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CN116635519A - 一种经修饰的免疫细胞及其应用 - Google Patents

一种经修饰的免疫细胞及其应用 Download PDF

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CN116635519A
CN116635519A CN202180079469.7A CN202180079469A CN116635519A CN 116635519 A CN116635519 A CN 116635519A CN 202180079469 A CN202180079469 A CN 202180079469A CN 116635519 A CN116635519 A CN 116635519A
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CN
China
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seq
modified cell
fusion protein
active fragment
functionally active
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CN202180079469.7A
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李本尚
王天怡
万欣宇
杨晓敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Pharmaceutical Group Biotherapy Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Pharmaceutical Group Biotherapy Technology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本申请涉及一种融合蛋白，尤其涉及一种包含所述融合蛋白的经修饰的免疫细胞及其应用。所述融合蛋白包含抗原或其功能活性片段、共刺激结构域和胞内信号转导结构域。包含所述融合蛋白的经修饰的细胞与多特异性抗体结合，对肿瘤细胞有很好的杀伤作用，并被命名为抗原偶联抗体重定向T细胞免疫疗法(Antigen Coupling Antibody Redirect T cell Immunotherapy,AgCAR‑T)。

Description

一种经修饰的免疫细胞及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种融合蛋白、经修饰的免疫细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CART)是近些年发展起来的一种行之有效的过继性细胞免疫治疗，该方法通过对自体来源的T细胞进行基因工程改造，使效应性T淋巴细胞产生针对肿瘤细胞的靶向细胞毒作用，以达到清除体内肿瘤细胞的目的。
CART的靶向性取决于通过基因工程技术对T细胞进行的改造方式，使之表达可以识别自身肿瘤细胞相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)的特异性单链抗体(scFv)，后者由TAA特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成，VL和VH之间由柔软的铰链区组成。除了在T细胞表面表达针对肿瘤细胞的特异性单链抗体外，在T细胞内同时表达可协同激活T细胞的共刺激分子，如CD28、4-1BB以及OX4等，从而一方面依靠特异性单链抗体识别肿瘤细胞，另一方面通过上述共刺激分子与CD3ζ协同激活T细胞产生靶向性细胞毒作用。
目前，CART技术在液体肿瘤中取得了巨大成功，但在实体瘤的应用领域尚未出现重大改变。CART治疗面临的问题包括：1)实体瘤发生的部位不像白血病散布全身，CART细胞需要抵达实体瘤的病灶，并且浸润到肿瘤内部才能发挥作用，这是实体瘤组织结构形成的CART治疗的空间阻碍作用；2)肿瘤内部免疫微环境的抑制作用会导致CART细胞无法正常发挥作用，并且会产生T细胞耗竭；3)实体瘤内部微环境存在缺氧、营养物质缺乏等情况，也不利于CART细胞大量增殖和产生靶向细胞毒作用。因此有必要开发新型结构来治疗肿瘤。
发明内容
本申请提供了一种融合蛋白、包含和/或表达所述融合蛋白的经修饰的细胞、包含和/或表达所述融合蛋白和多特异性抗体的经修饰的细胞，其具有下列性质的一种或多种：1)所述融合蛋白可以与多特异性抗体的第一靶向部分结合，多特异性抗体激活了包含所述融合蛋白的 经修饰的细胞，所述多特异性抗体的第二靶向部分可以靶向肿瘤细胞，从而使包含所述融合蛋白的经修饰的细胞杀伤肿瘤；2)扩大了细胞免疫治疗的范围；3)所述包含融合蛋白的经修饰的细胞攻击肿瘤细胞具有有效性和统一性；4)解决了T细胞耗竭的问题；5)能够治疗实体瘤；6)降低了细胞因子风暴发生的风险；7)不会引起自身免疫反应。
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含：1)抗原或其功能活性片段；2)共刺激结构域；以及3)胞内信号转导结构域。
在某些实施方式中，所述抗原包括肿瘤相关抗原或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述抗原包括免疫细胞激活相关抗原或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述免疫细胞激活相关抗原或其功能活性片段包括选自下组的抗原或其功能活性片段：CD45、CD56和CD58。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括选自下组的抗原或其功能活性片段：CD19、CD20、CD22、CD33，CD38、CD123、CD7和BCMA。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD19蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD20蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD22蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD33蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包含SEQ ID NO:2、4、6、8和10中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域或其组合：4-1BB、CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包括源自4-1BB的共刺激结构域。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结 构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段的C端与所述共刺激结构域的N端直接或间接地连接。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端直接或间接地连接。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码所述的融合蛋白。
在某些实施方式中，所述的分离的核酸分子包含SEQ ID NO:21所示的核酸序列。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含所述的分离的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的载体包括病毒载体。
在某些实施方式中，所述的载体包括慢病毒载体。
另一方面，本申请提供了一种经修饰的细胞，其包含所述的融合蛋白，所述的核酸分子和/或所述的载体。
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞包括免疫细胞。
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞包括免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自下组：T细胞、巨噬细胞 自然杀伤细胞(NK细胞)和NKT细胞。
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞包括T细胞或巨噬细胞
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞包括NK细胞或NKT细胞。
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞还包含和/或表达一种或多种多特异性抗体。
在某些实施方式中，所述多特异性抗体包含第一靶向部分和第二靶向部分。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分能够特异性结合肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别所述融合蛋白中所述抗原或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分所靶向的肿瘤相关抗原选自下组蛋白或其功能活性片段：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD123、CD7和BCMA。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分所靶向的肿瘤相关抗原选自下组蛋白或其功能活 性片段：GD2、DLL1、DLL3、ROR1、GPC3、HER2、VEGFA、CD1a、CD33、B7H3、CD138、BCMA、EGFRVIII和ERBB2。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD20蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD20蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD20蛋白或其功能活性片段，且第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:95中任一 项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:96中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24和HCDR3：SEQ ID NO:25；
b)HCDR1：SEQ ID NO:31，HCDR2：SEQ ID NO:32和HCDR3：SEQ ID NO:33；
c)HCDR1：SEQ ID NO:31，HCDR2：SEQ ID NO:32和HCDR3：SEQ ID NO:33；
d)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:41；
e)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:47；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:52；
g)HCDR1：SEQ ID NO:55，HCDR2：SEQ ID NO:56和HCDR3：SEQ ID NO:57；
h)HCDR1：SEQ ID NO:62，HCDR2：SEQ ID NO:63和HCDR3：SEQ ID NO:64；
i)HCDR1：SEQ ID NO:70，HCDR2：SEQ ID NO:71和HCDR3：SEQ ID NO:72；
j)HCDR1：SEQ ID NO:78，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:80；
k)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
l)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
m)HCDR1：SEQ ID NO:94，HCDR2：SEQ ID NO:95和HCDR3：SEQ ID NO:96。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:93中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:99中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:100中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
a)LCDR1：SEQ ID NO:27，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:29；
b)LCDR1：SEQ ID NO:35，LCDR2：SEQ ID NO:36和LCDR3：SEQ ID NO:37；
c)LCDR1：SEQ ID NO:35，LCDR2：SEQ ID NO:36和LCDR3：SEQ ID NO:37；
d)LCDR1：SEQ ID NO:43，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:45；
e)LCDR1：SEQ ID NO:49，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:50；
f)LCDR1：SEQ ID NO:49，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:45；
g)LCDR1：SEQ ID NO:59，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:60；
h)LCDR1：SEQ ID NO:66，LCDR2：SEQ ID NO:67和LCDR3：SEQ ID NO:68；
i)LCDR1：SEQ ID NO:74，LCDR2：SEQ ID NO:75和LCDR3：SEQ ID NO:76；
j)LCDR1：SEQ ID NO:82，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:83；
k)LCDR1：SEQ ID NO:88，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
l)LCDR1：SEQ ID NO:92，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
m)LCDR1：SEQ ID NO:98，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:100。
在某些实施方式中，所述VL包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:97中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:151中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:152中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:153中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:70，HCDR2：SEQ ID NO:71和HCDR3：SEQ ID NO:72；
b)HCDR1：SEQ ID NO:78，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:80；
