-StrandedNucleic Acid Analysis.Angewandte Chemie International Edition 55,12494-12498(2016).
12.Huang,G.et al.Electro-Osmotic Vortices Promote the Capture ofFolded Proteins by PlyAB Nanopores.Nano Letters 20,3819-3827(2020).
13.Fahie,M.A.,Yang,B.,Pham,B.&Chen,M.Tuning the Selectivity andSensitivity of an OmpG Nanopore Sensor by Adjusting Ligand Tether Length.ACSSensors 1,614-622(2016).
14.Wendell,D.et al.Translocation of double-stranded DNA throughmembrane-adapted phi29 motor protein nanopores.Nature Nanotechnology 4,765-772(2009).
15.Stoddart,D.,Heron,A.J.,Mikhailova,E.,Maglia,G.&Bayley,H.Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with abiological nanopore.Proceedings of the National Academy of Sciences 106,7702-7707(2009).
16.Stefureac,R.,Long,Y.T.,Kraatz,H.B.,Howard,P.&Lee,J.S.Transport ofalpha-helical peptides through alpha-hemolysin and aerolysinpores.Biochemistry 45,9172-9179(2006).
17.Van Meervelt,V.et al.Real-Time Conformational Changes andControlled Orientation of Native Proteins Inside a ProteinNanoreactor.Journal of the American Chemical Society 139,18640-18646(2017).
18.Galenkamp,N.S.,Biesemans,A.&Maglia,G.Directional conformerexchange in dihydrofolate reductase revealed by single-molecule nanoporerecordings.Nature Chemistry 12,481-488(2020).
19.Quick,J.et al.Real-time,portable genome sequencing for Ebolasurveillance.Nature 530,228-232(2016).
20.Roozbahani,G.M.,Chen,X.,Zhang,Y.,Wang,L.&Guan,X.Nanopore Detectionof Metal Ions:Current Status and Future Directions.Small Methods 4,2000266(2020).
21.Kasianowicz,J.J.,Burden,D.L.,Han,L.C.,Cheley,S.&Bayley,H.Genetically Engineered Metal Ion Binding Sites on the Outside of a Channel's Transmembraneβ-Barrel.Biophysical Journal 76,837-845(1999).
22.Choi,L.-S.,Mach,T.&Bayley,H.Rates and Stoichiometries of Metal IonProbes of Cysteine Residues within Ion Channels.Biophysical Journal 105,356-384(2013).
23.Braha,O.et al.Simultaneous stochastic sensing of divalent metalions.Nature Biotechnology 18,1005-1007(2000).
24.Borsley,S.&Cockroft,S.L.In Situ Synthetic Functionalization of aTransmembrane Protein Nanopore.ACS Nano 12,786-794(2018).
25.Zhou,B.,Wang,Y.-Q.,Cao,C.,Li,D.-W.&Long,Y.-T.Monitoring disulfidebonds making and breaking in biological nanopore at single moleculelevel.Science China Chemistry 61,1385-1388(2018).
26.Haugland,M.M.,Borsley,S.,Cairns-Gibson,D.F.,Elmi,A.&Cockroft,S.L.Synthetically Diversified Protein Nanopores:Resolving Click ReactionMechanisms.ACS Nano 13,4101-4110(2019).
27.Cao,J.et al.Giant single molecule chemistry events observed from atetrachloroaurate(iii)embedded Mycobacterium smegmatis porin Ananopore.Nature Communications 10,5668(2019).
28.Lee,J.&Bayley,H.Semisynthetic protein nanoreactor for single-molecule chemistry.P Natl Acad Sci USA 112,13768-13773(2015).
29.Lee,J.et al.Semisynthetic Nanoreactor for Reversible Single-Molecule Covalent Chemistry.Acs Nano 10,8843-8850(2016).
30.Bétermier,F.et al.Single-sulfur atom discrimination ofpolysulfides with a protein nanopore for improved batteries.CommunicationsMaterials 1,59(2020).
31.Clarke,J.et al.Continuous base identification for single-moleculenanopore DNA sequencing.Nature Nanotechnology 4,265-270(2009).
