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CN116602952A - 脂肪代谢因子lipoxinB4在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用 - Google Patents

脂肪代谢因子lipoxinB4在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用 Download PDF

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CN116602952A CN202310312195.2A CN202310312195A CN116602952A CN 116602952 A CN116602952 A CN 116602952A CN 202310312195 A CN202310312195 A CN 202310312195A CN 116602952 A CN116602952 A CN 116602952A
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裘聪
马可梵
祝昀辉
陈俊波
李毅
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开了脂肪代谢因子lipoxinB4在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用。所述脂氧素B4作为生物标志物检测其在外周血中的表达与分泌水平，低表达或者分泌水平预示有动脉粥样硬化发生发展的风险。lipoxinB4作为小分子化合物药物结构具有良好的空间分散性，具备良好的成药性能和药物代谢动力学性质，作为ROCK1和ROCK2激酶蛋白的抑制配体可作用于血管内壁平滑肌与内皮，减轻动脉粥样硬化斑块形成与发展，改善AS血管炎症微环境。lipoxinB4具高度亲脂性可以主动转运至细胞膜内部而不会被阻隔于膜外，通过注射该小分子药物可以通过循环系统到达全身血管，具有重要的临床应用价值和推广性。

Description

脂肪代谢因子lipoxinB4在制备动脉粥样硬化治疗药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及主动脉血管周围脂肪来源的脂肪代谢因子脂氧素lipoxinB4在制备动脉粥样硬化及相关疾病的诊断及治疗药物中的应用。
背景技术
在我国和欧美一些发达国家，心血管疾病的发病率和死亡率位居榜首，并且已经成为对人类健康和生命构成最大威胁的疾病。其中动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病及其并发症共同的病理生理基础，也是大多数心血管疾病的核心病因。传统上动脉粥样硬化被认为是一种内膜炎症性疾病，血管壁的炎症反应是促进其发生发展的主要核心机制。从炎症引起的内膜层内稳态紊乱，到血管重塑导致炎症逐渐蔓延，最后血管周围脂肪层的功能障碍进而加剧AS病变的发生发展。这种由内而外的信号传导方法多年来一直被奉为教条，尽管炎症细胞在外膜中聚集与浸润比内膜更早也更普遍。以往的研究认为只有血管壁的内膜及中膜参与了动脉粥样硬化的发生发展，往往忽略了血管周围脂肪(Perivascularadipose tissue，PVAT)的作用。长期以来血管周围脂肪PVAT一直被看作是血管的支撑组织是血管壁舒缩过程的保护层,而对于PVAT自身的生理功能却鲜有研究。然而目前越来越多的证据显示，动脉粥样硬化的形成存在“由外至内”的途径,比内膜多百倍的炎症细胞大量聚集在PVAT边缘，促使PVAT功能障碍，并且其会从外向内分泌抑炎或促炎脂肪因子并且作用于其内层血管细胞，加剧或抑制AS病变的发生发展，也提示了主动脉血管周围脂肪对于动脉粥样硬化的潜在调控机制。
血管周围脂肪(PVAT)是包裹着除脑部血管以外的大多数动脉静脉血管，不仅可以支持和保护血管稳态，不同于其他脂肪组织需要血液循环运输脂肪因子，它还通过旁分泌作用分泌具有血管舒缩活性的激素和脂肪因子直接作用于血管壁，同时通过自分泌脂肪因子改变自身组织的功能与性质，从而维持血管舒缩功能与炎症微环境平衡稳态。正是因为PVAT的特殊解剖学特点与分泌功能，使其与血管内层平滑肌内皮细胞之间具有密切的联系。近年来的研究发现，血管周围脂肪组织的脂质代谢通路将组织炎症与内稳态的维持整合串联起来，短链多不饱和脂肪酸(PUFA)及其衍生物作为脂肪组织特有的代谢因子对于健康脂肪组织形成与内稳态的维持起到关键作用。目前基于LC-MS/MS技术的脂肪组织代谢组学研究表明，脂肪组织的代谢产物因解剖位置而异，与皮下脂肪相比血管周围脂肪组织显示出更高的抑制炎症特殊脂质介质(SPMs)表达水平，包括分解素(RvD1、RvD2)、保护素(PD1)、脂氧素(LXs)、二十烷酸前列腺素(PGE2、PGD2、PGF2)、白三烯(LTB4)、羟基二十碳四烯酸(5-HETE、12-HETE、15-HETE)等生物代谢产物，说明血管周围脂肪组织代谢产物在抑制炎症与维持组织炎症稳态方面起到重要作用。因此，血管周围脂肪代谢产物相关SPMs有望成为心血管疾病防治的新视角，但是其调控AS发生发展的具体分子机制仍有待进一步研究。
作为一种重要的血管周围脂肪代谢SPMs产物，脂氧素B4(LipoxinB4)可以以旁分泌或自分泌方式在血管局部起抑制炎症的作用。大量文献表明，lipoxinB4为PUFAomega-6花生四烯酸的次级代谢产物，可直接调动细胞响应炎症刺激并抑制炎症反应和恢复血管稳态。部分文献指出在肥胖症及糖尿病等代谢综合症疾病中时常伴随着失调和异常的lipoxinB4，并且lipoxinB4或其类似物可以抑制中性粒细胞的浸润、促炎细胞因子和促炎趋化因子的产生，如白细胞介素(IL-1β、IL-6、IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，从而抑制血管组织炎症反应。而众所周知炎症反应是动脉粥样硬化疾病发生与发展的核心，因此lipoxinB4在维持主动脉血管稳态中扮演着重要角色，具有潜在的临床应用前景。基于上述原因，本发明对主动脉血管周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4的生物学功能和临床意义进行深入研究，并建立代谢因子脂氧素lipoxinB4与动脉粥样硬化发生发展的关系与作用机制，为治疗与干预动脉粥样硬化提供新的药物靶点。
发明内容
鉴于上述原因，本发明提供了主动脉血管周围脂肪代谢因子脂氧素B4在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用，主要目的在于研究脂肪代谢因子lipoxinB4在动脉粥样硬化疾病发生过程中的生物学功能及调控机制，并完成脂肪代谢因子lipoxinB4在制备动脉粥样硬化及相关疾病的诊断及治疗药物中的应用。
所述脂肪代谢因子脂氧素B4(lipoxinB4)为小分子花生四烯酸不饱和脂肪酸代谢化合物，其结构具有良好的空间分散性，具备良好的成药性能和药物代谢动力学性质，所述的脂肪代谢因子lipoxinB4的结构如下分子式C20H32O5，分子量352.47：
所述脂氧素B4(lipoxinB4)具备高度亲脂性，可以主动转运至细胞膜内部而不会被阻隔于膜外，通过注射该小分子药物可以通过循环系统到达全身血管并可直接进入并作用于细胞，所述的动脉粥样硬化治疗药物为注射试剂。
所述脂肪代谢因子脂氧素B4(lipoxinB4)作为动脉粥样硬化生物标志物，可通过检测其在外周血中的含量来判断动脉粥样硬化的严重程度，以及血管内炎症环境的改变程度，进而可以对动脉粥样硬化进行干预与治疗。脂肪代谢因子脂氧素B4(lipoxinB4)作为ROCK1RHO关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1的抑制配体和ROCK2RHO关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶2的抑制配体的应用。