c)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
d)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
e)HCDR1：SEQ ID NO:94，HCDR2：SEQ ID NO:95和HCDR3：SEQ ID NO:96；
f)HCDR1：SEQ ID NO:102，HCDR2：SEQ ID NO:103和HCDR3：SEQ ID NO:104；
g)HCDR1：SEQ ID NO:102，HCDR2：SEQ ID NO:103和HCDR3：SEQ ID NO:104；
h)HCDR1：SEQ ID NO:110，HCDR2：SEQ ID NO:111和HCDR3：SEQ ID NO:112；
i)HCDR1：SEQ ID NO:117，HCDR2：SEQ ID NO:118和HCDR3：SEQ ID NO:119；
j)HCDR1：SEQ ID NO:126，HCDR2：SEQ ID NO:127和HCDR3：SEQ ID NO:128；
k)HCDR1：SEQ ID NO:126，HCDR2：SEQ ID NO:127和HCDR3：SEQ ID NO:128；
l)HCDR1：SEQ ID NO:136，HCDR2：SEQ ID NO:137和HCDR3：SEQ ID NO:138；
m)HCDR1：SEQ ID NO:143，HCDR2：SEQ ID NO:144和HCDR3：SEQ ID NO:145；
n)HCDR1：SEQ ID NO:151，HCDR2：SEQ ID NO:152和HCDR3：SEQ ID NO:153。在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:150中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:155中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:156中任一项所示的氨基 酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:157中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
a)LCDR1：SEQ ID NO:74，LCDR2：SEQ ID NO:75和LCDR3：SEQ ID NO:76；
b)LCDR1：SEQ ID NO:82，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:83；
c)LCDR1：SEQ ID NO:88，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
d)LCDR1：SEQ ID NO:92，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
e)LCDR1：SEQ ID NO:98，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:100；
f)LCDR1：SEQ ID NO:106，LCDR2：SEQ ID NO:107和LCDR3：SEQ ID NO:108；
g)LCDR1：SEQ ID NO:106，LCDR2：SEQ ID NO:107和LCDR3：SEQ ID NO:108；
h)LCDR1：SEQ ID NO:114，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:115；
i)LCDR1：SEQ ID NO:121，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:122；
j)LCDR1：SEQ ID NO:130，LCDR2：SEQ ID NO:131和LCDR3：SEQ ID NO:132；
k)LCDR1：SEQ ID NO:130，LCDR2：SEQ ID NO:131和LCDR3：SEQ ID NO:132；
l)LCDR1：SEQ ID NO:140，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:141；
m)LCDR1：SEQ ID NO:147，LCDR2：SEQ ID NO:148和LCDR3：SEQ ID NO:149；
n)LCDR1：SEQ ID NO:155，LCDR2：SEQ ID NO:156和LCDR3：SEQ ID NO:157。
在某些实施方式中，所述VL包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:154中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述靶向部分包括VHH、scFv、Fab、dAb和/或衍生蛋白结构。
在某些实施方式中，所述靶向部分选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分包括scFv。
在某些实施方式中，所述第二靶向部分包括scFv。
在某些实施方式中，在所述多特异性抗体中，所述第一靶向部分与第二靶向部分在框内融合。
在某些实施方式中，所述第一靶向部分通过铰链区与所述第二靶向部分连接。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述经修饰的细胞包含和/或表达编码所述的融合蛋白的核酸分子和/或编码所述的多特异性抗体的核酸分子。
在某些实施方式中，所述编码融合蛋白的核酸分子和编码所述多特异性抗体的核酸分子位于不同的载体上。
在某些实施方式中，所述编码融合蛋白的核酸分子和编码所述多特异性抗体的核酸分子位于同一载体上。
在某些实施方式中，所述编码融合蛋白的核酸分子通过编码剪切肽的序列与所述编码多特异性抗体的核酸分子连接。
在某些实施方式中，所述编码剪切肽的核酸序列选自下组：P2A序列、T2A序列、F2A序列、E2A序列、BmCPV2A序列和BmIFV2A序列。
在某些实施方式中，所述剪切肽序列包括P2A序列。
在某些实施方式中，所述剪切肽序列包括T2A序列。
在某些实施方式中，所述的经修饰的细胞中所述剪切肽序列包含SEQ ID NO：13-16中任一项所示的核酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白与所述多特异性抗体的表达量不同。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的经修饰的细胞，和/或所述的一种或多种多特异性抗体。
在某些实施方式中，所述药物组合物中的所述多特异性抗体包含采用生物工程技术制备纯化的包含第一靶向部分和第二靶向部分的蛋白质分子。
在某些实施方式中，所述多特异性抗体被输入到血管内。
另一方面，本申请提供了一种所述的经修饰的细胞和/或所述的一种或多种多特异性抗体在制备药物中的用途。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的 载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括血液瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与CD33的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人髓系白血病(AML)。
另一方面，本申请提供了一种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，任一项所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与CD33的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治 疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，其用于治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与CD33的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，任一项所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与GD2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与HER2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述I-1～I-4、I-1-1～I-1-3、I-2-1～I-2-3、I-3-1～I-3-3、I-4-1～I-4-2的AgCAR结构。
图2显示的是本申请所述II-1～II-11的AgCAR结构。
图3显示的是本申请所述带有基因工程载体(AgCAR)结构的细胞的靶向细胞毒作用。
图4显示的是本申请所述CD19AgCAR backbone的载体结构图。
图5显示的是本申请所述CD19AgCAR Double antibody的载体结构图。
图6显示的是本申请所述CD19AgCAR的载体结构图。
图7显示的是本申请所述带有CD19AgCAR的慢病毒、带有CD19AgCAR backbone的慢病毒、带有CD19AgCAR Double antibody的慢病毒转染人T淋巴细胞的转染效率。
图8A-J显示的是本申请所述带有CD19AgCAR的T细胞、带有CD19AgCAR backbone的T细胞、带有CD19AgCAR Double antibody的T细胞、CD19-CART和CD33-CART体外杀伤CD33阳性髓系白血病细胞株HL60的效果。
图9A-L显示的是本申请所述带有CD19AgCAR的T细胞、带有CD19AgCAR backbone的T细胞、带有CD19AgCAR Double antibody的T细胞和GD2-CART体外杀伤GD2阳性神经母细胞瘤细胞株CHP134的效果。
图10显示的是本申请所述带有CD22AgCAR的T细胞、带有CD20AgCAR的T细胞和带有CD19AgCAR的T细胞与人急性淋巴细胞白血病细胞株MV4；11共孵育的实验中残留MV4；11的流式细胞技术检测结果。
图11显示的是本申请所述带有CD19AgCAR-33的T细胞的体内效果检测。
图12A-B显示的是本申请所述带有有CD19AgCAR-B7H3的T细胞的体内效果检测。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“抗原”或“Ag”通常是指为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。在某些情形中，所述抗原包括肿瘤相关抗原。例如，肿瘤相关抗原可以在肿瘤细胞表面表达。例如，肿瘤相关抗原也可以在其它细胞(例如，免疫细胞)表面表达。例如，肿瘤相关抗原可以包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD123、CD7、BCMA。在某些情形中，所述抗原包括免疫细胞激活相关抗原。例如，免疫细胞激活相关抗原可以包括但不限于CD45、CD56和CD58。例如，技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。因此，本领域技术人员将理解，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。本申请包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引起所需免疫应答的多肽。此外，本领域技术人员将理解，抗原可以不由“基因”编码。例如，抗原可以是合成的或可以源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品，肿瘤样品，细胞或生物流体。在某些情形中，抗原可以来自非人动物，包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。
在本申请中，术语“单链抗体”或“scFv”通常是指通过连接体连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。见，例如Bird等人，Science，242：423-426(1988)；和 Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)。在一些实施方案中，scFv的重链可变区和轻链可变区可以来自CD19、CD20、CD33、GD2、B7H3或CD22。
在本申请中，术语“CD19”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD19的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P15391。在本申请中，融合蛋白可以包含人CD19的部分或者全部氨基酸序列。
在本申请中，术语“CD22”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD22的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P20273。在本申请中，融合蛋白可以包含人CD22的部分或者全部氨基酸序列。
在本申请中，术语“CD20”通常是指人B淋巴细胞上与增殖和分化有关的重要膜抗原。人CD20的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P11836。在本申请中，融合蛋白可以包含人CD20的部分或者全部氨基酸序列。
在本申请中，术语“CD33”通常是指髓系细胞分化抗原。人CD33的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P20138。在本申请中，融合蛋白可以包含人CD33的部分或者全部氨基酸序列。
在本申请中，术语“GD2”通常是指一种神经节苷脂。GD2可以表达在神经外胚层生成的肿瘤表面，包括但不限于神经母细胞瘤、黑色素瘤和骨肉瘤等肿瘤。
在本申请中，术语“B7H3”通常是指一种归属于B7家族的跨膜蛋白。B7H3可以在多种肿瘤细胞表面表达。例如，肺癌、头颈癌、食管癌、前列腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌。人B7H3的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号Q5ZPR3。在本申请中，融合蛋白可以包含人B7H3的部分或者全部氨基酸序列。
在本申请中，术语“ERBB2”通常是指表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族成员之一。人CD20的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P04626。
在本申请中，术语“功能活性片段”通常是指与天然存在序列具有同源性的氨基酸序列或由同源性的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％ 或99.9％相同的氨基酸序列。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“共刺激信号传导结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。在某些情形中，共刺激信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。例如，共刺激信号传导结构域可以包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在本申请中，术语“胞内信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以将信号传导至细胞内。通常，胞内信号传导结构域为用于指导蛋白质寻靶的任何一段连续的氨基酸序列。在某些情形中，胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组的蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。例如，胞内信号传导结构域可以包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为 称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
