CN116635046A

CN116635046A - 在共培养系统中产生巨核细胞和血小板

Info

Publication number: CN116635046A
Application number: CN202180078592.7A
Authority: CN
Inventors: E·施帕尔; K·雷兹瓦尼; B·库玛尔; M·曼德特; V·阿夫沙尔-哈尔根; R·巴萨尔
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2023-08-22
Also published as: EP4228663A1; JP2023545499A; AU2021361241A1; EP4228663A4; US20230383257A1; WO2022082224A1; CA3198833A1

Abstract

本公开内容的实施方案包括用于产生用于有此需要的接受者个体的巨核细胞和血小板的系统、方法和组合物。巨核细胞和血小板是在MSC和CD34+细胞在包含干细胞因子、血小板生成素和IL‑6的培养基中共培养后产生的，并且其中在具体的实施方案中，至少CD34+细胞在β‑2‑微球蛋白基因组基因座处具有HLA‑E的敲入。在一些情况下，使用ROCK抑制剂。

Description

在共培养系统中产生巨核细胞和血小板

本申请要求2020年10月15日提交的美国临时专利申请序列号63/092,024的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开内容的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、细胞培养和医学的领域。

背景

美国医院每年输注超过200万个血小板单位以治疗血小板减少症患者[1、2]。对于例如接受化疗、接受手术或患有任何原因的潜在血小板减少症的患者对单采血液成分术衍生的血小板产品一直有持续的需求。目前在美国的COVID-19流行病爆发也是另一个主要问题，并且已导致了意外的过度使用，导致血小板短缺。血小板具有很短的储存寿命，并且医院依赖供体来补充输血单位供应[3]。为了克服对供体的依赖，需要开发不依赖供体并且易于获得的血小板，包括用于输血单位。本公开内容满足了这种需要。

概述

本公开内容的实施方案涉及促进巨核细胞和血小板产生的系统、方法和组合物。在具体的实施方案中，在本公开内容的方法中产生的巨核细胞产生血小板。具体的实施方案包括特定的试剂、条件、时间安排和/或某些细胞操作以产生所需的细胞。本公开内容的实施方案包括系统和方法，其中事件和特定的、有意的步骤的线性序列导致所需细胞(包括巨核细胞和/或血小板)的扩增和分化和收集。本文公开的系统和方法利用具有促进特定细胞扩增和分化的所需试剂和条件的选定培养基。在一些实施方案中，该系统可以利用包括一系列步骤(或者，在一些情况下，对于同一系统中的不同非同步细胞群，可以基本上同时发生的步骤)的过程。无论如何，本公开内容提供了克服血小板输注相关难治性的通用措施。

在具体的实施方案中，本公开内容涉及至少两个细胞群的共培养，其允许特定的、所需的细胞群的扩增和分化。在具体实施方案中，系统和过程中的初始或至少早期步骤包括间充质干细胞(MSC)与CD34+细胞(包括富含CD34+的干细胞)的共培养。使用同种异体MSC有利于为干细胞扩增和分化提供卓越的支持。在具体实施方案中，本公开内容的系统和方法避免使用人工细胞外基质来防止共培养中干细胞的凋亡。在具体的实施方案中，MSC和CD34+细胞来源于特定来源，例如脐带血。任何CD34+细胞都可以通过阳性富集或阴性选择或两者来选择。

两个细胞群的共培养物可以经受包含一种或多种特定试剂的培养基，所述试剂包括干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和IL-6。在一些实施方案中，MSC和/或CD34+细胞已被操纵以表达一种或多种异源基因和/或抑制一种或多种内源基因的表达。在具体的实施方案中，MSC和/或CD34+细胞在扩增过程开始之前被如此操纵。在一些情况下，对MSC和/或CD34+细胞进行操纵以具有内源性Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)在MSC和/或CD34+细胞中的减少或完全抑制的表达。在特定情况下，内源性ROCK1(也被称为ROCK I、ROKβ、Rho激酶β或p160ROCK)和/或ROCK2(也被称为ROCK II、ROKα或Rho激酶)具有降低或完全抑制的在MSC和/或CD34+细胞中的表达。在一些实施方案中，过程中的任何步骤或时间点可以在用于细胞培养的培养基中使用一种或多种ROCK抑制剂；在特定情况下，在巨核细胞产生后，例如在血小板产生和/或收获期间使用一种或多种ROCK抑制剂。

在具体的实施方案中，MSC和/或CD34+细胞被操纵和/或暴露于允许由其产生的血小板在递送至需要其的个体(包括在各自MSC和/或CD34+细胞的原始来源方面同种异体的个体)时具有增强的功效的条件。至少在一些情况下，对MSC和/或CD34+细胞进行操纵，以使得它们的共培养最终产生的血小板不会在接受者个体中引起有害的免疫系统反应。至少在一些情况下，对MSC和/或CD34+细胞(包括来自脐带血的)进行操纵，以使得它们的共培养最终产生的血小板是HLA-I耗尽衍生的巨核细胞和血小板。在具体的实施方案中，MSC和/或CD34+细胞被操纵以使得它们的共培养最终产生的血小板不被接受者个体中的T细胞和/或NK细胞破坏。在具体的实施方案中，MSC和/或CD34+细胞被操纵以具有HLA-E的敲入。HLA-E敲入可以位于各自MSC和/或CD34+细胞的β2-微球蛋白(B2M)基因座的任何位置。敲入可能减少(包括完全耗尽)MSC和/或CD34+细胞的HLA-I(包括B2M)表达。MSC和/或CD34+细胞的任何操纵可以是或可以不是CRISPR-Cas9介导的。

在具体的实施方案中，该系统和方法包括全部在具有相同组成(并且在特定时间点可以改变或不改变)的培养基中和/或全部在相同容器中的扩增、分化和血小板生成，尽管在替代实施方案中，使用不同的容器和/或过程的不同步骤使用具有不同组成的培养基。在具体的实施方案中，该系统符合GMP级标准。至少在一些情况下，该系统和方法可以是无血清的，包括不含牛血清白蛋白或任何其他脂质补充剂。

本发明的MSC/CD34+干细胞共培养系统允许显著提高共培养系统中巨核细胞的扩增潜力，在具体实施方案中包括与起始细胞相比至少10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-、125-、150-、175-、200-、225-、250-、275-、300-、325-、350-、375-、400-、425-、450-、475-、500-、600-、700-、800-、900-或1000-倍或更多。