本发明采取的技术方案分为以下几个方面实现：
1.本发明提出了一种动脉粥样硬化生物标志物，即主动脉血管周围脂肪组织来源的代谢因子脂氧素B4(lipoxinB4)，并验证了lipoxinB4与动脉粥样硬化的相关性。
具体方案的实现：①收集正常小鼠的血浆(Plasma)及主动脉血管周围脂肪(aortic perivascular adipose tissue，aortic PVAT)、肠系膜血管周围脂肪(mesenteric fat，mWAT)、内脏脂肪(visceral fat，vWAT)、附睾脂肪(epididymal fat，eWAT)、腹股沟皮下脂肪(inguinal subcutaneous fat，iWAT)与肩胛间周围脂肪(interscapular brown adipose tissue，iBAT)等组织用elisa法检测lipoxinB4在脂肪组织中的分布及其在血浆中的分泌水平。②检测正常对照与动脉粥样硬化造模小鼠血浆中的lipoxinB4水平，并分别分离两组小鼠主动脉血管周围脂肪组织中的原代脂肪前体干细胞，经分化后检测其细胞内与细胞培养液中的lipoxinB4表达水平。③最后，通过比对正常未患病人群与动脉粥样硬化患者血浆中的lipoxinB4水平，建立脂肪代谢因子脂氧素B4与动脉粥样硬化的临床相关性。
本发明通过对比正常小鼠体内各解剖学位置的脂氧素B4表达量可知，lipoxinB4主要是由主动脉血管周围脂肪组织表达，并且可能通过旁分泌分泌到血浆以及血管内层中。并且本发明还比对正常与动脉粥样硬化造模小鼠PVAT中lipoxinB4的含量，结果表明对照组小鼠相比，动脉粥样硬化造模组小鼠主动脉血管周围脂肪来源的原代脂肪前体细胞及其培养液中的lipoxinB4较少。这一结果证明了动脉粥样硬化的病理环境会影响脂肪细胞表达和分泌脂肪代谢因子脂氧素B4。进一步的，血液生化指标结果还显示了未患病组相比AS患者病人血浆中的lipoxinB4含量更少，这一结果也提示了脂肪代谢因子lipoxinB4与动脉粥样硬化的临床相关性，并可作为动脉粥样硬化的潜在生物标记物进行临床干预与检测。
2.本发明证明主动脉周围脂肪组织来源的代谢因子lipoxinB4对动脉粥样硬化的发生与发展具有治疗潜力
具体方案的实现：APOE-/-(载脂蛋白E缺失)的修饰基因型小鼠饲喂高脂饲料(即普通啮齿动物饲料添加40％猪油与1.25％胆固醇)三个月进行动脉粥样硬化疾病造模。在喂食高脂饲料1个半月以后将动脉粥样硬化造模小鼠分为两组，一组为lipoxinB4注射组，以100μg/kglipoxinB4生理盐水溶液的尾静脉注射小鼠；另一组尾静脉注射等量生理盐水作空白对照。注射频率为每周一次，并每两周颌下静脉取血并检测小鼠血浆内lipoxinB4水平，一共注射六次直至三个月造模完毕。造模完毕后的两组小鼠经戊巴比妥钠安乐死后取其血浆，解剖并采集小鼠主动脉、主动脉血管周围脂肪、心脏与头臂干。主动脉摊开进行油红O染色，头臂干血管及心脏组织经固定脱水后包埋于OCT中进行冰冻切片。主动脉血管周围脂肪组织一部分用于分离原代脂肪前体干细胞，一部分切碎后直接培养于普通细胞培养液(即DMEM高糖标准培养基+10％FBS胎牛血清)中培养24h，而后培养液无菌过滤后与血浆检测促炎因子及趋化因子(如白介素-6IL-6、单核细胞趋化因子MCP1和肿瘤坏死因子TNF-a等)。从而完整评估lipoxinB4对于AS发生发展的抑制作用。
本发明验证了脂肪代谢因子lipoxinB4对于动脉粥样硬化发生发展具有较强的治疗潜力。尾静脉注射lipoxinB4的动脉粥样硬化小鼠与对照组小鼠相比，整个主动脉斑块面积减少、头臂干血管及主动脉根部斑块病灶面积明显减少，血管及脂肪组织中炎症细胞浸润情况明显减少，并且血管周围脂肪组织表达与分泌的促炎因子量也极大下降，从而极大改善了动脉粥样硬化的血管炎症微环境。
3.本发明证明了lipoxinB4可以抑制ROCK1 RHO和ROCK2RHO关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1和2(ROCK1和ROCK2)的酶活及下游通路
(1)确定lipoxinB4与靶向蛋白ROCK1和2的作用位点
具体方案的实现：①首先基于lipoxinB4三维机构利用计算机辅助药物设计(CADD)的生信方法筛选lipoxinB4的潜在作用靶蛋白，获得了包括Rho相关激酶1与2(ROCK1与2)在内的多个受体靶蛋白。利用分子对接软件SYBYL-X对lipoxinB4与所有靶蛋白进行模拟对接，对接结果预测了lipoxinB4可与ROCK1、2形成受体-配体结合构象并有许多氢键连接的结合位点。②进一步的在体外生化实验中，由于lipoxinB4中的羧基可与磁珠上的伯氨基进行酰胺反应，据此原理构建了lipoxinB4-NH2纳米磁珠。构建野生型与突变了预测结合位点的突变型ROCK1、2靶蛋白表达质粒，并于体外293T细胞中进行质粒转染过表达，将所获野生型与突变型靶蛋白与lipoxinB4-NH2纳米磁珠进行免疫共沉淀实验。
(2)lipoxinB4对ROCK1与ROCK2蛋白酶活的抑制作用
具体方案的实现：①由于lipoxinB4与ROCK1与ROCK2蛋白的结合位点和ROCK1与ROCK2蛋白与ATP结合口袋部分重合，猜测lipoxinB4结构竞争性抑制ATP与lipoxinB4的结合，而ATP对于ROCK1与ROCK2蛋白酶活以及其生物学功能的行使是不可缺少的。因此本发明利用ATP与ROCK1与ROCK2结合产生ADP这一原理，对lipoxinB4与ROCK1、2结合前后的产生ADP的量进行酶活抑制IC50曲线测定。②用Western blot蛋白印迹法检测在不同浓度lipoxinB4的刺激下，ROCK1与ROCK2蛋白在内皮细胞及平滑肌细胞中的表达量。
本发明验证了代谢因子lipoxinB4能与ROCKs结合并影响其与ATP的结合，从而抑制ROCKs酶活与蛋白表达量。通过CADD生信技术与lipoxinB4-NH2纳米磁珠-靶蛋白免疫共沉淀WB实验确定了lipoxinB4可以与ROCK1与ROCK2蛋白结合，且软件预测的结合位点与lipoxinB4确有相互作用。通过体外生化实验及WB实验验证了代谢因子lipoxinB4结构性竞争抑制了ATP与ROCK1与ROCK2蛋白的结合，从而抑制了ROCK1与ROCK2蛋白的酶活水平，同时也降低了其蛋白表达量。
(3)lipoxinB4对于ROCK1与ROCK2蛋白相关下游信号通路的影响
具体方案的实现：①对于血管内皮细胞，当ROCK1与ROCK2蛋白的酶活被抑制且其表达量减少后，内皮特异性一氧化氮合酶eNOS在其蛋白1177位磷酸化水平会升高，蛋白表达与激活程度增加。②而对于血管平滑肌细胞，ROCK1与ROCK2蛋白被抑制且其表达量减少后，其下游肌球蛋白复合物(主要是MYPT1与MLY2蛋白)的磷酸化水平整体下降，并且TN-C肌钙蛋白(Tenascin C)的转录与蛋白表达水平也降低。③将不同浓度的lipoxinB4刺激人动脉内皮细胞(HAEC)与人动脉平滑肌细胞(HASMC)数小时后，分别收集两种细胞的总RNA和总蛋白，根据①和②的相关作用机制，用实时定量荧光qPCR与WB免疫印迹法检测相关标志物蛋白和mRNA的表达量。
本发明通过体外细胞实验及分子生化实验验证了lipoxinB4可以通过抑制ROCK1与ROCK2的酶活与蛋白表达量，增强内皮细胞中一氧化氮合酶的磷酸化程度，而该蛋白对于维持内皮舒收功能非常重要，因而一氧化氮合酶激活后内皮细胞表型会得到改善。此外lipoxinB4还降低了平滑肌细胞中的肌球蛋白磷酸化水平以及TN-C肌钙蛋白的转录与蛋白表达水平，进而抑制平滑肌细胞迁移与增殖能力。
(4)lipoxinB4对于动脉粥样硬化中内皮及平滑肌分子调控机制