32.Zernia,S.,van der Heide,N.J.,Galenkamp,N.S.,Gouridis,G.&Maglia,G.Current Blockades of Proteins inside Nanopores for Real-Time MetabolomeAnalysis.ACS Nano 14,2296-2307(2020).
33.Wallace,E.V.B.et al.Identification of epigenetic DNA modificationswith a protein nanopore.Chemical Communications 46,8195-8197(2010).
34.Manrao,E.A.,Derrington,I.M.,Pavlenok,M.,Niederweis,M.&Gundlach,J.H.Nucleotide Discrimination with DNA Immobilized in the MspA Nanopore.PlosOne 6(2011).
35.Hogrefe,R.I.,Midthune,B.&Lebedev,A.Current Challenges in NucleicAcid Synthesis.Israel Journal of Chemistry 53,326-349(2013).
36.Huq,F.&Peter,M.C.R.Interaction between NiCl2,and nucleobases,nucleosides and nucleotides.Journal of Inorganic Biochemistry 78,217-226(2000).
37.Masoud,M.S.,Soayed,A.A.&Ali,A.E.Complexing properties of nucleic-acid constituents adenine and guanine complexes.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy 60,1907-1915(2004).
38.El-Sagheer,A.H.&Brown,T.Click chemistry with DNA.Chemical SocietyReviews 39,1388-1405(2010).
39.Kolb,H.C.,Finn,M.G.&Sharpless,K.B.Click Chemistry:Diverse ChemicalFunction from a Few Good Reactions.Angewandte Chemie International Edition40,2004-2021(2001).
40.Struthers,H.,Spingler,B.,Mindt,T.L.&Schibli,R.“Click-to-Chelate”:Design and Incorporation of Triazole-Containing Metal-Chelating Systems intoBiomolecules of Diagnostic and Therapeutic Interest.Chemistry–A EuropeanJournal 14,6173-6183(2008).
41.Meng,G.et al.Modular click chemistry libraries for functionalscreens using a diazotizing reagent.Nature 574,86-89(2019).
42.Wu,X.et al.Selective sensing of saccharides using simple boronicacids and their aggregates.Chemical Society Reviews 42,8032-8048(2013).
43.Pizer,R.&Babcock,L.Mechanism of the complexation of boron acidswith catechol and substituted catechols.Inorganic Chemistry 16,1677-1681(1977).
44.Babcock,L.&Pizer,R.Dynamics of boron acid complexationreactions.Formation of 1:1 boron acid-ligand complexes.Inorganic Chemistry19,56-61(1980).
45.Pizer,R.&Tihal,C.Equilibria and reaction mechanism of thecomplexation of methylboronic acid with polyols.Inorganic Chemistry 31,3243-3247(1992).
46.D.A.&Zümreoglu-Karan,B.Complexation of boric acid with vitaminC.New Journal of Chemistry 33,1874-1881(2009).
47.D.A.,Zumreoglu-Karan,B.,Sahin,O.&O.Boric acidcomplexes with thiamine (vitamin B1)and pyridoxine(vitamin B6).InorganicaChimica Acta 413,77-83(2014).
48.Lorand,J.P.&Edwards,J.O.Polyol Complexes and Structure of theBenzeneboronate Ion.The Journal of Organic Chemistry 24,769-774(1959).
49.Bull,S.D.et al.Exploiting the Reversible Covalent Bonding ofBoronic Acids:Recognition,Sensing,and Assembly.Accounts of Chemical Research46,312-326(2013).
50.Ramsay,W.J.,Bell,N.A.W.,Qing,Y.&Bayley,H.Single-MoleculeObservation of the Intermediates in a Catalytic Cycle.Journal of the AmericanChemical Society 140,17538-17546(2018).
51.Good,N.E.et al.Hydrogen Ion Buffers for BiologicalResearch.Biochemistry 5,467-477(1966).
52.Ramsay,W.J.&Bayley,H.Single-Molecule Determination of the Isomersof d-Glucose and d-Fructose that Bind to Boronic Acids.Angewandte ChemieInternational Edition 57,2841-2845(2018).
53.Kuivila,H.G.Electrophilic Displacement Reactions.III.Kinetics ofthe Reaction between Hydrogen Peroxide and Benzeneboronic Acid.Journal of theAmerican Chemical Society 76,870-874(1954).