本公开内容的实施方案包括在离体系统中产生巨核细胞的方法，包括在产生巨核细胞的条件下在包含有效量的试剂的培养基的存在下在一个或多个容器或基质中共培养间充质干细胞(MSC)和CD34+细胞的步骤，所述试剂包含干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和白细胞介素6(IL-6)、基本上由其组成或由其组成，其中CD34+细胞已被操纵以包含HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)在CD34+细胞中β2-微球蛋白(β2M)的基因组基因座处的敲入，从而减少或消除CD34+细胞中HLA I类基因产物的表达。在一些实施方案中，该方法还包括增强血小板从巨核细胞的产生的步骤。至少大部分CD34+细胞和/或MSC可来源于脐带血、骨髓和/或脂肪组织。容器可进一步包含有效量的Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)的一种或多种抑制剂，例如Y27632、GSK269962、氮杂吲哚1、RKI-1447、GSK429286a、GSK180736a、法舒地尔、羟基法舒地尔或其组合，并且一种或多种ROCK抑制剂可以抑制ROCK1和/或ROCK2。

在具体的实施方案中，培养基包含或不包含一种或多种特定组分或具有特定浓度的某些组分。例如，培养基可以缺乏血清。在一些情况下，SCF的浓度在25-50ng/mL范围内；TPO的浓度范围为50-100ng/mL；和/或IL-6的浓度在50-100ng/mL的范围内。在具体实施方案中，SCF、TPO和IL-6的浓度基本上相同，例如为约50ng/mL。在特定情况下，培养基包含有效量的IL-1B。

在具体的实施方案中，该方法的至少一部分包括搅动一个或多个容器或基质。搅动可以发生在共培养过程中，包括MSC和CD34+细胞之间的共培养。搅动可在血小板的产生和/或收获期间发生。搅动可以或可以不以所需的角度发生，例如约8-9°。搅动可能足以在巨核细胞上诱导剪切应力。

在具体的实施方案中，巨核细胞被重复利用以产生额外的血小板。在某些方面，从培养基中获得细胞以分析它们的一种或多种巨核细胞标志物(例如CD42b、CD41a、CD61或其组合)的表达。可在共培养开始后约10-12天从培养基中获得细胞。可在共培养开始后约22-24天从培养基中获得细胞。在某些实施方案中，血小板是从培养基中获得的，包括多次从培养基中获得，并且可能需要在获得血小板之间一定的持续时间，例如约3天。在不同的血小板获得后，可以将它们合并。在任何情况下，都可以分析血小板，例如就聚集进行分析。

在某些实施方案中，该方法包括使MSC、CD34+细胞和/或巨核细胞经受有效量的CD34+细胞、MSC和/或巨核细胞的一种或多种岩藻糖基化手段的步骤。岩藻糖基化手段可包括一种或多种岩藻糖基转移酶以及GDP岩藻糖底物。培养基可包含有效量的一种或多种岩藻糖基转移酶。

在某些实施方案中，存在一种产生逃避宿主个体的有害免疫反应的血小板的方法，包括以下步骤：(a)在产生巨核细胞的条件下在包含有效量的试剂的培养基的存在下在一个或多个容器或基质中共培养间充质干细胞(MSC)和CD34+细胞，所述试剂包含SCF、TPO和IL-6、基本上由其组成或由其组成，其中CD34+细胞已被操纵以包含HLA-E在CD34+细胞中B2M的基因组基因座处的敲入，从而减少或消除CD34+细胞中HLA-I和/或B2M的表达，从而产生巨核细胞；(b)使巨核细胞经受合适的条件以产生有效量的血小板。在一些情况下，步骤(b)的合适的条件包括培养基中有效量的一种或多种ROCK抑制剂。(a)和(b)的步骤可以发生或可以不发生在相同容器或基质中。

在具体的实施方案中，有效量的本文涵盖的任何血小板被提供给有此需要的个体。在一些情况下，有此需要的人患有癌症；血小板减少症；骨髓疾病；血液病；贫血；再生障碍性贫血；冠状病毒感染；正在接受和/或将接受器官或骨髓移植；有外伤；是正在和/或将要接受心脏手术的个体；是烧伤患者；或其组合。

在某些实施方案中，存在治疗需要血小板的个体的方法，包括向个体施用有效量的通过本文涵盖的任何方法产生的血小板的步骤，其中个体患有癌症；血小板减少症；骨髓疾病；血液病；贫血；再生障碍性贫血；冠状病毒感染；正在接受和/或将接受器官或骨髓移植；有外伤；是正在和/或将要接受心脏手术的个体；是烧伤患者；或其组合。

在一些实施方案中，存在一种包含有效量的以下物质、由其组成或基本上由其组成的系统：MSC；CD34+细胞，或任选地，包含HLA-E在B2M基因组基因座处的敲入的CD34+细胞；容器或基质；培养基；SCF；TPO；IL-6；和任选地一种或多种ROCK抑制剂；以及任选地，一种或多种岩藻糖基转移酶。

上文相当宽泛地概述了本公开内容的特征和技术优点，以便可以更好地理解下面的详细描述。附加特征和优点将在下文中描述，其形成本文权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，所公开的构思和具体实施方案可以容易地用作修改或设计其他结构以实现与本设计相同的目的的基础。本领域的技术人员还应该认识到，这样的等同构造不脱离所附权利要求中阐述的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述中将更好地理解被认为是本文公开的设计(关于组织和操作方法两者)的特征的新颖特征连同进一步的目的和优点。然而，要明确理解的是，每幅图仅出于说明和描述的目的而提供，并不旨在作为对本公开内容的限制的定义。

附图简要说明

为了更完整地理解本公开内容，现在参考结合附图的以下描述。

图1A-1B。本公开内容的共培养系统的示意图。在特定情况下，存在一种在MSC共培养系统中从脐带血(CB)CD34+细胞产生成熟巨核细胞的策略，这可以在第23天(例如)转移到液体培养中再培养几天后发生，其中每2-3天收获一次巨核细胞(MK)/血小板。(图1B)使用CRISPR-Cas9系统产生β2-微球蛋白敲除(KO)CB CD34+细胞或早期巨核细胞祖细胞的策略的示意图，随后是图1A中用于产生基因编辑的β2-微球蛋白KO成熟巨核细胞和血小板的分化方案。

图2A-2E。CB衍生的CD34+衍生巨核细胞的扩增和表征。(图2A)在有和没有MSC的情况下扩增20天后成熟巨核细胞数量的倍数变化，柱上方的数字表示p值。(图2B)12天后CFU-Meg条件下CD34+细胞的5X AXIO VertA1图像分析(图2C)显示在Meg-CFU条件下以黑色三角形标记的前血小板样延伸的20X图像。(图2D)成熟巨核细胞的姬姆萨染色分析。(图2E)显示CD41a、CD42b和CD61表达的第20天扩增的巨核细胞的流式细胞术直方图。

图3A-3C。Rock抑制剂(Y27632)处理增加巨核细胞多倍体。(图3A)在5天内rock抑制剂处理成熟巨核细胞的策略的示意图。(图3B)显示经固定和透化的未处理或Y27632处理的巨核细胞中的碘化丙啶(PI)染色的直方图。(图3C)未处理组或Y27632处理组中多倍体(＝>8N)巨核细胞的百分比，柱上方的数字表示p值。