具体方案的实现：①分离培养正常对照与动脉粥样硬化组小鼠主动脉血管周围脂肪来源的原代前体干细胞SVFs，经分化后形成成熟脂肪细胞再进行后续实验。SVF一共分为四组，正常对照组SVFs+溶剂、AS造模组SVFs+溶剂、正常对照SVFs+lipoxinB4合成酶抑制剂PD146176、AS造模组SVFs+lipoxinB4合成酶抑制剂PD146176。PD146176配制于DMSO中母液浓度为10mM。PD146176通用工作浓度为200nM，稀释于SVFs细胞培养基中混匀，加入正常对照与AS造模组小鼠ADSC细胞于培养箱37℃刺激6小时；而正常对照组SVFs和AS造模组SVFs则用0.1％DMSO溶于培养基中作为空载对照于培养箱37℃刺激6小时，收集细胞与培养液用elisa等方法检测四组细胞分泌与表达lipoxinB4的水平。②将四种不同刺激SVFs细胞接种于transwell小室中与动脉内皮细胞HAEC(提前用促炎因子刺激来模拟AS炎症环境)于细胞培养箱中共培养24h，而后收集HAEC细胞总RNA与总蛋白，用实时定量荧光qPCR与Westernblot蛋白印迹检测在四组SVFs细胞分泌物lipoxinB4的刺激与炎症环境影响下的HAEC的ROCK1与ROCK2蛋白酶活水平与蛋白表达量的变化，以及ROCK1与ROCK2蛋白下游eNOS的蛋白表达水平以及磷酸化水平；同时检测在四组SVFs细胞分泌物lipoxinB4的刺激与炎症环境影响下的内皮功能，如用qPCR与Western blot蛋白印迹检测VWF、E-Selectin、ICAM1、VCAM1等内皮激活相关标志物蛋白的mRNA转录水平；用体外活细胞荧光标记法，显微镜观察检测内皮对于免疫细胞的粘附作用。③将四种不同刺激SVFs细胞接种于transwell小室中与动脉平滑肌细胞HASMC(提前用促炎因子刺激来模拟AS炎症环境)于细胞培养箱中共培养24h，而后收集HUSMC细胞总RNA与总蛋白。用实时定量荧光qPCR与Western blot蛋白印迹检测在四组SVFs细胞分泌物lipoxinB4的刺激与炎症环境影响下HASMC的ROCK1与ROCK2蛋白酶活性，及其下游通路中与细胞迁移相关肌球蛋白复合物的磷酸化激活程度以及细胞增殖相关TN-C肌钙蛋白转录与蛋白表达水平的变化；并且用CCK-8(Cell Counting Kit-8)和结晶紫法检测在四组SVFs细胞分泌物lipoxinB4的刺激与炎症环境影响下HASMC的细胞增殖与迁移的程度。进而综合评估主动脉周围脂肪代谢因子lipoxinB4对于动脉粥样硬化中内皮及平滑肌分子调控机制。
本发明通过体外细胞实验验证主动脉血管周围脂肪来源的原代脂肪细胞可以通过分泌的lipoxinB4对AS炎症环境中的血管内皮与平滑肌起到调控作用，并且抑制了AS的发生发展。代谢因子lipoxinB4通过抑制动脉内皮细胞HAEC与动脉平滑肌细胞HASMC中的ROCK1与ROCK2的酶活水平与蛋白表达量，增强了HAEC eNOS的磷酸化水平，提升了NO利用率与血管功能，抑制了包括VWF、E-Selectin、ICAM1、VCAM1等内皮激活蛋白的转录表达，并极大减少了免疫细胞粘附于HAEC的数量，降低了HAEC活化与粘附的作用；此外，代谢因子lipoxinB4还通过抑制HASMC中ROCK1与ROCK2的酶活与蛋白表达量，减弱了HASMC中的肌球蛋白复合物的磷酸化激活水平以及TN-C肌钙蛋白的转录与蛋白表达水平，有效抑制HASMC的细胞增殖与迁移能力。最终形成一系列脂肪代谢因子lipoxinB4对AS炎症环境中血管壁内侧细胞的分子调控机制，并最终通过该机制抑制了AS的发生发展。
综上所述，本发明提出了一种新型动脉粥样硬化疾病的生物标志物，即主动脉血管周围脂肪组织来源的代谢因子lipoxinB4。经过本发明的研究与验证，通过对比正常小鼠不同解刨学部位的其他脂肪组织lipoxinB4表达量，发现lipoxinB4主要是由主动脉血管周围脂肪组织大量分泌，并且可以由旁分泌作用分泌到血管内层以及血浆中。而在AS造模与正常对照小鼠中检测到lipoxinB4的表达量存在差异，并且这一结果也在AS患者与未患病人群中的血浆中体现，提示了该代谢因子lipoxinB4与AS疾病的相关性，并且可以作为AS的潜在生物标记物进行后续临床研究。本发明通过结构模拟对接，生信技术以及lipoxinB4-NH2纳米磁珠免疫共沉淀WB实验，验证了lipoxinB4可以与靶蛋白ROCK1与2结合，且明确了互作位点。接下来通过体外生化实验，验证lipoxinB4结构性竞争抑制ATP与ROCK1与ROCK2的结合，从而导致ROCKs酶活水平与蛋白表达含量均大幅降低。此外，本发明通过细胞实验验证了脂肪代谢因子lipoxinB4，通过抑制动脉内皮细胞与动脉平滑肌细胞中的ROCK1与ROCK2的酶活水平与蛋白表达量，增强了内皮细胞中ROCK1与ROCK2下游eNOS蛋白的磷酸化水平，提升了NO利用率与血管功能；抑制内皮细胞激活相关蛋白的转录水平与内皮细胞对免疫细胞的粘附作用；另外，lipoxinB4还可降低平滑肌细胞中ROCK1与ROCK2下游肌球蛋白的磷酸化激活水平、TN-C肌钙蛋白的转录与蛋白表达水平，从而有效抑制血管平滑肌的细胞增殖与迁移能力。最终明确了主动脉血管周围脂肪代谢因子lipoxinB4对AS炎症环境中的血管内皮及平滑肌细胞的分子调控机制，并通过该机制抑制了AS的发生发展。因此，脂肪代谢因子lipoxinB4可应用于制备干预与治疗AS及其引起的其他相关疾病的临床药物与治疗产品中，并且极大的丰富了AS及其引起的相关疾病的诊断、干预与治疗手段。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明首次提出了一种脂肪代谢因子新型AS生物标志物，即主动脉血管周围脂肪组织来源的代谢因子lipoxinB4。lipoxinB4为小分子花生四烯酸不饱和脂肪酸代谢化合物，药物结构具有良好的空间分散性，具备良好的成药性能和药物代谢动力学性质，可应用于制备干预与治疗AS及其引起的其他相关疾病包括主动脉粥样硬化症、冠状动脉粥样硬化症、心肌梗塞、脑梗塞、脑出血、肾衰竭、肠系膜动脉出血与梗塞、四肢动脉梗塞等疾病的临床药物与治疗产品中，并且极大的丰富了AS及其引起的相关疾病的诊断、干预与治疗手段，具有重要的临床应用价值和推广性。
(2)本发明首次证明了lipoxinB4主要是由主动脉血管周围脂肪组织特异性大量分泌，AS造模小鼠组比正常对照组小鼠其血管周围脂肪组织分泌LipoxinB4的量明显减少，并且一致的是，相较于未患病人群，AS患者血浆中lipoxinB4的含量也显著减少，提示了lipoxinB4与AS疾病的相关性，并且其可以作为AS的潜在生物标记物进行后续研究。
(3)本发明的脂肪代谢因子lipoxinB4作为小分子花生四烯酸不饱和脂肪酸代谢化合物可由旁分泌作用分泌到血管内层以及血浆中，并具高度亲脂性可以主动转运至细胞膜内部而不会被阻隔于膜外。通过尾静脉注射脂肪代谢因子lipoxinB4与空载溶剂到AS造模小鼠体内，检测两组小鼠AS斑块的发生发展与炎症微环境相关病理指标，从而验证了lipoxinB4对于减轻AS斑块发展，改善AS血管炎症微环境具有较大治疗潜力。
(4)本发明通过生信技术手段以lipoxinB4化学结构为基础，预测筛选了其靶蛋白ROCK1以及ROCK2蛋白，并用lipoxinB4-NH2免疫共沉淀WB实验验证了lipoxinB4的靶蛋白确实为ROCK1以及ROCK2蛋白。进而体外生化实验验证lipoxinB4结构性竞争抑制了ATP与ROCK1以及ROCK2蛋白结合，从而导致其酶活降低。
(5)本发明通过细胞实验验证了脂肪代谢因子lipoxinB4对AS病理条件下血管平滑肌与内皮的影响。具体来说，lipoxinB4通过抑制动脉内皮细胞HAEC与动脉平滑肌细胞HASMC中的ROCK1以及ROCK2蛋白的酶活水平，增强了内皮ROCKs下游靶蛋白eNOS的磷酸化水平，提升了内皮NO利用率与血管功能，并且抑制内皮激活相关蛋白的转录表达，进而抑制内皮活化与内皮对免疫细胞的粘附作用；降低平滑肌中的ROCKs下游靶蛋白肌球蛋白的磷酸化激活水平、以及TN-C肌钙蛋白的转录与蛋白表达水平，从而抑制平滑肌的增殖与迁移能力。最终明确了主动脉血管周围脂肪代谢因子lipoxinB4对AS炎症环境中的血管内皮及平滑肌细胞的分子调控机制，并通过该机制抑制了AS的发生发展。因此，脂肪代谢因子lipoxinB4可应用于制备干预与治疗AS及其引起的其他相关疾病的临床药物与治疗产品中，并且极大的丰富了AS及其引起的相关疾病的诊断、干预与治疗手段。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1脂肪组织代谢因子脂氧素B4表达与分泌水平检测结果；
