CN116622665A

CN116622665A - 一种生物催化生成o-糖苷的方法

Info

Publication number: CN116622665A
Application number: CN202310768089.5A
Authority: CN
Inventors: 王健博; 李敏
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2023-06-27
Filing date: 2023-06-27
Publication date: 2023-08-22

Abstract

本发明公开了一种生物催化生成O‑糖苷的方法，属于生物工程技术领域。通过蛋白质工程改造糖基转移酶以获得更高产率与区域选择性的突变体，所得的突变体ATD作为生物催化剂，以BP‑2，2,4‑二羟基苯丙酮，4‑氟‑2',4'‑二羟基二苯甲酮或者4'‑羟基苯庚酮作为受体底物，UDP‑葡萄糖作为供体底物，催化合成对应的O‑葡萄糖苷修饰产物，在糖苷类化合物的合成方面具有应用价值。

Description

一种生物催化生成O-糖苷的方法

技术领域

本发明涉及一种生物催化生成O-糖苷的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

糖苷是一类广泛存在于自然界的化合物，具有多样化的结构和广泛的生理活性。该类化合物的生物活性在很大程度由结构中的糖基基团所决定，因此开发能高效催化对应苷元糖基化的方法，是有机化学家和药物化学家所关注的热点。天然产物生物合成中的糖基化反应是由糖基转移酶(GTs；EC 2.4.)负责催化完成，该类酶催化糖分子从活化的糖基供体转移到底物受体，以一种简单的方式一步法直接构建糖基化产物，避免了化学法中冗长的保护-脱保护步骤，因此这一类酶作为强有力的糖基化工具受到了科学家的普遍认可。

大多数糖苷类天然产物为O-糖基化修饰产物，除此之外糖苷类化合物还包括C-、N-、S-糖基化产物。深入挖掘蛋白质内部进化导致的不同糖苷键形成的微妙差异，有助于扩大糖苷化合物的结构多样性，提升GTs作为生物催化剂的价值。利用蛋白质工程对现有的具有催化混杂性的糖基转移酶进行改造，实现各类糖基转移活性的完美切换，将提供一个具有高区域、立体和化学选择性的广利用度糖基化平台，实现广谱糖基化反应的精确调节，为开发新的生物活性分子或定制特定药理特性分子奠定基础。前期研究表明，MiCGT对结构不同的药物样支架和简单酚类化合物较易形成混杂的C-糖基和O-糖基产物，较大的限制了它的应用。

发明内容

本发明旨在通过蛋白质工程手段改造印度芒果(Mangifera indica)来源的糖基转移酶MiCGT，提高产能和化学选择性。本发明还提供了利用糖基转移酶突变体ATD(M148A/V190T/S121D)进行的生物催化合成不同O-糖苷的方法。该方法具有条件温和，环境友好，催化合成了不同化学选择性的糖基化产物等优点。

本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶MiCGT突变体ATD，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第148位甲硫氨酸突变为丙氨酸，第190位缬氨酸突变为苏氨酸，第121位丝氨酸突变为天冬氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶MiCGT突变体ATD的基因。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体包括pET系列载体、pRSF系列载体或pCDF系列载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达上述的糖基转移酶MiCGT突变体ATD。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pET系列的质粒为载体构建得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pET28a为载体，将编码所述突变体的基因与载体连接，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中重组表达所述的糖基转移酶突变体。

本发明的第五个目的是提供制备所述突变体的方法，将所述的基因工程菌发酵。

本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基为TB培养基，诱导剂为4-6g/Lα-乳糖一水合物或100-500μM IPTG，优选温度为18～25℃，转速160～200rpm，表达时长为18-20h。

本发明的一个实施方式中，接种时加入约0.05％葡萄糖。

本发明的一个实施方式中，所述基因工程菌的蛋白纯化，具体包括如下步骤：用预冷的离心机收集表达菌体，缓冲溶液洗两次，加入少量溶菌酶，液氮速冻，冰水浴解冻，超声破碎，高速离心，采用His-镍柱亲和纯化及脱盐柱脱盐。