在本申请中，术语“互补决定区”(CDR)通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本申请中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性，但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。另外，其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的嵌合抗原受体或本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的嵌合抗原受体或抗原结合蛋白即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方式中，所述细胞可以是免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以选自下组：T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免 疫细胞可以是T细胞。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本申请中，术语“肿瘤”通常指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。在本申请中，肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。例如，所述实体瘤可以包括神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、肝母细胞瘤、胰母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肺母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、肠癌、胃癌、胆囊癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、中枢神经系统肿瘤等实体瘤。例如，所述血液瘤可以包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、毛细胞白血病、肥大细胞白血病、浆细胞白血病、骨髓瘤。
在本申请中，术语“多特异性抗体”通常是指可以同时识别两个或两个以上抗原或者表位的抗体分子。所述多特异性抗体可以通过化学偶联法、杂交-杂交瘤法、基因工程抗体制备法等方法在真核表达系统或者在原核表达系统中获得。例如，所述多特异性抗体可以是双特 异性抗体。
在本申请中，术语“受试者”通常是指任何生物，包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。在本申请中，受试者可以是人类、宠物或家畜。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
发明详述
融合蛋白
一方面，本申请提供一种融合蛋白，其包含：1)抗原或其功能活性片段；2)共刺激结构域；以及3)胞内信号转导结构域。
在本申请中，所述的融合蛋白可以包括抗原或其功能活性片段。在某些情形中，所述抗原或其功能活性片段可以包括免疫细胞激活相关抗原或其功能活性片段。例如，所述免疫细胞激活相关抗原或其功能活性片段可以包括选自下组的抗原或其功能活性片段：CD45、CD56和CD58。
在本申请中，所述抗原或其功能活性片段可以包括肿瘤相关抗原。例如，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段可以包括选自下组的抗原或其功能活性片段：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD123、CD7、BCMA和B7H3。例如，所述肿瘤相关抗原可以是与B淋巴细胞发育相关的抗原。例如，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段可以包括CD19蛋白或其功能活性片段。又例如，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段可以包括CD20蛋白或其功能活性片段。又例如，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段可以包括CD22蛋白或其功能活性片段。又例如，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段可以包括CD33蛋白或其功能活性片段。又例如，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段可以包含SEQ ID NO：2、4、6、8和10中任一项所示的氨基酸序列，编码所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段的核酸序列可以包含SEQ ID NO：1、3、5、7和9任一项所示的序列。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域或其组合：4-1BB、CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM- 1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。例如，所述共刺激结构域可以包括源自4-1BB的共刺激结构域。例如，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。编码所述共刺激结构域的核酸序列可以包含SEQ ID NO：11所示的核酸序列。
在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。例如，所述胞内信号传导结构域可以包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。例如，所述胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。编码所述胞内信号传导结构域的核酸序列可以包含SEQ ID NO：18所示的核酸序列。
在本申请中，所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段的C端可以与所述共刺激结构域的N端直接或间接地连接。
在本申请中，所述共刺激结构域的C端可以与所述胞内信号传导结构域的N端直接或间接地连接。
在某些情形中，所述的融合蛋白，从N端到C端可以包含抗原或其功能活性片段、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在本申请中，所述抗原或其功能活性片段、所述共刺激结构域和所述胞内信号传导结构域可以在框内融合(如图1所示)。
例如，所述抗原或其功能活性片段可以是CD19蛋白或其功能活性片段，其氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:2所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。其核酸序列可以包含SEQ ID NO：1所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的核酸序列可包含与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的核酸序列。
例如，所述抗原或其功能活性片段可以是CD20蛋白或其功能活性片段，其氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:4所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。其核酸序列可以包含SEQ ID NO：3所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的核酸序列可包含与SEQ ID NO:3所示的核酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的核酸序列。
例如，所述抗原或其功能活性片段可以是CD22蛋白或其功能活性片段，其氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:6所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。其核酸序列可以包含SEQ ID NO：5所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的核酸序列可包含与SEQ ID NO:5所示的核酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的核酸序列。
例如，所述抗原或其功能活性片段可以是CD33蛋白或其功能活性片段，其氨基酸序列可以包含SEQ ID NO：8所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。其核酸序列可以包含SEQ ID NO:9所示的序列。例如，所述抗原或其功能活性片段的核酸序列可包含与SEQ ID NO:9所示的核酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的核酸序列。
在本申请中，所述共刺激结构域可以包括源自4-1BB的共刺激结构域，其可以包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。例如，所述共刺激结构域可以包含与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域，其可以包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。例如，所述胞内信号传导结构域的氨基酸序列可包含与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在某些情形中，所述的融合蛋白，从N端到C端可以包含CD19蛋白或其功能活性片段、4-1BB和CD3ζ。
在某些情形中，所述的融合蛋白，从N端到C端可以包含CD22蛋白或其功能活性片段、4-1BB和CD3ζ。
在某些情形中，所述的融合蛋白，从N端到C端可以包含CD20蛋白或其功能活性片段、4-1BB和CD3ζ。
在某些情形中，所述的融合蛋白，从N端到C端可以包含CD33蛋白或其功能活性片段、4-1BB和CD3ζ。
多特异性抗体
本申请提供了一种或多种多特异性抗体，其可以包括第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分识别所述融合蛋白中所述抗原或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以结合所述融合蛋白中所述抗原或其功能活性片段。
在某些情形中，所述第一靶向部分可以特异性结合所述融合蛋白中肿瘤相关抗原。
例如，所述第一靶向部分所靶向的肿瘤相关抗原可以选自下组蛋白或其功能活性片段：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD123、CD7、BCMA和B7H3。
在本申请中，所述第二靶向部分可以靶向肿瘤相关抗原。
例如，所述第二靶向部分所靶向的肿瘤相关抗原可以选自下组蛋白或其功能活性片段：GD2、DLL1、DLL3、ROR1、GPC3、HER2、VEGFA、CD1a、CD33、B7H3、CD138、BCMA、EGFRVIII。
在本申请中，所述靶向部分可以包括但不限于VHH、scFv、Fv片段、Fab、Fab'片段、F(ab')2片段、dAb和/或衍生蛋白结构。
在本申请中，所述靶向部分可以包括但不限于重组抗体、单克隆抗体、全人源抗体、鼠源抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包括scFv。在本申请中，所述第二靶向部分可以包括scFv(如图1所示)。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶 向部分可以识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD20蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD20蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD20蛋白或其功能活性片段，且第二靶向部分可以识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别GD2蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分可以识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD19蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD22蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD20蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO: 90和SEQ ID NO:93中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以识别CD33蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:93中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以识别GD2蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:116中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第二靶向部分可以识别B7H3蛋白或其功能活性片段，其包含重链可变区VH，所述VH可以包含SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:133中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一靶向部分可以包含与SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:133所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含重链可变区VH，所述重链可变区可包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR1可以包含与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:95中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR2可以包含与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:95中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:96中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR3可以包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含重链可变区VH，所述重链可变区可包括HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可包含选自下组中任意一组的氨基酸序列，或者所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可包含与选自下组中任意一组的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24和HCDR3：SEQ ID NO:25；