54.Hao,L.,Ding,G.,Deming,D.A.&Zhang,Q.Recent Advances in GreenSynthesis of Functionalized Phenols from Aromatic Boronic Compounds.EuropeanJournal of Organic Chemistry 2019,7307-7321(2019).
55.Dutta,A.,Ali,A.A.&Sarma,D.Versatile catalysis of“natural extract”:oxidation of sulfides and alcohols and ipso-hydroxylation of arylboronicacids.Journal of the Iranian Chemical Society 16,2379-2388(2019).
56.Reiner,S.,Ambrosio,M.,Hoffmann,C.&Lohse,M.J.Differential Signalingof the Endogenous Agonists at the beta(2)-Adrenergic Receptor.Journal ofBiological Chemistry 285,36188-36198(2010).
57.Moore,R.Y.&Bloom,F.E.Central Catecholamine Neuron Systems:Anatomyand Physiology of the Norepinephrine and Epinephrine Systems.Annual Review ofNeuroscience 2,113-168(1979).
58.Nichtova,Z.,Novotova,M.,Kralova,E.&Stankovicova,T.Morphologicaland functional characteristics of models of experimental myocardial injuryinduced by isoproterenol.General Physiology and Biophysics 31,141-151(2012).
59.Cortes,C.&Vapnik,V.Support-vector networks.Machine Learning 20,273-297(1995).
60.Ptak,T.,P.,Dobosz,A.,Rydzewska,A.&Prokopowicz,M.Potentiometric and NMR complexation studies of phenylboronic acid PBA andits aminophosphonate analog with selected catecholamines.Journal of MolecularStructure 1040,59-64(2013).
61.Zhang,S.,Tang,Y.,Chen,Y.,Zhang,J.&Wei,Y.Boronic acid-modifiedpolyhedral oligomeric silsesquioxanes on polydopamine-coated magnetizedgraphene oxide for selective and high-capacity extraction of thecatecholamines epinephrine,dopamine and isoprenaline.Microchimica Acta 187,77(2020).
62.Boersma,A.J.,Brain,K.L.&Bayley,H.Real-Time Stochastic Detection ofMultiple Neurotransmitters with a Protein Nanopore.ACS Nano 6,5304-5308(2012).
63.Secor,K.E.&Glass,T.E.Selective Amine Recognition:Development of aChemosensor for Dopamine and Norepinephrine.Organic Letters 6,3727-3730(2004).
64.Zhang,L.,Liu,X.A.,Gillis,K.D.&Glass,T.E.A High-AffinityFluorescent Sensor for Catecholamine:Application to Monitoring NorepinephrineExocytosis.Angewandte Chemie International Edition 58,7611-7614(2019).
65.Flatmark Catecholamine biosynthesis and physiological regulationin neuroendocrine cells.Acta Physiologica Scandinavica 168,1-17(2000).
66.Seley-Radtke,K.L.&Yates,M.K.The evolution of nucleoside analogueantivirals:A review for chemists and non-chemists.Part 1:Early structuralmodifications to the nucleoside scaffold.Antiviral Research 154,66-86(2018).
67.Warren,T.K.et al.Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys.Nature 531,381-385(2016).
68.Holshue,M.L.et al.First Case of 2019 Novel Coronavirus in theUnited States.New England Journal of Medicine 382,929-936(2020).
69.McMahon,J.H.,Udy,A.&Peleg,A.Y.Remdesivir for the Treatment ofCovid-19-Preliminary Report.New England Journal of Medicine 383,992-993(2020).
70.Wang,M.et al.Remdesivir and chloroquine effectively inhibit therecently emerged novel coronavirus (2019-nCoV)in vitro.Cell Research 30,269-271(2020).
71.Yin,W.et al.Structural basis for inhibition of the RNA-dependentRNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir.Science 368,1499-1504(2020).
72.Martin,A.R.,Vasseur,J.-J.&Smietana,M.Boron and nucleic acidchemistries:merging the best of both worlds.Chemical Society Reviews 42,5684-5713(2013).
73.Beigel,J.H.et al.Remdesivir for the Treatment of Covid-19—FinalReport.New England Journal of Medicine(2020).