a为正常小鼠体内脂氧素B4(lipoxinB4)在血浆及不同解剖学部位脂肪组织中的表达水平，说明脂氧素B4主要是由主动脉血管周围脂肪组织表达分泌，并可以进入到血浆中；b为高脂造模动脉粥样硬化(AS)组与正常对照小鼠体内血浆及两组小鼠主动脉血管周围脂肪来源的原代SVFs细胞培养液中lipoxinB4的表达与分泌水平，结果显示相较与正常对照组小鼠，AS组小鼠血浆与主动脉血管周围脂肪来源原代SVFs细胞中lipoxinB4的表达与分泌水平更少；c为未患病人群与AS患者血浆中lipoxinB4的表达水平，结果显示相较与未患病人群，AS患者血浆中lipoxinB4的表达水平更低。
图2主动脉血管周围脂肪代谢因子lipoxinB4对于动脉粥样硬化斑块形成的影响；
a为AS+溶剂空载组小鼠体内整个主动脉中斑块的油红O染色情况；b为AS+lipoxinB4组小鼠体内整个主动脉中斑块的油红O染色；c为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠的整个主动脉斑块面积统计结果；d为AS+溶剂空载组小鼠主动脉根部斑块的油红O染色结果；e为AS+lipoxinB4组小鼠主动脉根部斑块的油红O染色结果；f为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠的主动脉根部斑块面积统计结果；g为AS+溶剂空载组小鼠体内头臂干血管斑块的油红O染色结果；h为AS+lipoxinB4组小鼠体内头臂干血管斑块的油红O染色结果；i为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠头臂干血管斑块面积统计；上述所有结果显示主动脉血管周围脂肪代谢因子lipoxinB4对于动脉粥样硬化斑块发生发展的抑制作用。
图3AS发生发展中脂肪代谢因子lipoxinB4对于血管炎性细胞浸润的影响；
a为AS+溶剂空载组小鼠体内主动脉根部的CD68荧光染色结果；b为AS+lipoxinB4组小鼠体内主动脉根部的CD68荧光染色结果；c为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠的主动脉根部的CD68阳性的炎性细胞浸润面积占比统计结果；d为AS+溶剂空载组小鼠体内头臂干血管的CD68荧光染色结果；e为AS+lipoxinB4组小鼠体内头臂干血管的CD68荧光染色结果；f为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠的头臂干血管的CD68阳性的炎性细胞浸润面积占比统计结果；上述结果显示AS发生发展中脂肪代谢因子lipoxinB4对于血管组织炎性细胞浸润有抑制作用。
图4动脉粥样硬化发生发展中脂肪代谢因子lipoxinB4对血管内促炎微环境的影响；
a为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠体内主动脉血管周围脂肪分泌的促炎因子水平；b为AS+溶剂空载组与AS+lipoxinB4组小鼠体内血浆中的促炎因子水平；上述结果显示脂肪代谢因子lipoxinB4对AS发生发展中血管内促炎微环境的改善作用。
图5脂肪代谢因子lipoxinB4与ROCK1以及ROCK2蛋白的对接构象以及互作位点；
a为脂肪代谢因子lipoxinB4与ROCK1蛋白的对接构象以及互作位点；b为脂肪代谢因子lipoxinB4与ROCK1蛋白的对接构象以及互作位点；上述结果显示脂肪代谢因子lipoxinB4很可能与ROCK1以及ROCK2蛋白结合并且结合口袋可能接近两个酶的ATP结合口袋。
图6脂肪代谢因子lipoxinB4与ROCK1，ROCK2蛋白的结合位点接近ROCKs的ATP结合域；
a为空载--NH2以及lipoxinB4-NH2磁珠与野生型ROCK1以及ROCK2蛋白的免疫共沉淀WB验证结果；b为lipoxinB4-NH2磁珠野生型ROCK1以及ROCK2蛋白，以及预测结合位点突变型的ROCK1以及ROCK2蛋白的免疫共沉淀WB验证结果；上述结果证明了脂肪代谢因子lipoxinB4与ROCK1，ROCK2蛋白能结合，并且结合位点接近ROCKs的ATP结合域。
图7脂肪代谢因子lipoxinB4对ROCK1以及ROCK2蛋白酶活的抑制作用；
a为lipoxinB4对ROCK1酶活的抑制作用IC50抑制曲线的测定；b为lipoxinB4对ROCK2酶活的抑制作用IC50抑制曲线的测定；c在内皮和平滑肌细胞中加入不同剂量浓度的lipoxinB4检测ROCK1与ROCK2蛋白表达量；上述结果显示lipoxinB4抑制通过挤占ROCK1以及ROCK2蛋白ATP结合域，导致ATP结合不了ROCKs蛋白，从而抑制ROCK1以及ROCK2蛋白酶活，并且在内皮和平滑肌细胞中加入不用剂量的lipoxinB4可以影响ROCK1以及ROCK2蛋白表达量。
图8脂肪代谢因子lipoxinB4对于ROCK1以及ROCK2蛋白下游信号通路蛋白的激活或抑制作用，在HAEC与HASMC细胞中不同剂量浓度下lipoxinB4抑制ROCK1与ROCK2蛋白下游信号通路蛋白表达量磷酸化程度的WB免疫印迹结果。结果显示lipoxinB4对于ROCK1以及ROCK2蛋白下游信号通路蛋白表达或者磷酸化程度有抑制作用。
图9脂肪代谢因子lipoxinB4对于AS血管内皮与平滑肌细胞的分子调控机制；
a为正常对照小鼠主动脉血管周围脂肪分离的原代SVF脂肪前体细胞培养液(NC_SVFs_CM)与促炎因子一起刺激平滑肌细胞，其迁移能力的检测结果；b为AS造模小鼠主动脉血管周围脂肪分离的原代SVF脂肪前体细胞培养液(AS_SVFs_CM)与促炎因子一起刺激的平滑肌细胞，其迁移能力的检测结果；c为正常对照小鼠主动脉血管周围脂肪分离的原代SVF脂肪前体细胞用合成lipoxinB4酶的抑制剂PD146176刺激后的培养液(NC_SVFs_CM_PD146176)与促炎因子一起刺激的平滑肌细胞，其迁移能力的检测结果；d为AS造模小鼠主动脉血管周围脂肪分离的原代SVF脂肪前体细胞用合成lipoxinB4酶的抑制剂PD146176刺激后的培养液(AS_SVFs_CM_PD146176)与促炎因子一起刺激的平滑肌细胞，其迁移能力的检测结果；e为上述四组刺激后平滑肌细胞的迁移能力统计结果；f为四组SVFs培养液与促炎因子一起刺激平滑肌细胞，其增殖能力的检测结果；g为NC_SVFs_CM培养液与促炎因子一起刺激内皮细胞，其粘附免疫细胞能力的检测结果；h为AS_SVFs_CM培养液与促炎因子一起刺激的内皮细胞，其粘附免疫细胞能力的检测结果；i为NC_SVFs_CM_PD146176培养液与促炎因子一起刺激的内皮细胞，其粘附免疫细胞能力的检测结果；j为AS_SVFs_CM_PD146176培养液与促炎因子一起刺激的内皮细胞，其粘附免疫细胞能力的检测结果；k为上述四组刺激后内皮细胞粘附免疫细胞能力的统计结果；l为四组SVFs细胞培养液与促炎因子一起刺激内皮细胞，其粘附相关标记物蛋白的转录水平检测结果；m为四组SVFs细胞培养液与促炎因子一起刺激内皮与平滑肌细胞，对两种细胞ROCKs下游信号通路蛋白表达量与磷酸化程度影响的WB免疫印迹结果；上述结果显示在AS炎症环境中，主动脉血管周围脂肪代谢因子lipoxinB4对血管内皮粘附、激活能力以及对平滑肌细胞的增殖迁移能力的抑制，从而进一步对AS的发展进行调控。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验条件及方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1主动脉血管周围脂肪组织来源的代谢因子lipoxinB4与AS疾病的潜在临床相关性
(1)实验动物的饲养、造模与采集
