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CN116602976B - 一种组合物、一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法及应用 - Google Patents

一种组合物、一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法及应用 Download PDF

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CN116602976B CN202310417647.3A CN202310417647A CN116602976B CN 116602976 B CN116602976 B CN 116602976B CN 202310417647 A CN202310417647 A CN 202310417647A CN 116602976 B CN116602976 B CN 116602976B
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Abstract

本发明提供了一种组合物、一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法及应用，属于生物医药、动物模型构建技术领域，具体为一种组合物，包括阿霉素和连翘苷；本发明首次发现阿霉素和连翘苷组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型；本发明建立的斑马鱼心脏毒性模型，只出现心率降低的表现，各处理组斑马鱼未出现局部或全身水肿等异常，排除了阿霉素可能造成的肾毒性损伤的发生；利用本发明提供的斑马鱼心脏毒性损伤模型能够用于筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物。

Description

一种组合物、一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的 建立方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药、动物模型构建技术领域，具体涉及一种组合物、一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法及应用。
背景技术
阿霉素属蒽环类家族，是临床上常用的一种广谱抗肿瘤药物，能有效地作用于各种生长周期的肿瘤细胞。在应用中发现阿霉素具有心脏毒性，容易损伤心肌细胞，出现心律失常、ST-T改变，引起充血性心力衰竭，这种严重心力衰竭多在停药后的1～6个月内发生。阿霉素的心脏毒性与药物剂量、联合用药情况密切相关。在临床上，阿霉素一般作为第二线药物，在首选药物耐药时才可考虑应用。阿霉素的心脏毒副作用极大地限制了其在临床抗肿瘤治疗中的应用，因此，对于阿霉素心脏毒性机制的研究亟待开展。
动物模型是进行人类疾病研究的重要工具，利用动物模型能直观的体现人类疾病的病理生理改变，进行疾病机制研究。同时动物模型也是筛选活性药物，进行药物研发的重要工具。啮齿类动物生物体特点与人类接近，实验结果具有代表性，但啮齿类动物普遍存在体格大、成本高、周期长的缺点。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，属鲤科。其成鱼仅约3-4厘米长，产卵量大，胚胎透明而且体外发育，非常便于操作和观察。其胚胎发育周期短，许多研究在胚胎期即可进行，对药物的用量非常少。斑马鱼基因组序列与人类基因组高度相似，包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，因此，斑马鱼在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域得到广泛应用，是一种理想的脊椎模式生物。