b)HCDR1：SEQ ID NO:31，HCDR2：SEQ ID NO:32和HCDR3：SEQ ID NO:33；
c)HCDR1：SEQ ID NO:31，HCDR2：SEQ ID NO:32和HCDR3：SEQ ID NO:33；
d)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:41；
e)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:47；
f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:52；
g)HCDR1：SEQ ID NO:55，HCDR2：SEQ ID NO:56和HCDR3：SEQ ID NO:57；
h)HCDR1：SEQ ID NO:62，HCDR2：SEQ ID NO:63和HCDR3：SEQ ID NO:64；
i)HCDR1：SEQ ID NO:70，HCDR2：SEQ ID NO:71和HCDR3：SEQ ID NO:72；
j)HCDR1：SEQ ID NO:78，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:80；
k)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
l)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
m)HCDR1：SEQ ID NO:94，HCDR2：SEQ ID NO:95和HCDR3：SEQ ID NO:96。
在本申请中，所述第一靶向部分可以包含轻链可变区VL，所述重链可变区可包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR1可以包含与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:99中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR2可以包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:99中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述LCDR3可包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:100中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR3可以包含与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述可以包含轻链可变区VL，所述重链可变区可包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3可包含选自下组中任意一组的氨基酸序列，或者所述LCDR1、LCDR2和LCDR3可包含与选自下组中任意一组的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列：
a)LCDR1：SEQ ID NO:27，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:29；
b)LCDR1：SEQ ID NO:35，LCDR2：SEQ ID NO:36和LCDR3：SEQ ID NO:37；
c)LCDR1：SEQ ID NO:35，LCDR2：SEQ ID NO:36和LCDR3：SEQ ID NO:37；
d)LCDR1：SEQ ID NO:43，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:45；
e)LCDR1：SEQ ID NO:49，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:50；
f)LCDR1：SEQ ID NO:49，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:45；
g)LCDR1：SEQ ID NO:59，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:60；
h)LCDR1：SEQ ID NO:66，LCDR2：SEQ ID NO:67和LCDR3：SEQ ID NO:68；
i)LCDR1：SEQ ID NO:74，LCDR2：SEQ ID NO:75和LCDR3：SEQ ID NO:76；
j)LCDR1：SEQ ID NO:82，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:83；
k)LCDR1：SEQ ID NO:88，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
l)LCDR1：SEQ ID NO:92，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
m)LCDR1：SEQ ID NO:98，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:100。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含重链可变区VH，所述重链可变区可包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:151中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR1可以包含与SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:151中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:152中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR2可以包含与SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:152中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:153中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR3可以包含与SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述可以包含重链可变区VH，所述重链可变区可包括HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可包含选自下组中任意一组的氨基酸序列，或者所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可包含与选自下组中任意一组的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:70，HCDR2：SEQ ID NO:71和HCDR3：SEQ ID NO:72；
b)HCDR1：SEQ ID NO:78，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:80；
c)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
d)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
e)HCDR1：SEQ ID NO:94，HCDR2：SEQ ID NO:95和HCDR3：SEQ ID NO:96；
f)HCDR1：SEQ ID NO:102，HCDR2：SEQ ID NO:103和HCDR3：SEQ ID NO:104；
g)HCDR1：SEQ ID NO:102，HCDR2：SEQ ID NO:103和HCDR3：SEQ ID NO:104；
h)HCDR1：SEQ ID NO:110，HCDR2：SEQ ID NO:111和HCDR3：SEQ ID NO:112；
i)HCDR1：SEQ ID NO:117，HCDR2：SEQ ID NO:118和HCDR3：SEQ ID NO:119；
j)HCDR1：SEQ ID NO:126，HCDR2：SEQ ID NO:127和HCDR3：SEQ ID NO:128；
k)HCDR1：SEQ ID NO:126，HCDR2：SEQ ID NO:127和HCDR3：SEQ ID NO:128；
l)HCDR1：SEQ ID NO:136，HCDR2：SEQ ID NO:137和HCDR3：SEQ ID NO:138；
m)HCDR1：SEQ ID NO:143，HCDR2：SEQ ID NO:144和HCDR3：SEQ ID NO:145；
n)HCDR1：SEQ ID NO:151，HCDR2：SEQ ID NO:152和HCDR3：SEQ ID NO:153。
在本申请中，所述第二靶向部分可以包含轻链可变区VL，所述重链可变区可包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:155中任一项所示的氨基酸序 列。例如，所述LCDR1可以包含与SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:155中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:156中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR2可以包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:156中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述LCDR3可包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:157中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述LCDR3可以包含与SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述可以包含轻链可变区VL，所述重链可变区可包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3可包含选自下组中任意一组的氨基酸序列，或者所述LCDR1、LCDR2和LCDR3可包含与选自下组中任意一组的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列：
a)LCDR1：SEQ ID NO:74，LCDR2：SEQ ID NO:75和LCDR3：SEQ ID NO:76；
b)LCDR1：SEQ ID NO:82，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:83；
c)LCDR1：SEQ ID NO:88，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
d)LCDR1：SEQ ID NO:92，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
e)LCDR1：SEQ ID NO:98，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:100；
f)LCDR1：SEQ ID NO:106，LCDR2：SEQ ID NO:107和LCDR3：SEQ ID NO:108；
g)LCDR1：SEQ ID NO:106，LCDR2：SEQ ID NO:107和LCDR3：SEQ ID NO:108；
h)LCDR1：SEQ ID NO:114，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:115；
i)LCDR1：SEQ ID NO:121，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:122；
j)LCDR1：SEQ ID NO:130，LCDR2：SEQ ID NO:131和LCDR3：SEQ ID NO:132；
k)LCDR1：SEQ ID NO:130，LCDR2：SEQ ID NO:131和LCDR3：SEQ ID NO:132；
l)LCDR1：SEQ ID NO:140，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:141；
m)LCDR1：SEQ ID NO:147，LCDR2：SEQ ID NO:148和LCDR3：SEQ ID NO:149；
n)LCDR1：SEQ ID NO:155，LCDR2：SEQ ID NO:156和LCDR3：SEQ ID NO:157。
在本申请中，在所述多特异性抗体中，所述第一靶向部分可以与第二靶向部分在框内融合。
在本申请中，在所述多特异性抗体中，所述第一靶向部分可以通过铰链区与所述第二靶向部分连接。
在本申请中，所述铰链区可包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28和4-1BB。
在本申请中，所述铰链区可包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
核酸和载体
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的融合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述融合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、重链可变区中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。例如，所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述的融合蛋白的核酸，这些方法包括但不限于，采用逆转录PCR和PCR获得本申请所述的融合蛋白的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允 许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体可为表达载体。例如，所述载体可为病毒载体。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使插入的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。本申请所述的载体可以被引入细胞。例如，本申请所述的载体可以是慢病毒载体。
经修饰的细胞
另一方面，本申请提供了一种或多种经修饰的细胞，其可包含和/或表达所述的融合蛋白、一种或多种(例如，2个或以上)所述的核酸分子和/或一种或多种(例如，2个或以上)所述的载体。
在某些情形中，所述细胞还可包含和/或表达本申请所述多特异性抗体。
在某些情形中，所述细胞可包括免疫细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括免疫效应细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括T细胞、巨噬细胞 自然杀伤细胞(NK细胞)和/或NKT细胞。