74.Pan,H.et al.Repurposed antiviral drugs for COVID-19–interim WHOSOLIDARITY trial results.medRxiv,2020.2010.2015.20209817(2020).
75.Warren,T.K.et al.Protection against filovirus diseases by a novelbroad-spectrum nucleoside analogue BCX4430.Nature 508,402-405(2014).
76.Oxford,J.S.Inhibition of the Replication of Influenza A and BViruses by a Nucleoside Analogue (Ribavirin).Journal of General Virology 28,409-414(1975).
77.Furuta,Y.et al.Favipiravir(T-705),a novel viral RNA polymeraseinhibitor.Antiviral Research 100,446-454(2013).
78.Peleg,M.,Normand,M.D.&Corradini,M.G.The Arrhenius EquationRevisited.Critical Reviews in Food Science and Nutrition 52,830-851(2012).
79.Ross,G.A.et al.Plasma and 24 H-Urinary CatecholamineConcentrations in Normal and Patient Populations.Annals of ClinicalBiochemistry 30,38-44(1993).
80.Fahie,M.A.,Yang,B.,Mullis,M.,Holden,M.A.&Chen,M.SelectiveDetection of Protein Homologues in Serum Using an OmpG Nanopore.AnalyticalChemistry 87,11143-11149(2015).
81.Galenkamp,N.S.,Soskine,M.,Hermans,J.,Wloka,C.&Maglia,G.Directelectrical quantification of glucose and asparagine from bodily fluids usingnanopores.Nature Communications 9,4085(2018).
82.Patterson,D.M.,Nazarova,L.A.&Prescher,J.A.Finding the Right(Bioorthogonal)Chemistry.ACS Chemical Biology 9,592-605(2014).
83.Wang,Y.et al.Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of BiologicalNanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing.ACS Applied Materials&Interfaces 10,7788-7797(2018).
84.Stoddart,D.,Heron,A.J.,Mikhailova,E.,Maglia,G.&Bayley,H.Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with abiological nanopore.Proceedings of the National Academy of Sciences 106,7702-7707(2009).
85.Frisch,M.J.et al.(Wallingford,CT；2016).
86.Zhao,Y.&Truhlar,D.G.The M06 suite of density functionals for maingroup thermochemistry,thermochemical kinetics,noncovalent interactions,excited states,and transition elements:two new functionals and systematictesting of four M06-class functionals and 12 other functionals.TheoreticalChemistry Accounts 120,215-241(2008).
87.Zhao,Y.&Truhlar,D.G.Density Functionals with Broad Applicabilityin Chemistry.Accounts of Chemical Research 41,157-167(2008).
88.Wadt,W.R.&Hay,P.J.Ab initio effective core potentials formolecular calculations.Potentials for main group elements Na to Bi.TheJournal of Chemical Physics 82,284-298(1985).
89.Hinkes,S.P.A.&Klein,C.D.P.Virtues of Volatility:A FacileTransesterification Approach to Boronic Acids.Organic Letters 21,3048-3052(2019).
90.Zhou,J.,Stapleton,P.,Haider,S.&Healy,J.Boronic acid inhibitors ofthe class Aβ-lactamase KPC-2.Bioorganic&Medicinal Chemistry 26,2921-2927(2018).
91.Masoud,M.S.,Soayed,A.A.&Ali,A.E.Complexing properties of nucleic-acid constituents adenine and guanine complexes.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy 60,1907-1915(2004).
92.Huq,F.&Peter,M.C.R.Interaction between NiCl2,and nucleobases,nucleosides and nucleotides.Journal of Inorganic Biochemistry 78,217-226(2000).
93.Mai,K.,Lin,J.,Zhuang,B.,Li,X.&Zhang,L.-M.Cationic dendronizationof amylose via click chemistry for complexation and transfection of plasmidDNA.International Journal of Biological Macromolecules 79,209-216(2015).
94.Struthers,H.,Spingler,B.,Mindt,T.L.&Schibli,R.“Click-to-Chelate”:Design and Incorporation of Triazole-Containing Metal-Chelating Systems intoBiomolecules of Diagnostic and Therapeutic Interest.Chemistry–A EuropeanJournal 14,6173-6183(2008).