图4A-4E。Rock抑制剂处理增强血小板分泌和TRAP诱导的激活。(图4A)在有或没有rock抑制剂(Y27632)的情况下体外巨核细胞培养48小时的策略的示意图(图4B)48小时后的血小板数量，柱上方的数字表示p值。(图4C)Rock抑制剂处理后的MK细胞大小(图4D)TRAP刺激后血小板中的CD62P表达。(图4E)CD62P阳性活化血小板的数量，柱上方的数字表示p值。

图5A-5D。CB衍生的血小板在免疫缺陷小鼠中循环，并且离体扩增的巨核细胞可以植入各种生态位并在NOD scidγ小鼠(NSG)小鼠(一种免疫缺陷模型)中释放循环血小板。特别地，植入的CB巨核细胞可以释放循环血小板，并且在血液中检测到离体产生的CB功能性血小板。(图5A)巨核细胞移植和植入分析策略的示意图。(图5B)2个月时在NSG小鼠的不同器官中的巨核细胞植入。(图5C)显示移植后4周NSG小鼠的外周血中移植的CB巨核细胞衍生的血小板嵌合状态的等高线图分析。(图5D)在0、1、4和24小时时间点在小鼠血液中离体产生血小板嵌合状态。

图6A-6C。细胞的CRISPR-Cas9基因组编辑。图6A-6B显示了CRISPR-Cas9基因组编辑技术生成β2-微球蛋白敲除(KO)CB衍生的CD34+细胞的图形表示。脐带血(CB)CD34+细胞用Cas9蛋白和特异性靶向β2-微球蛋白(HLA-I基因)的单引导RNA(sgRNA；图6A)或双引导RNA、反式激活crRNA(tracrRNA)和crispr RNA(crRNA)杂合体(1:1比例，图6B)进行电穿孔。Cas9在目标基因中产生双链断裂(DSB)并去除基因组DNA片段，使细胞缺乏功能性HLA-I蛋白复合物。细胞最终将通过非同源末端连接(NHEJ)修复途径修复，该途径在没有供体DNA的情况下修复断裂末端，并导致编辑细胞中的缺失(插入缺失(indel))突变。这些CB B2M KOCD34+细胞功能齐全，并且可以扩增和分化为巨核细胞和血小板。(图6C)表示对照(仅Cas9，红色(向右的峰))和CRISPR-Cas9编辑的(蓝色(向左的峰)CD34+细胞中的B2M平均荧光强度(MFI)表达的基于流式细胞术的示意性直方图分析，确认在大约85％的CD34+细胞中的B2MKO。

图7A-7G。图7A。在对照和岩藻糖基化巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP，谱系-CD34+CD38+CD135-CD45RA-细胞)中的HECA-452抗体平均荧光强度(MFI)表达的基于流式细胞术的直方图分析表明岩藻糖基化MEP中的增加的岩藻糖基化水平。(p<0.0001，图7B)对照和岩藻糖基化HSC(谱系-CD34+CD38-CD90+CD45RA-细胞)中HECA-452抗体平均荧光强度(MFI)表达的基于流式细胞术的直方图分析表明外源性岩藻糖基化HSC后增加的岩藻糖基化水平(p＝0.0058，图7B)。(图7C)对照和岩藻糖基化巨核细胞(CD41a+CD42b+CD61+细胞)中HECA-452抗体平均荧光强度(MFI)直方图表达。(图7D-7E)CB巨核细胞注入NSG小鼠、BM归巢分析和对照和岩藻糖基化巨核细胞组中归巢的巨核细胞的百分比的示意图。(图7F-7G)将CB巨核细胞注射到亚致死照射(3Gy)的NSG小鼠中的策略和在对照和岩藻糖基化组中第7天血液循环CB衍生的血小板百分比测量。

详细描述

本公开内容涉及从至少两个起始细胞群的共培养产生所需细胞；该产生包括扩增和分化步骤，然后是收获所需的细胞。在具体的实施方案中，巨核细胞由包括至少干细胞作为起始群体之一的共培养系统产生。在至少一些情况下，共培养物中的一个或多个初始群体来自脐带血，包括人脐带血。

在具体的实施方案中，从人脐带血(CB)造血干细胞产生巨核细胞为输血医学提供了益处。本公开内容涉及在共培养系统中使用CB组织衍生的间充质干细胞(MSC)从CB大规模生成巨核细胞(MK)的原始方法。CB衍生的CD34+细胞与MSC共培养物的扩增和分化方案已在特定情况下进行了优化，以利用某些试剂、条件、时间等。在具体实施方案中，至少扩增和分化方案发生在补充有外源SCF、TPO、IL-6细胞因子(在一些情况下，各自浓度为50ng/mL)的无血清条件下。在具体的实施方案中，也可加入FLT3-L(10-25ng/ml)、IL-21(50-150ng/ml)、IL-9(40-100ng/ml)和/或IL-11(10-100ng/ml)细胞因子以进一步增强巨核细胞的扩增和分化潜能。

所公开系统的MSC共培养有利于维持造血干细胞和分化巨核细胞的长期功能，因为它概括了骨髓微环境，其中所有细胞都非常接近。这些CB衍生的离体扩增细胞表达成熟巨核细胞谱系特异性标志物并分泌功能性血小板，例如在凝血酶受体激活肽(TRAP)刺激后表现出CD62P(P-选择素)表达。在某些实施方案中，在巨核细胞成熟、血小板分泌和/或其在使用一种或多种Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂(可商购，至少在一些情况下)后的活化特征谱的步骤进一步优化系统和方法。发明人在此证明，CB衍生的成熟巨核细胞及其分泌的血小板具有生理活性，可以在异种NSG小鼠模型中成功归巢和移植，并在体内维持长期的供体血小板嵌合状态。这些扩增的巨核细胞祖细胞为有此需要的个体(至少包括血小板减少症患者)提供短期血小板支持。

本文公开的系统和方法解决了当今输血医学中至少对于因HLA抗体致敏而患有顽固性血小板减少症的患者而言的一个主要问题[4、5]。该患者对血小板输注没有反应，即使是单一供体，并且他们也经常经历严重和致命的出血并发症[6,7]。本文公开的某些系统和方法提供了通过利用基因工程(例如成簇规则间隔的短回文重复/Cas9(CRISPR-Cas9)诱导的消融)(以减少或消融HLA基因(包括HLA-I复合分子β2-微球蛋白基因)的表达，导致宿主免疫系统无法识别，从而避免输血引起的血小板减少症)克服输注的血小板的同种免疫抗体诱导的排斥的策略。这允许输注CB衍生的巨核细胞祖细胞和血小板以逃避同种抗体介导的破坏并允许它们存活并提供强大的血小板支持。