斑马鱼幼鱼鱼体透明，显微镜下可清晰观察心脏和全身血循环状况，在药物心脏毒性研究及活性药物研发方面具备独特的生物优势，因而得到大量应用。赵慧等人用阿霉素处理发育36hpf斑马鱼，诱导建立心肌损伤模型，斑马鱼出现心包水肿，静脉窦和动脉球(SV-BA)距离增大表现。徐卓然等人用阿霉素处理发育24hpf斑马鱼，获得了斑马鱼心脏毒性损伤模型，并对阿霉素毒性损伤机制进行研究。这些研究均通过水溶性给药处理斑马鱼，实验方法便捷，易于高通量进行。但目前的研究多在斑马鱼胚胎期(＜72hpf)开展，正常斑马鱼在受精24hpf血管发育开始，72hpf时完成，此时绝大多数器官发育成熟，具备正常功能，幼鱼孵化出膜，因此，大于72hpf斑马鱼更适于研究药物对成熟机体和器官功能的毒性作用，结果更具有借鉴意义。Rider等人将阿霉素显微注射至72hpf斑马鱼血循环系统，斑马鱼出现心力衰表现，但是这一方法对技术要求比较高，不适于大规模开展。因此，有必要寻找一种操作简便、效果可靠的方法，诱导建立一种针对斑马鱼幼鱼的阿霉素心脏毒性损伤模型，为临床阿霉素所致的心脏功能损伤的预防和治疗研究提供实验基础。并且现有技术中关于利用动物模型用于筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物的研究报道较少。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种组合物、一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法及应用。
本发明首次发现阿霉素和连翘苷组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型。
本发明的目的是提供一种阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法，用于研究阿霉素心脏毒性损伤机制及筛选预防或治疗阿霉素所致的心肌损伤的活性药物。
术语说明：
dpf(days post fertilization)：指受精后的天数。
本发明技术方案如下：
一种用于建立斑马鱼心脏毒性损伤模型的组合物，包括阿霉素和连翘苷。
根据本发明优选的，所述组合物中组分的使用浓度为阿霉素(20-40)μg/mL，连翘苷(200-700)μg/mL。
进一步优选的，所述组合物中组分的使用浓度为阿霉素30μg/mL，连翘苷(200-700)μg/mL。
根据本发明优选的，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上的斑马鱼。
进一步优选的，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上并且小于6dpf的斑马鱼。
根据本发明优选的，斑马鱼为AB系野生型斑马鱼。
阿霉素和连翘苷在建立斑马鱼心脏毒性损伤模型中的应用。
根据本发明优选的，所述应用中，阿霉素的使用浓度为(20-40)μg/mL，连翘苷的使用浓度为(200-700)μg/mL。
进一步优选的，所述应用中，阿霉素的使用浓度为30μg/mL，连翘苷的使用浓度为(200-700)μg/mL。
根据本发明优选的，所述应用中，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上的斑马鱼。
进一步优选的，所述应用中，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上并且小于6dpf的斑马鱼。
根据本发明优选的，所应用中，斑马鱼为AB系野生型斑马鱼。
一种斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法，包括如下步骤：
取斑马鱼随机分组，分别为模型组和正常对照组，模型组为加入含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，正常对照组为加入不含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，将模型组和正常对照组进行培养，培养20-28h，观察每条鱼的心跳状况，并计数心率，模型组与正常对照组相比，心率降低显著，斑马鱼心脏毒性损伤模型建立成功，否则不成功。
根据本发明优选的，所述方法中，斑马鱼为AB系野生型斑马鱼。
根据本发明优选的，所述方法中，所用的斑马鱼为3dpf以上的斑马鱼。
进一步优选的，所述方法中，所用的斑马鱼为3dpf以上并且小于6dpf的斑马鱼。
根据本发明优选的，所述方法中，含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，含阿霉素浓度为(20-40)μg/mL和连翘苷的浓度为(200-700)μg/mL。
进一步优选的，所述方法中，含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，含阿霉素浓度为30μg/mL和连翘苷的浓度为(200-700)μg/mL。