95.Steinmeyer,J.&Wagenknecht,H.-A.Synthesis of DNA Modified withBoronic Acid:Compatibility to Copper(i)-Catalyzed Azide–AlkyneCycloaddition.Bioconjugate Chemistry 29,431-436(2018).
96.Dai,C.et al.The first chemical synthesis of boronic acid-modifiedDNA through a copper-free click reaction.Chemical Communications 47,3598-3600(2011).
97.Pizer,R.&Babcock,L.Mechanism of the complexation of boron acidswith catechol and substituted catechols.Inorganic Chemistry 16,1677-1681(1977).
98.Pizer,R.&Tihal,C.Equilibria and reaction mechanism of thecomplexation of methylboronic acid with polyols.Inorganic Chemistry 31,3243-3247(1992).
99.D.A.&Zümreoglu-Karan,B.Complexation of boric acid with vitaminC.New Journal of Chemistry 33,1874-1881(2009).
100.D.A.,Zumreoglu-Karan,B.,Sahin,O.&O.Boric acidcomplexes with thiamine (vitamin B1)and pyridoxine(vitamin B6).InorganicaChimica Acta 413,77-83(2014).
101.Zhang,S.,Tang,Y.,Chen,Y.,Zhang,J.&Wei,Y.Boronic acid-modifiedpolyhedral oligomeric silsesquioxanes on polydopamine-coated magnetizedgraphene oxide for selective and high-capacity extraction of thecatecholamines epinephrine,dopamine and isoprenaline.Microchimica Acta 187,77(2020).
102.Qi,F.et al.arXiv:1901.08013(2018).
103.Martin,A.R.,Vasseur,J.-J.&Smietana,M.Boron and nucleic acidchemistries:merging the best of both worlds.Chemical Society Reviews 42,5684-5713(2013).
104.Peleg,M.,Normand,M.D.&Corradini,M.G.The Arrhenius EquationRevisited.Critical Reviews in Food Science and Nutrition 52,830-851(2012).

Claims (27)

1.用于表征目标分析物的系统，所述系统包含：
纳米孔；和
聚合物链，所述聚合物链包含系链位点和反应段，
其中所述聚合物链通过所述系链位点被系链，使得所述聚合物链不能穿过所述纳米孔，并且其中所述反应段包含至少一个传感模块，所述传感模块可以与所述目标分析物的单个分子相互作用。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述反应段包含两个或更多个传感模块，所述传感模块可以与两种或更多种不同目标分析物相互作用。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的系统，其中每个传感模块由一个、两个或更多个传感部分组成，并且每个传感部分可以与所述目标分析物的单个分子的一个或两个或更多个结合位点相互作用。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述传感部分选自由任何核苷酸的碱基、任何氨基酸、1,2,3-三唑、苯硼酸(PBA)或其任何组合组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中所述传感模块中的至少一个由选自由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的组的两个相邻嘌呤组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，其中所述反应段通过以下方式中的任一种或其任意组合进行制备：
a.将一种或更多种包含传感部分的单体掺入所述反应段；
b.将一种或更多种包含官能团的单体掺入所述反应段，并且将所述官能团化学修饰成传感部分；或
c.将一种或更多种包含第一反应柄的单体掺入所述反应段，并且使所述第一反应柄与第二反应柄反应，所述第二反应柄与传感部分连接。
7.根据权利要求6所述的系统，其中所述第一反应柄和所述第二反应柄是点击反应柄。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述第一反应柄和所述第二反应柄选自由叠氮化物和炔烃组成的组。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中将所述聚合物链系链至阻挡物分子或所述纳米孔蛋白质。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述阻挡物分子是可以特异性结合小分子化合物的蛋白质，所述系链位点包含所述小分子化合物，并且通过所述小分子化合物与所述蛋白质的特异性结合将所述聚合物链系链至所述阻挡物分子。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述阻挡物分子是链霉亲和素或半抗原的抗体，并且所述小分子化合物是生物素或所述半抗原。
12.根据权利要求9所述的系统，其中所述系链位点包含可以与所述阻挡物分子或所述纳米孔蛋白质的表面上的天然氨基酸反应的小分子，并且通过所述小分子化合物与所述天然氨基酸之间的反应将所述聚合物链系链至所述阻挡物分子。
13.根据权利要求9所述的系统，其中将第一反应柄引入所述阻挡物分子或所述纳米孔蛋白质的表面，所述系链位点包含第二反应柄，并且通过所述第一反应柄与所述第二反应柄之间的反应将所述聚合物链系链至所述阻挡物分子。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的系统，其中所述聚合物链还包括延伸段，并且所述延伸段被设置成能够使所述反应段位于适合测量阻塞的区域中。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统，其中所述聚合物链进一步包含牵引段，并且所述牵引段被设置成将所述反应段保持在适合测量阻塞的区域中。