I.巨核细胞和血小板的产生系统和方法

本公开内容涉及用于产生巨核细胞的系统和方法，从所述巨核细胞可以产生血小板。在一些实施方案中，系统和方法利用共培养系统来产生巨核细胞，并且在特定情况下，它们涉及用于任何合适的临床目的(包括治疗或预防)的大规模临床级成熟巨核细胞和血小板产物的产生。在系统和过程的初始步骤中使用的细胞来自需要血小板的个体的情况下，通过系统和方法产生的血小板可以以自体方式用于个体。在系统和过程的初始步骤中使用的细胞来自不是血小板的接受者的一个或多个个体的情况下，通过系统和方法产生的血小板可用于同种异体接受者；在这种情况下，产生的血小板可以以现成的方式使用。现成的血小板在使用前可以或可以不被适当地储存。

本发明公开的系统和方法可以产生大量(例如，至少10⁹、10¹⁰、10¹¹等，包括在特定情况下1-7x10¹¹)的成熟巨核细胞和功能性血小板，包括脐带血衍生的成熟巨核细胞和功能性血小板。这些成熟的巨核细胞始终分泌活性血小板并提供来自任何来源(例如来自HLA不匹配的脐带血来源)的血小板的可控来源。在本公开内容的具体实施方案中，由于一种或多种特定试剂、一种或多种特定条件、一种或多种特定时间控制和/或一种或多种特定的某些细胞操纵的有意选择，成熟巨核细胞保留持续产生功能性血小板的能力。在具体的实施方案中，在没有此类一种或多种特定试剂、一种或多种特定条件、一种或多种特定时间控制和/或一种或多种特定的某些细胞操纵的情况下，巨核细胞和/或由其产生的血小板的所需的活性和/或数量将无法实现。

在具体的实施方案中，系统和方法在初始或至少早期开始步骤中利用故意选择的(1)两个或更多个细胞群的组合用于与用于共培养的(2)试剂的特定组合(包括所有或至少其中一些是细胞因子)共培养；试剂的组合可以在培养基中提供并且外源地添加到培养基中。在替代实施方案中，起始细胞被操纵以表达一种或多种外源试剂，包括SCF、TPO和IL-6(其可被称为SCF+TPO+IL-6混合物)中的一种或多种。SCF+TPO+IL-6混合物可包含任何合适浓度的三种组分，其可为50ng/ml。与SCF+TPO+IL-6混合物单独地或与SCF+TPO+IL-6混合物的各种组合的其他细胞因子如IL-21(50-150ng/ml)、IL-11(10-100ng/ml)、IL-9(40-100ng/ml)、FLT3-L(10-25ng/ml)也可应用于具体的实施方案以用于巨核细胞的增强的扩增和分化。在具体的实施方案中，试剂的特定组合包含SCF、TPO和IL-6、基本上由其组成或由其组成。在具体的实施方案中，系统和方法还在组合中利用(3)一种或多种ROCK抑制剂。在具体的实施方案中，系统和方法还(4)使两个或更多个细胞群中的至少一个中的细胞被操纵，使得它们表达一种或多种外源或异源基因和/或被操纵以具有一种或多种内源基因在细胞内的敲低或敲除。外源或异源基因包含HLA 1类组织相容性抗原α链E(HLA-E)。在特定情况下，两个或更多个细胞群中的至少一个中的细胞被操纵为耗尽HLA-I和过表达HLA-E，其产生耗尽HLA-I且过表达HLA-E的巨核细胞和血小板。

在具体的实施方案中，系统和方法利用培养基用于细胞培养作为扩增和分化以及血小板产生步骤的一部分。在具体的实施方案中，该培养基包含SCF、TPO和IL-6、基本上由其组成或由其组成。SCF也被称为KIT配体、KL或钢铁因子，并且它是一种与c-KIT受体(CD117)结合的细胞因子。SCF可以作为跨膜蛋白和可溶性蛋白存在。在本发明的系统和方法中，可以使用任何合适浓度的SCF，但在特定情况下SCF的浓度为25-50ng/ml。在特定情况下，SCF的浓度为50ng/mL。TPO也被称为THPO和巨核细胞生长发育因子(MGDF)，并且在本发明的系统和方法中，可以使用任何合适浓度的TPO，但在特定情况下，TPO的浓度为50-100ng/ml。在特定情况下，TPO的浓度为50ng/mL。IL-6是一种用作促炎细胞因子的白细胞介素，并且在本发明的系统和方法中，可以使用任何合适浓度的IL-6，但在特定情况下，IL-6的浓度为50-100ng/ml。在特定情况下，IL-6的浓度为50ng/mL。在特定情况下，培养基中SCF、TPO和IL-6的浓度相同，而在其他情况下，SCF、TPO和IL-6的浓度不同。在SCF、TPO和IL-6的浓度不同的情况下，浓度水平可由所考虑的系统和方法中的一个或多个步骤确定。

在具体的实施方案中，系统和方法利用两个细胞群的组合作为最终产生大量功能性巨核细胞的共培养物。在特定情况下，两个细胞群中的一个或两个来源于特定来源，例如脐带血(CB)、骨髓和/或脂肪。至少在一些情况下，本发明的系统和方法从CB造血祖细胞产生大量巨核细胞。在具体实施方案中，初始细胞群之一包括CD34+细胞，包括CD34+干细胞，例如来自CB。在其他实施方案中，初始细胞群之一包括MSC，包括来自CB的MSC。一方面，本公开内容的系统通过使细胞非常靠近来模拟骨髓微环境中的自然过程。

在某些实施方案中，系统和方法产生HLA-I耗尽和HLA-E过表达的巨核细胞和血小板，因为它们是由HLA-I耗尽和HLA-E过表达的细胞产生的。在特定情况下，至少一些起始和一些(如果不是全部)产生的巨核细胞和血小板具有HLA-I敲除和HLA-E敲入，包括在细胞中HLA-I基因组基因座处的HLA-E敲入。这种操纵极大降低或消除了接受者个体中输血相关的移植物抗宿主病或任何输血难治性的风险。在特定情况下，任何合适的HLA-I基因都被敲除，但在特定情况下，HLA-I基因是β2-微球蛋白(β2M)。

图1提供了使用用于巨核细胞和血小板产生的系统的一个例子。一般而言，在具体的实施方案中，发生扩增和分化以产生成熟的巨核细胞，然后巨核细胞随后产生血小板。该方法的每一部分(扩增、分化和/或血小板产生)，或其中的一个或多个步骤，可以具有或可以不具有特定的持续时间、特定类型的培养基、特定数量的培养基变化、特定数量的添加到培养基的任何类型的添加剂，等等。在至少一些情况下，将MSC接种在基质上或容器的至少一个表面上。在具体的实施方案中，将MSC粘附于基底或容器表面。在至少一些情况下，一定百分比的基底表面或容器表面被粘附的MSC覆盖，例如为40-50％汇合。在适当的持续时间(例如1-2天)后，将CD34+细胞添加到系统中。这些CD34+细胞可以从商业上获得，或可以通过谱系细胞标志物的负耗尽、CD34+细胞的正选择或连同流式细胞术分选的CD34+细胞在系统中使用前的负/正选择获得。CD34+细胞可以是干细胞并且可以以特定范围或量(例如至少1-5x10⁶个细胞)添加到系统中。在具体的实施方案中，在共培养步骤之前和/或期间系统中的培养基是无血清的并且包含试剂(其为SCF、TPO和IL-6)、由其组成或基本上由其组成。