根据本发明优选的，所述方法中，培养水溶液中含有：含5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4，pH 7.2。
根据本发明优选的，所述方法中，每组斑马鱼的数量为15-30条。
根据本发明优选的，所述方法中，培养的条件为27-28℃，光照/黑暗周期为14h/10h。
根据本发明优选的，心率降低显著的统计学依据方法是独立样本t检验。
上述方法建立的斑马鱼心脏毒性损伤模型在筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物中的应用。
一种利用上述方法建立的斑马鱼心脏毒性损伤模型筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物的方法，包括如下步骤：
取斑马鱼随机分组，分别为正常对照组、模型组和治疗组，正常对照组为加入不含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，模型组为加入含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，治疗组提前加入含待测样品的培养水溶液预处理2-5h，然后加入阿霉素和连翘苷至所需浓度，或治疗组加入含阿霉素、连翘苷及待测样品的培养水溶液，将正常对照组、模型组和治疗组进行培养，培养20-28h，观察每条鱼的心跳状况，并计数心率，治疗组与模型组相比，心率升高显著，表明斑马鱼心脏毒性损伤得到缓解，待测药物具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性，否则没有活性。
有益效果
1、本发明首次发现阿霉素和连翘苷组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型。
2、本发明利用阿霉素和连翘苷联合处理斑马鱼幼鱼(≥3dpf)，诱导建立斑马鱼心脏毒性损伤模型，由于斑马鱼各器官已发育完成，能更准确的反映正常情况下阿霉素对心脏功能的毒性影响，所获得的结果对临床上阿霉素的心脏毒副作用研究具有更好的借鉴意义和参考价值。
3、本发明建立的斑马鱼心脏毒性模型，只出现心率降低的表现，各处理组斑马鱼未出现局部或全身水肿等异常，排除了阿霉素可能造成的肾毒性损伤的发生，使该模型能够特异用于阿霉素心脏毒性相关研究，摒除了其他脏器功能变化的干扰。
4、本发明通过水溶性给药途径处理斑马鱼幼鱼，方法便捷，处理周期短，药物用量少，效果明显，有效提高实验效率，适用于高通量药物筛选。
5、利用本发明提供的斑马鱼心脏毒性损伤模型能够用于筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物。
附图说明
图1为阿霉素与连翘苷联用对斑马鱼形态的影响图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述，但保护范围不限于此。
实施例中使用的药品及试剂，若无特殊说明，则为普通市售产品，实施例
中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
材料与试剂
斑马鱼，试验所用AB系野生型斑马鱼，来源于齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所，也可以从国家斑马鱼资源中心购买。在28℃，按光照/黑暗周期为14/10h条件下饲养。每日喂食两次丰年虾。傍晚时将雌雄亲鱼按1：1比例放入带筛板的产卵缸内，置于黑暗中，次日受光照刺激排卵。收集鱼卵用0.003％(v/v)次氯酸钠溶液冲洗后放于培养水内，放于28℃，光照培养箱内继续孵育，属于本领域的常规培养方法。
阿霉素(Doxorubicin)，购自上海源叶生物科技有限公司，分子量579.99，HPLC≥98％，用纯净水溶解配成2mg/mL储液。连翘苷(Phillyrin)，购自上海源叶生物科技有限公司，分子量534.55，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成0.2g/mL储液。右丙亚胺(Dexrazoxane)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分子量268.27，纯度≥97％，用二甲基亚砜溶解配成5mg/mL储液。乙酰半胱氨酸(Acetylcysteine)，购自北京索莱宝科技有限公司，分子量163.195，HPLC≥98％，实验时用培养水溶解配至所需浓度。三卡因(MS-222)购自北京索莱宝科技有限公司。各样品储液放于4℃避光保存。