1)小鼠品系及饲养：SPF级C57BL/6JGpt(即为野生型WT小鼠)、B6/JGpt-Apoeem1Cd82/Gpt(即为载脂蛋白E双敲除apoe-/-小鼠),6-7周周龄雄性小鼠，体重大约20-25g，由上海南方模式动物中心提供。同组小鼠置于同一笼以每笼5只密度在浙江大学实验动物中心分笼饲养。空调控制室温23-26摄氏度之间，相对湿度55±10％以内，照明12小时昼夜周期实施，摄食及饮水自由摄取。
2)小鼠造模与组织采集：①野生型小鼠在适应环境一周后腹腔注射40ug/g戊巴比妥钠实施安乐死并收集小鼠血浆及主动脉血管周围脂肪、肠系膜血管周围脂肪、内脏脂肪、附睾脂肪、腹股沟皮下脂肪与肩胛间周围脂肪等组织。②APOE-/-小鼠适应环境一周后，分为两组开始为期三个月的造模，一组为正常对照组：小鼠造模期间三个月均喂食普通啮齿动物饲料；另一组为AS造模组：小鼠造模期间三个月均喂食高脂饲料，即添加了40％猪油与1.25％胆固醇的普通啮齿动物饲料。造模完毕后用戊巴比妥钠溶液腹腔注射安乐死小鼠，解剖小鼠并收集其血浆待测，收集主动脉血管周围脂肪组织并分离该组织来源的原代SVFs前体脂肪干细胞。
(2)未患病人群与动脉粥样硬化患者信息与血浆的采集
1)正常对照组与动脉粥样硬化(AS)患者信息采集：本研究发明从2021年1至2022年1月期间在浙江大学医学院附属邵逸夫医院心血管科门诊接诊AS患者中，纳入符合指征并在本院治疗的AS患者52例；在该医院非心脑血管疾病科门诊接诊患者中，纳入符合指征的51例患者(整形五官科患者30例、口腔科患者21例)作为AS未患病人群。①AS患者纳入标准为：平均年龄62.2±6岁、平均体质量分数(body mass index,BMI)22.2±8kg/m2、收缩压123.3±30mmHg、舒张压73.2±23mmHg、糖尿病和遗传性AS疾病及相关因素；多普勒超声参数：踝肱指数(ABI)≤1；排除标准：动脉粥样硬化继发性相关疾病患者、服用内分泌激素类药物(包括口服避孕药，糖皮质激素等类药物)降血糖或降血脂药物患者、妊娠或哺乳期患者、严重肝肾功能异常患者、神经或者精神疾病患者。②AS未患病人群纳入标准为：平均年龄60.2±4岁、BMI 20.2±4kg/m2、收缩压115.3±20mmHg、舒张压72.2±10mmHg、ABI＞1；排除标准：血脂异常、糖调节功能异常、处于妊娠或哺乳期、肝肾功能异常、糖尿病、高血压、遗传性心血管疾病、AS相关疾病、神经或者精神疾病等既往病史。
2)未患病人群与AS患者血浆样本的采集及相关指标的检测：采集空腹正常对照组与AS患者静脉血浆样本，并用相关指标的elisa试剂盒根据试剂盒使用说明检测两组血浆样本中的超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症介质指标；检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、脂蛋白a(LPA)等血脂指标；检测纤维蛋白原(FBG)、D-二聚体、血清同型半胱氨酸(HCY)等脑卒中指标。以上未患病人群与AS患者的相关临床信息的采集与血浆标本的采集均符合浙江大学医学院附属邵逸夫医院医学伦理委员会审批。未患病人群与AS患者的临床资料及动脉粥样硬化相关血液生化指标结果如表1所示。
表1为未患病人群与AS患者的临床资料及相关血浆检测结果
(3)验证主动脉血管周围脂肪组织来源的代谢因子lipoxinB4与AS疾病的潜在临床相关性
①用lipoxinB4的elisa检测试剂盒按照使用说明检测正常小鼠(WT野生型小鼠)的血浆及主动脉血管周围脂肪、肠系膜血管周围脂肪、内脏脂肪、附睾脂肪、腹股沟皮下脂肪与肩胛间周围脂肪等组织中lipoxinB4的表达情况及分泌水平。结果显示，在正常小鼠体内，与其他解刨学部位的脂肪组织相比，代谢因子lipoxinB4在主动脉血管周围脂肪中表达最多。②在上述(2)步骤中高脂喂养AS造模小鼠与正常对照小鼠血浆以及两组小鼠分离的主动脉血管周围脂肪来源SVFs前体脂肪细胞内与细胞培养液中检测lipoxinB4表达与分泌水平。结果显示，AS造模小鼠血浆以及分离的主动脉血管周围脂肪来源SVFs前体脂肪细胞内与其细胞培养液中表达与分泌的lipoxinB4水平明显少于正常对照小鼠。③进一步的，用lipoxinB4 elisa检测试剂盒按照说明书检测上述(2)步骤中采集的未患病人群与AS患者血浆样品中的lipoxinB4含量，验证lipoxinB4与AS是否具有相关性。结果显示脂肪代谢因子lipoxinB4与AS疾病的临床相关性。
如图1中的结果所示，lipoxinB4在正常小鼠的所有脂肪组织中均有表达，但主动脉血管周围脂肪中表达量最多，并且分泌入血浆中也较多。并且，与正常对照组小鼠相比，AS造模组小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源的SVFs和其培养上清液中的lipoxinB4较少,说明AS的发生发展可能会导致主动脉血管周围脂肪来源的SVFs减少合成和分泌lipoxinB4。并且进一步的，与未患病人群相比，AS患者病人血浆中的lipoxinB4含量明显更少，提示了lipoxinB4与AS疾病具有一定程度的相关性。综上实验结果验证了主动脉血管周围脂肪组织来源的lipoxinB4与AS的潜在临床相关性。
实施例2主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4在AS发生发展中的抑制作用
(1)实验动物的饲养、造模与采集
小鼠造模：APOE-/-基因型小鼠饲喂高脂饲料(即普通啮齿动物饲料添加40％猪油与1.25％胆固醇)1个半月以后分为两组，一组小鼠以100μg/kg注射量尾静脉注射lipoxinB4生理盐水溶液100μl作为AS给药组(AS+lipoxinB4组)，另一组尾静脉注射等量生理盐水作为AS空白对照组(AS+溶剂空载组)。注射频率每周一次，一共注射六次直至三个月造模完毕，并每两周颌下静脉取血elisa法检测血浆内lipoxinB4水平。
组织采集：造模完毕后的两组小鼠经戊巴比妥钠安乐死后取其血浆，解剖采集其整根主动脉、心脏与头臂干血管固定于4％PFA多聚甲醛溶液(体积比1:20)中，室温固定4-6小时；主动脉血管周围脂肪切碎后直接培养于细胞培养液(DMEM高糖标准培养基+10％FBS胎牛血清)中培养24h，离心取其上清无菌过滤待测。
(2)研究脂肪代谢因子lipoxinB4对于AS发生发展的影响
1)lipoxinB4对于AS斑块形成的影响：①主动脉斑块面积检测：将AS+溶剂空载和AS+lipoxinB4两组小鼠的整根主动脉从中间摊开后用固定针固定后进行油红O染色。油红O母液浓度为1.5％即1.5g配于100ml异丙醇溶液中，以油红O母液：双蒸水3:2的比例稀释母液得到油红O工作液。固定后摊开的整根主动脉加入油红O工作液室温染色1h，再用双蒸水洗涤2遍每次3min,洗涤完毕后用OCT将整根主动脉封于玻片中。于体视镜下进行拍照，用ImageJ软件统计整根主动脉中的斑块总面积；②头臂干血管及主动脉根部斑块面积的检测：将AS+溶剂空载和AS+lipoxinB4两组小鼠的头臂干血管与心脏组织用4％PFA室温固定4-6小时，30％蔗糖脱水过夜，而后包埋于OCT中进行冰冻切片。头臂干血管与主动脉根部心脏切片用油红O与苏木精-伊红(HE)染色试剂盒染色，油红O染色与封片方法同上所述，HE染色根据试剂盒说明书操作，即先苏木精3min,流水洗涤10min,伊红染色5min,乙醇阶梯脱水(70％乙醇10秒，80％乙醇10秒，90％乙醇10秒，无水乙醇10秒)，二甲苯透明5分钟，新鲜的二甲苯再透明5分钟。用中性树脂封片。染色后的头臂干血管及主动脉根部切片于倒置显微镜下拍照，用ImageJ软件统计其斑块面积。AS+溶剂空载和AS+lipoxinB4两组小鼠整根主动脉、头臂干血管及主动脉根部的染色与斑块面积统计结果如图3所示，脂肪代谢因子lipoxinB4可以抑制小鼠动脉粥样硬化中斑块的发生发展。