如图1所示，MSC与CD34+细胞的共培养步骤是其中CD34+扩增和巨核细胞分化的步骤。系统的这部分可能持续数天，包括约21-30天。在系统和方法的扩增和分化部分，可能有或可能没有培养基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种变化以提供包括任何种类的试剂(包括SCF、TPO和IL-6)的培养基的新的来源。在这些培养基变化过程中，SCF、TPO和IL-6的浓度可以是或可以不是第一步骤中的SCF、TPO和IL-6的相同浓度。在一些情况下，培养基在特定天数后发生变化，例如在1、2、3、4、5或更多天后，但在特定情况下，培养基在大约3天后发生变化。在一些情况下，在扩增和/或分化步骤期间，培养的细胞可以或可以不转移到不同的容器中，例如不同的烧瓶或生物反应器。在一些情况下，在扩增和分化步骤中，培养的细胞被重新接种到新鲜的MSC上。在方法期间的任何时间点，包括在扩增和/或分化步骤期间，可以获取和分析来自系统的样品，包括用于流式细胞术分析(例如，以分析指示巨核细胞的一种或多种标志物)和/或污染测试。分化的巨核细胞中的阳性标志物的例子包括CD41a、CD42B、CD61、其他谱系标志物，它们对CD34呈阴性但对CD11b、CD14、CD3、CD11c、CD15、CD19、CD56和CD235a呈阳性。即，但在具体的实施方案中，分化的巨核细胞祖细胞最初表达CD34，当它们变成巨核细胞时，它们失去CD34并获得其他标志物。

如图1所示，在共培养一定天数(例如23-27天)后或基于测试(包括例如通过流式细胞术和/或其他分析)指示巨核细胞的产生后，收获巨核细胞并储存或进一步培养和/或操纵以产生血小板。在替代实施方案中，巨核细胞保留在系统中并且从其收获血小板。在任何情况下，从巨核细胞成熟到足以产生血小板的时间点起以及血小板产生的持续时间可以是例如1-10天。在血小板收集阶段，系统可以在培养基中使用一种或多种ROCK抑制剂，例如Y27632、GSK269962、氮杂吲哚1、RKI-1447、GSK429286a、GSK180736a、法舒地尔、羟基法舒地尔或其组合。在一些情况下，一种或多种ROCK抑制剂在巨核细胞成熟之前、期间和/或之后添加。在一些情况下，多次收获血小板，并且多次收获之间的持续时间可以是任何合适的时间，例如彼此的1、2、3、4、5或更多天之内。收集的血小板可以或可以不与其他时间的收集物组合，并且血小板在使用前可以或可以不储存(例如用于现成的使用)。在一些情况下，IL-1β细胞因子用于促进血小板和/或TNF-α细胞因子的产生以增加血小板聚集特性。在一些实施方案中，血小板在收集后被转染或转化或转导。

在一些情况下，对于相同系统中的不同细胞群，步骤可以基本上同时发生。例如，该系统可以包括某些细胞的初始扩增以产生扩增的群体，并且来自扩增的群体的至少一些细胞然后经历分化，最终导致巨核细胞的产生。然后从巨核细胞产生血小板。然而，在这样的系统中，取决于时机和条件，可能存在在相同系统中经历扩增的细胞群，其基本上同时还包括经历分化的细胞群。

在具体的实施方案中，本公开内容的系统和方法产生与天然存在的巨核细胞和血小板相比经过遗传修饰的巨核细胞和血小板，并且这种遗传修饰的发生是因为巨核细胞和血小板来源于经过如此遗传修饰的细胞。在一些情况下，CD34+细胞和/或MSC被操纵以使得它们表达一种或多种外源基因和/或它们被操纵以具有细胞中的一种或多种内源基因的敲低或敲除。在特定情况下，例如如图1B所示，CD34+细胞和/或MSC被操纵以在一种或多种HLA-I基因(包括至少β2-微球蛋白(β2M))的基因座处包含HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)的敲入。敲入可以位于整个基因座的任何位置，包括跨越任何外显子、任何内含子或任何外显子-内含子连接点。敲入可以用HLA-E基因替换全部或部分基因座。敲入可引起导致不可转录和/或不可翻译的核酸序列的基因座的表达的破坏。在一些情况下，细胞的遗传操纵发生在共培养开始之后，而在其他情况下，细胞的遗传操纵发生在共培养之前。这种在β2M处的敲除在特定方面不从基因座产生β2M基因产物。在特定情况下，不使用HLA-E与β2M的融合作为在β2M处敲入的构建体。细胞的任何遗传操纵可以通过任何合适的方法进行，例如至少包括CRISPR。

在其中HLA-E在β2M处敲入的具体实例中，所产生的血小板是有利的，因为与通过缺乏在β2M处的HLA-E敲入的细胞所产生的血小板相比，它们在用于接受者时不会引发有害免疫系统反应或具有降低的引发有害免疫系统反应的能力。产生的血小板特别有用，因为(1)它们具有HLA-E的外源表达，这将为接受者个体中的天然NK细胞提供信号以使其不杀死血小板；和(2)它们缺乏β2M的表达，这将导致个体中的天然T细胞无法识别输注的血小板，从而避免它们被天然T细胞破坏。因此，血小板中的相同修饰(在β2M位点处的HLA-E敲入)允许血小板逃避NK细胞(通过基因/功能的获得)和T细胞(通过基因/功能丢失)。

在系统和方法的一些实施方案中，以任何方式搅动系统中的细胞。在特定情况下，细胞被搅动(例如摇动)一段时间并在该方法的特定部分(例如，在产生巨核细胞后产生血小板时，尽管在特定情况下存在细胞的培养物在扩增和/或分化过程中的的运动)进行细胞搅动。在一些情况下，搅动是在一定角度，例如8-180度。至少在特定情况下，以一定角度搅动细胞在巨核细胞上产生剪切应力以促进血小板从巨核细胞释放到培养基中。

在某些实施方案中，系统中的培养基包含用于巨核细胞的岩藻糖基化的一种或多种手段，例如通过包含一种或多种岩藻糖基转移酶。

在该方法的事件顺序中的任何点，可以适当地储存产生的细胞和/或生产中的细胞，例如在适当的温度下冷冻(例如，-80℃或在液氮中)。在一些情况下，巨核细胞在产生血小板之前被储存(例如冷冻)。