例如，所述细胞可包括T细胞。所述T细胞可包括胸腺细胞、天然T细胞、未成熟T细胞、成熟T细胞、静息T细胞或活化的T细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T细胞可以是CD4+辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+/CD8+T细胞、CD4-/CD8-T细胞或任何其他T细胞亚型。在某些情形中，所述经修饰的T细胞是人类T细胞。在扩增和遗传修饰本申请的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，例如患者，获得细胞来源。T细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些情形中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的T细胞系。在另一些情形中，所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一些情形中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。
例如，当所述经修饰的细胞使用T细胞时，使用所述经修饰的细胞治疗的方法可以被称为抗原偶联抗体重定向T细胞免疫疗法(Antigen Coupling Antibody Redirect T-cell Immunotherapy,AgCAR-T)。
在某些情形中，所述细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。
例如，当所述经修饰的细胞使用NK细胞时，使用所述经修饰的细胞治疗的方法可以被称为抗原偶联抗体重定向NK细胞免疫疗法(Antigen Coupling Antibody Redirect NK-cell Immunotherapy,AgCAR-NK)。
在某些情形中，所述细胞可包括NKT细胞。例如，所述NKT细胞可以包括1型NKT细胞、2型NKT细胞和类NKT细胞。
例如，当所述经修饰的细胞使用NKT细胞时，使用所述经修饰的细胞治疗的方法可以被称为抗原偶联抗体重定向NKT细胞免疫疗法(Antigen Coupling Antibody Redirect NKT-cell Immunotherapy,AgCAR-NKT)。
在某些情形中，所述细胞可包括巨噬细胞 巨噬细胞是一种可以吞噬和消化细胞碎片、微生物、癌细胞和那些所有缺少正常细胞表面表达的表面标志的其他物质，这个过程 叫做吞噬作用。巨噬细胞几乎存在于所有组织中，通过阿米巴运动寻找可能的病原物。它们除了在非专一的天然免疫反应中起重要作用外，还可以通过招募其他免疫细胞类型，如淋巴细胞，帮助启动获得性免疫。
例如，当所述经修饰的细胞使用 细胞时，使用所述经修饰的细胞治疗的方法可以被称为抗原偶联抗体重定向 细胞免疫疗法(Antigen Coupling Antibody Redirect Immunotherapy, )。
在本申请中，所述编码融合蛋白的核酸分子和编码所述多特异性抗体的核酸分子可以位于不同的载体上。
在本申请中，所述编码融合蛋白的核酸分子和编码所述多特异性抗体的核酸分子可以位于同一载体上。在某些情形中，所述编码融合蛋白的核酸分子可以通过编码剪切肽的序列与所述编码多特异性抗体的核酸分子连接。
在本申请中，所述编码剪切肽的核酸序列可选自下组：P2A序列、T2A序列、F2A序列、E2A序列、BmCPV2A序列和BmIFV2A序列。例如，所述编码剪切肽的核酸序列可以是P2A序列。例如，所述编码剪切肽的核酸序列可以包含SEQ ID NO:13-16中任一项所示的核酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可以与所述多特异性抗体的表达量不同。例如，所述融合蛋白的表达量可以与所述多特异性抗体的表达量相差至少1％。例如，所述融合蛋白的表达量可以与所述多特异性抗体的表达量相差1％，5％，6％，7％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。
在某些情形中，所述载体除一般的表达载体组件外，从5’端到3’端，依次可以包含编码抗原或其功能活性片段的核酸序列，编码共刺激结构域的核酸序列，编码胞内信号传导结构域的核酸序列，剪切肽序列，编码第一靶向部分的核酸序列和编码第二靶向部分的核酸序列(如图2所示)。
在本申请中，所述经修饰的细胞可以表达所述融合蛋白和所述多特异性抗体，其中所述融合蛋白位于所述经修饰的细胞表面，所述多特异性抗体分泌到所述经修饰的细胞外，所述融合蛋白可以与所述多特异性抗体的第一靶向部分结合并激活所述经修饰的细胞，所述多特异性抗体的第二靶向部分可以靶向相应的肿瘤细胞，发挥细胞毒作用杀伤肿瘤(例如，急性髓系白血病，神经母细胞瘤或实体瘤)，如图3所示。
药物组合物、用途和方法
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含所述的经修饰的细胞，和/或所述的 一种或多种多特异性抗体。在某些情形中，所述多特异性抗体可包含采用生物工程技术制备纯化的包含第一靶向部分和第二靶向部分的蛋白质分子。在某些情形中，多特异性抗体可以被注射进入人体。例如，所述多特异性抗体可以通过血管输注至体内。在某些情形中，所述经修饰的细胞可以被注射进入人体。
例如，在所述药物组合物中，所述经修饰的细胞和所述多特异性抗体可以共同施用。例如，在所述药物组合物中，所述经修饰的细胞和所述多特异性抗体可以分别施用。例如，可以先施用所述经修饰的细胞，再施用所述多特异性抗体。例如，可以先施用所述多特异性抗体，再施用所述经修饰的细胞。例如，所述经修饰的细胞和所述多特异性抗体可以以相同的方式施用，例如，所述经修饰的细胞和所述多特异性抗体可以以不同方式施用。
例如，在所述药物组合物中，所述经修饰的细胞和所述多特异性抗体可以放置在同一个容器中。例如，在所述药物组合物中，所述经修饰的细胞和所述多特异性抗体可以放置在不同容器中。
例如，在所述药物组合物中，所述多特异性抗体可以包含采用生物工程技术制备纯化的包含第一靶向部分和第二靶向部分的蛋白质分子，所述多特异性抗体可以输入到血管内并与本申请所述融合蛋白和/或所述经修饰的细胞一起发挥作用。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的融合蛋白，一种或多种(例如，2个或以上)所述的分离的核酸分子，一个或多个(例如，2个或以上)所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
另一方面，本申请提供了所述的经修饰的细胞，和/或所述的一种或多种多特异性抗体在制备药物中的用途。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其可用于治疗肿瘤。
在某些情形中，所述肿瘤可包括血液瘤。
在某些情形中，所述肿瘤可包括实体瘤。
另一方面，本申请提供了一种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其可用于治疗与CD33的表达相关的疾病或病症。
在某些情形中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症可包括人髓系白血病。
在某些情形中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症可包括人急性髓系白血病(AML)。
另一方面，本申请提供了一种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所 述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与CD33的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人髓系白血病。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与HER2 的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种或多种所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，其用于治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与CD33的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，任一项所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人髓系白血病。
在某些实施方式中，所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与GD2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与HER2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的融合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的经修饰的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1构建基因工程载体
1.1首先，如图4，5，6所示，RRE序列插入到表达载体pWPXL-X的多克隆位点的上游，WPRE序列和cPPT序列插入到多克隆位点的下游，EF1A启动子插入到RRE序列与多克隆位点之间。
1.2除一般的表达载体组件外，基因工程载体主要的元件组成如下，通过基因合成的方法合成相应的序列：
I-1：CD19抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ；
I-2：CD22抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ；
I-3：CD20抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ；
I-4：CD33抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ。
其中，CD19抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CD22抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，CD20抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，CD33抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，共刺激分子4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，胞内信号传导结构域CD3ζ如SEQ ID NO：19所示。
1.3针对CD19、CD20、CD22、CD33设计第一抗体CD19 scFv(VH如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:30所示、VL如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:34所示)、CD20 scFv(VH如SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51所示、VL如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53所示)、CD22 scFv(VH如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61所示、VL如SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65所示)、CD33 scFv(VH如SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93所示、VL如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97所示)，针对GD2、B7H3、CD33、CD30、ERBB2设计第二抗体GD2 scFv(VH如SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:116、所示、VL如SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:120、所示)、B7H3scFv(VH如SEQ ID NO:125、 SEQ ID NO:133所示、VL如SEQ ID NO：SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:134所示)、CD33scFv(VH如SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93所示、VL如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97所示)、CD30 scFv(VH如SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:142所示、VL如SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:146所示)、ERBB2 scFv(VH如SEQ ID NO:150所示、VL如SEQ ID NO:154所示)，第一抗体跟第二抗体之间以铰链区(柔性氨基酸铰链区)相连，铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:158所示。通过基因合成的方法合成相应的序列，并进行序列组装，得到如下结构：
I-1-1：CD19 scFv-CD33 scFv；
I-1-2：CD19 scFv-GD2 scFv；
I-1-3：CD19 scFv-B7H3 scFv；
I-2-1：CD22 scFv-CD33 scFv；
I-2-2：CD22 scFv-GD2 scFv；
I-2-3：CD22 scFv-B7H3 scFv；
I-3-1：CD20 scFv-CD33 scFv；
I-3-2：CD20 scFv-GD2 scFv；
I-3-3：CD20 scFv-B7H3 scFv；
I-4-1：CD33 scFv-GD2 scFv；
I-4-2：CD33 scFv-B7H3 scFv；
1.4如图1所示，I-1～I-4和I-1-1～I-1-3、I-2-1～I-2-3、I-3-1～I-3-3、I-4-1～I-4-2可以分别位于不同的表达载体上进行表达。如图2所示，I-1可以通过剪切肽序列(SEQ ID NO：13)分别与I-1-1、I-1-2、I-1-3连接，I-2可以通过剪切肽序列分别与I-2-1、I-2-2、I-2-3连接，I-3可以通过剪切肽序列分别与I-3-1、I-3-2、I-3-3连接，I-4可以通过剪切肽序列分别与I-4-1、I-4-2连接，通过基因合成的方法合成相应的序列，得到如下结构：
II-1：CD19抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD19 scFv-CD33scFv；
II-2：CD19抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD19scFv-GD2scFv；
II-3：CD19抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD19scFv-B7H3scFv；
II-4：CD22抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD22scFv-CD33scFv；
II-5：CD22抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD22scFv-GD2scFv；