本发明的第六个目的是提供应用本发明的糖基转移酶MiCGT突变体ATD合成多种O-糖苷的方法。

本发明的一种实施方式中，所述方法是于40-60mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲体系中，投入酶量为40-100μg/100μL或者对应全细胞(OD₆₀₀ _nm＝40-60)，pH＝7.0～8.0，30-40℃条件下，受体底物浓度为0.1-5mM，UDP-葡萄糖浓度0.1-10mM或者葡萄糖浓度2％，反应转速为800-1200rpm，反应时间为2-6h。

本发明的第七个目的是提供所述突变体，或所述基因，或所述表达载体，或所述基因工程菌，或制备所述突变体的方法，或所述合成多种O-糖苷的方法在食品、制药等领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明是使用来源于印度芒果(Mangifera indica)的糖基转移酶MiCGT生产芒果苷的基础上进行蛋白质工程改造，获得的突变体ATD(M148A/V190T/S121D)作为生物催化剂，催化BP-2、2,4-二羟基苯丙酮、4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮或4'-羟基苯庚酮生成对应的O-葡萄糖苷修饰产物。

(1)与野生酶MiCGT相比，以BP-2作为底物，突变体ATD(M148A/V190T/S121D)可得到高化学选择性的O-葡萄糖苷修饰产物，转化率从3％提高到91％，TON从136提高到9313，比酶活达到36858.8U/mg，并在50mL的反应体系中实现了高化学选择性的O-葡萄糖苷修饰产物的全细胞制备(53.6mg)。

(2)以2,4-二羟基苯丙酮作为底物，可得到高化学选择性的O-葡萄糖苷修饰产物，转化率从<3％提高到68％；以4-氟-2',4'二羟基二苯甲酮作为底物，可得到高化学选择性的O-葡萄糖苷修饰产物，转化率从<3％提高到91％；以4'-羟基苯庚酮作为底物，可得到高化学选择性的O-葡萄糖苷修饰产物，转化率从<3％提高到89％。

附图说明

图1：BP-2与糖基转移酶MiCGT的突变体ATD和野生型的反应混合液的HPLC色谱图(A)和柱形图(B)。

图2：BP-2与突变体ATD反应产生的产物1a和1b的一级质谱和二级质谱图；A)1a的MS；B)1a的MS2；C)1b的MS；D)1b的MS2。

图3：2,4-二羟基苯丙酮与糖基转移酶MiCGT的突变体ATD和野生型的反应混合液的HPLC色谱图(A)和柱形图(B)。

图4：2,4-二羟基苯丙酮与突变体ATD反应产生的反应产生的产物2a和2b的一级质谱和二级质谱图；A)2a的MS；B)2a的MS2；C)2b的MS；D)2b的MS2。

图5：4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮与糖基转移酶MiCGT的突变体ATD和野生型的反应混合液的HPLC色谱图(A)和柱形图(B)。

图6：4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮与突变体ATD反应产生的产物3a和3b的一级质谱和二级质谱图；A)3a的MS；B)3a的MS2；C)3b的MS；D)3b的MS2。

图7：4'-羟基苯庚酮与糖基转移酶MiCGT的突变体ATD和野生型的反应混合液的HPLC色谱图(A)和柱形图(B)。

图8：4'-羟基苯庚酮与突变体ATD反应产生的产物4a的一级质谱和二级质谱图；:A)4a的MS；B)4a的MS2。

具体实施方式

一种生物催化合成C-糖苷和O-糖苷的方法，具体实施步骤将在如下说明。

本发明中所采用的化学药品，均以商业途径购买获得。

实施例里采用的培养基配方如下：

固体培养基配方(1L)：酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂15g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。

LB培养基配方(1L)：酵母提取粉5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，用去离子水定容，高压蒸汽灭菌。

TB培养基配方(1L)：酵母提取物24g、蛋白胨12g、甘油4mL。加入900mL去离子水，使溶解后高压蒸汽灭菌，再加入100mL经同样灭菌操作后的0.17M KH₂PO₄/0.72MK₂HPO₄的溶液。(注：氯化钠购自阿拉丁，其余均购自生工生物有限公司)

产物分析方法：高效液相色谱及质谱分析。其相应液相检测方法为5-μm C18柱，PDA检测器，流动相为：A相(H₂O含0.1％甲酸)与B相(甲醇含0.1％甲酸)。梯度洗脱程序为：10-50％ B 8min，50％-85％ B 2min，85％ B 3min，80％-10％ B 7min。

转化数(Turnover Number，TON)定义：表示在一定温度、压力、反应物比例和一定的反应程度下，单位时间内、单位活性位点上发生催化反应的次数或生成目标产物的数目或消耗反应物的数目。

转化数(Turnover Number，TON)计算：在50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)中，分别加入3/4/5mM的底物和不同浓度的纯化好的MiCGT的突变体ATD，分别为0.1μM，0.2μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM在40℃反应24h，总体积为100μL。加入300μL的冰甲醇终止反应，通过液相色谱检测。计算TON，计算方法为转化的底物的量/酶的量。

糖基转移酶的酶活测定：在200μL反应缓冲液中进行糖基转移酶的活性测定，其中包括6mM UDP-葡萄糖，50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)和约1μg的突变体纯化酶。在50℃孵育5分钟，然后通过添加相同体积的甲醇终止反应，通过HPLC分析。一个单位的酶活性定义为1min消耗1μmol受体底物或生成1μmol产物的酶量。

蛋白质含量检测：使用Nano-300微量分光光度计测定280nm处蛋白的吸收。

比酶活计算：比活＝1U·(mg蛋白质)^-1＝1μmol·(min·mg蛋白质)^-1。

转化率的计算：转化率＝已转化的原料的量/原料的总量*100％。

实施例1：糖基转移酶MiCGT蛋白质工程改造

(1)突变体的设计和制备：

以序列如SEQ ID NO.2所示的基因为模板，设计引物，对位点S121，M148和V190突变，获得ATD(M148A/V190T/S121D)突变体的编码基因。

表1ATD突变引物

(2)重组质粒的构建：

使用商品化VazymeMultiS One Step Cloning Kit试剂盒将步骤(1)制备的突变体的编码基因与pET28a载体连接，获得重组载体pET28a-MiCGT^mutant，具体步骤见说明书。使用相同方法将SEQ ID NO.2所示野生型基因与pET28a载体连接，获得重组载体pET28a-MiCGT。

实施例2：糖基转移酶MiCGT突变体ATD的表达纯化

把实施例1构建的重组载体pET28a-MiCGT^mutant和pET28a-MiCGT分别通过化学转化到感受态细胞Rosetta-gami B(DE3)中，取适量菌液涂在含卡那霉素和氯霉素的固体培养基上，37℃下培养12-15h。分别挑一个含转化重组质粒的单菌落到LB培养基中(含50μg mL^-1卡那霉素和35μg mL^-1氯霉素)，于37℃培养过夜。分别取1％ LB培养物接种到TB培养基中(含50μg mL^-1卡那霉素、35μg mL^-1氯霉素、50μg mL^-1和过膜除菌的0.05％葡萄糖)，随后在37℃下培养至生长对数期，即OD600值为0.6～0.8，加入5g/Lα-乳糖一水合物作为诱导剂，转到25℃160rpm条件下进行表达18-20h。

用4℃预冷的离心机分别收集表达菌体，以含10％甘油的50mM(pH＝8.0)NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液洗两次，再加入少量溶菌酶，液氮速冻，冰水浴解冻，超声破碎，高速离心，采用His-镍柱亲和纯化(以含10％甘油和80mM咪唑的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗杂蛋白，以含10％甘油和500mM咪唑的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗脱目的蛋白，及利用脱盐柱脱盐(脱盐缓冲溶液为含10％甘油的50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液)。测定突变体ATD对BP-2的比活力为36858.84U/mg，野生酶对BP-2的比活力为135.8U/mg，ATD较野生酶对BP-2的比活力提高了271倍。测定突变体ATD对BP-2的TON为9313，野生酶对BP-2的TON为136，较野生酶对BP-2的TON提高了68倍。

实施例3：糖基转移酶MiCGT及其突变体ATD催化BP-2合成O-葡萄糖苷

在100μL反应体系中，UDP-葡萄糖的浓度为4mM，底物2,2',4,4'-四羟基二苯甲酮(BP-2)浓度为3mM，50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)，DMSO(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体ATD的终浓度为54μg，以野生酶为对照，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。

由图1和图2可以看出，突变体ATD催化BP-2可以得到O-葡萄糖苷产物，转化率91％，而野生酶得到较为混杂的糖苷产物，转化率3％。突变体较野生酶化学选择性更高的同时，转化率大幅度提高。

在50mL反应体系中，底物2,2',4,4'-四羟基二苯甲酮(BP-2)36.9mg，50mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)，DMSO(v/v,5％)，生物催化剂为表达突变体ATD的全细胞，催化剂终浓度为OD₆₀₀＝40，在30℃反应24h。随后，样品在4,000g下离心5分钟，收集上清。用20mLddH₂O洗涤细胞，离心2次。上清液经过滤，用大孔树脂柱层析初步纯化和浓缩，再利用硅胶柱层析进一步纯化，分离得到53.6mg O-糖苷产物。

实施例4：糖基转移酶MiCGT及其突变体ATD催化2,4-二羟基苯丙酮合成O-葡萄糖苷

在100μL反应体系中，UDP-葡萄糖的浓度为4mM，底物2,4-二羟基苯丙酮浓度为3mM，50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)，DMSO(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体ATD的终浓度为54μg，以野生酶为对照，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。

由图3和图4可以看出，突变体ATD催化2,4-二羟基苯丙酮可以得到O-葡萄糖苷产物，转化率68％，而野生酶得到较为混杂的糖苷产物，转化率<3％。突变体较野生酶化学选择性更高的同时，转化率大幅度提高。

实施例5：糖基转移酶MiCGT及其突变体ATD催化4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮合成O-葡萄糖苷

在100μL反应体系中，UDP-葡萄糖的浓度为4mM，底物根皮素(4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮)浓度为3mM，50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)，DMSO(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体ATD的终浓度为54μg，以野生酶为对照，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。

由图5和图6可以看出，突变体ATD催化4-氟-2',4'-二羟基二苯甲酮可以得到O-葡萄糖苷产物，转化率78％，而野生酶得到较为混杂的糖苷产物，转化率<3％。突变体较野生酶化学选择性更高的同时，转化率大幅度提高。

实施例6：糖基转移酶MiCGT及其突变体ATD催化4'-羟基苯庚酮合成O-葡萄糖苷

在100μL反应体系中，UDP-葡萄糖的浓度为4mM，底物4'-羟基苯庚酮浓度为3mM，50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 8.0)，DMSO(v/v,5％)，生物催化剂纯酶突变体ATD的终浓度为54μg，以野生酶为对照，30℃下反应2h得到相应糖基化产物。加3倍体积冰甲醇终止反应，高效液相色谱及质谱分析。

由图7和图8可以看出，突变体ATD催化4'-羟基苯庚酮可以得到O-葡萄糖苷产物，转化率89％，而野生酶虽可以得到化学选择性较高的O-葡萄糖苷产物，但转化率仅<3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种糖基转移酶MiCGT的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第148位甲硫氨酸突变为丙氨酸，第190位缬氨酸突变为苏氨酸，并将第121位丝氨酸突变为天冬氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括pET系列载体、pRSF系列载体或pCDF系列载体。

4.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

5.制备权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将权利要求4所述的基因工程菌发酵。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵过程中添加诱导剂，所述诱导剂为4-α-乳糖或IPTG。

7.一种合成O-糖苷的方法，其特征在于，以UDP-葡萄糖或者葡萄糖为糖基供体，以权利要求1所述的突变体或者权利要求4所述的基因工程菌作为生物催化剂，以BP-2、2,4-二羟基苯丙酮、4-F-2',4'二羟基二苯甲酮或4'-羟基苯庚酮为受体进行反应。

8.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4所述基因工程菌，或权利要求5或6所述方法，或权利要求7所述方法在食品、制药等领域的应用。