斑马鱼培养水为含5mM NaCl,0.17mM KCl,0.33mM CaCl2,and 0.33mM MgSO4的水溶液，pH 7.2。
实验例1
阿霉素和连翘苷联用对斑马鱼(3dpf)的心脏功能的影响
取3dpf的斑马鱼，随机分组，每组30条，加入24孔细胞培养板内。向孔内加入含阿霉素30μg/mL和连翘苷0，100，200，400，700，1000μg/mL的培养水溶液，每孔溶液的终体积为2mL，对照组加入含与处理组同等体积比例DMSO的培养水，每孔溶液终体积为2mL，加盖后放于28℃光控培养箱内，光照/黑暗周期为14/10h，处理24h。处理结束后，将孔内的斑马鱼取出放于显微镜下，观察每组鱼的表型、心跳状况，并计数心率。
表1阿霉素与连翘苷联用对斑马鱼(3dpf)心率的影响
*:与空白对照组比，P＜0.05；#：与阿霉素30μg/mL组比，P＜0.05。
结果显示，3dpf斑马鱼经30μg/mL阿霉素和不同浓度的连翘苷混合溶液处理24h后，对照组斑马鱼心率为163±3.2次/min，30μg/mL阿霉素处理组斑马鱼心率为160±5.1次/min，与对照组比无明显变化。采用独立样本t检验比较组间心率差异，发现30μg/mL阿霉素与200－700μg/mL连翘苷联合处理组斑马鱼心率比正常对照组降低并有显著性差异(P＜0.05)，30μg/mL阿霉素与1000μg/mL连翘苷组斑马鱼死亡较多，少数存活斑马鱼出现心律不齐，表明阿霉素和连翘苷联合应用损伤斑马鱼心脏功能，损伤程度与连翘苷呈剂量依赖性(表1)。各处理组斑马鱼均未见明显局部水肿或全身性水肿(图1)，表明未引起肾功能损伤。
实验例2
阿霉素和连翘苷联用对斑马鱼(5dpf)的心脏功能的影响
取5dpf的斑马鱼，随机分组，每组20条，加入24孔细胞培养板内。向孔内加入含阿霉素40μg/mL和连翘苷200，400，700μg/mL的培养水溶液，每孔溶液的终体积为2mL，对照组加入含与处理组同等体积比例DMSO的培养水，每孔溶液终体积为2mL，加盖后放于28℃光控培养箱内，光照/黑暗周期为14/10h，处理24h。处理结束后，将孔内的斑马鱼取出，用30μg/mL MS-222处理1min，然后放于显微镜下，观察每组鱼的表型、心跳状况，并计数心率。
结果显示，5dpf斑马鱼经40μg/mL阿霉素和不同浓度的连翘苷混合溶液处理24h后，对照组斑马鱼心率为163±3.2次/min，40μg/mL阿霉素处理组斑马鱼心率为160±5.1次/min，与对照组比无明显变化。采用独立样本t检验比较组间心率差异，发现40μg/mL阿霉素与200－700μg/mL连翘苷联合处理组斑马鱼心率比正常对照组降低并有显著性差异(P＜0.05)(表2)。各处理组斑马鱼均未见明显局部水肿或全身性水肿，表明未引起肾功能损伤。
表2阿霉素与连翘苷联用对斑马鱼(5dpf)心率的影响
*:与空白对照组比，P＜0.05；#：与阿霉素40μg/mL组比，P＜0.05。
总上，环境温度23℃-28℃条件下，受精3－5天的斑马鱼正常心率范围为160－168次/min，经上述方法处理使心脏功能受到毒性损伤后，心率可降至120－130次/min以下，严重的降至60次/min，出现死亡。
6dpf以内的斑马鱼泳动能力低、鱼体透明，适于镜下观察，而且不用喂食可以在孔板内存活，适于进行实验，6dpf以上斑马鱼体格生长快，需要喂食草履虫，不适合进行药物处理和观察。
实验例3
右丙亚胺对阿霉素所致的心脏毒性损伤的保护作用
取3dpf的斑马鱼，随机分组，每组20条，加入24孔细胞培养板内。取右丙亚胺储液，用培养水稀释得10，50，100μg/mL工作浓度，加入板孔内，对照组设两个孔，加入含同体积DMSO的培养水溶液，加盖后放于28℃光控培养箱，光照/黑暗周期为14/10h，处理4h。取出培养板，向对照组一孔内加入阿霉素、连翘苷至培养水溶液中阿霉素终浓度为30μg/mL、连翘苷终浓度为400μg/mL，为损伤组，向右丙亚胺处理组内加入阿霉素、连翘苷至培养水溶液中阿霉素终浓度为30μg/mL、连翘苷终浓度为400μg/mL，右丙亚胺浓度不变，为治疗组，空白对照组为含同体积DMSO的培养水溶液，每孔溶液终体积为2mL。加盖后放于28℃光控培养箱，光照/黑暗周期为14/10h，处理20h。处理结束后，将孔内的斑马鱼取出放于显微镜下，观察每组鱼的表型、心跳状况，并计数心率。
结果显示，空白对照组斑马鱼心率为165±2.5次/min，阿霉素(30μg/mL)和连翘苷(400μg/mL)处理后的损伤组斑马鱼心率为128±4.5次/min，采用独立样本t检验比较组间心率差异，发现损伤组心率比空白对照组显著降低(P＜0.05)。用含100μg/mL右丙亚胺溶液预处理斑马鱼4h，然后加入阿霉素(30μg/mL)和连翘苷(400μg/mL)处理，斑马鱼心率分别为152±5.6次/min，高于损伤组并有显著性差异(P＜0.05)，但仍显著低于空白对照组，表明100μg/mL右丙亚胺能在一定程度上缓解阿霉素与连翘苷联合用药所致的心脏毒性损伤(表3)。
表3右丙亚胺预处理对阿霉素与连翘苷心脏毒性作用的影响
*:与对照组比，P＜0.05；#：与损伤组比，P＜0.05。
实施例4
乙酰半胱氨酸在阿霉素所致的心脏毒性损伤中的作用
取4dpf的斑马鱼，随机分组，每组15条，加入24孔细胞培养板内。损伤组孔内加入含30μg/mL阿霉素、400μg/mL连翘苷的培养水溶液，治疗组在损伤组溶液基础上加入5，10，50mg/mL三个浓度的新配制的乙酰半胱氨酸培养水溶液，对照组加入含同体积DMSO的培养水溶液，每孔终体积为2mL，加盖后放于28℃光控培养箱，光照/黑暗周期为14/10h，处理26h。处理结束后，将孔内的斑马鱼取出放于显微镜下，观察每组鱼的表型、心跳状况，并计数心率。
结果显示，对照组斑马鱼心率为168±5.5次/min，阿霉素(30μg/mL)和连翘苷(400μg/mL)处理后的损伤组斑马鱼心率为126±3.6次/min，采用独立样本t检验比较组间心率差异，发现损伤组心率比空白对照组显著降低(P＜0.05)。加入5，10，50mg/mL三个浓度的乙酰半胱氨酸后，斑马鱼心率与损伤组心率无显著性差异，斑马鱼心率仍低于空白对照组，并有显著性差异(P＜0.05)，表明乙酰半胱氨酸对阿霉素与连翘苷联合用药所致的心脏毒性损伤无治疗活性(表4)。
表4乙酰半胱氨酸对阿霉素与连翘苷心脏毒性作用的影响
*:与对照组比，P＜0.05。
对比例1
阿霉素对斑马鱼的心脏功能的影响
取3dpf的斑马鱼，随机分组，每组30条，加入24孔细胞培养板内。向孔内加入含10，20，30，40，50μg/mL阿霉素的培养水溶液，对照组加入同体积的培养水溶液，每孔溶液终体积为2mL。加盖后放于28℃光控培养箱内，光照/黑暗周期为14/10h，连续处理72h，每日更换1/2药液。每24h取出孔内的斑马鱼放于显微镜下，观察形态变化、心跳状况，并计数心率。发现经10－40μg/mL阿霉素处理24、48、72h后，幼鱼形态无明显异常，无局部或全身水肿，心率与对照组比无显著性差异。50μg/mL阿霉素处理24h后，孔内幼鱼全部死亡。
对比例2
连翘苷对斑马鱼心脏功能的影响
取3dpf的斑马鱼，随机分组，每组25条斑马鱼，加入24孔细胞培养板内。取连翘苷储液，用培养水稀释得到100，200，400，700，1000μg/mL浓度组，加入板孔内，对照组加入含与连翘苷处理组同等体积比例DMSO的培养水溶液，每孔溶液终体积为2mL。加盖后放于28℃光控培养箱内，光照/黑暗周期为14/10h，处理24h。处理结束后，将孔内的斑马鱼取出放于显微镜下，观察每条鱼的表型、心跳状况，并计数心率。发现，
结果显示，与对照组比，100-1000μg/mL连翘苷处理组幼鱼形态均无明显异常，无局部或全身水肿，心率与对照组比无显著性差异。
根据上述实验，用阿霉素或连翘苷分别单独处理斑马鱼，并延长处理时间，与对照组比，斑马鱼未出现心率降低，心脏功能未出现异常，说明未对斑马鱼心脏造成毒性损伤，而本发明首次发现阿霉素与连翘苷联用的技术方案能够实现造成斑马鱼心脏毒性损伤的效果。
本发明首次发现阿霉素和连翘苷组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型。本发明利用阿霉素和连翘苷联合处理斑马鱼幼鱼(≥3dpf)，诱导建立斑马鱼心脏毒性损伤模型，由于斑马鱼各器官已发育完成，能更准确的反映正常情况下阿霉素对心脏功能的毒性影响，所获得的结果对临床上阿霉素的心脏毒副作用研究具有更好的借鉴意义和参考价值。
本发明建立的斑马鱼心脏毒性模型，只出现心率降低的表现，各处理组斑马鱼未出现局部或全身水肿等异常，排除了阿霉素可能造成的肾毒性损伤的发生，使该模型能够特异用于阿霉素心脏毒性相关研究，摒除了其他脏器功能变化的干扰。
利用本发明提供的斑马鱼心脏毒性损伤模型能够用于筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物。