II-6：CD22抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD22scFv-B7H3scFv；
II-7：CD20抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD20scFv-CD33scFv；
II-8：CD20抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD20scFv-GD2scFv；
II-9：CD20抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD20scFv-B7H3scFv；
II-10：CD33抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD33scFv-GD2scFv；
II-11：CD33抗原序列-共刺激分子4-1BB-胞内信号传导结构域CD3ζ-2A序列-CD33scFv-B7H3scFv；
1.5通过设计合适的酶切位点，用所选的限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII分别双酶切I-1～I-4，I-1-1～I-1-3、I-2-1～I-2-3、I-3-1～I-3-3、I-4-1～I-4-2、II-1～II-11、表达载体pWPXL-x，将酶切后的I-1～I-4，I-1-1～I-1-3、I-2-1～I-2-3、I-3-1～I-3-3、I-4-1～I-4-2、II-1～II-11分别和表达载体相连，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，阳性克隆接种后过夜。
1.6细菌抽提质粒。
1.7酶切鉴定和送测序，表达载体与I-1结构酶切连接后得到的是基因工程载体CD19AgCAR backbone(I-1，如图4所示)，表达载体与I-1-1结构酶切连接后得到的是基因工程载体CD19AgCAR Double antibody(I-1-1，第二抗体为CD33 scFv，如图5所示)，表达载体与II-1结构酶切连接后得到的是基因工程载体CD19AgCAR(II-1，如图6所示)。
1.8表达载体与I-1结构酶切连接后得到的是基因工程载体CD19AgCAR backbone(I-1，如图4所示)，表达载体与I-1-2结构酶切连接后得到的是基因工程载体CD19AgCAR Double antibody(I-1-2，第二抗体为GD2 scFv)，表达载体与II-2结构酶切连接后得到的是基因工程载体CD19AgCAR(II-2)。
实施例2制备带有基因工程载体的病毒
2.1分别将基因工程载体CD19AgCAR backbone、CD19AgCAR Double antibody、CD19AgCAR和病毒包装质粒按照摩尔比1:1:1进行转染，质量总量6ug/10cm Dish，慢病毒转染293T细胞72h和96h后收集培养上清并进行病毒浓缩。
2.2通过实时定量PCR方法，按慢病毒的1ul:2ul:4ul:8ul:16ul:32ul的浓度梯度转染1x10 6个293T细胞进行病毒滴度的确定，最后分别得到带有基因工程载体CD19AgCAR backbone、CD19AgCAR Double antibody、CD19AgCAR的病毒。
实施例3病毒转染免疫细胞
3.1收集人外周血T淋巴细胞，进行上述病毒的转染，确保转染效率在20％以上，从中找到合适的MOI值用于临床治疗。需要指出的是，每批病毒均需要进行上述操作，确保临床试验的疗效稳定可靠。
3.2通过转染人外周血T细胞进行转染效率的检测，在第一抗体或者第二抗体scFv片段5`端添加了myc、flag、HA等蛋白标签(tag)，可采用相应的荧光标记抗体通过流式细胞检测技术对转染效率进行检测或采用实时定量PCR的方法进行转染效率的检测，病毒转染后的T细胞命名为AgCAR-T细胞。
3.3通过将病毒转染的ABC-T细胞与第二抗体相应抗原表达阳性的细胞株或者病人原代细胞进行1:4；1:10；和1:20的比例混合和共孵育，在0h、24h和48h后通过流式细胞技术进行体外杀伤检测，比较不同孵育时间的细胞杀伤效果并与对照病毒进行比较。
实施例4 AgCAR-T细胞的获得及扩增
4.1通过采集外周血0.5～2ml/Kg，磁珠分选获得CD3阳性T细胞或者CD56获得NK细胞，或者TCRγ/δ分选获得γ/δT细胞，加入CD3/CD28免疫磁珠进行刺激激活和病毒转染，继续给予CD3/CD28免疫磁珠、白介素-7和白介素-15进行体外扩增，一般7～8天可以扩增100倍以上，达到合适细胞数量后经洗涤回输人体。根据体内负荷进行调整，回输人体AgCAR-T细胞数量在2×10 5/Kg～2×10 7/Kg。
3.5基因工程载体制备的病毒，经体外转染后一般转染效率在20％以上，绝大部分在40～70％之间，如图7所示。图7中，依次是带有CD19AgCAR、CD19AgCAR backbone和CD19AgCAR Double antibody的病毒转染人T淋巴细胞后的转染效率。
实施例5与人髓系白血病细胞株HL60共孵育
将带有CD19AgCAR(II-1)、CD19AgCAR backbone(I-1)和CD19AgCAR Double antibody(I-1-1)的病毒转染人T淋巴细胞，并与人髓系白血病细胞株HL60进行共孵育，CD19-CART细胞和CD33-CART细胞分别与人髓系白血病细胞株HL60进行共孵育。之后，在共孵育0h和24h时进行共孵育体系中残留HL60细胞的流式细胞技术检测。如图8所示：A、F分别为带有CD19AgCAR(II-1)的慢病毒转染T细胞后与HL60细胞共孵育0h和24h的结果；B、G分别为带有CD19AgCAR backbone(I-1)的慢病毒转染T细胞后与HL60细胞共孵育0h和24h的结果；C、H分别带有CD19AgCAR Double antibody(I-1-1)的慢病毒转染T细胞后与HL60细胞共孵育0h和24h的结果；D、I分别为CD19-CART细胞与HL60细胞共孵育0h和24h的结果；E和J分别为CD33-CART细胞与HL60细胞共孵育0h和24h的结果。从上述结果可以看到，带有CD19AgCAR(II-1)的慢病毒转染T细胞后24h可以将靶细胞CD33阳性HL60细胞完全杀死，产生了与CD33-CART细胞相同的细胞毒作用，比带有CD19AgCAR backbone(I-1)的慢病毒转染T细胞、带有CD19AgCAR Double antibody(I-1-1)的慢病毒转染T细胞以及CD19-CART细胞对靶细胞的细胞毒作用显著增强。
实施例6与人神经母细胞瘤细胞株CHP134进行共孵育
将带有CD19AgCAR(II-2)、CD19AgCAR backbone(I-1)和CD19AgCAR Double antibody(I-1-2)的病毒转染人T淋巴细胞，并与人神经母细胞瘤细胞株CHP134进行共孵育，以及GD2-CART细胞与人神经母细胞瘤细胞株CHP134进行共孵育，并在共孵育0h、24h和48h时进行共孵育体系中残留CHP134细胞的流式细胞技术检测。如图9所示：A、B、C依次为带有CD19AgCAR(II-2)的慢病毒转染T细胞后与CHP134细胞共孵育0h、24h和48h的结果；D、E、F依次为带有CD19AgCAR backbone(I-1)的慢病毒转染T细胞后与CHP134细胞共孵育0h、24h和48h的结果；G、H、I依次为带有CD19AgCAR Double antibody(I-1-2)的慢病毒转染T细胞后与CHP134细胞共孵育0h、24h和48h的结果；J、K、L依次为GD2-CART细胞后与CHP134细胞共孵育0h、24h和48h的结果；从上述结果可以看到，带有CD19AgCAR(II-2)的慢病毒转染T细胞后24h和48h后可以将靶细GD2阳性神经母细胞瘤细胞株CHP134细胞完全杀死，产生了较GD2-CART细胞更好的细胞毒作用，同时也比带有CD19AgCAR backbone(I-1)的慢病毒转染T细胞、带有CD19AgCAR Double antibody(I-1-2)的慢病毒转染T细胞对靶细胞的细胞毒作用显著增强。
实施例7与人急性淋巴细胞白血病细胞株MV4；11进行共孵育
将带有CD22AgCAR(II-4)、CD20AgCAR(II-7)和CD19AgCAR(II-2)的病毒转染人T淋巴细胞，并与人急性淋巴细胞白血病细胞株MV4；11进行共孵育(MV4；11细胞株表达CD33和CD123，但不表达GD2)，并在共孵育0h、24h和48h时进行共孵育体系中残留MV4；11细胞的流式细胞技术检测。如图10所示：A、B、C依次为带有CD22AgCAR(II-4)的慢病毒转染T细胞后与MV4；11细胞共孵育0h、24h和48h的结果；D、E、F依次为带有CD20AgCAR(II-7)的慢病毒转染T细胞后与MV4；11细胞共孵育0h、24h和48h的结果；G、H、I依次为带有CD19AgCAR(II-2)的慢病毒转染T细胞后与MV4；11细胞共孵育0h、24h和48h的结果。从上述结果可以看到，带有CD22AgCAR(II-4)和CD20AgCAR(II-7)的慢病毒转染T细胞后24h和48h后可以将靶细胞MV4；11细胞完全杀死(CD123阳性细胞被杀死)，产生了较CD19AgCAR(II-2)细胞更好的细胞毒作用。
实施例8人体内CD19AgCAR-33(II-1)的疗效
针对一例AML患者，此患者的白血病细胞特异性表达CD33。将带有CD19AgCAR-33(II-1)病毒转染的该患者自身的T淋巴细胞制备成5*10 6/kg的CD19AgCAR-33T细胞经外周静脉注射到患者血管中(第0天)。治疗前患者骨髓微量残留病(MRD)检测为43.8％(说明图11A所示)，在CD19AgCAR-33T细胞输注后第14天检测，该患者的MRD降低到<0.1％(说明图11B所示)，达到了分子水平缓解，从而提示CD19AgCAR-33T细胞具有临床治疗价值。
实施例9人体内CD19AgCAR-B7H3(II-3)的疗效
针对一例神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)患者，此患者的肿瘤细胞特异性表达B7H3。将带有CD19AgCAR-B7H3(II-3)病毒转染的该患者自身的T淋巴细胞制备成6.3*10 6/kg的CD19AgCAR-B7H3T细胞经外周静脉注射到患者血管中(第0天)。治疗前患者骨髓中形态学可见5％的神经母细胞瘤细胞，在CD19AgCAR-B7H3T细胞输注后第25天检测，该患者骨髓中无形态学可见的肿瘤细胞，同时神经母细胞瘤的MRD也降低到<0.01％，达到了分子水平缓解。随后治疗后68天和半年时评估，均未见到肿瘤细胞。上述结果提示CD19AgCAR-B7H3T细胞具有临床治疗价值。
实施例10人体内CD20AgCAR-GD2(II-8)的疗效
针对一例神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)患者，此患者的肿瘤细胞特异性表达GD2。 将带有CD20AgCAR-GD2(II-8)病毒转染的该患者自身的T淋巴细胞制备成4.8*10 6/kg的CD20AgCAR-GD2T细胞经外周静脉注射到患者血管中(第0天)。治疗前患者骨髓中形态学可见2％的神经母细胞瘤细胞，在CD20AgCAR-GD2T细胞输注后第30天检测，该患者骨髓中无形态学可见的肿瘤细胞，最近随访到103天时患者的骨髓仍处于缓解状态。上述结果提示CD20AgCAR-GD2T细胞具有临床治疗价值。
实施例11采用19AgCAR-ROR1 T细胞、体外制备的双靶点抗体蛋白与人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH进行共孵育
将带有CD19AgCAR-ROR1的病毒转染人T淋巴细胞，并与人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH(表达ROR1蛋白靶点)进行共孵育，并将通过蛋白表达得到的CD19-ROR1双靶点抗体上清(说明图12A)按照不同剂量加到上述共孵育的培养体系中，并在共孵育0h、24h和48h时进行共孵育体系中残留SK-N-SH细胞的流式细胞技术检测。如图12B所示：随着加入表达双靶点抗体量的增加，在加入100ul上清后CD19AgCAR-ROR1 T细胞发挥了最好的靶向杀伤效果，随着加入抗体浓度的增加，杀伤活力反而下降，提示CD19AgCAR-ROR1 T细胞与上靶点抗体之间存在量效关系，可能与CD19AgCAR-ROR1 T细胞和SK-N-SH细胞上的靶点被封闭有关。该实验也进一步说明，本申请中提到的针对其它靶点的AgCAR结构同样具有相应地特异性的靶向细胞毒作用。

Claims (126)

  1. 融合蛋白，其包含：1)抗原或其功能活性片段；2)共刺激结构域；以及3)胞内信号转导结构域。
  2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗原或其功能活性片段包括与相应抗体或者相互作用分子结合后，可以引起免疫细胞激活的所有相关抗原或其功能片段。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原或其功能活性片段包括选自下组的抗原或其功能活性片段：CD45、CD56和CD58。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原或其功能活性片段包括肿瘤相关抗原或其功能活性片段。
  5. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括选自下组的抗原或其功能活性片段：CD19，CD20，CD22，CD33，CD38，CD123，CD7，BCMA和B7H3。
  6. 根据权利要求4-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括与B淋巴细胞发育相关的抗原。
  7. 根据权利要求4-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD19蛋白或其功能活性片段。
  8. 根据权利要求4-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD20蛋白或其功能活性片段。
  9. 根据权利要求4-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD22蛋白或其功能活性片段。
  10. 根据权利要求4-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD33蛋白或其功能活性片段。
  11. 根据权利要求4-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包括CD38蛋白或其功能活性片段。
  12. 根据权利要求4-11中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤相关抗原或其功能活性片段包含SEQ ID NO:2、4、6、8和10中任一项所示的氨基酸序列。
  13. 根据权利要求1-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包含源自选自下组蛋白的共刺激结构域或其组合：4-1BB、CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包括源自4-1BB的共刺激结构域。
  15. 根据权利要求1-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
  16. 根据权利要求1-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12。
  17. 根据权利要求1-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包括源自CD3ζ的胞内信号传导结构域。
  18. 根据权利要求1-17中任一项所述的融合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
  19. 根据权利要求1-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原或其功能活性片段的C端与所述共刺激结构域的N端直接或间接地连接。