16.根据权利要求15所述的系统，其中所述牵引段包含以下中的任一项：
a.聚合物链，其在施加于所述纳米孔的电场中倾向于穿过纳米孔通道；
b.偶联位点，其可以与所述纳米孔的通道的表面上的天然氨基酸反应；
c.第二反应柄，其可以与被引入至所述纳米孔的通道的表面的第一反应柄反应；或
d.聚合物链，其可以穿过所述纳米孔的通道，并且在所述纳米孔外形成尺寸大于所述纳米孔的出口的三维结构。
17.根据权利要求15所述的系统，其中所述牵引段是长度为10nt或更长的核酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，其中所述聚合物链基于核酸、核酸类似物、多肽、多糖、均聚物、共聚物或其任何组合。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的系统，其中所述目标分析物选自由以下组成的组：
包含金属元素的离子；优选包含碱土金属或过渡金属的离子；更优选AuCl4 -、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+或Pb2+；
单糖；优选核糖、果糖或甘露糖；更优选D-(-)-核糖、D-果糖或D-(+)-甘露糖；
寡糖；优选二糖或三糖；更优选4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖)、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖)或4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖)；
多糖；
葡萄糖苷；
多酚，例如花青素或原花青素；
儿茶酚胺；
儿茶酚胺衍生物；优选肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素；
多元醇；优选含有两个邻位羟基基团、1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物；更优选3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)、3,4-二羟基苯乙酸、儿茶酚、乙二醇、甘油、L-乳酸或维生素(例如维生素C或维生素B6)；
质子化或去质子化形式化合物；优选质子化或去质子化形式的tris；
含有核糖部分的化合物；优选核苷酸、核苷、其类似物或其单磷酸盐衍生物或其多磷酸盐衍生物；更优选核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物、胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)；
过氧化氢；
寡肽或环肽；
缓冲试剂；优选tris；
小分子药物；优选核苷类似物药物；更优选galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物；
神经递质；优选儿茶酚胺或其衍生物；
具有特定手性的化合物；优选L-去甲肾上腺素或D-去甲肾上腺素；
含有同位素的分析物；优选儿茶酚-D6(氘取代儿茶酚上的所有氢原子)；
化学中间体；
或其任何组合。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的系统，其中所述纳米孔是生物纳米孔、固态纳米孔或DNA纳米孔。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述蛋白质纳米孔是MspA、α-HL、气溶素、ClyA、FhuA、FraC、PlyA/B、CsgG Phi 29连接体或者其同源物或变体。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的系统，其中所述系统包含两个或更多个纳米孔。
23.用于表征目标分析物的方法，所述方法包括：
(i)提供根据权利要求1-22中任一项的系统；
(ii)在所述纳米孔的两侧之间施加电压，允许一条聚合物链进入所述纳米孔；
(iii)允许目标分析物穿过所述纳米孔；和
(iv)测量通过所述纳米孔的离子电流以提供电流模式，并基于所述电流模式表征所述目标分析物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述系统的聚合物链包含两个或更多个传感模块，所述传感模块可以与两种或更多种不同目标分析物相互作用，并且其中所述方法用于表征两种或更多种目标分析物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法包括：
(i)提供根据权利要求1-22中任一项的系统；
(ii)在所述纳米孔的两侧之间施加第一电压，允许一条聚合物链进入所述纳米孔；
(iii)允许第一目标分析物穿过所述纳米孔；和
(iv)测量通过所述纳米孔的离子电流以提供电流模式，并基于所述电流模式表征所述第一目标分析物；
(v)将两个隔室之间的电压转换成与所述第一电压方向相反的第二电压，从而使所述纳米孔中的聚合物链从所述纳米孔退出；
(vi)将所述两个隔室之间的电压转换成所述第一电压并允许另一条聚合物链进入所述纳米孔；和
(vi)将步骤(iii)-(iv)应用于不同于所述第一目标分析物的第二目标分析物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述传感模块能够与所述第一目标分析物和/或所述第二目标分析物发生不可逆的相互作用。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的系统，其中所述目标分析物选自由以下组成的组：
含有金属元素的离子；优选包含碱土金属或过渡金属的离子；更优选AuCl4 -、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+或Pb2+；
单糖；优选核糖、果糖或甘露糖；更优选D-(-)-核糖、D-果糖或D-(+)-甘露糖；
寡糖；优选二糖或三糖；更优选4-O-β-d-吡喃半乳糖基-d-呋喃果糖(乳果糖)、6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖(异麦芽酮糖)或4-O-b-D-半乳糖基蔗糖(半乳糖基蔗糖)；
多糖；
葡萄糖苷；
多酚，例如花青素或原花青素；
儿茶酚胺；
儿茶酚胺衍生物；优选肾上腺素、去甲肾上腺素或异丙肾上腺素；
多元醇；优选含有两个邻位羟基基团、1,2-顺式-二醇或1,3-顺式-二醇部分的化合物；更优选3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸(VMA)、3,4-二羟基苯乙酸、儿茶酚、乙二醇、甘油、L-乳酸或维生素(例如维生素C或维生素B6)；
质子化或去质子化形式的化合物；优选质子化或去质子化形式的tris；