Claims (16)

1.一种用于建立斑马鱼心脏毒性损伤模型的组合物，其特征在于，由阿霉素和连翘苷组成；
所述组合物中组分的浓度为阿霉素20-40μg/mL，连翘苷200-700μg/mL；
建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上的斑马鱼。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中组分的浓度为阿霉素30μg/mL，连翘苷200-700μg/mL。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上并且小于6dpf的斑马鱼。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为AB系野生型斑马鱼。
5.阿霉素和连翘苷在建立斑马鱼心脏毒性损伤模型中的应用，其特征在于，阿霉素的浓度为20-40μg/mL，连翘苷的浓度为200-700μg/mL；建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为3dpf以上并且小于6dpf的斑马鱼。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，阿霉素的浓度为30μg/mL，连翘苷的浓度为200-700μg/mL。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为AB系野生型斑马鱼。
8.一种斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
取斑马鱼随机分组，分别为模型组和正常对照组，模型组为加入含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，正常对照组为加入不含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，将模型组和正常对照组进行培养，培养20-28h，观察每条鱼的心跳状况，并计数心率，模型组与正常对照组相比，心率降低显著，斑马鱼心脏毒性损伤模型建立成功，否则不成功；
所用的斑马鱼为3dpf以上并且小于6dpf的斑马鱼；
含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，含阿霉素浓度为20-40μg/mL和连翘苷的浓度为200-700μg/mL。
9.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述方法中，斑马鱼为AB系野生型斑马鱼。
10.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述方法中，含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，含阿霉素浓度为30μg/mL和连翘苷的浓度为200-700μg/mL。
11.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述方法中，培养水溶液中含有：含5mM NaCl、 0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4，培养水溶液的pH 7.2。
12.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述方法中，每组斑马鱼的数量为15-30条。
13.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述方法中，培养的条件为27-28℃，光照/黑暗周期为14h/10h。
14.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述方法中，心率降低显著的统计学依据方法是独立样本t检验。
15.权利要求8-14任一项所述方法建立的斑马鱼心脏毒性损伤模型在筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物中的应用。
16.一种利用权利要求8-14任一项所述方法建立的斑马鱼心脏毒性损伤模型筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取斑马鱼随机分组，分别为正常对照组、模型组和治疗组，正常对照组为加入不含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，模型组为加入含阿霉素和连翘苷的培养水溶液中，治疗组提前加入含待测样品的培养水溶液预处理2-5h，然后加入阿霉素和连翘苷至所需浓度，或治疗组加入含阿霉素、连翘苷及待测样品的培养水溶液，将正常对照组、模型组和治疗组进行培养，培养20-28h，观察每条鱼的心跳状况，并计数心率，治疗组与模型组相比，心率升高显著，表明斑马鱼心脏毒性损伤得到缓解，待测药物具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性，否则没有活性。
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Assignor: BIOLOGY INSTITUTE OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES

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Denomination of invention: Establishment method and application of a combination and an doxorubicin related zebrafish cardiac toxicity injury model

Granted publication date: 20240105

License type: Open License

Record date: 20240906