  20. 根据权利要求1-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述共刺激结构域的C端与所述胞内信号传导结构域的N端直接或间接地连接。
  21. 根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
  22. 分离的核酸分子，其编码权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白。
  23. 根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:21所示的核酸序列。
  24. 载体，其包含权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子。
  25. 根据权利要求24所述的载体，其包括病毒载体。
  26. 根据权利要求24-25中任一项所述的载体，其包括慢病毒载体。
  27. 经修饰的细胞，其包含权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的核酸分子和/或权利要求24-26中任一项所述的载体。
  28. 根据权利要求27所述的经修饰的细胞，其中所述细胞包括免疫细胞。
  29. 根据权利要求27-28中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞包括免疫效应细胞。
  30. 根据权利要求29所述的经修饰的细胞，其中所述免疫效应细胞选自下组：T细胞、巨噬细胞 自然杀伤细胞(NK细胞)和NKT细胞。
  31. 根据权利要求27-30中任一项所述的经修饰的细胞，其包括T细胞或 细胞。
  32. 根据权利要求27-31中任一项所述的经修饰的细胞，其包括NK细胞或NKT细胞。
  33. 根据权利要求27-32中任一项所述的经修饰的细胞，其还包含和/或表达一种或多种多特异性抗体。
  34. 根据权利要求33所述的经修饰的细胞，其中所述多特异性抗体包含第一靶向部分和第二靶向部分。
  35. 根据权利要求34所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分结合所述融合蛋白中所述抗原或其功能活性片段。
  36. 根据权利要求34-35中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分能够特异性结合所述融合蛋白中所述肿瘤相关抗原。
  37. 根据权利要求34-36中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分所靶向的肿瘤相关抗原选自下组蛋白或其功能活性片段：CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD123、CD7、BCMA和B7H3。
  38. 根据权利要求34-37中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第二靶向部分能够特异性结合肿瘤相关抗原。
  39. 根据权利要求34-38中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第二靶向部分所靶向的肿瘤相关抗原选自下组蛋白或其功能活性片段：GD2、DLL1、DLL3、ROR1、GPC3、HER2、VEGFA、CD1a、CD33、B7H3、CD138、BCMA、EGFRVIII和ERBB2。
  40. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段。
  41. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
  42. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD19蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
  43. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段。
  44. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
  45. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD22蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
  46. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD20蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段。
  47. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD20蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
  48. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD20蛋白或其功能活性片段，且第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
  49. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别GD2蛋白或其功能活性片段。
  50. 根据权利要求34-39中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分识别CD33蛋白或其功能活性片段，且所述第二靶向部分识别B7H3蛋白或其功能活性片段。
  51. 根据权利要求34-50中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:94中任一项所示的氨基酸序列。
  52. 根据权利要求51所述的经修饰的细胞，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:95中任一项所示的氨基酸序列。
  53. 根据权利要求51-52中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:96中任一项所示的氨基酸序列。
  54. 根据权利要求51-53中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
    a)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24和HCDR3：SEQ ID NO:25；
    b)HCDR1：SEQ ID NO:31，HCDR2：SEQ ID NO:32和HCDR3：SEQ ID NO:33；
    c)HCDR1：SEQ ID NO:31，HCDR2：SEQ ID NO:32和HCDR3：SEQ ID NO:33；
    d)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:41；
    e)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:47；
    f)HCDR1：SEQ ID NO:39，HCDR2：SEQ ID NO:40和HCDR3：SEQ ID NO:52；
    g)HCDR1：SEQ ID NO:55，HCDR2：SEQ ID NO:56和HCDR3：SEQ ID NO:57；
    h)HCDR1：SEQ ID NO:62，HCDR2：SEQ ID NO:63和HCDR3：SEQ ID NO:64；
    i)HCDR1：SEQ ID NO:70，HCDR2：SEQ ID NO:71和HCDR3：SEQ ID NO:72；
    j)HCDR1：SEQ ID NO:78，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:80；
    k)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
    l)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
    m)HCDR1：SEQ ID NO:94，HCDR2：SEQ ID NO:95和HCDR3：SEQ ID NO:96。
  55. 根据权利要求51-54中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述VH包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:93中任一项所示的氨基酸序列。
  56. 根据权利要求34-55中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:98中任一项所示的氨基酸序列。
  57. 根据权利要求56所述的经修饰的细胞，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:99中任一项所示的氨基酸序列。
  58. 根据权利要求56-57中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:100中任一项所示的氨基酸序列。
  59. 根据权利要求56-58中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
    a)LCDR1：SEQ ID NO:27，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:29；
    b)LCDR1：SEQ ID NO:35，LCDR2：SEQ ID NO:36和LCDR3：SEQ ID NO:37；
    c)LCDR1：SEQ ID NO:35，LCDR2：SEQ ID NO:36和LCDR3：SEQ ID NO:37；
    d)LCDR1：SEQ ID NO:43，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:45；
    e)LCDR1：SEQ ID NO:49，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:50；
    f)LCDR1：SEQ ID NO:49，LCDR2：SEQ ID NO:44和LCDR3：SEQ ID NO:45；
    g)LCDR1：SEQ ID NO:59，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:60；
    h)LCDR1：SEQ ID NO:66，LCDR2：SEQ ID NO:67和LCDR3：SEQ ID NO:68；
    i)LCDR1：SEQ ID NO:74，LCDR2：SEQ ID NO:75和LCDR3：SEQ ID NO:76；
    j)LCDR1：SEQ ID NO:82，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:83；
    k)LCDR1：SEQ ID NO:88，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
    l)LCDR1：SEQ ID NO:92，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
    m)LCDR1：SEQ ID NO:98，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:100。
  60. 根据权利要求56-59中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述VL包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:97中任一项所示的氨基酸序列。
  61. 根据权利要求34-60中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第二靶向部分包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:151中任一项所示的氨基酸序列。
  62. 根据权利要求61所述的经修饰的细胞，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:152中任一项所示的氨基酸序列。
  63. 根据权利要求61-62中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:153中任一项所示的氨基酸序列。
  64. 根据权利要求61-63中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
    a)HCDR1：SEQ ID NO:70，HCDR2：SEQ ID NO:71和HCDR3：SEQ ID NO:72；
    b)HCDR1：SEQ ID NO:78，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:80；
    c)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
    d)HCDR1：SEQ ID NO:85，HCDR2：SEQ ID NO:79和HCDR3：SEQ ID NO:86；
    e)HCDR1：SEQ ID NO:94，HCDR2：SEQ ID NO:95和HCDR3：SEQ ID NO:96；
    f)HCDR1：SEQ ID NO:102，HCDR2：SEQ ID NO:103和HCDR3：SEQ ID NO:104；
    g)HCDR1：SEQ ID NO:102，HCDR2：SEQ ID NO:103和HCDR3：SEQ ID NO:104；
    h)HCDR1：SEQ ID NO:110，HCDR2：SEQ ID NO:111和HCDR3：SEQ ID NO:112；
    i)HCDR1：SEQ ID NO:117，HCDR2：SEQ ID NO:118和HCDR3：SEQ ID NO:119；
    j)HCDR1：SEQ ID NO:126，HCDR2：SEQ ID NO:127和HCDR3：SEQ ID NO:128；
    k)HCDR1：SEQ ID NO:126，HCDR2：SEQ ID NO:127和HCDR3：SEQ ID NO:128；
    l)HCDR1：SEQ ID NO:136，HCDR2：SEQ ID NO:137和HCDR3：SEQ ID NO:138；
    m)HCDR1：SEQ ID NO:143，HCDR2：SEQ ID NO:144和HCDR3：SEQ ID NO:145；
    n)HCDR1：SEQ ID NO:151，HCDR2：SEQ ID NO:152和HCDR3：SEQ ID NO:153。
  65. 根据权利要求61-64中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述VH包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:150中任一项所示的氨基酸序列。
  66. 根据权利要求34-65中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第二靶向部分包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:155中任一项所示的氨基酸序列。
  67. 根据权利要求66所述的经修饰的细胞，其中所述LCDR2包含SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:156中任一项所示的氨基酸序列。
  68. 根据权利要求66-67中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:157中任一项所示的氨基酸序列。
  69. 根据权利要求66-68中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
    a)LCDR1：SEQ ID NO:74，LCDR2：SEQ ID NO:75和LCDR3：SEQ ID NO:76；
    b)LCDR1：SEQ ID NO:82，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:83；
    c)LCDR1：SEQ ID NO:88，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
    d)LCDR1：SEQ ID NO:92，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:89；
    e)LCDR1：SEQ ID NO:98，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:100；
    f)LCDR1：SEQ ID NO:106，LCDR2：SEQ ID NO:107和LCDR3：SEQ ID NO:108；
    g)LCDR1：SEQ ID NO:106，LCDR2：SEQ ID NO:107和LCDR3：SEQ ID NO:108；
    h)LCDR1：SEQ ID NO:114，LCDR2：SEQ ID NO:99和LCDR3：SEQ ID NO:115；
    i)LCDR1：SEQ ID NO:121，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:122；
    j)LCDR1：SEQ ID NO:130，LCDR2：SEQ ID NO:131和LCDR3：SEQ ID NO:132；
    k)LCDR1：SEQ ID NO:130，LCDR2：SEQ ID NO:131和LCDR3：SEQ ID NO:132；
    l)LCDR1：SEQ ID NO:140，LCDR2：SEQ ID NO:28和LCDR3：SEQ ID NO:141；
    m)LCDR1：SEQ ID NO:147，LCDR2：SEQ ID NO:148和LCDR3：SEQ ID NO:149；
    n)LCDR1：SEQ ID NO:155，LCDR2：SEQ ID NO:156和LCDR3：SEQ ID NO:157。
  70. 根据权利要求66-69中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述VL包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:154中任一项所示的氨基酸序列。
  71. 根据权利要求34-70中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述靶向部分包括VHH、scFv、Fab、dAb和/或衍生蛋白结构。
  72. 根据权利要求34-71中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述靶向部分选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
  73. 根据权利要求34-72中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第一靶向部分包括scFv。
  74. 根据权利要求34-73中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述第二靶向部分包括scFv。
  75. 根据权利要求34-74中任一项所述的经修饰的细胞，其中在所述多特异性抗体中，所述第一靶向部分与第二靶向部分在框内融合。
  76. 根据权利要求34-75中任一项所述的经修饰的细胞，其中在所述多特异性抗体中，所述第一靶向部分通过铰链区与所述第二靶向部分连接。
  77. 根据权利要求76所述的经修饰的细胞，其中所述铰链区包含源自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、和4-1BB。
  78. 根据权利要求76-77中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述铰链区包含SEQ ID NO：17中任一项所示的氨基酸序列。
  79. 根据权利要求27-78中任一项所述的经修饰的细胞，所述经修饰的细胞包含和/或表达编码权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白的核酸分子和/或编码权利要求33-78中任一项 所述的多特异性抗体的核酸分子。
  80. 根据权利要求79所述的经修饰的细胞，其中所述编码融合蛋白的核酸分子和编码所述多特异性抗体的核酸分子位于不同的载体上。
  81. 根据权利要求79-80中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述编码融合蛋白的核酸分子和编码所述多特异性抗体的核酸分子位于同一载体上。
  82. 根据权利要求79-81中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述编码融合蛋白的核酸分子通过编码剪切肽的序列与所述编码多特异性抗体的核酸分子连接。
  83. 根据权利要求82所述的经修饰的细胞，其中所述编码剪切肽的核酸序列选自下组：P2A序列、T2A序列、F2A序列、E2A序列、BmCPV2A序列和BmIFV2A序列。
  84. 根据权利要求82-83中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述剪切肽序列包括P2A序列。
  85. 根据权利要求82-84中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述剪切肽序列包括T2A序列。
  86. 根据权利要求82-85中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述剪切肽序列包含SEQ ID NO:13-16中任一项所示的核酸序列。
  87. 根据权利要求33-86中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述融合蛋白与所述多特异性抗体的表达量不同。
  88. 药物组合物，其包含权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求33-78中任一项所述的一种或多种多特异性抗体。
  89. 权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞和/或权利要求33-78中任一项所述的一种或多种多特异性抗体在制备药物中的用途。
  90. 药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
  91. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。
  92. 根据权利要求91所述的用途，其中所述肿瘤包括血液瘤。
  93. 根据权利要求91所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
  94. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物，其用于治疗与CD33的表达相关的 疾病或病症。
  95. 根据权利要求94所述的用途，其中所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
  96. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物，其用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
  97. 根据权利要求96所述的用途，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
  98. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物，其用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
  99. 根据权利要求98所述的用途，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
  100. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物，其用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
  101. 根据权利要求100所述的用途，其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
  102. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物，其用于治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症。
  103. 根据权利要求102所述的用途，其中所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
  104. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药 物用于治疗与CD33的表达相关的疾病或病症。
  105. 根据权利要求104所述的用途，其中所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
  106. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与GD2的表达相关的疾病或病症。
  107. 根据权利要求106所述的用途，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
  108. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
  109. 根据权利要求108所述的用途，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
  110. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与HER2的表达相关的疾病或病症。
  111. 根据权利要求110中所述的用途，其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
  112. 权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，其用于治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症。
  113. 根据权利要求112所述的用途，其中所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺癌。
  114. 预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求 88和90中任一项所述的药物组合物。
  115. 预防和/或治疗与CD33的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物。
  116. 根据权利要求115所述的方法，其中所述与CD33的表达相关的疾病或病症包括人急性髓系白血病(AML)。
  117. 预防和/或治疗与GD2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物。
  118. 根据权利要求117所述的方法，其中所述与GD2的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
  119. 预防和/或治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物。
  120. 根据权利要求119所述的方法，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括神经母细胞瘤。
  121. 预防和/或治疗与HER2的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物。
  122. 根据权利要求121中所述的方法，其中所述与HER2的表达相关的疾病或病症包括乳腺癌。
  123. 预防和/或治疗与DLL1的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，权利要求22-23中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求24-26中任一项所述的载体，权利要求27-87中任一项所述的经修饰的细胞，和/或权利要求88和90中任一项所述的药物组合物。
  124. 根据权利要求123所述的用途，其中所述与DLL1的表达相关的疾病或病症包括肺 癌。
  125. 根据权利要求88所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体包含采用生物工程技术制备纯化的包含第一靶向部分和第二靶向部分的蛋白质分子。
  126. 根据权利要求88和125中任一项所述的药物组合物，其中所述多特异性抗体被输入到血管内。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015524255A (ja) * 2012-07-13 2015-08-24 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 二重特異性抗体を共導入することによってｃａｒｔ細胞の活性を強化する方法
UY35468A (es) * 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
AU2014337367B2 (en) * 2013-10-15 2020-04-30 The Scripps Research Institute Peptidic chimeric antigen receptor T cell switches and uses thereof
JP7372728B2 (ja) * 2014-10-31 2023-11-01 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 改変ｔ細胞に関する方法および組成物
WO2016154621A1 (en) * 2015-03-26 2016-09-29 The California Institute For Biomedical Research SWITCHABLE NON-scFv CHIMERIC RECEPTORS, SWITCHES, AND USES THEREOF
EP3411065B1 (en) * 2016-02-05 2021-03-31 Orionis Biosciences BV Clec9a binding agents

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118652340A (zh) * 2024-05-29 2024-09-17 深圳豪石生物科技有限公司 人源化抗体b09及其在制备car-t细胞中的应用

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