含有核糖部分的化合物；优选核苷酸、核苷、其类似物或其单磷酸盐衍生物或其多磷酸盐衍生物；更优选核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物、胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)；
过氧化氢；
寡肽或环肽；
缓冲试剂；优选tris；
小分子药物；优选核苷类似物药物；更优选galidesvir、利巴韦林、法维拉韦-RTP、瑞德西韦或其三磷酸代谢物；
神经递质；优选儿茶酚胺或其衍生物；
具有特定手性的化合物；优选L-去甲肾上腺素或D-去甲肾上腺素；
含有同位素的分析物；优选儿茶酚-D6(氘取代儿茶酚上的所有氢原子)；
化学中间体；
或其任何组合。
CN202180076322.2A 2020-11-13 2021-07-22 用于随机传感的可编程纳米反应器（pnrss） Pending CN116635712A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2020/128706 2020-11-13
CNPCT/CN2020/128706 2020-11-13
PCT/CN2021/107874 WO2022100147A1 (en) 2020-11-13 2021-07-22 Programmable nano-reactors for stochastic sensing (pnrss)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116635712A true CN116635712A (zh) 2023-08-22

Family

ID=81602080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180076322.2A Pending CN116635712A (zh) 2020-11-13 2021-07-22 用于随机传感的可编程纳米反应器（pnrss）

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230400474A1 (zh)
EP (1) EP4244610A4 (zh)
JP (1) JP2023549796A (zh)
CN (1) CN116635712A (zh)
WO (1) WO2022100147A1 (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016069806A2 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Genia Technologies, Inc. Alpha-hemolysin variants with altered characteristics
CN106133513A (zh) * 2014-02-19 2016-11-16 华盛顿大学 蛋白质特征的基于纳米孔的分析
CN106687574A (zh) * 2014-06-03 2017-05-17 亿明达股份有限公司 使用对纳米颗粒或纳米颗粒附近锚定的系链检测事件的组合物，系统和方法
CN107835858A (zh) * 2015-06-03 2018-03-23 亿明达股份有限公司 使用锚定至邻近纳米孔的聚合酶的系链对多核苷酸测序的组合物、系统和方法
WO2019197590A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for detection and analysis of analytes
WO2020023405A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Single-molecule electronic multiplex nanopore immunoassays for biomarker detection

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105136875B (zh) * 2015-07-31 2018-03-20 江苏巨珩新材料科技有限公司 利用超级三明治核酸探针纳米孔道传感器高灵敏高特异性检测Zn2+的方法
WO2017167811A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Genia Technologies, Inc. Nanopore protein conjugates and uses thereof
CN108645905B (zh) * 2018-05-24 2019-12-03 南通大学 一种基于固态纳米孔检测过氧化氢的方法
CN109856227A (zh) * 2019-02-28 2019-06-07 南通大学 一种固态纳米孔内酶分子可控修饰的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106133513A (zh) * 2014-02-19 2016-11-16 华盛顿大学 蛋白质特征的基于纳米孔的分析
CN106687574A (zh) * 2014-06-03 2017-05-17 亿明达股份有限公司 使用对纳米颗粒或纳米颗粒附近锚定的系链检测事件的组合物，系统和方法
WO2016069806A2 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Genia Technologies, Inc. Alpha-hemolysin variants with altered characteristics
CN107835858A (zh) * 2015-06-03 2018-03-23 亿明达股份有限公司 使用锚定至邻近纳米孔的聚合酶的系链对多核苷酸测序的组合物、系统和方法
WO2019197590A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for detection and analysis of analytes
WO2020023405A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Single-molecule electronic multiplex nanopore immunoassays for biomarker detection

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WILLIAM J. RAMSAY ET AL: "Single-Molecule Determination of the Isomers of d-Glucose and d-Fructose that Bind to Boronic Acids", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 57, 24 January 2018 (2018-01-24), pages 2841 - 2845 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022100147A1 (en) 2022-05-19