本公开内容的实施方案包括用于产生非供体依赖性血小板(包括用于血小板输注单元)的系统和方法，其中血小板由巨核细胞产生，所述巨核细胞衍生自在至少TPO、SCF和IL-6的存在下的MSC和CD34+细胞的共培养物。至少在一些情况下，该方法过程中的任何细胞都经过遗传操纵以耗尽HLA-I和过表达HLA-E。至少在一些情况下，利用一种或多种ROCK抑制剂以用于任何目的，包括用于提高从巨核细胞产生血小板的功效。

II.巨核细胞和血小板的使用方法

本公开内容的实施方案包括使用由本公开内容的系统和方法产生的巨核细胞和血小板的方法。在具体实施方案中，将来自产生的巨核细胞的有效量的血小板(例如，1x10⁸至1x10¹²)提供给有此需要的个体。将血小板施用于个体可以或可以不在血小板产生后的储存步骤之后进行。在具体的实施方案中，血小板是HLA-I耗尽的和HLA-E过表达的，这降低了接受者个体中有害免疫反应性的机会。在任何情况下，个体可能需要一次或多次血小板输注，包括当个体与供体是非HLA匹配的时。至少在一些情况下，个体可能或可能不接受血小板作为通用现成产品。在任何情况下，血小板可以是输血级的。

可以以任何合适的施用途径向任何需要血小板的个体提供有效量的血小板。在一些情况下，个体患有癌症；任何原因引起的血小板减少症(无论是否与癌症和/或癌症治疗有关，以及无论是否来自自身免疫或其他原因)；直接或间接导致减少的血小板数量的任何骨髓疾病或血液疾病；贫血；再生障碍性贫血；冠状病毒感染(包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS等)；器官或骨髓移植；外伤的受害者；接受心脏手术的个体；烧伤受害者；等等。在具体的实施方案中，提供血小板的医疗机构缺乏来自HLA匹配供体的血小板。在具体的实施方案中，个体对血小板的标准来源是难治性的并且可能患有难治性血小板减少症。

用通过本公开内容的系统和方法产生的血小板进行治疗的方法包括输血相关的移植物抗宿主病或任何输血难治性。至少在特定情况下，由于血小板是HLA-I耗尽和HLA-E过度表达的，个体具有输血相关移植物抗宿主病或任何输血难治性的减少的变化，允许NK细胞和T细胞避开血小板。本公开内容的方法和系统避免了出于任何原因有此需要的个体(包括至少对于接受手术、出于任何目的对于潜在血小板减少症、接受化疗、其组合等的个体)对单采血液成分术衍生的血小板产品的需求。

治疗个体癌症；任何原因引起的血小板减少症(无论是否与癌症和/或癌症治疗有关，以及无论是否来自自身免疫或其他原因)；直接或间接导致减少的血小板数量的任何骨髓疾病或血液疾病；贫血；再生障碍性贫血；冠状病毒感染(包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS等)；器官或骨髓移植；外伤的受害者；接受心脏手术的个体；烧伤受害者；等等的方法的实施方案，包括向个体提供有效量的血小板的步骤，其中血小板由本文涵盖的系统和方法产生。

在一些实施方案中，血小板，包括由本文涵盖的巨核细胞制备的血小板，被裂解以产生血小板裂解物。血小板裂解物可以局部使用。在一些实施方案中，血小板裂解物用于止血和/或伤口愈合。伤口可以是任何伤口，例如手术伤口、糖尿病性溃疡或烧伤。

实施例

包括以下实施例以证明本公开内容的具体的实施方案。本领域的技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表被发现在本公开内容的系统和方法的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为构成其实践的特定模式。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应该理解，在不脱离本公开内容的系统和方法的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

巨核细胞和血小板的产生

本实施例涉及在具有外源性细胞因子(SCF、TPO和IL-6)的混合物的无血清共培养系统中使用CB组织衍生的同种异体间充质干细胞(MSC)从脐带血(CB)大规模产生成熟巨核细胞(MK)的新颖、稳健的方法。可以使用来自其他来源的MSC，包括例如来自骨髓和/或脂肪组织的MSC。离体扩增和分化的这种策略产生了成熟的巨核细胞，其可以从终末分化的巨核细胞有效且连续地产生大量血小板(图1)。血小板可用于血小板输注装置。

这种离体扩增方法允许在20天的时间段内用MSC持续产生约300倍的扩增，并产生约3x10⁸-4x10⁸个巨核细胞(图2A)。这些20天扩增的成熟巨核细胞可以在每3天的每次收获中有效地离体分泌大约1x10¹⁰个功能性血小板。在具体的实施方案中，结合ROCK抑制剂和额外的作用，例如垂直/水平摇动以在巨核细胞上产生剪切应力，可以产生大约1-5x10¹¹个CB衍生的血小板。这些剂量可以为有此需要的个体(例如血小板减少症患者)提供血小板支持。

CB衍生的扩增的CD34+细胞具有巨核细胞分化潜能并且可以在基于胶原蛋白的Megacult-C巨核细胞集落形成(CFU-Meg)测定中形成巨核细胞集落，如通过CD41b/CD61+(GPIIb/IIIa受体复合物)染色所证实的(图2B)，并在培养物中产生血小板，如前血小板样结构形成所证实的(图2C)。通过姬姆萨染色和基于流式细胞术的CD42b、CD41a和CD61表达进一步验证扩增的多倍体巨核细胞，所有这些都证实了扩增的巨核细胞的纯度和成熟(图2D-2E)。这些数据证明了稳健分化为MK祖细胞，其具有指示它们具有提供血小板支持的能力的指标。

Rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂先前已被显示增加巨核细胞细胞骨架蛋白重塑，导致前血小板形成和增加的血小板从巨核细胞的脱落[8-10]。发明人表征了ROCK抑制剂对CB巨核细胞倍性变化、血小板分泌及其功能性的影响。

与对照巨核细胞相比，ROCK抑制剂处理组中存在分泌多倍体巨核细胞的血小板的显著增加的数量，证实其在终末成熟中的作用(图3)。此外，MK的经ROCK抑制剂处理的组在48小时内以剂量依赖性方式分泌更高数量的血小板(图4A-4C)，并表现出增强的凝血酶受体激活肽(TRAP)诱导的血小板激活和聚集，如以CD62P表达为特征。这指示CB血小板的功能概况的增强(图4D-4E)。几种不同的ROCK抑制剂可用于此过程，包括Y27632、KD025、GSK269962和氮杂吲哚1([9-12]。

接下来，发明人在全血细胞减少症的异种移植模型中评估了CB衍生的扩增的巨核细胞和血小板的体内功能。首先，通过亚致死(3.5Gy)辐射免疫缺陷NSG小鼠制备血小板减少的小鼠，然后在两个单独的实验中通过尾静脉途径输注7x10⁶个巨核细胞和1.3x10⁶个CB血小板/小鼠。离体产生的巨核细胞和血小板可以成功归巢并植入免疫缺陷小鼠的各种器官，并在小鼠血液中分泌循环血小板(图5A-5D)。

结合共培养系统使用ROCK抑制剂代表了一种用于在接受CB衍生的离体扩增的巨核细胞和血小板的个体中或在需要血小板输注的化疗患者中更快地恢复血小板计数的新的策略。除了药理学ROCK抑制外，还可以使用ROCK基因特异性单引导RNA(sgRNA)或双引导(crRNA:tracrRNA)RNA杂合体应用成簇规则间隔的短回文重复/Cas9(CRISPR-Cas9)技术以敲除ROCK基因以促进与未操纵的CB巨核细胞相比体外和体内增强的从编辑的巨核细胞的血小板释放。

在一些实施方案中，生物反应器可用于培养细胞。在特定情况下，使用GE WAVE生物反应器系统用于培养ROCK抑制剂诱导的终末分化的巨核细胞以释放血小板。该生物反应器能够使用2-20升的各种Cellbags^TM培养不同数量的细胞以用于小规模到大规模的血小板产生。

简而言之，将CRISPR-Cas9工程化的巨核细胞在Cellbag^TM生物反应器培养基悬浮液中于5％ CO₂中培养24-48小时。微载体用于提供一些锚固支持和剪切应力。可以连续监测生长中的巨核细胞的温度、细胞密度、pH水平和活力。生物反应器中随角度产生的摇摆运动足以诱导巨核细胞表面上的剪切应力以释放血小板到培养基中。

培养后，血小板可通过出口Clave^TM样品端口从Cellbag^TM生物反应器悬浮培养基中收获，并可使用基于Ficoll-Hypaque的密度梯度离心与巨核细胞进一步分离。使用凝血酶激活肽(TRAP)或ADP刺激聚集测定分析血小板的聚集特性，然后将其用于其他下游应用。活的巨核细胞可以重复使用，并且(在一些情况下)可以在Cellbag^TM中与额外的巨核细胞一起培养以持续产生血小板。IL-1B细胞因子也可用于悬浮培养基以释放额外的血小板。这种方法可以使用当今临床使用的许多其他生物反应器来执行。

许多接受血小板输注的癌症患者由于产生针对人类白细胞抗原I类(HLA-I)的同种抗体而出现难治性血小板减少症。在因HLA抗体而患有难治性血小板减少症的患者中，输注来自非HLA匹配供体的血小板无法增加血小板计数。因此，在没有HLA-I相容性供体的情况下，本文涵盖的CB衍生的血小板输注是此类患者的有效替代方法[13,14]。HLA-I耗尽的CB衍生的血小板是使用CRISPR-Cas9技术使用单引导RNA(sgRNA，图6A)或双引导CRISPRRNA(crRNA)和反式激活crispr RNA(tracrRNA，图6B)RNA杂合体以靶向CD34+细胞或早期巨核细胞祖细胞中的HLA-I复合分子β2-微球蛋白(β2M)来产生的。β2-微球蛋白基因外显子区域的Cas9诱导的切除产生HLA-1敲除(KO)或缺陷型CD34+细胞和CD34+衍生的巨核细胞和血小板。此外，使用CRISPR-Cas9/腺相关载体(CRISPR-Cas9/AAV)技术引入HLA-E基因敲入(过表达)并同时从CB CD34+细胞中的DNA基因座去除β2-微球蛋白(β2M)基因去除至少任何与免疫排斥相关的次要自然杀伤(NK)细胞[15]。

此外，在CB细胞中使用新型多重CRISPR-Cas9/AAV技术的ROCK、β2M KO和HLA-E敲入组合策略是用于高精度基因组工程化的高度特异性工具。在特定情况下，基因组编辑的CB巨核细胞接收者具有增强的血小板分泌和更快的血小板计数恢复，以减轻血小板减少症，同时避免了宿主免疫系统的排斥反应。

除了HLA基因的细胞表面表达的基于CRISPR-Cas9的基因工程化操纵之外，在具体的实施方案中，进行扩增的巨核细胞祖细胞或成熟巨核细胞的岩藻糖基化以提高它们的骨髓(BM)归巢潜力。

岩藻糖基化(糖基化的一种类型)由各种岩藻糖基转移酶(FT)酶进行并转移岩藻糖基团到蛋白质或碳水化合物部分上，导致从头获得E-选择蛋白结合潜力。细胞表面上的岩藻糖基化碳水化合物部分参与多种生理和病理过程，包括细胞粘附、白细胞运输和肿瘤转移(16-18)。发明人之前在首次人体临床试验中显示，通过使用短期α1,3-岩藻糖基转移酶(FT-VI)加上GDP-岩藻糖处理对CB CD34+祖细胞进行离体处理可以增加岩藻糖基化，并且其可以显著减少接受者患者(19)的中性粒细胞减少症和血小板减少症持续时间。

为了表征稳定状态下的岩藻糖基化水平，发明人进行了流式细胞术HECA-452抗体染色(其识别sLex/皮肤淋巴细胞抗原(CLA)，岩藻糖基化的选择素配体)以测量新鲜分离的CB衍生的造血干细胞(HSC，谱系-CD34+CD38-CD90+CD45RA-细胞)、定型的巨核细胞谱系、巨核细胞红系祖细胞(MEP，谱系-CD34+CD38+CD135-CD45RA-)和分化的巨核细胞(CD41a+CD42b+细胞)中细胞表面岩藻糖基化的水平。此外，用α1,3-岩藻糖基转移酶(FT-VI，0.025μg/ml)加上GDP-岩藻糖在37℃下进行30分钟的离体处理显著增加了HSC、MEP和巨核细胞中的岩藻糖基化水平(图7A-7C)。NSG骨髓归巢实验确定CB MK的表面岩藻糖基化修饰是否影响它们归巢到受辐射的小鼠骨髓生态位。简而言之，将5x10⁶个荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染料标记的、未经操纵的对照或体外岩藻糖基转移酶-VI(FT-VI)诱导的岩藻糖基化、扩增的CB巨核细胞注射到亚致死(3Gy)辐射的NSG小鼠中，并在移植后20小时通过流式细胞术进行骨髓归巢分析。在20小时进行的CFSE+巨核细胞(CD41a+CD42b+)在小鼠骨髓(胫骨和股骨衍生细胞)的总活Ter119-(小鼠RBC排除标志物)细胞部分中的百分比归巢分析，并观察到与非岩藻糖基化巨核细胞相比在岩藻糖基化的巨核细胞组中显著更高百分比的骨髓归巢(p<0.0001，图7D-7E)。类似地，进行了另一个巨核细胞尾静脉移植(5x10⁶/小鼠)实验，并测量了来自对照和岩藻糖基化MK接受者组的初始百分比循环血小板水平。在移植后第7天，在岩藻糖基化组小鼠中存在与对照MK小鼠组相比显著更高水平的循环血小板(p＝0.0058，图7F-7G)。这些数据证实，增加内源性岩藻糖基化水平将增强移植的巨核细胞的BM归巢，并将增强循环血小板反映的巨核细胞功能性。在具体实施方案中，在CB巨核细胞(FT-VII)上岩藻糖基转移酶-VI(FT-VI)或岩藻糖基转移酶-VII的使用分别针对两种基因、组合的两种基因以及与IL-21细胞因子组合的基于逆转录病毒、慢病毒的过表达载体的外源性FT-VI处理或过表达增强在各种生态位中的BM归巢和运输。使用FT-VI或FT-VII酶过表达的外源岩藻糖基化或内源组成型岩藻糖基化方法可以与ROCK抑制和CRISPR-Cas9产物相结合以生成独特的巨核细胞产物。至少在一些情况下，这些遗传修饰的MK及其血小板可用于用作现成的通用供体产品，并且是克服HLA-I相关同种免疫难治性并具有增强的BM归巢能力的有效策略。

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本文引用的所有专利和出版物均通过引用整体并入本文。本文引用的参考文献的完整引文在以下列表中提供，并且也通过引用整体并入本文。

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尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但是应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的设计的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围并不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质的组合物、手段、方法和步骤的具体的实施方案。正如本领域的普通技术人员将从本公开内容中容易地理解，可以根据本公开内容利用目前存在的或以后将被开发的执行与在此描述的相应实施方案基本上相同的功能或实现基本上相同的结果的过程、机器、制造、物质的组合物、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在将这样的过程、机器、制造、物质的组合物、装置、方法或步骤包括在它们的范围内。

Claims

1.一种在离体系统中产生巨核细胞的方法，包括在产生巨核细胞的条件下在包含有效量的试剂的培养基的存在下在一个或多个容器或基质中共培养间充质干细胞(MSC)和CD34+细胞的步骤，所述试剂包含干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和白细胞介素6(IL-6)、基本上由其组成或由其组成，其中CD34+细胞已被操纵以包含HLA I类组织相容性抗原α链E(HLA-E)在β2-微球蛋白(β2M)的基因组基因座处的敲入，从而减少或消除CD34+细胞中HLAI类基因产物的表达。

2.权利要求1的方法，还包括增强血小板从巨核细胞的产生的步骤。

3.权利要求1或2的方法，其中至少大部分CD34+细胞和/或MSC来源于脐带血、骨髓或脂肪组织。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述容器还包含有效量的Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)的一种或多种抑制剂。

5.权利要求4的方法，其中一种或多种ROCK抑制剂包括Y27632、GSK269962、氮杂吲哚1、RKI-1447、GSK429286a、GSK180736a、法舒地尔、羟基法舒地尔或其组合。

6.权利要求4或5的方法，其中一种或多种ROCK抑制剂抑制ROCK1和/或ROCK2。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基不含血清。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中SCF的浓度在25-50ng/mL的范围内。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中TPO的浓度在50-100ng/mL的范围内。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中IL-6的浓度在50-100ng/mL的范围内。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中SCF、TPO和IL-6的浓度基本上相同。

12.权利要求11的方法，其中所述浓度为50ng/mL。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中在共培养步骤期间和/或在增强血小板产生步骤期间，所述方法还包括搅动所述一个或多个容器或基质。

14.权利要求15的方法，其中所述搅动以所需的角度发生。

15.权利要求16的方法，其中所述角度为约8-9°。

16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述搅动足以在巨核细胞上诱导剪切应力。

17.权利要求2-16中任一项的方法，其中所述巨核细胞被重复利用以产生额外的血小板。

18.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基包含有效量的IL-1B。

19.权利要求1-18中任一项的方法，还包括从培养基中获得细胞样品以分析所述细胞样品的一种或多种巨核细胞标志物的表达的步骤。

20.权利要求19的方法，其中所述细胞样品是在共培养开始后约10-12天从培养基中获得的。

21.权利要求19的方法，其中所述细胞样品是在共培养开始后约22-24天从培养基中获得的。

22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述巨核细胞标志物选自CD42b、CD41a、CD61及其组合。

23.权利要求2-22中任一项的方法，其中血小板是从培养基中获得的。

24.权利要求23的方法，其中多次从培养基中获得血小板。

25.权利要求24的方法，其中至少连续两次获得血小板之间的持续时间为约3天。

26.权利要求2-25中任一项的方法，其中分析所述血小板。

27.权利要求26的方法，其中分析所述血小板的聚集。

28.前述权利要求中任一项的方法，还包括使MSC、CD34+细胞和/或巨核细胞经受有效量的CD34+细胞、MSC和/或巨核细胞的一种或多种岩藻糖基化手段的步骤。

29.权利要求28的方法，其中所述岩藻糖基化手段包括一种或多种岩藻糖基转移酶以及GDP岩藻糖底物。

30.前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养基包含有效量的一种或多种岩藻糖基转移酶。

31.一种产生逃避宿主个体的有害免疫反应的血小板的方法，包括以下步骤：

(a)在产生巨核细胞的条件下在包含有效量的试剂的培养基的存在下在一个或多个容器或基质中共培养间充质干细胞(MSC)和CD34+细胞，所述试剂包含SCF、TPO和IL-6、基本上由其组成或由其组成，其中CD34+细胞已被操纵以包含HLA-E在B2M的基因组基因座处的敲入，从而减少或消除CD34+细胞中B2M的表达，从而产生巨核细胞；和

(b)使巨核细胞经受合适的条件以产生有效量的血小板。

32.权利要求31的方法，其中步骤(b)的合适的条件包括培养基中有效量的一种或多种ROCK抑制剂。

33.权利要求31或32的方法，其中(a)和(b)在相同容器或基质中发生。

34.权利要求31-33中任一项的方法，其中将有效量的血小板提供给有此需要的宿主个体。

35.权利要求34的方法，其中有此需要的个体患有癌症；血小板减少症；骨髓疾病；血液病；贫血；再生障碍性贫血；冠状病毒感染；正在接受和/或将接受器官或骨髓移植；有外伤；是正在和/或将要接受心脏手术的个体；是烧伤患者；或其组合。

36.一种治疗需要血小板的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的通过权利要求2-30中任一项的方法产生的血小板的步骤，其中所述个体患有癌症；血小板减少症；骨髓疾病；血液病；贫血；再生障碍性贫血；冠状病毒感染；正在接受和/或将接受器官或骨髓移植；有外伤；是正在和/或将接受心脏手术的个体；是烧伤患者；或其组合。

37.一种包含有效量的以下物质、由其组成或基本上由其组成的系统：

MSC；

CD34+细胞，或任选地，包含HLA-E在B2M基因组基因座处的敲入的CD34+细胞；

容器或基质；

培养基；

SCF；

TPO；

IL-6；和任选地

一种或多种ROCK抑制剂；和任选地，

一种或多种岩藻糖基转移酶。