2)lipoxinB4对于AS发生发展过程中血管组织炎性细胞浸润的影响：①将将AS+溶剂空载和AS+lipoxinB4两组小鼠的头臂干病理切片用巨噬细胞表面标记物CD68抗体、指示血管壁中平滑肌细胞的表面标记物aSMA抗体与指示细胞核的DAPI染料进行免疫荧光染色；主动脉根部心脏切片用CD68抗体与DAPI染料进行免疫荧光染色。染色步骤大概为：切片恢复到室温后用PBS洗涤10min,在组织上滴加封闭透化液室温孵育一小时。封闭透化液是添加0.25％TritonX100、5％山羊血清与1％牛血清白蛋白BSA的PBS溶液。封闭透化完毕后用PBST溶液(即PBS溶液加入1％Tween 20)洗涤三遍每次3分钟，吸干组织表面液体滴加一抗四度孵育过夜。一抗稀释比例一般为1:200-400，稀释于封闭透化液中。孵育完毕后吸干组织表面液体用上述方法洗涤切片，吸干组织表面液体滴加荧光二抗室温孵育1小时，二抗制备同一抗方法一样。再用上述方法洗涤切片与吸干组织表面液体滴加以1:500稀释于封闭透化液中的DAPI染料室温孵育30min，PBST溶液洗涤三遍每次3分钟。吸尽组织表面液体后用防荧光淬灭封片剂封片，于荧光倒置显微镜下进行拍照，用ImageJ软件统计头臂干与主动脉根部斑块中的炎性细胞浸润面积。AS+溶剂空载和AS+lipoxinB4两组小鼠的头臂干与主动脉根部斑块和血管中CD68阳性炎性细胞荧光染色结果与炎性细胞浸润面积的统计结果如图3所示。上述结果显示脂肪代谢因子lipoxinB4可以抑制小鼠动脉粥样硬化中血管组织中炎性细胞浸润。
3)lipoxinB4对于AS发生发展过程中对血管促炎微环境的影响：用相关指标的elisa试剂盒根据说明书检测AS+溶剂空载和AS+lipoxinB4两组小鼠小鼠的血浆以及无菌过滤后的主动脉血管周围脂肪来源原代SVFs前体脂肪细胞培养液中瘦素(leptin)、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子(MCP1)与肿瘤坏死因子(TNF-a)等相关脂肪因子、细胞因子与趋化因子的表达水平，检测结果如图4所示。上述结果显示，AS发生发展过程中脂肪代谢因子lipoxinB4能改善血管促炎微环境。
上述所有研究结果表明，脂肪代谢因子lipoxinB4对于AS发生发展起到显著的抑制作用。AS+lipoxinB4组小鼠较AS+溶剂空载空白对照组小鼠，整体主动脉斑块面积与主动脉根部斑块病变面积都大量减少，头臂干血管内斑块病灶的炎症细胞浸润情况也明显减少，并且lipoxinB4还可以改善AS发生发展过程中血管的促炎环境。
实施例3主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4靶向ROCK1以及ROCK2蛋白
(1)靶蛋白的预测及筛选：①基于lipoxinB4的三维机构，用计算机辅助药物设计(CADD)原理集成药效团匹配软件PharmMapper Server预测筛选lipoxinB4的潜在作用靶蛋白，获得包括Rho相关激酶1与Rho相关激酶2(ROCK1以及ROCK2)在内的多个受体靶蛋白的相关蛋白信息、功能信息、与lipoxinB4的互作分数以及具体互作区域的蛋白结构。②从预测结果中挑选互作分数最高的靶蛋白ROCK1以及ROCK2，用分子对接软件SYBYL-X使两种蛋白与lipoxinB4进行结构模拟对接。lipoxinB4与ROCK1以及ROCK2蛋白的对接构象以及互作位点的结果如图5所示。对接结果显示lipoxinB4可与ROCK1以及ROCK2蛋白形成受体-配体结合构象，互作区域中能形成许多氢键连接的互作位点，并且lipoxinB4-ROCK1以及ROCK2的对接区域与ATP-ROCK1以及ROCK2蛋白的对接区域互作氨基酸部分重合，而ATP作为激活因子对于维持ROCKs蛋白酶活具有重要作用，也提示lipoxinB4可能存在结构性竞争ATP与ROCKs蛋白结合，抑制ROCKs酶活。
(2)生化实验验证lipoxinB4与ROCK1以及ROCK2结合位点：
1)lipoxinB4-NH2纳米磁珠的构建：lipoxinB4结构中含有的羧基与PuriMagHomoL-NH2氨基磁珠(PuriMagTechnology)通过酰胺反应进行偶联，得到共价结合的lipoxinB4-NH2纳米磁珠。
具体步骤如下：①首先平衡磁珠：磁分离氨基磁珠并转移约80ul磁珠到干净EP管中，磁分离并吸弃上清液。从磁力架上取下EP管，加入200μl偶联缓冲液(0.1M MES,0.5MNaCl,pH 6.0)重悬磁珠，磁分离并吸弃上清液。再用上述缓冲液及方法清洗磁珠两次。②配体与磁珠孵育：将配体溶解于偶联缓冲液中至浓度达到1-10mg/ml。用80ul偶联缓冲液重悬磁珠,取适量大约1-10ul配体加入氨基磁珠中，再在反应体系中加入1μl的溶于1MNaOH的5M氰基硼氢化钠溶液并混匀，室温下孵育2小时，随后磁分离并吸弃上清液。加入反应混合物同体积的溶于双蒸水的0.1M乙醇胺，并在室温下旋转孵育15分钟，磁分离吸弃上清液。③封闭磁珠：加入500μl封闭缓冲液(50mM Tris,pH8.0,5-10mM Hydroxylamine)并重悬磁珠，室温孵育30分钟。将EP管置于磁力架上60秒并吸弃上清液。重复上述缓冲液及方法清洗磁珠一次。加入500μL的PBS(pH7.4)重悬磁珠，将EP管置于磁力架60秒并吸弃上清液，重复PBS溶液洗涤2次，最后加入100μL的PBS(pH7.4)重悬磁珠，并于4℃储存。
2)野生型与突变型ROCK1及ROCK2重组蛋白的获取：
①cDNA的获取：用通用盐离子吸附柱法提取RNA试剂盒提取细胞总RNA，并反转录试剂盒反转录RNA成cDNA。②野生型ROCK1及ROCK2表达质粒构建和鉴定：设计特异性ROCK1及ROCK2的cDNA引物,用普通PCR法扩增获得的目的cDNA片段。酶切CMV-3XFlag通用质粒载体，用同源重组酶让其与目的cDNA片段连接。将重组质粒通过热激法转化入大肠杆菌感受态细胞中，活化感受态细胞后，接菌于培养皿中37℃倒置培养14-16小时。次日挑选单克隆菌落，37℃培养5-7小时单克隆菌落后，用通用质粒提取试剂盒(Omega)提取菌落质粒，测序比对该菌落质粒与NCBI数据库中的野生型ROCK1与2的DNA序列是否一致。将测序正确的菌落扩大培养后，用质粒提取试剂盒提取并获得野生型ROCK1及ROCK2重组质粒。③突变型ROCK1及ROCK2表达质粒构建和鉴定：在获得的野生型ROCK1及ROCK2重组质粒的基础上，根据SYBYL-X分子对接软件模拟出的lipoxinB4与ROCK1、2蛋白结合构象中的潜在互作位点，用多点突变试剂盒(transgen,Fast MultiSite Mutagenesis System)突变野生型ROCK1及ROCK2质粒中的相应氨基酸位点，用同源重组酶连接突变的质粒片段并获得重组突变型ROCK1及ROCK2质粒，具体构建与鉴定步骤同②；④野生型与突变型ROCK1及ROCK2蛋白的提取：首先将293T细胞接种于数盘10cm培养皿中，当细胞融合率达到80％-90％时进行转染。将野生型与突变型ROCK1、2重组质粒以及空白组空载质粒和Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂混合稀释于opti-MEM培养液中并孵育20分钟制备转染复合物。将复合物加入细胞培养皿后轻轻混合，于细胞培养箱中孵育6小时后更换新鲜培养液。随后自转染之日起48小时后收集细胞，用通用提取RNA试剂盒提取总RNA与RIPA裂解细胞提取总蛋白，随后荧光定量qPCR与WB方法鉴定质粒是否成功过表达；一部分以每10^6细胞加入800ul裂解液的比例加入1mM PMSF的RIPA裂解液并混匀提取细胞总蛋白。用超声仪破碎细胞裂解液直至充分裂解，12000r/min离心10min取上清，获得野生型与突变型ROCK1及ROCK2以及空载蛋白裂解液。
3)lipoxinB4-NH2磁珠与野生型与突变型ROCK1及ROCK2的免疫共沉淀实验
将所获野生型与突变型ROCK1及ROCK2蛋白裂解液与lipoxinB4-NH2纳米磁珠共孵育，所得结合液进行免疫共沉淀实验。Western blot蛋白印迹法检测上述结合液中野生型与突变型ROCK1以及ROCK2蛋白的结合含量，从而验证lipoxinB4与ROCK1及ROCK2蛋白是否可结合以及具体互作位点。
具体步骤如下：①将过表达野生型与突变型ROCK1及ROCK2的蛋白裂解液加入到步骤1)中制备好的lipoxinB4-NH2纳米磁珠离心管中涡旋10秒混匀，室温孵育30分钟或4℃摇动孵育过夜，进行配体-磁珠免疫共沉淀实验。磁分离弃上清后，从磁力架上取下试管，加入200μl带有蛋白酶抑制剂的WB裂解液重悬磁珠。磁分离弃上清液，从磁力架上取下EP管。再用上述裂解液洗两次去除未结合抗原。吸尽液体后向磁珠内加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液并在95℃加热磁珠5分钟。磁分离后上清加到SDS-PAGE凝胶上进行WB检测。以空载蛋白为对照检测结合液中野生型与突变型ROCK1及ROCK2蛋白的结合含量。
本实例验证了在体外生化条件中，小分子lipoxinB4可以与野生型ROCK1及ROCK2蛋白结合，而与位点突变型的ROCK1以及ROCK2蛋白几乎不能与lipoxinB4结合，验证了lipoxinB4与ROCK1的互作位点为I82、R84、A86和D216；lipoxinB4与ROCK2的互作位点为A102、F103、S104、D218和N219，验证结果如图六所示。总之，主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4可以靶向结合ROCK1以及ROCK2蛋白。
实施例4主动脉周围脂肪代谢因子lipoxinB4对ROCK1及ROCK2蛋白的抑制作用
(1)ROCK1及ROCK2蛋白的酶活抑制IC50曲线测定：由于lipoxinB4与ROCK1及ROCK2的结合位点和ROCK1及ROCK2与ATP结合区域部分重合，猜测lipoxinB4结构竞争性抑制ATP与lipoxinB4的结合，而ATP对于ROCK1及ROCK2酶活以及其生物学功能的行使是不可缺少的。利用ATP与ROCK1及ROCK2结合会生成ADP这一原理，用ADP-GloTMKinase Assay试剂盒对lipoxinB4与ROCK1及ROCK2结合前后的产生ADP量进行检测。
具体步骤为：1)配制激酶反应液、ATP底物、酶液以及ATP与ADP不同转化率标品：按照试剂盒说明书，激酶反应液为pH值7.5的40mM Tris-HCL缓冲液同时添加20mM Mgcl2、2mMDTT与0.1mg/ml BSA。将试剂盒中提供的10mM ATP与ADP稀释成1mM终浓度工作液。酶活反应中ATP底物浓度经查阅文献可知为80μM,并用1X激酶反应液将其配成5XATP底物溶液。标品配制如下：100％转化率(1μM ADP：0μM ATP)；80％转化率(0.8μM ADP：0.2μM ATP)；60％转化(0.6μM ADP：0.4μM ATP)；40％转化(0.4μM ADP：0.6μM ATP)；20％转化率(0.2μM ADP：0.8μM ATP)；10％转化率(0.1μM ADP：0.9μM ATP)；5％转化率(0.05μM ADP：0.95μM ATP)；4％转化率(0.04μM ADP：0.96μM ATP)；3％转化率(0.03μM ADP：0.97μM ATP)；2％转化率(0.02μM ADP：0.98μM ATP)；1％转化(0.01μM ADP：0.99μM ATP)；和0％转换(0μM ADP：1μMATP)。酶液配制：用1X激酶反应液稀释ROCK1及ROCK2激酶酶液，使酶液终浓度为1mg/ml。②检测ROCK1及ROCK2激酶酶活抑制曲线IC50值：上述标品配制后取25ul加到96孔板中作为标品曲线的绘制；取两种酶液(1mg/ml浓度)各10μl加入96孔板中，加入10μl2.5X不同浓度的lipoxinB4(浓度区间大约为0-1mM)，最后将5μl 80uM ATP底物加入其中，并于室温反应一小时。设置没有加入lipoxinB4但是其他条件相同的孔作为阳性对照孔,同时设置只有酶液或只有lipoxinB4或者激酶反应液为blank空白孔。所有孔在室温孵育一小时后均加入25μlADP-GloTM试剂室温反应40min，使反应液停止激酶反应并耗尽未消耗的ATP，只留下ADP和非常低的ATP背景。再加入50μl激酶检测试剂并于室温孵育30分钟，将反应液中的ADP转化为ATP。用多功能酶标仪检测新合成的ATP所带的荧光素的荧光强度，所产生的荧光与ROCK1及ROCK2激酶反应产生的ADP的量成正比且能指示激酶活性，根据相关荧光值绘制成lipoxinB4对于ROCK1与ROCK2的IC50抑制曲线。
2)Western blot蛋白印迹法检测内皮细胞和平滑肌细胞在不同浓度lipoxinB4刺激情况下ROCK1及ROCK2的蛋白表达量：正常培养内皮和平滑肌细胞于六孔板中直至其长满。将0、50、100、200、300、400nM的不同浓度lipoxinB4配制于培养液中，混匀加入细胞37℃孵育4小时。刺激完毕用PBS洗涤细胞两遍，胰酶酶解收集细胞并加入WB蛋白裂解液，超声破碎细胞裂解液，4℃13000g离心取上清即为提取的细胞总蛋白。将SDS上样缓冲液加入细胞蛋白样品中ROCK1及ROCK2并在100℃金属浴加热5分钟，其冷却至室温后加到SDS-PAGE凝胶上，用WB免疫印迹检测ROCK1及ROCK2的表达量。
脂肪代谢因子lipoxinB4对ROCK1及ROCK2的抑制作用的验证结果如图7所示。体外生化实验的显示，lipoxinB4通过竞争性抑制阻碍ATP结合ROCK1及ROCK2激酶，从而抑制了ROCK1及ROCK2的激酶酶活。并且进一步的，Western blot蛋白印迹法检测在不同浓度lipoxinB4的刺激下，ROCK1及ROCK2在内皮细胞及平滑肌细胞中的蛋白表达量，检测结果显示lipoxinB4剂量依赖的抑制内皮及平滑肌细胞中的ROCK1及ROCK2蛋白表达水平。综上，lipoxinB4不仅抑制了ROCK1及ROCK2的激酶活性，同时也抑制其在内皮及平滑肌细胞中的蛋白表达量。
实施例5主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4对于ROCK1及ROCK2相关下游信号通路蛋白的影响
Western blot蛋白印迹法检测不同浓度lipoxinB4刺激下，血管内皮细胞及平滑肌细胞中ROCK1及ROCK2相关下游信号通路蛋白的表达情况。
通过大量文献可知，ROCK1及ROCK2对其下游信号通路蛋白的作用机制。①对于血管内皮细胞HAEC，当ROCK1及ROCK2的酶活被抑制且其表达量减少后，内皮特异性一氧化氮合酶eNOS在其蛋白1177位磷酸化水平会升高，蛋白表达与激活程度增加。②对于血管平滑肌细胞HASMC，ROCK1及ROCK2被抑制且其表达量减少后，其下游肌球蛋白复合物(主要是MYPT1与MLY2蛋白)的磷酸化水平整体下降，并且TN-C肌钙蛋白(Tenascin C)的转录与蛋白表达水平也降低。根据①和②的ROCK1及ROCK2对其下游信号通路蛋白的作用机制，用于方案4步骤2)中的方法提取不同浓度lipoxinB4刺激情况下血管内皮细胞及平滑肌细胞的总蛋白与总RNA，用实时定量荧光qPCR与WB免疫印迹法进行相关指标的检测，结果如图8所示。上述实验结果显示，lipoxinB4通过抑制内皮及平滑肌细胞中的ROCK1及ROCK2的酶活与蛋白表达量，增强HAEC中eNOS的磷酸化激活程度，从而提升血管对NO的利用率维持血管舒张功能；降低HASMC中的肌球蛋白的磷酸化激活水平以及TN-C肌钙蛋白的转录与蛋白表达水平，从而抑制增殖与迁移的能力。
实施例6主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4对于AS血管壁内侧细胞的分子调控机制
1)分离与分化小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源的前体干细胞SVFs：分离正常对照组与AS造模组小鼠原代主动脉血管周围脂肪来源的前体干细胞SVFs，经过培养并分化为成熟脂肪细胞，将成熟脂肪细胞分为四组并收取其培养上清，正常对照组SVFs(NC_SVFs_CM)、AS造模组SVFs(AS_SVFs_CM)、正常对照SVFs+合成lipoxinB4酶的抑制剂(NC_SVFs_CM_PD146176)和AS造模组SVFs+抑制剂PD146176(AS_SVFs_CM_PD146176)。PD146176配制于DMSO中母液浓度为10mM。PD146176通用工作浓度为200nM，稀释于SVF细胞培养基中，混匀后加入正常对照与AS造模组小鼠SVF细胞中，于细胞培养箱刺激6h；而正常对照组SVF和AS造模组SVF则用0.1％DMSO培养基混合液刺激6h，即所有不同分组SVFs细胞的刺激与分组完毕，刺激完毕后收取各组SVF细胞的其上清液
2)主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4对AS血管内皮细胞的分子调控机制检测：①ROCK1、2及相关下游信号通路蛋白表达量检测：用transwell小室使四组细胞与提前用炎症因子刺激的血管内皮细胞HAEC(模拟AS炎症环境)于细胞培养箱中共培养24h,用与方案4步骤2)中相同方法收集HAEC细胞总RNA与总蛋白，用实时定量荧光qPCR与Westernblot蛋白印迹检测在四组SVFs分泌lipoxinB4的刺激下炎症因子预处理的HAEC细胞中ROCK1及ROCK2的蛋白表达量、eNOS的蛋白表达水平以及磷酸化水平、检测HAEC中的VWF、E-Selectin、ICAM1、VCAM1等内皮激活因子的转录水平。②活细胞荧光标记法HAEC粘附作用检测：按照①中方法刺激已经炎症因子处理后的HAEC，用PBS洗涤细胞两次，吸尽液体后加入活细胞荧光染料标记好的THP-1悬液。CellTrackerTM红色CMTPX活细胞荧光染料与THP-1细胞于37℃孵育15min，再4℃孵育15min，标记结束后THP-1细胞800g离心5min，弃去上清用PBS重悬，相同方法PBS洗涤两次后用HAEC培养液重悬带荧光标记的THP-1细胞，混匀后以10^4每六孔板一个孔的量加入到不同处理的HAEC中，共同培养1h后用PBS洗两遍洗去未被粘附的多余THP-1细胞，然后于荧光倒置显微镜下观察并拍照，用ImageJ软件进行统计粘附免疫细胞的细胞数，从而检测不同刺激下的HAEC对于免疫细胞THP-1的粘附作用。
3)主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4对AS血管平滑肌细胞的分子调控机制检测：①ROCK1及ROCK2及相关下游信号通路蛋白表达量检测：用transwell小室使四组细胞与提前用炎症因子刺激的动脉平滑肌细胞HASMC(模拟AS炎症环境)于细胞培养箱中共培养24h,用与方案4步骤2)中相同方法收集HASMC细胞总RNA与总蛋白，用实时定量荧光qPCR与Western blot蛋白印迹检测在四组SVFs分泌lipoxinB4的刺激下炎症因子预处理的HASMC细胞中ROCK1及ROCK2的蛋白表达量；检测肌球蛋白(包括MYPT1与MLY2蛋白)复合物的磷酸化激活程度以及TN-C肌钙蛋白的mRNA转录水平与蛋白表达水平；②HASMC增殖与迁移检测：用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测其细胞增殖程度。具体方法：将不同数量的按照①中方法刺激已经炎症因子处理后的HASMC细胞接种于96孔板中每孔加入200微升无酚红DMEM高糖培养基。培养至细胞贴壁充分后，加入20微升CCK-8溶液，以加了等量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加细胞的孔作为空白对照孔。在细胞培养箱内继续孵育2小时，用酶标仪在450nm检测吸光度，整合并绘制细胞增殖折线即可比较不同刺激下HASMC的细胞增殖能力；用结晶紫法检测其细胞迁移程度。具体方法：铺板：将按照①中方法刺激已经炎症因子处理后的HASMC细胞用0.2ml培养基重悬后加入24孔板8μmTranswell小室中，每个Transwell小室大约8x10^3个处理完毕的HASMC，24孔板下室装有0.5ml HASMC新鲜培养基，于细胞培养箱中培养24h后进行结晶紫细胞染色。染色：将PBS加入干净24孔板中，再将上述小室置于该孔中清洗小室细胞迁移面，再在小室里面加入PBS洗两遍清洗小室铺板面。液体吸尽后，用4％PFA加入小室与干净24孔中室温固定15-20min，再用PBS清洗小室上下两面，将结晶紫染液(2％结晶紫固定溶于无水乙醇溶液)加入小室及小室下干净孔中，整个小室浸没于结晶紫染液室温孵育15min。染色完毕后将小室用双蒸水漂洗多遍后用干净纸沥水，用棉签轻轻的擦去小室内铺板面的细胞。拍照：用玻片垫在显微镜载物台上将小室反面即迁移面朝上盖在玻片上，用倒置显微镜拍照观察，用ImageJ软件进行统计迁移的细胞数。
主动脉周围脂肪组织代谢因子lipoxinB4对于AS血管内皮与平滑肌细胞的分子调控机制的验证结果如图9所示。上述结果显示，主动脉血管周围脂肪来源的原代脂肪细胞分泌的代谢因子lipoxinB4确实能对AS炎症环境中的血管内层HAEC与HASMC细胞起到调控作用，并且抑制了AS的发生发展。具体来说，主动脉血管周围脂肪来源的原代脂肪细胞所分泌的代谢因子lipoxinB4通过抑制内皮细胞中ROCK1及ROCK2的酶活与蛋白表达量，增强了内皮中eNOS的磷酸化激活水平，从而提升内皮的NO利用率与血管功能；抑制包括VWF、E-Selectin、ICAM1、VCAM1等在内的内皮激活相关因子的转录表达，并且极大减少了免疫细胞粘附于内皮的数量，从而降低了内皮活化与粘附的作用；此外，代谢因子lipoxinB4还通过抑制平滑肌细胞中ROCK1及ROCK2的酶活与蛋白表达量，减弱了平滑肌细胞中的肌球蛋白复合物的磷酸化激活水平以及TN-C肌钙蛋白的转录与蛋白表达水平，从而抑制其增殖与迁移的能力。因此，脂肪代谢因子lipoxinB4对动脉粥样硬化炎症环境中的血管内皮和平滑肌的分子调控机制，并最终通过该机制抑制了动脉粥样硬化的发生发展。
综上，本发明提出了一种新型AS生物标志物，即主动脉血管周围脂肪组织来源的代谢因子lipoxinB4。由于脂肪代谢因子lipoxinB4的分泌作用以及其对血管壁内层细胞的调控机制，进而抑制动脉粥样硬化的发生与发展，因而lipoxinB4作为AS生物标志物，可应用于制备干预与治疗AS及其引起的其他相关疾病包括主动脉粥样硬化症、冠状动脉粥样硬化症、心肌梗塞、脑梗塞、脑出血、肾衰竭、肠系膜动脉出血与梗塞、四肢动脉梗塞等疾病的临床药物与产品中，极大的丰富了AS及其引起的相关疾病的诊断、干预与治疗手段。具有良好的预测价值，lipoxinB4可应用于制备脓毒症患者预后诊断的试剂或试剂盒。
本发明已参照特定的实施例作了描述，实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。本发明的说明是说明性的而非限制性的，本领域的技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下轻易的做出改进和修饰，但这些改进和修饰也都落入本发明权利要求保护的范围内。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由实施例及其附图详细给出。

Claims (6)

1.脂肪代谢因子脂氧素B4在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脂肪代谢因子脂氧素B4的结构如下：
3.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的动脉粥样硬化治疗药物为注射试剂。
4.权利要求要求1所述的应用，其特征在于，所述脂肪代谢因子脂氧素B4作为动脉粥样硬化生物标志物。
5.脂肪代谢因子脂氧素B4作为ROCK1 RHO关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1的抑制配体的应用。
6.脂肪代谢因子脂氧素B4作为ROCK2RHO关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶2的抑制配体的应用。
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