EP4244610A1 (en) 2023-09-20
JP2023549796A (ja) 2023-11-29
EP4244610A4 (en) 2025-01-01
US20230400474A1 (en) 2023-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jia et al. Programmable nano-reactors for stochastic sensing
Zhang et al. Dual-aptamer-assisted ratiometric SERS biosensor for ultrasensitive and precise identification of breast cancer exosomes
Wang et al. In vivo electrochemical biosensors: Recent advances in molecular design, electrode materials, and electrochemical devices
Wang et al. Bio-inspired track-etched polymeric nanochannels: steady-state biosensors for detection of analytes
Sun et al. Applying carbon dots-metal ions ensembles as a multichannel fluorescent sensor array: detection and discrimination of phosphate anions
Xi et al. Ultrasensitive detection of cancer cells combining enzymatic signal amplification with an aerolysin nanopore
Huang et al. Solid-state nanochannels for bio-marker analysis
Ruan et al. Target-triggered assembly in a nanopipette for electrochemical single-cell analysis
An et al. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence
Ledovskaya et al. Efficient labeling of organic molecules using 13 C elemental carbon: universal access to 13 C 2-labeled synthetic building blocks, polymers and pharmaceuticals
Gunsolus et al. Analytical aspects of nanotoxicology
US9518986B2 (en) Method of detecting and/or quantifying an analyte in a biological sample
Kushwaha et al. Epitope imprinting of Mycobacterium leprae bacteria via molecularly imprinted nanoparticles using multiple monomers approach
Stuber et al. Aptamer conformational dynamics modulate neurotransmitter sensing in nanopores
Zhou et al. Gold nanocluster-based fluorescent microneedle platform toward visual detection of ATP
Jia et al. Identification of single-molecule catecholamine enantiomers using a programmable nanopore
Haugland et al. Synthetically diversified protein nanopores: resolving click reaction mechanisms
Zhang et al. Synthesis of a highly azide-reactive and thermosensitive biofunctional reagent for efficient enrichment and large-scale identification of O-GlcNAc proteins by mass spectrometry
CN107430107A (zh) 通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测
Ouyang et al. Construction of a smart nanofluidic sensor through a redox reaction strategy for high-performance carbon monoxide sensing
Fang et al. Surface-roughened SERS-active single silver nanowire for simultaneous detection of intracellular and extracellular pHs
Wang et al. Retarded translocation of nucleic acids through α-hemolysin nanopore in the presence of a calcium flux
Piskin et al. Development of ultra-sensitive and selective molecularly imprinted polymer-based electrochemical sensor for L-lactate detection
Liu et al. Selective detection of 8-Oxo-2′-deoxyguanosine in single-stranded DNA via nanopore sensing approach
Liu et al. Cell viability and drug evaluation biosensing system based on disposable AuNPs/MWCNT nanocomposite modified screen-printed electrode for exocytosis dopamine detection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination